TWI488967B - 提高農桿菌轉殖植物效率之方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於自農桿菌單離HspL
基因及其功能性分析，及利用HspL
基因提高農桿菌感染植物細胞的效率之方法。
隨著全球人口之增加，地球暖化問題日益嚴重，可耕地面積之減少，大幅提昇植物資源的開發及利用，已成為現今各國當務之急。為了解決人類對於糧食作物之需求，傳統耗時之育種方法，已逐漸被快速且有效之分子育種方式所取代，其中又以基因改造技術為主。目前全球約有10%的農地種植基因改良作物(Genetic Modified Crops)或轉殖基因植物。全球之基改作物以大豆、棉花、油菜及玉米為主，佔全球基改作物總種植面積的90%以上，種植面積中以基改大豆為最大。植物生技產業及植物育種學家以基因轉殖方式，改造或增加農作物的性狀：如提高作物的抗蟲性、抗病性、增加產量、提升作物內含有的營養成分，增加抵抗除草劑，改變花形、花色、花香等。其中現有之120種基改作物中，以耐除草劑及抗蟲這二種性狀為主。另外在林業部分，則以發展抗蟲、降低木質素、或加速生長速度之樹種為主，將來可用於造紙業及發展生質酒精。現今作物基因轉殖技術的開發及應用，已成為植物生技產業，尤其是植物種苗產業發展之主流。
植物基因轉殖主要可分為三個階段：首先將一外來的基因送入植物細胞，其二是外來基因穩定地插入植物的基因組中，最後是能將此外來基因在新生的植物細胞中表現，並持續穩定地隨著子代遺傳下去。目前所使用之基因轉殖技術可大致分為二大類：使用載體媒介間接地將基因送入植物細胞中，主要利用農桿菌將雙偶型載體(binary vector)或病毒載體(viral vector)經感染過程送入植物細胞中表現；或是以非載體之方式以化學或物理性方法，將基因片段直接送入植物細胞中表現，主要以基因槍(particle bombardment)、電穿孔(electroporation)、微注射(microinjection)、PEG(polyethylene glycol)等方法。上述之眾多方法又以農桿菌感染植物細胞，為最常用、有效且成本最為低廉之方法。農桿菌(Agrobacterium tumefaciens
)存在土壤中，是一種伺機性植物病原菌，屬於格蘭氏陰性好氧菌。農桿菌在自然界中可感染約600種以上的植物種類，其中包含藻類、裸子植物、被子植物中的雙子葉植物以及少數單子葉植物(DeCleene與DeLey,Bot. Rev. 42,
389-466,1976)。但許多重要的經濟作物，屬於單子葉植物，無法有效地經由農桿菌轉殖以改良其性狀。農桿菌菌體內的Ti質體(腫瘤誘生質體Tumor inducing plasmid)上的一段轉移DNA(transferred DNA，T-DNA)，可藉由農桿菌自然感染的過程，而轉移並插入植物基因體中。故植物學家可利用農桿菌跨界轉移DNA之能力，將外源基因轉移至植物細胞中表現，可在短時間內培育出具有優良性狀或新的性狀之植物品種。
當植物受傷時，在其傷口處會分泌出一些化學物質，如醣類、酚類化合物和氨基酸，可吸引土壤農桿菌附著在植物傷口處。而傷口處所分泌出的酚類化合物，如乙醯丁香酮(acetosyringone，AS)，可誘導Ti質體上的vir
基因(virulence genes)大量表現並幫助農桿菌感染植物細胞(Citovsky等人,Cell Microbiol. 9,
9-20,2007;Gelvin,Annu. Rev. Phytopathol. 48,
45-68,2010)。農桿菌利用由VirA和VirG二蛋白質組成的二組成系統(two-component system)，接收植物釋放之訊號，並進一步活化VirG轉錄因子，使VirG能與vir
基因的啟動子(promotor)區域中的vir
box結合，促使其他vir
基因開始表現。其中VirD1及VirD2會將T-DNA從Ti質體上截切下，以產生單股T-DNA。此T-DNA會與VirD2結合在5’端，並帶領T-DNA經過由VirB1-11和VirD4蛋白質組成之第四型分泌系統(type IV secretion system，T4SS)，進入植物細胞。T4SS包含了一線狀構造的T線毛(T-pilus)及位於細胞膜上Vir蛋白質所組成的高分子量複合體，負責於感染植物細胞時轉移T-DNA及Vir蛋白質。T線毛主要是由VirB2、VirB5、VirB7三個蛋白質所組成(Cascales與Christie,Science 304
