TWI501786B - 油體蛋白（ｏｌｅｏｓｉｎ）及修飾型態用於製備安定之新型微脂粒 - Google Patents

Description

油體蛋白(oleosin)及修飾型態用於製備安定之新型 微脂粒

本發明係關於新型微脂粒之製備方法，更特別地，係關於在製備微脂粒的過程中，添加油體蛋白來增加微脂粒之安定性，避免微脂粒因聚結而發生沉澱。

1965年英國科學家Bangham等人發現，當磷脂質薄膜分散於水相溶液中，磷脂質會自動形成類似洋蔥狀的多層中空球體結構。1968年由Sessa和Weissmann將此脂質球體命名為微脂粒(liposome)，並定義微脂粒是由一到多層脂質雙層膜所組成的脂質小泡，有自行密合的特性(Sessa G.及Weissmann G.,Journal of lipid research 9(3) ：310-318；1968)。由於微脂粒的結構類似生物細胞膜的結構，與人體細胞間具有良好的生物相容性和分解性，因此吸引了科學家們研究以微脂粒作為藥物載體之可行性。1976年Gregoriadis將微脂粒應用於藥物的載體上(Gregoriadis G.,New England Journal of Medicine 295(13) ：704-710；1976)，直到90年代才有第一個藥劑的上市。至今，經過世界各國研究人員不斷地研究與改良，微脂粒除了可提供藥物輸送與導入人體的管道外，也可作為控制釋放藥物的載體，提高藥物的穩定性、延長藥效時間、降低藥物對組織正常細胞產生毒性，並且還可以有效的將包覆的物質輸送到特定的標的上，以達到最佳的療效。目前已有超過十種的微脂粒藥物通過美國食品藥物管理局的認可(Wagner V.等人，Nat Biotech 24(10) ：1211-1217；2006)。

現今不同製備方式會做出粒徑大小不同的微脂粒，最常使用粒徑大小及層數來做區分。依造微脂粒的粒徑大小及結構可分成多層微脂粒(MLVs)、單層大微脂粒(LUVs)、單層小微脂粒(SUVs)和多泡微脂粒。其中多層微脂粒大小範圍較寬，一般以100~1000 nm不等，組成MLV的脂質雙層有五層或更多，層數較少的有時也被稱為寡層微脂粒(oligolamellar liposomes)。然由於多層包覆，使物質擴散的阻力增加，釋放速度減慢。由於多層脂雙層結構有利於包覆疏水性物質，故通常用來作為疏水性藥物的載體。而單層大微脂粒是指粒徑大於1000 nm的單脂質雙層微脂粒，其可包覆較高比例的水相。以粒子型態來說，LUVs較MLVs均勻，在包覆上較SUVs多，且就脂質的使用較為經濟，是對於包覆親水性藥物，最具應用價值的微脂粒。

微脂粒在儲放的過程中可能發生多種不同的變化。如磷脂質會氧化以及水解而生成短鏈的磷脂，並在膜中形成具溶解性的衍生物；另外，微脂粒間可能發生凝聚、融合的物理現象，因而導致包覆物質的滲漏。因此，微脂粒產品若要開發上市，就必須在儲藏其間有良好的穩定性；在體內到達標靶區域前或發揮緩釋作用前，亦須保持一定的大小及安定性(平其能，現代藥劑學，第一版，北京：中國醫藥科技出版社；1998)。

通常為避免磷脂質氧化降解，可以使用新鮮萃取的磷脂質和新鮮蒸餾的溶劑，避免高溫，並再充氮或無氧的環境下製備，最後將微脂粒儲存於惰性環境中等措施來降低氧化程度。以中性磷脂質製備的微脂粒會產生聚集，主要是與凡德瓦力的互相作用有關，可藉由在脂雙層中加入少量負電荷磷脂質(如10% PA或PG)來克服。另外，Hollmann等人研究指出，使用從乳酸菌上取得的蛋白質，用來覆蓋於微脂粒上，能夠於膽鹽、胰液萃取物、pH值變化及熱衝擊的環境下維持安定性(Hollmann A.等人，Biochimica et Biophysica Acta (BBA)Biomembranes 1768(3)：393-400,2007)。由於油體蛋白(oleosin)有安定油體之功能，因此本發明嘗試於製備微脂粒時添加油體蛋白，以期能達到增加微脂粒安定性的功效。

