TWI487711B - 一種鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法及其製品 - Google Patents

Description

一種鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法及其製品

本發明提供一種鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法及一種用於生醫材料或化妝品之製品。

鮪魚是全球主要的撈捕魚種，鮪魚魚種包括括正鰹、黃鰭鮪、大目鮪、長鰭鮪以及黑鮪；上述魚種均為數百萬貧窮人民的重要糧食，也是世界高級生魚片市場的重心。然而，在生產食用鮪魚罐頭或生魚片的過程中，常會產生大量的廢棄物，這些廢棄物大多為魚鱗、魚皮或魚鰾等結締組織，廢棄除了會造成異味或蒼蠅滋生外，也會造成環保問題。

膠原蛋白(collagen)為普遍存在於動物組織中的蛋白質，分佈於結締組織，約佔脊椎動物總蛋白質的30%。其結構主要特色為由三條胜肽鏈組成三股螺旋(triple helix)之構形，Prockop and Kivirikko(Annu. Rev. Biochem. 64: 403-434；1995)將膠原蛋白依結構、胜肽鏈組成或基因座位置區分為19種類型(type)。但僅有部分膠原蛋白的生理功能被充分瞭解(Deyl and Miksik,J. Chromatogr. B. 739: 3-31；2000)，目前於生物醫學研究上仍以第一型、第二型及第三型膠原蛋白最為廣泛利用。膠原蛋白為高價值之生物高分子(biopolymer)，由於其具高度生物相容性(biocompatibity)低度免疫性(immunogenictiy)且與細胞間有近幾年其在生物醫學領域的應用逐漸受到重視，特別是與吸引細胞遷移、促進細胞增生與組織修補等特性，相信若能自低單價的鮪魚結締組織中萃取膠原蛋白，能促進產業升級並提高業者之經濟收益。

本發明係一種鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法。鮪魚皮自魚產公司採集後，將鮪魚結締組織去除肌肉與脂肪，並以機械粉碎增加表面積。並將處理後的鮪魚組織進行下列步驟：

(a)　取前處理的鮪魚組織；

(b)　將磷酸鹽溶液與鮪魚組織共均質後，產生一均質物，並利用攪拌機攪拌；

(c)　加入鹼性溶液或鹼金屬氫氧化物並浸泡該均質物；

(d)　加入醇類溶液攪拌；及

(e)　加入有機酸溶液及酵素後，獲得一膠原蛋白溶液。

本發明進一步將該膠原蛋白溶液經由一活性碳過濾裝置去除異味，使該膠原蛋白溶液不會因異味而限制應用領域。

本發明萃取鮪魚組織之膠原蛋白之步驟(b)所使用的磷酸鹽濃度為0.01~1%，當磷酸鹽加入後，其攪拌時間為4~48小時。在步驟(c)所使用的鹼性溶液或鹼金屬氫氧化物包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈣或其組合物，本發明較佳具體實施例係使用氫氧化鈉，其濃度為0.01~0.60N(當量濃度)及浸泡並攪拌4~48小時。在步驟(d)中，所使用的醇類溶液包含乙醇、甲醇、正丙醇、乙醇、山梨糖醇、乙二醇、甘油醇或其組合物，本發明較佳具體實施例係使用乙醇，其濃度為10~50%及攪拌時間為4~48小時。在步驟(e)中所使用的有機酸包含鹽酸、磷酸、乳酸、醋酸、檸檬酸或其組合，其濃度為0.5~10.0%，此外，本發明所使用的酵素包含酵素胰蛋白酶、胃蛋白酶或無花果酵素或其組合，其中該酵素濃度為0.05～10%。

本發明所萃取的膠原蛋白溶液可經由冷凍乾燥處理獲得膠原蛋白粉末。本發明進一步提供一種用於生醫材料、機能性食品或化妝品之製品，其包含上述方法所萃取鮪魚膠原蛋白溶液。其中該鮪魚膠原蛋白溶液應用於膠原蛋白溶液、膠原蛋白粉末、可注射軟組織填補劑(soft tissue augmentation)、膠原蛋白薄膜、膠原蛋白膠體、止血劑(haemostatic agent)、創傷敷料(wound dressing)、細胞培養之基質(matrix)、組織接著劑(tissue adhesive)、膠囊或藥物傳遞系統(drug delivery system)。

另一方面，本發明所萃取的鮪魚膠原蛋白溶液或粉末可呈水溶液、乳液、面膜、乳霜、凝膠、香膏、軟膏藥膏、或上述形式之組合用於外服接受之類型。更進一步可做為膳食補充劑、食品、乳品、飲料或上述形式之組合。

