TWI494117B

TWI494117B - Extraction Method and Content of Cinnamon Water Extract for Inhibiting Tyrosinase The composition of the aqueous extract

Info

Publication number: TWI494117B
Application number: TW102139539A
Authority: TW
Original assignee: Derlin Biotech Corp
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2015-08-01
Also published as: TW201515656A

Description

用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法及含有該水萃物的組成物

本發明是有關於由肉桂之中萃取一種用於抑制酪胺酸酶(tyrosinase)的肉桂水萃物(water extract)的萃取方法，以及含有該水萃物的組成物。

黑色素(melanin)是以酪胺酸(L-tyrosine)為起始物，經由黑色素細胞(melanocyte)中的一系列酵素進行一系列的氧化合成反應所形成的一種生物色素，主要的生理功能是避免紫外線對於皮膚的傷害，當黑色素的生成過快無法即時代謝時，便會累積於皮膚之中使膚色變深或產生斑點，嚴重者還可能癌化而發生皮膚癌。

在黑色素的生合成路徑(melanogenesis)中，酪胺酸酶(tyrosinase)同時具有單酚氧化酶(monophenolase)與雙酚氧化酶(diphenolase)的活性，並分別以該二活性參與黑色素生合成路徑中初期的兩個反應，分別是：以單酚氧化酶活性將單酚類(monophenols)的受質(substrate)酪胺酸轉化為鄰位雙酚類(o-diphenols)的多巴(L-DOPA)，及，以雙酚氧化酶的活性氧化多巴，並產生多巴醌(o-dopaquinone)，多巴醌再由其他酵素進行一系列的氧化合成反應，最後生成深黑色素(pheomelanins)或是真黑色素(eumelanins)。(參考例如：S.-Y.Seo等人J.Agric.Food Chem.51(10)：2837-2853(2003))可以想見的是，酪胺酸酶的活性大體上決定了黑色素的生成與否，是相當關鍵的酵素。因此，目前醫學界、美容界所使用的美白或是淡化黑色素斑點的方式，多從抑制酪胺酸酶的活性，也就是阻斷黑色素形成的源頭著手。

目前已有數種酪胺酸酶抑制劑被應用為化妝品及藥品的成份，例如：熊果素(arbutin)、維生素C、傳明酸(tranexamic acid)、麴酸(kojic acid)、對苯二酚(hydroquinone)等，然而該等成份在使用上往往有其限制或疑慮，例如維生素C不僅容易氧化與光解，耐熱性也不高；麴酸非常地不穩定，易氧化變色且容易致敏；對苯二酚則是已證實具有細胞毒性，過量使用會導致細胞病變。

有鑑於此，以天然的植物作為原料，並從中獲得具有生物活性的複方成份來作為有效、穩定且安全的酪胺酸酶抑制劑，已儼然成為醫藥界與美容界開發相關醫美產品的重要方向。

於是，在第一個方面，本發明提供第一種自肉桂中萃取能用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法。

在第二個方面，本發明提供第二種自肉桂中萃取能用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法。

在第三個方面，本發明提供一種含有該第一種萃取方法所獲得的肉桂水萃物並能用於抑制酪胺酸酶的組成物。

在第四個方面，本發明提供一種含有該第二種萃取方法所獲得的肉桂水萃物並能用於抑制酪胺酸酶的組成物。

為了無疑義地了解本說明書之目的，需注意的是：術語“包含(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一相同的意義。

除非另外有所定義，在本說明書中所使用的所有技術性與科學術語均具有本發明所屬技藝領域的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本發明所屬技藝領域者能等效置換被描述於本說明書中的方法和材料，且同樣能夠用於實施本發明。當然，本發明絕不限定於說明書所描述的特定方法與材料。

植物來源的複方成份在臨床應用上較為安全，且不會產生非所欲的副作用，因而逐漸受到了廣泛的重視。為了由植物中獲得具有生物活性的複方成份作為酪胺酸酶抑制劑，發明人選用了肉桂作為材料，並以水萃取法來提取有效成份。

水萃取法所萃取的成份較不具有肉桂的刺鼻味道，故能提高使用者的接受度；此外，水萃取法相較於使用有機溶劑的油萃取法，能夠避免溶劑殘留問題，有機溶劑多為可能會影響人體健康的物質，因此，為了符合產品的安全使用規格，通常在完成萃取後，還要進行將有機溶劑殘留量減少至安全範圍的去除溶劑程序，不僅需要花費額外的成本開銷，且難以完全去除，殘留的溶劑容易造成對皮膚的刺激性甚至引起過敏或病變，因此以水萃取法所萃取的成份能夠更加安全地應用於醫藥品或是化妝品中。

