TWI465259B - 使用萃取自黃荊葉的精油來抑制黑色素生成 - Google Patents

Description

使用萃取自黃荊葉的精油來抑制黑色素生成

本發明是有關於使用一萃取自黃荊葉的精油(essential oil extracted fromVitex negundo Linn leaves)來抑制黑色素生成(melanogenesis)。

黑色素(melanin)是一種由皮膚黑色素細胞(dermal melanocyte)所產生的色素(pigment)，它會影響動物與人類的膚色(skin color)。當皮膚受到紫外線[特別是紫外線-B(UV-B)]的照射後會促使黑色素細胞進行黑色素合成(melanin synthesis)[亦即，黑色素生成(melanogenesis)]，藉此可保護皮膚的下皮層(hypodermis)免於紫外線所造成的光損害(photodamage)。然而，當大量的黑色素被累積於皮膚上時可能會導致皮膚疾病(skin disorders)，諸如雀斑(lentigines)、斑點(freckle)、黑皮病(melasma)、老人斑(age spots)以及色素過多(hyperpigmentation)等。

為了達到皮膚美白(skin whitening)的目的，大多數人會藉由使用一些黑色素合成抑制劑(melanin synthesis inhibitors)來淡化或去除累積於皮膚上的黑色素或是黑斑。目前已知的黑色素合成抑制劑大多是經由下列的作用機制來調節黑色素的生成：(1)在黑色素生成之前：例如抑制酪胺酸(tyrosinase)的轉錄[諸如C₂ -神經醯胺(C₂ -ceramide)以及維生素A酸(tretinoin)]以及醣化(glycosylation)[諸如泛硫醇磺酸鈣 (calcium D-pantetheine-S-sulfonate,PaSSO₃ Ca)]；(2)在黑色素生成的期間：例如抑制酪胺酸的活性[諸如對苯二酚(hydroquinone)、熊果苷(arbutin)以及麴酸(kojic acid)]；以及(3)在黑色素生成之後：例如促進黑色素分解[諸如亞麻油酸(linoleic acid)]、抑制黑色素體運輸(melanosome transfer)[諸如菸鹼醯胺(Niacinamide)以及絲胺酸蛋白抑制劑(serine protease inhibitor)]以及加速皮膚更新(turnover)[諸如甘草甙(liquiritin)以及乙醇酸(glycolic acid)]。

近年來，人類對於皮膚美白與保養的需求與日俱增，然而目前所使用的黑色素合成抑制劑在淡化或去除黑色素上的效果仍不盡理想。因此，醫藥界以及化妝品工業的研究人員嘗試從傳統中藥(traditional Chinese medicines,TCM)中來尋找安全並且具有抑制黑色素生成之效用的活性組分(active components)以供廣大的醫學美容市場之所需。

黃荊(拉丁學名：Vitex negundo Linn；英文俗名：five-leaved chaste tree；漢語拼音：Huang jing；中文別名：蚊煙柴、埔姜以及布荊等)是一種馬鞭草科(Verbenaceae )牡荊屬(Vitex )的大型芳香灌木(aromatic shrub)；葉子呈掌狀，具有5枚披針形小葉(lanceolate leaflet)，少數具有3枚，葉邊緣有鋸齒；花頂生，花序排成圓錐花序(panicle)，花萼呈鐘狀，花冠為淡紫色；果實是一多肉質的核果(succulent drupe)。產區主要分佈於印度、東非、菲律賓島、馬來西亞以及台灣等國家。

依據傳統中藥典籍“本草綱目”的記載，黃荊具有除風熱、開經絡、導痰涎、行血氣以及解熱痢等功效。此外，黃荊亦被證實具有治療風濕性痛(rheumatic pain)、慢性支氣管炎(chronic bronchitis)以及減緩關節的腫脹(swellings of the joints)等效用。有研究發現，黃荊的各種植物部位(包括根、莖、葉、花、果實與種子等)皆具有保健或治療之功能，因而可被廣泛地應用於傳統民俗療法(folk therapy)中(A.S.Vishwanathanet al .(2010),European Journal of Biological Sciences ,3：30-42)。此外，有研究指出，黃荊的葉子具有顯著的抗發炎、抗痙攣(anticonvulsant)以及止痛(analgesic)的活性，而這些活性可能是因為黃荊的葉子含有大量的多酚化合物(polyphenolic compound)、類萜(terpenoids)、糖苷環戊并吡喃萜類化合物(glycosidic iridoids)以及生物鹼(alkaloids)所造成的(M.G.Dharmasiriet al .(2003),Journal of Ethnopharmacology ,87：199-206；R.K.Gupta and V.R.Tandon(2005),Indian Journal of Physiology and Pharmacology ,49：163-170；V.R.Tandon and R.K.Gupta(2005),Indian Journal of Physiology and Pharmacology ,49：199-205；V.R.Tandonet al .(2008),Fitoterapia ,79：533-538)。