本發明基於以上之目的發現，油體蛋白能夠運用在製備高穩定性之微脂粒，且從粒徑分析及表面電位分析中，油體蛋白能夠縮小微脂粒的粒徑，並增加其表面電荷。

於是，本發明之一方面係關於一種新型微脂粒，其特徵在於包含油體蛋白(oleosin)或其修飾型態及磷脂質。於本發明之具體態樣，所述之磷脂質係選自由雙油酸磷脂醯膽鹼(DOPC)、雙硬脂酸磷脂醯膽鹼(DSPC)及雙棕櫚酸磷脂醯膽鹼(DPPC)所組成之組群。於本發明之一些具體態樣，本發明之新型微脂粒進一步包含膽固醇。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之油體蛋白係得自天然植物油體。於本發明之一項具體實施態樣，所述之油體蛋白為芝麻油體蛋白。於本發明之具體實施態樣，所述之油體蛋白為基因重組表現的油體蛋白或修飾型態，可為其中央厭水區(central hydrophobic domain)經部分截短之重組油體蛋白。所述之其中央厭水區經部分截短之重組油體蛋白，其中央厭水區較佳地仍保留至少36個胺基酸殘基。

本發明之另一方面，係關於一種製備新型微脂粒的方法，其包含：提供一包含磷脂質之脂質溶液；提供一包含油體蛋白(oleosin)或其修飾型態之水性溶液；將該脂質溶液與該油體蛋白溶液混合；及製備得具有高安定性的新型微脂粒。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之新型微脂粒可利用該項技術領域習知用於製備微脂粒的方法製備成。可例舉之製備微脂粒的方法包括薄膜水合法(Thin-film hydration method)、超音波震盪法(Sonication method)、薄膜擠 壓法(Membrane extrusion method)、冷凍解凍法(Freeze and thaw method)、酒精注射法(Ethanol injection)、乙醚注射法(Ether injection)及逆向蒸發法(Reverse-phase evaporation method)等。

本發明之新型微脂粒可使用做為一種藥物載體，除了具備微脂粒的已知作用特性外，由於添加油體蛋白顯著增加微脂粒之安定性，減少微脂粒產生相互凝聚和融合的現象，因此更有利於應用在做為長效藥物的載體。

圖1為為中央疏水域部分或完全被截斷的油體蛋白(oleosin)示意圖。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

於下述本發明之實例，係使用磷脂質與膽固醇配製脂質溶液，再與油體蛋白及/或其修飾型態混合而製備微脂粒。膽固醇是組成生物膜的重要成分，它可用來添加於微脂粒中的磷脂質雙層中，主要的目的係在於改變脂雙層的熱力學性質，降低微脂粒脂雙層的流動性，減少包覆物洩漏，所以微脂粒在製備過程中加入適量的膽固醇作為雙層磷脂質的安定劑是必要的。

油體蛋白(Oleosin)本身的分子結構中，有三個結構區域：一個N末端雙親性區域(N-terminal amphipathic domain)、一個中央親油的油體錨固區域(a central hydrophobic oil-body anchoring domain)及一個C末端雙親α螺旋(C-terminal amphipathic α-helix domain)。已曾經嘗試將油體蛋白中間親油區域截短，而得到中央疏水區部分被截斷的油體蛋白(參見圖1所示)，並利用其製備安定的人造油體(Peng C.C.等人，J.Agric.Food Chem. 55 ：5604-5610,2007)。於下述本發明之實例， 所使用之油體蛋白，是由中興大學曾志正教授實驗室所提供。

包含油體蛋白之微脂粒的製備與粒徑及表面電位測量 薄膜水合/超音波震盪法

首先稱取20 mg 1,2-雙硬脂酸-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼(DSPC；Sigma)及5 mg膽固醇(CHOL；Sigma)溶解於5 ml無水酒精中，調配成脂質之酒精溶液。取5 ml如前述配置得之脂質酒精溶液放入一50 mL的圓底濃縮瓶中，再把該圓底瓶接到旋轉減壓濃縮機，在減壓濃縮的裝置下溫度控制在37℃，將溶劑完全抽乾，使其脂質於瓶壁上形成一層半透明的薄膜。取出濃縮瓶，加入9 ml的0.01 M磷酸鈉緩衝溶液(取磷酸1.69 ml和氫氧化鈉1 g溶於100 ml純水中)，以超音波洗淨機震盪，至薄膜完全脫離圓底瓶之瓶壁，即可得到多層微脂粒。

接著於該多層微脂粒溶液中加入1 mL含有750 μg油體蛋白或其修飾型式的0.01 M磷酸鈉緩衝溶液，並用均質機充分混合5分鐘。將該多層微脂粒混合溶液以超音波細胞粉碎機，在振幅30%、脈衝設定開10秒、關10秒下震盪15分鐘，即完成本發明新型微脂粒的製備。

酒精注射法

將20 mg 1,2-雙硬脂酸-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼(DSPC；Sigma)及5 mg膽固醇(CHOL；Sigma)溶解於2 mL無水酒精，調配成脂質之酒精溶液。取2 ml該脂質酒精溶液，利用注射針筒快速注入7 ml的0.01 M磷酸鈉緩衝溶液中。接著將1 mL含有750 μg油體蛋白或其修飾型式的0.01 M磷酸鈉緩衝溶液加入該溶液中，並用均質機均質混合5分鐘，即完成本發明新型微脂粒的製備。