肉桂為樟科(Lauraceae)、樟屬(Cinnamomum )的常綠喬木，原產於中國，分布於廣西、廣東、福建、雲南等濕熱地區，其中尤以廣西最多；台灣、越南、寮國、印度尼西亞、斯里蘭卡等地亦可見其蹤跡。

肉桂自古以來便被作為辛香料與傳統醫學的藥材使用，香氣濃郁，味辣甜，並具有驅風健胃、散寒止痛及活血通經等療效。肉桂的植物各部如樹皮、枝、葉、果、花梗都可提取精油，除用作香料、化妝品、日用品的香精之外，肉桂精油已被證實具有多種功效，如抑制真菌與多種革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的生長。

於是，本發明提供一種自肉桂中萃取能用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其包含下列步驟：(a)將一種屬於肉桂的新鮮植物材料洗淨後予以乾燥處理，以獲得一乾燥物料；(b)將得自步驟(a)的該乾燥物料進行碎化處理，以獲得一待萃物料；及(c)將得自步驟(b)的該待萃物料以水蒸氣蒸餾法持續蒸餾，以獲得一蒸發為氣相後冷凝的第一水萃物，及一未蒸發的剩餘料。

本發明所指之肉桂可以選自下列至少一種：玉桂(Cinnamomum cassia )、日本香桂(Cinnamomum japonicum )、西貢肉桂(Cinnamomum loureiro i)、陰香(Cinnamomum burmannii )、錫蘭肉桂(Cinnamomum verum )、台灣土肉桂(Cinnamomum osmophloeum )。

依據本發明，所使用的肉桂是台灣土肉桂。台灣土肉桂為台灣特有種，生長於中低海拔400~1,500m山區之天然闊葉樹林中，主要分布於中部埔里、蓮華池、日月潭、谷關、松鶴、佳保台與南部武威山、扇平、東部玉里及三民等地。

台灣土肉桂全株都能提取精油，為富藏於台灣的珍貴天然資源，尤其以葉片的精油提取率最高，介於0.7~1.3wt%，平均約1wt%。其中，精油內含量最高的物質為酚樹脂(phenolics)，其含量高達80%以上，酚樹脂當中又以反式肉桂醛(trans-cinnamaldehyde)為主要成份，酚樹脂中其餘含量較高的化合物還包含乙酸桂皮酯(cinnamyl acetate)、丁香酚(eugenol)及苯甲醛(benzaldehyde)等。

依據本發明，所使用的肉桂的植物材料是台灣土肉桂的葉片。在洗淨肉桂植材後去除葉梗，僅取餘下之葉片部位操作後續的乾燥處理。該乾燥處理包含但不限於曬乾、烘乾、凍乾、噴霧乾燥及真空乾燥。

依據本發明，該乾燥處理為以日光曝曬至乾燥後的乾燥產品的含水率達5~20wt%為止；更佳地，達含水率10~14wt%為止，且在過程當中避免溫度高於60℃，以免肉桂的有效成份遭到破壞；更佳地，將溫度控制在30° C~35℃。

依據本發明，該步驟(b)中，在該乾燥物料被碎化後，還進一步使用一篩網過篩以去除未碎化完全的葉片與粗大的葉脈，以獲得該待萃物料。藉此，可增進後續的蒸餾萃取效能。

依據本發明的一個實施例，該篩網的網目數規格(篩號)為ASTM 10 mesh，但實際上，只要是網目數規格大於等於ASTM 10 mesh的篩網，都能獲得良好的篩選效果。

依據本發明，該步驟(c)中，是以水蒸氣蒸餾法持續蒸餾直到蒸餾冷凝液呈澄清狀即停止收集。較佳地，進行水蒸氣蒸餾法的加熱時間為1~3小時；更佳地，進行水蒸氣蒸餾法的加熱時間為1~2小時。

於是，本發明還提供一種用於抑制酪胺酸酶的組成物，該組成物包含由上述的萃取方法所獲得的第一水萃物。

依據本發明，該第一水萃物包含反式肉桂醛；更佳地，還包含乙酸桂皮酯及苯甲醛。

該組成物可進一步包含一被廣泛地使用於化妝品製造技術領域的化妝品可接受的佐劑(cosmetically acceptable adjuvant)。該化妝品可接受的佐劑包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、填料(filler)、膠凝劑、增稠劑(thickening agent)、活性劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、介面活性劑、抗氧化劑、防腐劑、染色劑(coloring agent)、香料以及氣味吸收劑。上述佐劑的選用與組合是熟習此項技藝領域之人士的專業可達成之技術。