,1170-1173,2004;Christie等人,Annu Rev Microbiol 59
,451-485,2005;Tzfira與Citovsky,Springer Science+Business Media,LLC.,New York,NY,USA,2008)。T-DNA及Vir蛋白質進入植物細胞後，VirE2會與T-DNA結合，藉此保護單股的T-DNA不被降解；而且VirD2可與植物細胞中的其他蛋白質結合，如：細胞骨架蛋白質和importin α等蛋白質，幫助T-DNA進入植物細胞核。最後VirD2、VirE2及VirF則能利用植物細胞中蛋白質之降解系統，幫助包覆在T-DNA外之Vir蛋白質分解，使T-DNA裸露並嵌入植物的染色體中，並且其他的植物及Vir蛋白質會幫助T-DNA內所攜帶之基因開始表現(Gelvin,Annu. Rev. Phytopathol. 48
,45-68,2010)。
農桿菌中除了Vir蛋白質以外，也有位在染色體上之基因產物可幫助農桿菌感染植物細胞。農桿菌中的小熱休克蛋白質(small heat shock protein) HspL是一個典型的α-Hsp，可在胞外(in vitro
)實驗中防止檸檬酸合成酶的熱凝聚現象。此類型的小熱休克蛋白質通常用於保護因逆境而產生凝聚作用的蛋白質免於凝聚。農桿菌中的HspL經分析，會形成寡聚合體。HspL
基因會受植物傷口處釋放之酚類化合物AS所誘導，而大量表現(Lai等人,Proteomics 6
,4130-4136,2006)，且HspL
是基因的表現，會間接地受農桿菌中的VirB蛋白質影響，而非直接受VirG蛋白質之調控。當農桿菌中的HspL蛋白質功能喪失時，會進一步影響數個VirB蛋白質之穩定度，以及利用T4SS轉移DNA的效能和農桿菌致病之能力。進一步生化分析結果顯示，HspL主要位於農桿細胞的內膜上，且與VirB8蛋白質有直接的交互作用。此外，HspL亦為VirB8的伴護蛋白質(chaperone)，在胞外實驗中顯示其具有保護GST-VirB8重組蛋白質，防止其熱凝聚反應的功能。HspL的伴護VirB8蛋白質之能力，為其可能促進農桿菌第四型蛋白質分泌系統轉移DNA的效能及農桿菌致病的原因(Tsai等人,Microbiol. 155
,3270-3280,2009;Tsai等人,J. Biol. Chem. 285
,19757-19766,2010)。
經由以上所述可知，在植物生技產業中，常以農桿菌做為轉殖基因植物或獲得基因改良作物之主要方法，但目前為止仍有許多的重要經濟作物，並不能使用農桿菌轉殖技術有效地獲得基改作物，使得許多種苗公司或植物生技公司，在使用農桿菌轉殖技術改良作物品種時，不僅耗時且只能侷限在幾類的作物品種。因此，本發明之目的係在於提供一種直接提高農桿菌轉殖植物細胞效率的方法，其可應用於植物生技產業，以減短其獲得基改作物之產程並增加基改作物之種類。
因此為達上述目的，本發明之一方面係關於一種提高農桿菌轉殖植物效率之方法，該方法包括將HspL
基因大量表現至農桿菌中，使HspL
基因於該農桿菌中進行異位表現；以及將該其中HspL大量表現的農桿菌感染欲轉殖之植物。
於一項具體實施例，本發明之提高農桿菌轉殖植物效率之方法包含下列步驟：(a)製備大量表現HspL
基因之質體；(b)將所得之質體轉殖於農桿菌內，使得該農桿菌大量表現該載體所載之HspL
基因所轉譯的蛋白質；及(c)將該其中HspL大量表現的農桿菌感染欲轉殖之植物。
於另一項具體實施例，該HspL蛋白質包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
於其他具體實施例，該欲轉殖之植物為經濟作物。
本發明之另一方面係關於一種製備大量表現HspL
基因之質體的方法，其包含：(a)利用基因組DNA聚合酶鏈式反應(genomic DNA polymerase chain reaction)的方式，以SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之核苷酸序列作為引子，自農桿菌中選殖以得到HspL
的編碼區域片段，其中該HspL
的編碼區域具有SEQ ID NO:3之核苷酸序列；及(b)將該編碼區域片段選殖放入一適當載體，而獲得可經轉殖於農桿菌內，使得該農桿菌大量表現HspL蛋白質的質體。