粒徑分析

以Zetasizer Nano ZS粒徑分析儀分析微脂粒粒徑，此儀器可測粒徑範圍為3 nm~3000 nm，樣品濃度限制在 每次可測得5×104~1×106個粒子。分析樣品前，先將儀器熱機15分鐘，並設定所需之條件，將製備完成的微脂粒溶液，以純水稀釋後，置於透明比色槽中，並避免比色槽中有氣泡產生，將比色槽放入儀器內進行粒徑量測，每個樣品量測3次，將量測之結果求其平均粒徑及粒徑分佈(PI)。

表面電位測量

研究中以Zetasizer Nano ZS儀器來量測微脂粒的表面電位，其原理主要是藉由在電場下以正負電極來量測粒子的電泳速度。電場強度在已知的情況下，界面電位分佈可計算求得。分析樣品前，先設定所需的條件，測量前先將zeta cell依序以酒精及純水清洗數遍，並以高壓空氣將zeta cell槽內剩餘水分帶走，利用乾淨的注射針筒吸取製備好的微脂粒溶液約1 ml緩緩注入zeta cell中，同時避免氣泡存在zeta cell槽內，所有程序完成後即可進行量測，每個樣品量測10次後求其平均值，即完成表面電位之分析。

油體蛋白對微脂粒的影響

本實驗係將有或無利用油體蛋白製備得之微脂粒，做進一步粒徑和表面電位的分析，並且探討油體蛋白在薄膜水合/超音波震盪法及酒精注射法，安定這兩者不同方法所製備得之微脂粒的有效性。如前述製備方法中所述，薄膜水合/超音波震盪法係先以旋轉式減壓濃縮機，將已其中已溶有脂質的無水酒精抽乾，使脂質於瓶內形成薄膜，再使用超音波震盪完成微脂粒的製備。

由上表1之粒徑分析結果觀察到，添加油體蛋白製備得之微脂粒相較於未添加的微脂粒，能夠得到具有更小粒徑及更高表面電位的微脂粒，且添加油體蛋白製備得之微脂粒粒徑分佈較集中，故微脂粒間因電荷的大大提升，彼此排斥力大大增加而避免凝聚及合併，而安定微脂粒。

由上表2之粒徑和表面電位的結果顯示，添加油體蛋白製備得之微脂粒相較於未添加的微脂粒，能夠得到具有更小粒徑及更高表面電位的微脂粒，且添加油體蛋白製備得之微脂粒粒徑分佈較集中。故不論是薄膜水合/超音波震盪法或酒精注射法，油體蛋白皆有同樣的效果，尤其對於無添加油體蛋白之酒精注射法，其微脂粒粒徑本來就比薄膜水合/超音波震盪法較大，更能顯示出油體蛋白的效果。

pH值對酒精注射法微脂粒粒徑及表面電位的影響

將取製備完成之微脂粒200 μl，使用純水和pH 7.5磷酸鈉緩衝溶液800μl稀釋處理2小時後測量粒徑及表面電位，下表3。

結果顯示有添加油體蛋白的微脂粒分佈集中許多，表面電位也較高，平均粒徑小很多，故較安定。

離子濃度對對酒精注射法微脂粒的影響

取製備完成之微脂粒200 μl，使用純水和0.1M磷酸鈉緩衝溶液800μl稀釋處理2小時後測量粒徑及表面電位，下表4。

結果顯示有添加油體蛋白的微脂粒分佈集中許多，表面電位也較高，平均粒徑小很多，故較安定。

Claims (8)

1. 一種具有高安定性的微脂粒，其特徵在於包含油體蛋白(oleosin)或其修飾型態及一磷脂質，其中該油體蛋白修飾型態為其中央疏水區被部分截斷且仍保留至少36個胺基酸殘基的油體蛋白。
2. 根據申請專利範圍第1項之具有高安定性的微脂粒，其中該磷脂質係選自由雙油酸磷脂醯膽鹼(DOPC)、雙硬脂酸磷脂醯膽鹼(DSPC)及雙棕櫚酸磷脂醯膽鹼(DPPC)所組成之組群。
3. 根據申請專利範圍第1項之具有高安定性的微脂粒，其進一步包含膽固醇。
4. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之具有高安定性的微脂粒之方法，其包含：(a)提供一包含磷脂質之脂質溶液；(b)提供一包含油體蛋白(oleosin)或其修飾型態之水性溶液，其中該油體蛋白修飾型態為其中央疏水區被部分截斷且仍保留至少36個胺基酸殘基的油體蛋白；(c)將該脂質溶液與該油體蛋白溶液混合；及(d)製備得具有高安定性的新型微脂粒。
5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該脂質溶液進一步包含膽固醇。
6. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該方法包含以薄膜/超音波震盪法製備微脂粒。
7. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該方法包含以酒精注射法製備微脂粒。
8. 一種醫藥載劑，其包含根據申請專利範圍第1項之具有高安定性的微脂粒。