該組成物可進一步被應用於製造護膚保養(skincare)、化妝(makeup)、卸妝(makeup remover)、清潔(cleaning)或護髮(haircare)的產品，該產品的形式包括但不限於：粉末、水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)、油性溶液(oily solution)、水包油型溶液(oil-in-water type solution)、油包水型溶液(water-in-oil type solution)或複合型之噴霧、慕斯(mousse)、乳液(lotion)、凝膠、軟膏、乳霜、面膜、貼布(pack)或貼片等。上述產品形式的選用與組合是熟習此項技藝領域之人士的專業可達成之技術。

該組成物所應用之產品可進一步與一或多種選自於下列的已知活性的外用劑合併使用：殺菌劑(bactericides)、傷口治療劑(wound-healing agents)、止癢劑(antipruritics)、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、保濕劑、皮膚營養劑(skin nutrients)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、抗汗劑(antipsoriatics)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheics)、抗痘劑(anti-acne agents)、美白劑(whitening agents)、美黑劑(self-tanning agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗老化劑(antiager)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、植物萃取物(plant extracts)、皮質類固醇(corticosteroids)及激素(hormones)。上述外用劑的選用與組合是熟習此項技藝領域之人士的專業可達成之技術。

於是，本發明還提供另一種自肉桂中萃取能用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其包含下列步驟：(a)將一種屬於肉桂的新鮮植物材料洗淨後予以乾燥處理，以獲得一乾燥物料；(b)將得自步驟(a)的該乾燥物料進行碎化處理，以獲得一待萃物料；(c)將得自步驟(b)的該待萃物料以水蒸氣蒸餾法持續蒸餾，以獲得一蒸發為氣相後冷凝的第一水萃物，及一未蒸發的剩餘料；(d)將得自步驟(c)的剩餘料加水後，持續加熱煎煮進行熱水萃取法，以獲得一煎煮液；及(e)濾除該煎煮液中的渣滓，以獲得一第二水萃物。

依據本發明，步驟(a)至步驟(c)完全相同於前述的第一水萃物的萃取方法，於此不再贅述。

依據本發明，該剩餘料秤重之後每1kg的剩餘料加入10~20kg的水後加熱進行熱水萃取法；更佳地，每1kg的剩餘料加入16kg的水。

依據本發明，該熱水萃取法為使用煎煮鍋加蓋於85℃~100℃之下持續煎煮1~5小時；更佳地，於95℃煎煮2~3小時。

依據本發明，該萃取方法還包含一介於步驟(d) 與步驟(e)之間的步驟(x)，步驟(x)是對步驟(d)的煎煮液進行濃縮處理，以獲得一濃縮的煎煮液後，再於步驟(e)中進行濾除渣滓的處理。

依據本發明，該步驟(x)的濃縮處理為減壓濃縮法，且較佳是濃縮至步驟(x)中的該濃縮的煎煮液的含水率為60~90wt%為止；更佳地，濃縮至含水率為70~80wt%為止。

依據本發明，在該步驟(e)中，是使用一過濾元件濾除該濃縮的煎煮液中的渣滓，在本發明的一個實施例中，該過濾元件的網目數規格為ASTM 100 mesh，但實際上，只要該過濾元件的網目數規格大於等於ASTM 100 mesh，均能獲得良好的過濾效果。

於是，本發明還提供一種用於抑制酪胺酸酶的組成物，該組成物包含由上述的另一種萃取方法所獲得的第二水萃物。

依據本發明，該第二水萃物包含乙酸桂皮酯。

該組成物可進一步包含一被廣泛地使用於化妝品製造技術領域的化妝品可接受的佐劑，該佐劑的特性已於上文詳細說明，於此不再贅述。

該組成物可進一步被應用於製造護膚保養的產品，該產品的形式已於上文詳細說明，於此不再贅述。

該組成物所應用之產品可進一步與一或多種選自於下列的已知活性的外用劑合併使用，該外用劑的選擇已於上文詳細說明，於此不再贅述。

值得一提的是，上述組成物所添加的佐劑、外用劑與所應用之產品、產品形式的選用與組合均為熟習此項技藝領域之人士的專業可達成之技術。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的較佳實施例詳細說明中清楚地呈現，其中：圖1是該第一水萃物相較於已知美白功效成份在不同濃度之下對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性；圖2是該第一水萃物相較於已知美白功效成份在不同濃度之下對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性；圖3是該第二水萃物相較於已知美白功效成份在不同濃度之下對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性；圖4是該第二水萃物相較於已知美白功效成份在不同濃度之下對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性；圖5是該第一水萃物對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的Lineweaver-Burk雙倒數作圖；圖6是該第二水萃物對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的Lineweaver-Burk雙倒數作圖；圖7是肉桂成分標準品之HPLC層析圖譜；圖8是該第一水萃物經10倍稀釋後的HPLC層析圖譜；圖9是該第二水萃物經10倍稀釋後的HPLC層析圖譜；圖10是苯甲醛對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性；圖11是苯甲醛對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性；圖12是反式肉桂醛對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性；圖13是反式肉桂醛對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性；圖14是乙酸桂皮酯對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性；圖15是乙酸桂皮酯對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性；圖16是苯甲醛對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的Lineweaver-Burk雙倒數作圖；圖17是反式肉桂醛對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的Lineweaver-Burk雙倒數作圖；及圖18是乙酸桂皮酯對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的Lineweaver-Burk雙倒數作圖。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來作進一步說明，但應了解的是，該等實施例僅供例示說明用，不應限制本發明實施的樣態。