目前已有文獻報導，黃荊葉的精油(essential oil ofVitex negundo Linn leaf)具有抗氧化與抗微生物等的效用。例如，在Pradeep Singhet al .(2010),International Journal of ChemTech Research ,2：1686-1690中，Pradeep Singh等人藉 由使用Clevenger-類型裝置(Clevenger-type apparatus)的水蒸餾(hydrodistillation)而從新鮮的黃荊葉中萃取出精油，由此所得到的黃荊葉的精油藉由氣相層析-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)來鑑定化學成分並且利用瓊脂井化擴散生物分析(agar well diffusion bioassay)來進行抗微生物分析(antimicrobial assay)。實驗結果發現，在該黃荊葉的精油所含有的揮發性組分(volatile constituents)當中，以倍半萜(sesquiterpene)的含量最多(47.14%)，其次為單萜(monoterpene)(45.50%)以及脂肪酸(fatty acid)(7.36%)。而該黃荊葉的精油被證實對於多種臨床上的致病性微生物具有顯著的抗微生物活性(antimicrobial activity)，因而可以被使用作為一種抗菌劑(antimicrobial agent)。

在K.S.Nagarsekaret al .(2010),Indian J .Pharm .Sci .,72：641-643中，K.S.Nagarsekar等人主要是藉由薄層層析法(thin layer chromatography,TLC)來鑑定得自於黃荊葉的超臨界流體萃取物(supercritical fluid extract)、經水蒸餾的油(hydrodistillated oil)、石油醚萃取物(petroleum ether extract)以及乙醇萃取物(ethanol extract)的化學成分，並且利用紙盤法(paper disc method)與井-擴散法(well-diffusion method)來分析該等黃荊葉的萃取物或油的抗菌活性(antibacterial activity)。化學成分的鑑定結果發現，黃荊葉的乙醇萃取物的主要組分為類黃酮(flavonoids)，黃荊葉的石油醚萃取物含有類萜(terpenoid)以及葉綠素衍生物 (chlorophyll derivatives)，而黃荊葉的超臨界流體萃取物與經水蒸餾的油的主要組分皆為類萜。此外，抗菌活性的分析結果顯示，黃荊葉的超臨界流體萃取物、黃荊葉的經水蒸餾的油以及黃荊葉的石油醚萃取物這三者具有明顯優越的抗菌潛力。

在K.S.Nagarsekaret al .(2011),Indian J .Pharm .Sci .,73：422-429中，K.S.Nagarsekar等人主要是藉由薄層層析法以及氣相層析-質譜法來鑑定得自於黃荊葉的超臨界流體萃取物與乙醇萃取物的化學成分，並且使用α,α-二苯-β-苦味基肼基(α,α-diphenyl-β-picryhydrazyl,DPPH)來分析它們的活體外抗氧化能力(in vitro antioxidant ability)，以及藉由使用TBARS方法來分析它們的活體內抗脂質過氧化能力(in vivo antilipid peroxidation ability)以及活體內抗氧化能力(in vivo antioxidant ability)。化學成分的鑑定結果發現，黃荊葉的乙醇萃取物的主要組分為環烯醚萜苷(negundoside)與類黃酮，而黃荊葉的超臨界流體萃取物的主要組分為表藍桉醇(epiglobulol)(6.6%)以及β-石竹烯(β-caryophyllene)(4.59%)。此外，黃荊葉的超臨界流體萃取物以及乙醇萃取物皆具有活體外DPPH自由基清除能力並且可以降低TBARS的位準，其中以黃荊葉的乙醇萃取物所測得的結果為較佳。K.S.Nagarsekar等人據此而認為，黃荊葉的超臨界流體萃取物(亦即精油)以及乙醇萃取物具有抗氧化以及抗脂質過氧化的潛力。

經研究，申請人意外地發現黃荊葉的精油除了具有抗 微生物、抗氧化以及抗脂質過氧化的活性之外，還具有降低細胞內的黑色素含量以及抑制酪胺酸酶活性的效用。因此，黃荊葉的精油被預期可供作為一種黑色素合成抑制劑。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於抑制黑色素生成的組成物，其包含有一萃取自黃荊葉的精油，其中該萃取自黃荊葉的精油包含有一或多種萜烯類化合物(terpene compound)，該萜烯類化合物是選自於單萜(monoterpene)、倍半萜(sesquiterpene)或類萜(terpenoid)化合物。