於一項具體實施例，係將經單離的HspL
基因之片段嵌入於雙偶型載體pCAMBIA1305.2的Tac啟動子及終止子間。於另一項具體實施例，該大量表現HspL
基因之質體為質體pCAMBIA1305.2-HspL(寄存編號：94X1-1000729)。
本發明將以下述實施例配合參考圖示，進一步說明本發明之技術內容，然而所列之實施例僅作說明之用，而無意於限定本發明之所屬範圍。熟習該項技藝者，皆可根據本發明及實施例所述，在不背離本發明精神及範圍下，做修飾及變更，惟仍應涵蓋於本發明之範圍內。
本發明係使用屬於格蘭氏陰性的農桿菌(Agrobacterium tumefaciens
)。挑取單一菌落並劃菌於含有抗生素的523固態培養基。待長出單一菌落後，接種於含抗生素的523液態培養基，置於28℃震盪培養至OD600
約為0.8~1，再利用Gene mark tissue and genomic DNA purification kit萃取細菌中的基因組DNA(genomic DNA)。參考其使用手冊所述，取適量的菌液以12,000rpm的速度離心數分鐘後，去除上清液，並加入200微升的萃取液及加入20微升的蛋白質分解酶(proteinase K)溶液回溶沉澱物。置於56℃水浴槽中1至3小時，以打破細胞。接者以14,000rpm的速度離心10分鐘後，將上清液中混和加入200微升的binding溶液，混和均勻後置於70℃水浴槽中10分鐘，再加入200微升的酒精，混和均勻後將溶液吸取至spin column(置於1.5毫升離心管中)，再以12,000rpm離心一分鐘，再加入300微升的binding溶液清洗管柱。再加入700微升的washing溶液清洗管柱，在高速離心後重複加入同量的washing溶液清洗，之後利用離心2至5分鐘，去除管柱中多餘的酒精。接著加入100微升的65℃預熱的二次水，於室溫靜置回溶5分
鐘，將spin column移到新的1.5毫升離心管中，最後以12,000rpm的速度離心兩分鐘，即可獲得菌體內的基因組DNA。
取3微克的DNA於0.2毫升的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)試管內，再加入10微升的5倍Phusion HF反應緩衝液、4微升的dNTP(2.5 mM)、0.5微升(25μM)的HspL
基因引子對(5'-GTGGTACCATCGCCAGAATGGGATG-3',SEQ ID NO：1)與(5'-GAAAGCTTACTATTAGTTGACCTGA-3',SEQ ID NO：2)，及0.5微升的Phusion DNA聚合酶(2單位/μl)、和適量的無菌去離子水，使得總體積為50微升，混合均勻後，利用PxE Thermal Cycler進行聚合酶連鎖反應，其DNA生合成所用的程式為：98℃ 30秒後，以98℃ 10秒、56℃ 40秒、72℃ 30秒執行35次循環，最後以72℃作用5分鐘。以此方式獲得HspL
的基因序列。
首先將前述利用PCR獲得之HspL
基因片段利用限制酶Kpn
I及Hind
III截切後，將此片段黏合於pTrc200質體中Kpn
I及Hind
III限制酶切點上，成為質體pTrchspLstop。再利用限制酶Pvu
II及Hind
III，將此質體上包含HspL
的編碼區域片段(含有從起始密碼到終止密碼的DNA序列，其DNA序列如序列表所示)及tac啟動子區域剪切下來，再以Klenow酵素進行填入作用(fill-in)將此DNA片段二端補齊。
同時將雙偶型載體(binary vector)pCAMBIA1305.2以Sac
II限制酶截切後，再以Klenow酵素進行填入作用將此DNA片段二端補齊。並將上述含有tac啟動子區域及HspL
的編碼區域片段黏合放入載體pCAMBIA1305.2，即成為用以大量表現HspL
基因的質體pCAMBLA1305.2-HspL(寄存編號：94X1-1000729)。
將農桿菌GV3101品系培養於含有適當濃度抗生素之523固態培養基，於28℃培養2~3天。再挑取單一菌落，接種於含抗生素的523液態培養基中，在28℃培養，待農桿菌生長至OD600
約為0.8~1.0之間。接著取適量菌液於4℃以5,000 rpm離心10分鐘，再加入1毫升冰的無菌二次水回溶並清洗菌體，並重複清洗步驟4~6次。接著以1毫升的10%溶液再清洗菌體一次，並將菌液離心、去除上清液，再加入60微升的10%甘油(glycerol)回溶。