實驗材料

實施例1 製備台灣土肉桂葉片的第一水萃物

將新鮮的台灣土肉桂的植物材料切除葉梗部位後，餘下之葉片部位以日照在30℃~35℃曝曬，直到葉片以鹵素水份檢測儀(Mettler-Toledo,HB_43)測定含水率降為10%~14wt%後，以粉碎機將乾燥後的葉片粗碎，再以網目數規格為ASTM 10 mesh的篩網篩除未粉碎完全的葉片以及較粗大的葉脈部位後，以水蒸氣蒸餾過篩後的葉片粉末，同時收集蒸餾之冷凝液，持續1~2小時直到冷凝液呈澄清狀時停止收集，所獲得之冷凝液即為第一水萃物。

實施例2 製備台灣土肉桂葉片的第二水萃物

將新鮮的台灣土肉桂的植物材料切除葉梗部位後，餘下之葉片部位以日照在30℃~35℃曝曬，直到葉片以鹵素水份檢測儀測定含水率降為10%~14wt%後，以粉碎機將乾燥後的葉片粗碎，再以網目數規格為ASTM 10 mesh的篩網篩除未粉碎完全的葉片，以水蒸氣蒸餾過篩後的葉片粉末，持續1~2小時直到冷凝液呈澄清狀時停止蒸餾，並將蒸餾後未被蒸發的剩餘料秤重，每1kg的剩餘料加入16kg的水後，加蓋在95℃之下以煎煮鍋煎煮2~3小時進行熱水萃取，萃取完成之後以網目數規格為ASTM 100 mesh的篩網濾去渣滓，再將液體部分濃縮至以鹵素水份檢測儀測定水含量為70~80wt%，即獲得第二水萃物。

實驗方法

實施例3 檢驗第一、第二水萃物的主要組成份

由先前技術了解到，肉桂精油中的主要組成份包含：反式肉桂醛、乙酸桂皮酯、丁香酚及苯甲醛等，因此將反式肉桂醛(Nacalai tesque,KYOTO,Japan)、乙酸桂皮酯(Sigma,Louisiana,USA)、丁香酚(Wako,Osaka,Japan) 、苯甲醛(Sigma,Louisiana,USA)的標準品與實施例1、2所獲得的該第一、第二水萃物分別透過高效能液相層析儀(HPLC,Acme 9000,Young Lin,Korea)層析並製作層析圖譜。

實施例4 該第一、第二水萃物及其組成份對酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制能力測定

酪胺酸酶的抑制活性測定方法是參考Y.Kobayashi等人於Biosci.Biotechnol.Biochem.59 (9)：1745-1746(1995)當中所述的方法來進行，簡而言之，將市售的蘑菇酪胺酸酶(mushroom tyrosinase)(Sigma,Louisiana,USA)以酪胺酸(Sigma,Louisiana,U.S.A.)做為受質進行反應，藉由酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader,Sunrise,Tecan,Austria)測定反應後的溶液在475nm的吸光讀值(light absorption)，並測試加入系列稀釋後不同濃度的該第一、第二水萃物後，對於吸光讀值的影響，即對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性；在本試驗中，以已知的美白功效成分：熊果素(台灣艾比克股份有限公司)、傳明酸(台灣艾比克股份有限公司)與麴酸(Alfa Aesar,Lancaster,England)作為對照組，並比較該第一、第二水萃物與已知美白功效成分對於酪胺酸酶的抑制活性，實驗步驟如下：分別系列稀釋該第一、第二水萃物，取稀釋後不同濃度之第一、第二水萃物溶液40μL分別添加於96孔盤中，再加入40μL磷酸緩衝液(0.2M的磷酸氫鈉(Na₂ HPO₄ ) 24.4mL與濃度0.2M的磷酸二氫鈉(NaH₂ PO₄ )25.5mL，混合後加水至100mL，pH 6.8)，及10μL濃度0.25mg/mL的酪胺酸混合後，置於振盪槽中振盪10分鐘均勻混合，再加入10μL濃度為100U/mL的酪胺酸酶反應25分鐘後，以酵素免疫分析測讀儀檢測475nm之吸光讀值作為實驗組；以等體積的水取代酪胺酸酶的吸光讀值作為空白組(A0)；以等體積的磷酸鉀緩衝液取代該第一、第二水萃物做為控制組(Ab)；再分別以等體積的熊果素、傳明酸或麴酸等已知美白功效成份溶液取代該第一、第二水萃物，並測試其對酪胺酸酶的抑制活性做為對照組，其中，該等已知美白功效成份的濃度均為衛生署法定之化妝品的最高添加濃度，分別是：熊果素70mg/mL、傳明酸30mg/mL及麴酸20mg/mL。