承上所述，本發明主要特徵是萃取鮪魚所含的膠原蛋白之方法及其製品，該方法可有效利用其所產生的廢棄物及解決環保問題。

實施例1：鮪魚結締組織前處理方法

鮪魚皮自魚產公司採集後，以碎冰包裹進行保存，以自來水沖洗後，利用刀片將可見脂肪與肌肉組織切除，並以細切機將其切為2mm寬之條狀物，冷凍保存留待進一步製備膠原蛋白之用。

實施例2：鮪魚組織的化學組成分析

將實施例1所獲得的鮪魚結締組織參考美國官方分析化學學會AOAC(1995)之分析方法進行水份、粗蛋白、粗脂肪及灰份分析，所得之結果如表一。

實施例3：萃取膠原蛋白之方法

1.取經前處理鮪魚皮組織

2.使用20倍重量容積比(鮪魚皮/溶液=W/V)之0.5%磷酸鹽溶液與鮪魚皮組織共同高速均質2分鐘後並以攪拌機攪拌24小時後離心達固液分離效果。

3.取步驟2之沈澱物，使用20倍重量容積比(鮪魚皮/溶液=W/V)之0.5N氫氧化鈉溶液與鮪魚皮組織共同均質2分鐘，並於室溫下浸泡24小時使鮪魚皮組織膨潤並去除非膠原蛋白蛋白質離心達固液分離效果。

4.取步驟3之沈澱物，使用20倍重量容積比(鮪魚皮/溶液=W/V)之50%乙醇溶液共同均質，並於室溫攪拌24小時，以移除脂肪。

5.取步驟4之沈澱物，使用20倍重量容積比(鮪魚皮/溶液=W/V)之10%有機酸溶液及8.0%胰蛋白酶、胃蛋白酶或無花果酵素，獲得膠原蛋白溶液。

實施例4、鮪魚膠原蛋白溶液之除臭處理

由於鮪魚皮處理不易，加上其中含不飽和脂肪酸極易引起自氧化效應，氧化產物常會造成異味而限制了膠原蛋白的應用領域，本發明使用一種活性炭過濾裝置，藉由活性炭吸附小分子過氧化物或脂肪酸之能力，來降低膠原蛋白的異味成分，步驟如下：

1.使用直徑60mm，長度為80mm之壓克力管柱，並填充活性炭，活性炭為椰殼製得，粒徑為8~30mesh，具有機械強度高，比表面積大及孔隙容積高等特點。本發明將活性炭充填至管柱95%高度。

2.將膠原蛋白溶液置於進樣管(Feed tubing)，並將進樣幫浦調整至20rpm。

3.目測膠原蛋白溶液開始進樣，此時通過管柱之物質會被分配為通透物(Permeate)與滯留物(Retentate)兩條管路。

4.將滯留物管路與進樣管置於同一樣品槽，以達濃縮試樣之效果。

5.小分子過氧化物或脂肪酸會透過通透物管線流出，藉反覆操作可達除臭之效果。

實施例5、鮪魚膠原蛋白溶液之滅菌處理與粉末產製

將實施例3所得之膠原蛋白溶液以0.22μm之超過濾膜實施過濾滅菌。以抽氣幫浦作為驅動力來源過濾膠原蛋白溶液。經超過濾滅菌之溶液可再經冷凍乾燥處理，所得之產物即為膠原蛋白粉末。

實施例6、膠原蛋白溶液之純度分析

參考Lin and Kuan法(Food Chemistry：119(3)1271-1277；2010)，並分析樣品中的4-羥脯胺酸之濃度並推算膠原蛋白之含量。

1.將20μL之經水解之試樣分別注入微量盤之樣品皿。

2.以微量分注器取30μL濃度3.0至5.5N之氫氧化鈉溶液加入微量盤之各樣品皿。

3.於各樣品皿加入450μL Chloroamine T試劑，並靜置於室溫，氧化25分鐘。

4.於各樣品皿中加入500μL含二甲基胺苯之呈色試劑。

5.將微量盤置於乾浴器(dry bath incubator)或乾燥烘箱中以65℃加熱40分鐘。

6.依序於室溫→4℃→室溫下分別冷卻10、15與20分鐘。

7.以ELISA reader於波長550nm測定吸光值並以EXCEL或SigmaPlot等軟體繪製標準區線並計算迴歸係數與迴歸式。

8.將所測得之吸光值套入迴歸式中，即可求得4-羥脯胺酸濃度並進一步計算試樣中膠原蛋白之含量。

9.本發明所獲得之膠原蛋白溶液之膠原蛋白濃度達5.94mg/mL，推回容積1030mL，以每次製程使用100g鮪魚結締組織(濕重)，每次可得6.117g純膠原蛋白。