以每管40微升的量分裝農桿菌勝任細胞。再將40微升的農桿菌勝任細胞與1~3微升上述之質體pCAMBIA1305.2-HspL，混合均勻，再放入2公釐之電擊管中。利用電穿孔機器Gene Pulser II Electroporation System，將電擊條件設定為：電阻200 ohms、電流25 μF、電壓為2.5 kV，進行電穿孔轉型。電擊完成後，立刻加入1毫升冰的523液態培養基。混合均勻後，將菌液移至新的離心管後，置於28℃、震盪培養一小時，接著取適量菌液以無菌的玻璃珠均勻塗抹於含有適當抗生素的523固態培養基上，再置於28℃培養2~3天。
首先將由實施例3所獲得，含有質體pCAMBIA1305.2-HspL的農桿菌，培養在含有適當抗生素的523液態培養基中，培養在28℃中16小時以上，待農桿菌生長至OD600
約為0.8~1.0之間。吸取適當之菌液以12,000rpm離心五分鐘，去除上清液，再以適量的1倍的TE溶液將沉澱物回溶，使菌液之OD600
吸光值約等於10，接著加入適量的4倍的SSB溶液，使最終溶液濃度為1倍的SSB後，於99℃處理10分鐘。待打破細胞後，再以低溫4℃、12,000 rpm的速度離心10分鐘，將上清液吸取至新的離心管中，並進行蛋白質濃度測定。
利用牛血清蛋白質(Bovine serum albumin，BSA)濃度為10,000μg/μl與blank溶液混合，製備成含不同濃度的BSA標準溶液(2,000、1,500、1,000、750、500、250、125、25 μg/μl)。另外將3微升的待測樣品與22微升的blank溶液混合後，加入96孔盤中。同時將25微升的標準溶液依濃度高低加入盤中，之後在每個樣品中加入200微升的BCA溶液(BCA試劑A：BCA試劑B=50：1)，置於37℃中作用30分鐘後，在4℃冷卻5分鐘，最後利用Sunrise Absorbance Reader以波長570 nm的光進行吸光值的測定。將所獲得的讀值，對照標準液獲得蛋白質濃度後，再乘以稀釋倍數為8.33後再除以1,000，即可得知樣品中蛋白質真正的濃度(單位為μg/μl)。
接著準備適量之蛋白質萃取液進行蛋白質電泳分析(SDS-polyacrylamide gel[SDS-PAGE] analysis)，首先置備蛋白質電泳膠體利用Mini-Protein 3 Cell的電泳系統，並參照Mini-Protein 3 Cell的使用手冊進行鑄膠器之組合。首先以95%酒精清潔含spacer的玻璃(厚度為15公釐)和short玻璃後，利用鑄膠器組合，接著將下膠溶液緩慢的注入於二片玻璃間到一定的高度。再加入少許的95%酒精幫助壓平液面，約20分鐘之後，再倒掉酒精並以二次水稍作清洗。接著加入上膠溶液後，插入齒梳，待15~20分鐘膠體凝固後，將電泳膠從鑄膠台上取下稍作清洗，即可進行後續蛋白質的電泳分析。
將兩片電泳膠與Mini-Protein 3 Cell的電泳系統組裝完成後，在負極電泳槽加入負極電泳溶液，在正極電泳槽內加入正極電泳溶液。再將齒梳拔出後，分別將蛋白質標準液和15微克蛋白質樣品依序加入凹槽中，先施以定電壓50伏特25分鐘，接著再施以定電流75毫安培120分鐘，進行電泳分析。接著進行膠體轉漬，使用Mini-Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell轉漬系統，並以Protran Nitrocellulose為轉漬膜。首先照此系統使用手冊，依序將海綿、吸水濾紙，電泳膠、轉漬膜、吸水濾紙及海綿組裝，置於mini gel holder cassette，接著將此cassette放入轉漬槽中(電泳膠應置於負極側)。並倒入適量的轉漬溶液，再施以定電壓100伏特，電流350毫安培95分鐘。同時可將整個轉漬槽置於冰中，確保整個轉漬過程維持在低溫。轉漬結束後可先以Ponceau S染劑染色，確認轉漬的效果，再以大量清水清洗轉漬膜，至無染劑顏色為止。