將實驗組及對照組分別測得的吸光讀值(As)，以及上述的各讀值分別代入下列公式，以求得各組對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性(%)：

測試該第一、第二水萃物中的主要組成份對於酪胺酸酶之單酚氧化酶的抑制活性的方法大致與上述相同，依實施例3的HPLC分析結果(配合參照圖7至圖9)可知，該第一、第二水萃物中的主要組成份為：苯甲醛、反式肉桂醛與乙酸桂皮酯。另外以前述組成份(苯甲醛、反式肉桂醛與乙酸桂皮酯)的標準品分別取代該第一、第二水萃物操作上述程序，即能獲得當各組成份單獨存在時，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性。

實施例5 檢驗第一、第二水萃物及其組成份對酪胺酸酶的雙酚氧化酶活性的抑制能力

實驗步驟大致與實施例4相同，唯一不同之處在於，本試驗以多巴(Sigma,Louisiana,U.S.A.)取代酪胺酸作為酪胺酸酶的受質，以測定該第一、第二水萃物及其組成份(苯甲醛、反式肉桂醛與乙酸桂皮酯)之標準品對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性。

實施例6 以酵素動力學分析第一、第二水萃物及其組成份對於酪胺酸酶的抑制機制

實驗方法大致相同於實施例4，不同之處在於：配製不同濃度(I)的該第一、第二水萃物，及苯甲醛、反式肉桂醛與乙酸桂皮酯的標準品作為實驗組，並檢測其在不同濃度的受質多巴的存在下，對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性；以等體積的水(I=0)取代酪胺酸酶的吸光讀值作為對照組，並將結果數據利用Lineweaver-Burk雙倒數繪圖法，將反應速率的倒數()對受質濃度的倒數()作圖，分析該第一、第二水萃物及其組成份抑制酪胺酸酶的酵素動力學，其抑制形式的倒數方程式為：

(v 為反應速率(O.D.₄₇₅ /min)，Km 為米氏常數(Michaelis constant)，Vm 為最大反應速率，Ki 為酵素-抑制劑複合物(EI)之解離常數，I為抑制劑濃度(mg/mL)，S為基質濃度(mg/mL)，Ki '為酵素-基質-抑制劑複合物(ESI)之解離常數)

酵素-抑制劑複合物之解離常數(Ki )可由以下方程式計算而得：

(Slope 為Lineweaver-Burk雙倒數繪圖圖形斜率)

酵素-基質-抑制劑複合物之解離常數(Ki ')則由Lineweaver-Burk雙倒數繪圖之縱軸截距(axis intercept)經以下方程式計算所得：

由上述方法可以計算出該第一水萃物的各數值如表1所示：

由上述方法可以計算出該第二水萃物的各數值如表2所示：

由上述方法可以計算出苯甲醛的各數值如表3所示：

由上述方法可以計算出反式肉桂醛的各數值如表4所示：

由上述方法可以計算出乙酸桂皮酯的各數值如表5所示：

結果

圖1為不同濃度的該第一水萃物與已知美白功效成分對於酪胺酸酶之單酚氧化酶的抑制活性；圖2為不同濃度的該第一水萃物與已知美白功效成分對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶的抑制活性。任意二不同填色形式的組別代表該二組別之間的抑制活性有顯著差異(p<0.05)。平均值±SD(n=3)。

其中，已知美白功效成份中的麴酸對於酪胺酸酶的抑制活性上有最好的表現，不論是以酪胺酸為基質或是以多巴為基質，抑制活性皆達100%；熊果素對於酪胺酸酶的單酚氧化酶活性抑制活性也相當優秀，為99.4%，但對於雙酚氧化酶活性的抑制活性幾乎不存在，抑制活性僅有1.2%；相較之下，傳明酸的美白機制非為抑制酪胺酸酶的活性(參考K.Maeda等人於Journal of Health Science53 (4)：389-396(2007))，由結果也可以看出，其對酪胺酸酶之單酚氧化酶與對雙酚氧化酶活性的抑制活性均在50%以下。