實施例7、以鮪魚膠原蛋白產製含膠原蛋白之化妝品

以鮪魚膠原蛋白可產製O/W中性乳霜及膠原蛋白凝膠等化妝品。O/W中性乳霜油相約30~50%左右，不致有過於油膩之感受，可添加膠原蛋白於配方中，具有修復表皮及促進肌膚緊緻之效果，將本發明所得之鮪魚膠原蛋白應用於中性乳霜之配方如表三，將鮪魚膠原蛋白懸浮於純水中，並以乳化機均質10分鐘，並在高速狀態下緩慢加入油相之成分，待乳化完成後，即可得含膠原蛋白之乳霜，該乳霜可在室溫下保存6個月。

本發明所得之膠原蛋白進一步可用於產製膠原蛋白凝膠，該凝膠不僅可補充水分、保濕並可促進肌膚緊緻之效果，該凝膠之配方表四。

實施例8、製成含鮪魚膠原蛋白之膳食補充品

由於膠原蛋白可做為一種膳食補充品並應用於健康食品產業，將膠原蛋白混合特定益生物質如玻尿酸、維生素A、維生素B₃ 維生素B₃ 及維生素B₅ (泛酸鈣)等混合並溶解於賦形劑中混合均勻，覆形劑經過混合、造粒、烘乾、經打錠機打錠成型，所使用之配方表五：

一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中一種鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法及其用途乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。

本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。說明書中提及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同 的改變。

因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

10‧‧‧本發明之萃取膠原蛋白流程圖

101‧‧‧鮪魚前處理

102‧‧‧磷酸鹽溶液處理

103‧‧‧鹼性溶液或鹼金屬氫氧化物溶液處理

104‧‧‧醇類溶液處理

105‧‧‧以檸檬酸溶液/酵素進行

106‧‧‧獲得膠原蛋白溶液

圖1為萃取鮪魚組織膠原蛋白溶液之流程圖。

10．．．本發明之萃取膠原蛋白流程圖

101．．．鮪魚前處理

102．．．磷酸鹽溶液處理

103．．．鹼性溶液或鹼金屬氫氧化物溶液處理

104．．．醇類溶液處理

105．．．以酸溶液/酵素進行

106．．．獲得膠原蛋白溶液

Claims (8)

1. 一種鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法，包含以下步驟：(a)取前處理的鮪魚組織；(b)將磷酸鹽溶液與鮪魚組織共均質後，產生一均質物，並利用攪拌機攪拌；(c)加入鹼性溶液或鹼金屬氫氧化物並浸泡該均質物；(d)加入醇類溶液攪拌；及(e)加入有機酸溶液及酵素後，獲得一膠原蛋白溶液；其中該酵素包含酵素胰蛋白酶、胃蛋白酶或無花果酵素或其組合，且該酵素濃度為0.05~10%；(f)該膠原蛋白溶液進一步經由一活性碳過濾裝置去除異味，其中藉由活性碳過濾裝置之滯留物管路與進樣管係置於同一樣品槽，以達到濃縮膠原蛋白溶液之效果。
2. 如申請專利範圍第1項所述之鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法，其中該磷酸鹽濃度為0.01~1%及攪拌時間為4~48小時。
3. 如申請專利範圍第1項所述之鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法，其中該鹼性溶液或鹼金屬氫氧化物包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈣或其組合物。
4. 如申請專利範圍第3項所述之鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法，該鹼金屬氫氧化物濃度為0.01~0.60當量濃度及浸泡並攪拌時間為4~48小時。
5. 如申請專利範圍第1項所述之鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法，其中該醇類溶液濃度為10~50%，使用之醇類溶液包括甲醇、正丙醇、乙醇、山梨糖醇、 乙二醇、甘油醇或其組合物及攪拌時間為4~48小時。
6. 如申請專利範圍第1項所述之鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法，其中該有機酸包含鹽酸、磷酸、乳酸、醋酸、檸檬酸或其組合。
7. 如申請專利範圍第1項所述之鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法，其中該有機酸濃度為0.5~10.0%。
8. 如申請專利範圍第1項所述之鮪魚膠原蛋白溶液之萃取方法，其中該膠原蛋白溶液經冷凍乾燥處理獲得一膠原蛋白粉末。