再以針對辨認HspL蛋白質之抗體進行西方墨點法(Western blot assay)，偵測農桿菌中HspL蛋白質之累積量。首先配置1倍的TBST溶液含5%的脫脂奶粉。以此溶液在室溫下處理轉漬膜30分鐘，再用1倍的TBST溶液清洗兩次，每次5分鐘。再將3%脫脂奶粉的1倍的TBST溶液加入一抗的抗體，使用的一抗抗體為HspL抗體(稀釋倍數為1:10,000)。以此溶液處理轉漬膜在室溫作用一小時，再以1倍的TBST清洗三次，每次五分鐘。再加入適量含二次抗體山羊抗兔子IgG-HRP共軛抗體(Goat anti rabbit IgG-HRP conjugated antibody)的3%脫脂奶粉之1倍的TBST溶液，於室溫作用半小時，再以1倍的TBST溶液清洗四次(第一次15分鐘，其餘每次5分鐘)。最後加入適量的冷光偵測試劑(western lighting reagent，褐色瓶與白色瓶以1：1的比例於使用前混合而成)，稍微搖晃讓試劑均勻分佈於轉漬膜上。再將轉漬膜放入塑膠膜中，並用擦手紙去除多餘試劑與氣泡，以膠帶固定於壓片盒上、在暗房內利用X光片(Super RX)進行偵測訊號。利用顯影劑及定影劑呈像。
由圖1西方墨點分析之結果顯示，農桿菌中含有質體pCAMBIA1305.2-HspL者，可大量累積HspL蛋白質在菌體內。而控制組是農桿菌中只含有載體pCAMBIA1305.2，故未偵測到HspL蛋白質之累積。圖1係顯示在HspL大量表現的農桿菌株中，HspL蛋白質累積量皆較控制組為高。
使用HspL大量表現的農桿菌感染野生種阿拉伯芥(生態型：Ws及Petergof)的根部，進行農桿菌短暫表現T-DNA之性狀分析(transient transformation assays)，以測試其可被農桿菌轉殖後，在數天內可表現T-DNA的效率。因此菌種內含有質體pCAMBIA1305.2，其T-DNA區域內含有一glucuronidase報導基因(reporter gene)。故農桿菌感染植物細胞後，T-DNA不需嵌入植物的染色體內，即可於植物細胞核內產生mRNA，並進一步檢測在植物細胞中GUS蛋白質的表現量。
以長柄鑷子將約5周大的阿拉伯芥根部，用解剖刀切成約3~5 mm的片段，以濾紙吸去多餘的水分，再放置於MS固態培養基上，以待農桿菌感染。同時將農桿菌培養於20毫升含有適當抗生素的523液態培養基內，當細菌生長至OD600
=0.8-1.0時，取1毫升菌液以10,000 rpm於室溫離心2分鐘，並加入等量的0.9%氯化鈉清洗菌體兩次，隨後以0.9%的氯化鈉溶液將菌體回溶至OD600
=1。並將細菌以0.9%的氯化鈉稀釋至欲感染的濃度，進行感染，將跟段與細菌共培養在22-24℃植物生長箱中40至48小時。再用含有濃度100 μg/mL timentin的無菌二次水洗滌根段，以去除農桿菌。完成感染之根段，以濾紙吸去多餘水分後，移至含100μg/ml timentin的CIM固態培養基上，培養六天後，將根段分別放置於GUS蛋白質染劑(50 mM磷酸氫二鈉[Na2
HPO4
]；0.1%采酮X-100[Triton X-100]；1.5 mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸，pH 7.0)中，於37℃染色16小時。之後利用解剖顯微鏡計算多少根上有藍點產生，做為各個農桿菌短暫表現T-DNA之效率。
由圖2的黑色柱狀圖▅顯示，當使用107
個細胞/ml細菌濃度感染阿拉伯芥(生態型：Ws)植物根部時，Ws植物被控制組農桿菌(只含載體)感染後，短暫表現T-DNA的效率為32.1%。若同樣使用控制組農桿菌，但濃度為108
個細胞/ml感染Ws植物時，其短暫表現T-DNA的效率為28%。但若使用大量表現HspL蛋白質之農桿菌，分別以107
個細胞/ml和108
個細胞/ml細菌濃度感染Ws植物根部時，其短暫表現T-DNA的效率分別為41.4%及35.3%，如圖2的斜狀條紋柱狀圖所示。由此結果可知以大量表現HspL蛋白質之農桿菌感染Ws植物時，其感染效率比控制組增加了1.3倍。
另外，若以控制組農桿菌去感染阿拉伯芥野生種(生態型：petergof)植物根部時，分別以分別以107
cells/ml和 108
cells/ml細菌濃度感染時，其短暫表現T-DNA的效率分別為23.1%及15.4%，如圖2的格狀條紋柱狀圖所示。但以大量表現HspL蛋白質之農桿菌，分別以107
個細胞/ml和108
個細胞/ml細菌濃度感染petergof植物根部時，其短暫表現T-DNA的效率分別為32.5%及41.9%，如圖2的黑格狀條紋柱狀圖所示。