圖1顯示該第一水萃物經系列稀釋之後濃度範圍介於3.55×10^-5 ~0.532mg/mL之間，當濃度介於3.55×10^-5 ~1.6×10^-2 mg/mL時，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性均小於50%；而當濃度大於等於5.32×10^-2 mg/mL時，對酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性顯著地提升，於最高濃度0.532mg/mL時，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性已高達88.8%。

與已知美白功效成分相比顯示，該第一水萃物於濃度0.532mg/mL時的抑制活性優於傳明酸的抑制活性(37.3%)，僅略低於濃度70mg/ml的熊果素的抑制活性(99.4%)與濃度20mg/ml的麴酸的抑制活性(100%)。

上述結果顯示該第一水萃物以遠低於熊果素與麴酸的濃度，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性，已相當接近高濃度的熊果素與麴酸所產生的效果，且其主要的抑制活性是針對於酪胺酸酶的單酚氧化酶活性，說明以本發明的方法所獲得的該第一水萃物確實具有應用於美白相關產品的有效性與實用性，再加上該第一水萃物完全是取自天然植材並以水萃取，更兼具使用上較安全的特性。

圖2顯示在抑制酪胺酸酶之雙酚氧化酶的活性上，該第一水萃物達最高濃度0.532mg/mL時抑制活性仍小於50%，但仍優於熊果素(70mg/mL)與傳明酸的抑制活性，據此已可說明本發明之第一水萃物在抑制黑色素的應用上，應可產生不輸給現有熟知的美白成分熊果素或傳明酸的抑制活性，雖然另一現有美白成分麴酸對酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性高達100%，但產生該抑制活性的麴酸濃度為20mg/mL，而該第一水萃物在濃度0.532mg/mL的條件上，即有接近50%的抑制活性。結合圖1與圖2的結果，更顯示由本發明的方法所獲得的該第一水萃物不但在對酪胺酸酶的單酚氧化酶與雙酚氧化酶活性的抑制活性上都表現顯著的效果，且在應用上還有不需擔心有機溶劑殘留與製程較環保的有益特性。

圖3為不同濃度的該第二水萃物與已知美白功效成分對於酪胺酸酶之單酚氧化酶的抑制活性；圖4為不同濃度的該第二水萃物與已知美白功效成分對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶的抑制活性。任意二不同填色形式的組別代表該二組別之間的抑制活性有顯著差異(p<0.05)。平均值±SD(n=3)。

圖3顯示該第二水萃物經系列稀釋之後濃度範圍介於2.61×10^-3 ~39.21mg/mL之間，當濃度上升時，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性也相對上升，具有劑量依賴效應。當濃度介於2.61×10^-3 ~7.84×10^-2 mg/mL時，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性均小於50%；而當濃度大於等於0.392mg/mL時，對酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性顯著提高，達最高濃度39.21mg/mL時，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶活性的抑制活性達100%，與麴酸有同樣良好的抑制活性。

由結果看來，在抑制酪胺酸酶之單酚氧化酶活性上，該第二水萃物在高濃度時能夠達到百分之百的抑制，但其實在低濃度(7.84mg/mL)時即有80%以上的抑制活性，顯示該第二水萃物具有與現有美白功效成份相比毫不遜色的效果，由天然植材萃取更具備使用上穩定溫和的特性，且無溶劑殘留的顧慮。

圖4顯示在抑制酪胺酸酶之雙酚氧化酶的活性上，在濃度介於2.61×10^-3 ~7.84×10^-1 mg/mL時，對於酪胺酸酶幾乎沒有抑制效果；但當濃度為3.92mg/mL時，對於酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性有顯著的提升；於濃度大於等於7.84mg/mL時，抑制活性已高達95%以上，顯示該第二水萃物於低濃度(7.84mg/mL)時，其表現便已與已知美白功效成份的麴酸無顯著差異，且更遠遠優於熊果素與傳明酸的表現。

結合圖3與圖4的結果，更顯示由本發明的方法所獲得的該第二水萃物不但在對酪胺酸酶的單酚氧化酶與雙酚氧化酶活性的抑制活性上都表現顯著的效果，且與市面上現有的美白功效成份相差無幾，在應用上還具有天然植材萃取的複方成分特有的穩定性與溫和性、不需擔心有機溶劑殘留與製程較環保的有益特性。

圖5與圖6分別藉由對酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的Lineweaver-Burk雙倒數作圖，來探討該第一、第二水萃物的抑制機制。