以上結果顯示以大量表現HspL蛋白質之農桿菌感染petergof植物時，其感染效率比控制組增加了1.4倍至2.7倍。表示根據本發明方法所製得之含有大量表現HspL蛋白質的農桿菌，在感染二種野生種阿拉伯芥植物後，使得植物細胞短暫表現T-DNA的效率有明顯地增加，顯示本發明之方法確實可提升農桿菌轉殖植物細胞的效率。
由所舉較佳的實施例可得知，依據本發明所選殖得之農桿菌HspL
基因，的確具有提高農桿菌轉殖植物細胞效率之功能。本發明能夠普遍應用於植物生物科技產業，藉此可提高獲得基因改良作物或轉殖植物之效率，極具有產業利用價值。
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圖1為一墨點分析之結果，顯示HspL大量表現的農桿菌(HspL OE)內HspL蛋白質累積量增加。
圖2為一柱狀圖，顯示HspL大量表現的農桿菌感染植物後短暫表現T-DNA的效率。圖中的黑色柱狀圖代表生態型Ws的阿拉伯芥植物根部，被控制組農桿菌感染後短暫表現T-DNA的效率；斜狀條紋柱狀圖代表生態型Ws的阿拉伯芥植物根部，被大量表現HspL蛋白質之農桿菌感染後短暫表現T-DNA的效率；格狀柱狀 代表生態型petergof的阿拉伯芥植物根部，被控制組農桿菌感染後短暫表現T-DNA的效率；而黑格狀條紋圖則代表生態型petergof的阿拉伯芥植物根部，被大量表現HspL蛋白質之農桿菌感染後短暫表現T-DNA的效率。
Claims (7)
- 一種提高農桿菌轉殖植物效率之方法，該方法包含下列步驟：(a)製備大量表現HspL 基因之質體，其中該HspL 基因係編碼具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的蛋白質；(b)將所得之質體轉殖於農桿菌內，使得該農桿菌大量表現該載體所載之HspL 基因所轉譯的蛋白質；及(c)將該其中HspL大量表現的農桿菌感染欲轉殖之植物。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該欲轉殖之植物為可受農桿菌感染的雙子葉植物或單子葉植物。
- 一種製備大量表現HspL 基因之質體的方法，其包含：(a)利用基因組DNA聚合酶鏈式反應(genomic DNA polymerase chain reaction)的方式，以SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之核苷酸序列作為引子，自農桿菌單離得到HspL 基因編碼區域片段，其中該HspL 基因編碼區域具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列；及(b)將該編碼區域片段選殖放入一適當載體，而獲得可經轉殖於農桿菌內，使得該農桿菌大量表現HspL蛋白 質的質體。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該經單離的HspL 基因片段係嵌入於雙偶型載體pCAMBIA1305.2的Tac啟動子及終止子之間。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該大量表現HspL 基因之質體為質體pCAMBIA1305.2-HspL(寄存編號：94X1-1000729)。
- 一種由如申請專利範圍第3項所述之方法所製備得之大量表現HspL 基因之質體。
- 一種包含有如申請專利範圍第6項所述之之質體的農桿菌，其大量表現HspL蛋白質。
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| Yun-Long Tsai, Yin-Ru Chiang, Franz Narberhaus, Christian Baron, and Erh-Min Lai， "The Small Heat-shock Protein HspL Is a VirB8 Chaperone Promoting Type IV Secretion-mediated DNA Transfer"，The Journal of Biological Chemistry，2010，Vol.285，page 19757~19766 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201307554A (zh) | 2013-02-16 |
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