圖5參照表1可知該第一水萃物的三個不同濃度(I=0.000106、0.00106、0.0106mg/mL)所繪出的直線相交於第二象限，且當濃度(1)上升時，最大反應速率(Vm )隨之降低，且米氏常數(Km )隨之增加，顯示該第一水萃物對於酪胺酸酶的抑制機制為混合型抑制(mixed inhibition)；同理，圖6參照表2顯示，於該第二水萃物的濃度漸次提高(I=0.00784、0.0784、0.784mg/mL)的情況下，最大反應速率(Vm )隨之降低、米氏常數(Km )隨之增加，且所繪出的直線相交於第二象限，因此該第二水萃物對於酪胺酸酶的抑制機制同樣為混合型抑制。

圖7為肉桂成分標準品之HPLC層析圖譜，隨著時間推移依序出現的四個峰值(peak)分別為：苯甲醛、反式肉桂醛、丁香酚及乙酸桂皮酯。

圖8為該第一水萃物經10倍稀釋後的層析圖譜，比對峰值之後可推得該第一水萃物的組成份包含苯甲醛、反式肉桂醛與乙酸桂皮酯。

圖9為該第二水萃物經10倍稀釋後的層析圖譜，比對峰值之後可推得該第二水萃物中主要包含乙酸桂皮酯。

得到該第一、第二水萃物的主要組成份之後，分別檢驗在該等組成份(苯甲醛、反式肉桂醛及乙酸桂皮酯)單獨存在的情況下，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶、雙酚氧化酶活性的抑制活性。

圖10與圖11分別是苯甲醛單獨對酪胺酸酶之單酚氧化酶、雙酚氧化酶活性的抑制活性檢驗，圖16是苯甲醛對酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的Lineweaver-Burk雙倒數作圖。

由結果可知苯甲醛在不同濃度：0.008mg/mL、1.03mg/mL之下，對於酪胺酸酶的單酚氧化酶活性的抑制活性分別為0.4%與93.3%；對於雙酚氧化酶活性的抑制活性則為0.1%與57.4%，可見苯甲醛在極低濃度(0.008mg/mL)之下雖無明顯抑制效果，但在濃度僅有1.03mg/mL時，對於酪胺酸酶之單酚氧化酶、雙酚氧化酶活性均有明顯的抑制作用，且對於單酚氧化酶活性的抑制活性尤佳；此外，由圖16參照表3可看出，苯甲醛不同濃度所繪出之直線相交於橫軸(axis)，且當濃度(I)上升時，最大反應速率(Vm )隨之降低，米氏常數(Km )則不變，顯示苯甲醛對於酪胺酸酶的抑制機制為非競爭型抑制(non-competitive inhibition)。

圖12與圖13別是反式肉桂醛單獨對酪胺酸酶之單酚氧化酶、雙酚氧化酶活性的抑制活性檢驗，圖17是反式肉桂醛對酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的Lineweaver-Burk雙倒數作圖。

由結果可知反式肉桂醛在不同濃度：6.8mg/mL、31mg/mL之下，對於酪胺酸酶的單酚氧化酶活性的抑制活性分別為60.3%與66.6%；對於雙酚氧化酶活性的抑制活性則為82.6%與91.3%，可見反式肉桂醛在低濃度(6.8mg/mL)之下對於酪胺酸酶之單酚氧化酶、雙酚氧化酶活性即有明顯的抑制作用，且對於雙酚氧化酶活性的抑制活性尤佳，在濃度為31mg/mL其抑制活性已超過90%；此外，由圖17參照表4可看出，反式肉桂醛不同濃度所繪出之直線相交於第二象限，且當濃度(I)上升時，最大反應速率(Vm )隨之下降，米氏常數(Km )則隨之升高，顯示反式肉桂醛對於酪胺酸酶的抑制機制為混合型抑制。

圖14與圖15分別是乙酸桂皮酯單獨對酪胺酸酶之單酚氧化酶、雙酚氧化酶活性的抑制活性檢驗，圖18是乙酸桂皮酯對酪胺酸酶之雙酚氧化酶活性的抑制活性的 Lineweaver-Burk雙倒數作圖。

由結果可知，乙酸桂皮酯在不同濃度：0.025mg/mL、0.24mg/mL之下，對於酪胺酸酶的單酚氧化酶活性的抑制活性分別為86.8%與88.6%；對於雙酚氧化酶活性的抑制活性則為33.9%與43.4%，可見反式肉桂醛在極低濃度之下對於酪胺酸酶之單酚氧化酶、雙酚氧化酶活性即有明顯的抑制作用，且對於單酚氧化酶活性的抑制活性尤佳，在濃度僅有0.025mg/mL時即有將近90%的好表現；此外，由圖18參照表5可看出，乙酸桂皮酯不同濃度所繪出之直線相交於第二象限，且當濃度(I)上升時，最大反應速率(Vm )隨之下降，米氏常數(Km )則隨之升高，顯示乙酸桂皮酯對於酪胺酸酶的抑制機制為混合型抑制。

由上述結果可歸納出，反式肉桂醛與乙酸桂皮酯的抑制機制與該第一、第二水萃物同為混合型抑制，因此可推得該第一水萃物主要的抑制活性來自於反式肉桂醛與乙酸桂皮酯；該第二水萃物的主要抑制活性則來自於乙酸桂皮酯。有鑑於此，未來可選取反式肉桂醛與乙酸桂皮酯含量較高的肉桂種類作為萃取的材料來源，將有助於增進該第一、第二水萃物中對酪胺酸酶具有抑制作用之活性成分的含量，在應用上可產生更佳的效果。

綜上所述，本發明用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法流程簡單，且以水作為萃取方式能夠有效地避免油萃取法的溶劑殘留問題，不僅製程環保，且能夠節省掉去除殘留溶劑所需額外花費的工時與成本，在產品應用上，也不會有萃出刺激性或是致敏性等非活性成份物質的疑慮。

此外，藉由上述方法所萃取出的該第一、第二水萃物對於酪胺酸酶的確有顯著的抑制效果，且使用濃度較低時也有良好的表現，並不輸給現有被廣泛使用的美白功效成份，說明以本發明的方法所獲得的該第一、第二水萃物確實具有應用於美白相關產品的實用價值；且該第一、第二水萃物是取自天然植材、僅以水操作萃取所得的複方成分，有著較為穩定安全的特性，且過程中完全不添加任何化學藥劑，因此不存在於化學藥劑殘留的可能性，更兼具應用於醫美產品的安全性。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

Claims

一種用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，包含下列步驟：(a)將一種屬於肉桂的新鮮植物材料洗淨後予以乾燥處理，以獲得一乾燥物料；(b)將得自步驟(a)的該乾燥物料進行碎化處理，以獲得一待萃物料；及(c)將得自步驟(b)的該待萃物料以水蒸氣蒸餾法持續蒸餾，直到冷凝液呈澄清狀即停止收集，以獲得一蒸發為氣相後冷凝的第一水萃物，及一未蒸發的剩餘料。
如請求項1所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，該步驟(a)中的肉桂是選自以下的至少一者：玉桂、日本香桂、西貢肉桂、陰香、錫蘭肉桂、台灣土肉桂。
如請求項1所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，該步驟(a)中的肉桂的植物材料是台灣土肉桂的葉片。
如請求項1所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，該步驟(a)中的乾燥處理是在60℃以下乾燥至該乾燥物料的含水率為5~20wt%。
如請求項1所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，該步驟(b)中，在該乾燥物料被碎化後，還進一步使用一篩網過篩去除未碎化完全的葉片與粗大的葉脈，以獲得該待萃物料。
如請求項5所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，該步驟(b)中所使用的篩網的網目數規格大於等於ASTM 10 mesh。
一種用於抑制酪胺酸酶的組成物，該組成物包含由請求項1至請求項6中任一項請求項所述的萃取方法所製得的第一水萃物。
如請求項7所述的用於抑制酪胺酸酶的組成物，其中，該第一水萃物包含反式肉桂醛。
如請求項8所述的用於抑制酪胺酸酶的組成物，其中，該第一水萃物還包含乙酸桂皮酯及苯甲醛。
一種用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，包含如請求項1所述的(a)~(c)步驟之外，還包含下列步驟：(d)將得自步驟(c)的該剩餘料加水後，持續加熱煎煮進行熱水萃取法，以獲得一煎煮液；及(e)濾除該煎煮液中的渣滓，以獲得一第二水萃物。
如請求項10所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，該步驟(d)中每1kg的剩餘料加入10~20kg的水。
如請求項10所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，該步驟(d)的熱水萃取法在85℃~100°C之下持續煎煮1~5小時。
如請求項10所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，還包含一介於步驟(d)與步驟(e)之間的步驟(x)，步驟(x)是對步驟(d)的煎煮液進行濃縮處理，以獲得一濃縮的煎煮液後，再於步驟(e)中進行濾除渣滓的處理。
如請求項13所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，該步驟(x)中的該濃縮的煎煮液的含水率為60~90wt%。
如請求項10所述的用於抑制酪胺酸酶的肉桂水萃物的萃取方法，其中，在該步驟(e)中，是使用一過濾元件濾除該煎煮液中的渣滓，且所使用過濾元件的網目數規格大於等於ASTM 100 mesh。
一種用於抑制酪胺酸酶的組成物，該組成物包含由請求項10至請求項15中任一項請求項所述的萃取方法所製得的第二水萃物。
如請求項16所述的用於抑制酪胺酸酶的組成物，其中，該第二水萃物包含乙酸桂皮酯。