在第二個方面，本發明提供一種用於抑制黑色素生成的方法，其包括對一需要抑制皮膚黑色素生成的個體投予(administering)一如上所述的組成物。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

在開發可用於抑制黑色素生成的藥物上，申請人意外地發現到：一萃取自黃荊葉的精油具有這方面的產業應用潛力。於是，本發明揭示一萃取自黃荊葉的精油供應用於製備一用來抑制黑色素生成之醫藥品的用途，該萃取自黃荊葉的精油包含有一或多種萜烯類化合物，其中該萜烯類化合物是選自於單萜、倍半萜或類萜化合物。

如本文中所用的，術語“萜烯類化合物(terpene compound)”意欲涵蓋萜烯類(terpene)以及類萜(terpenoid)，其中萜烯類主要是由異戊二烯單元(isoprene units)連結而成的化合物，它們具有(C₅ H₈ )_n 的分子式(n表示被連結的異戊二烯單元的數目)，並且可依據該異戊二烯單元的數目來進行分類，諸如單萜(n=2)、倍半萜(n=3)以及雙萜(diterpene)(n=4)等。而類萜意指萜烯類衍生物(terpene derivatives)，其主要是萜烯類經由化學修飾[諸如氧化或碳骨架的重排(rearrangement of the carbon skeleton)]後所形成的化合物。類萜的實例包括，但不限於：類萜醇(terpenoid alcohol)、類萜酮(terpenoid ketone)、類萜酯(terpenoid ester)、類萜醚(terpenoid ether)、類萜酸(terpenoid acid)以及類萜氧化物(terpenoid oxide)。

如本文中所用的，術語“抑制黑色素生成(inhibition of melanogenesis)”與“抑制黑色素合成(inhibition of melanin synthesis)”、“去色素(depigmenting)”、“淡化黑色素(lightening the melanin)”、“美白(whitening)”、“膚色淡化(skin color lightening)”、“漂白(bleaching)”、“淨白”、“增白(brightening)”、“退黑”以及“驅黑”可被交換地使用。

如本文中所用的，術語“精油(essential oil)”與“揮發油(volatile oil)”以及“香精油(ethereal oil)”可被交換地使用。

依據本發明，該萃取自黃荊葉的精油是藉由對黃荊葉進行一選自於由下列所構成之群組中的萃取處理(extraction treatment)而被製得：水蒸餾(hydrodistillation)、蒸汽蒸餾(steam distillation)、水蒸汽蒸餾(water and steam distillation)以及超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction)。有關這些萃取處理的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在此方面，可以參照，例如，Naima Sahraouiet al .(2008),Journal of Chromatography A ,1210：229-233；Pradeep Singhet al .(2010)，同上述；K.S.Nagarsekaret al .(2010)，同上述；K.S.Nagarsekaret al .(2011)，同上述；Chen-Lung Hoet al .(2012),Natural Product Communications ,7：261-264；Tiziana Fornariet al .(2012),Journal of Chromatography A ,1250：34-48；以及Baya Berka-Zougaliet al .(2012),Int .J .Mol .Sci .,13：4673-4695。

在本發明的一個較佳具體例中，該萃取自黃荊葉的精 油是藉由對黃荊葉進行一水蒸餾而被製得。

依據本發明，該黃荊葉可得自於熱帶的東非、南非以及亞洲等國家，這包括，但不限於：台灣、印度、中國、印尼、越南、菲律賓、馬來西亞、日本、巴基斯坦(Pakistan)、斯里蘭卡(Sri Lanka)、阿富汗(Afghanistan)、孟加拉(Bangladesh)、肯亞(Kenya)、馬達加斯加(Madagascar)以及坦尚尼亞(Tanzania)。在本發明的一個較佳具體例中，該黃荊葉是得自於台灣。

依據本發明，在製備黃荊葉的精油時可以使用新鮮的黃荊葉來進行萃取，或者可使用預先經過一選自於由下列所構成之群組中的加工處理的黃荊葉來進行萃取：冷凍處理(freezing)、冷凍乾燥處理(lyophilizing)以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該萃取自黃荊葉的精油是藉由將新鮮的黃荊葉拿來進行萃取處理而被製得。

可瞭解到的是，該萃取自黃荊葉的精油內所含有的萜烯類化合物的種類與含量可能會受下列因素的影響：被用來進行萃取之黃荊葉片的來源、栽培(cultivation)與收獲方式(harvesting procedures)以及萃取方法等。因此，熟習此項技藝者可視其所需來選用適合的黃荊葉以及萃取操作條件，俾以獲得符合本發明所需之黃荊葉的精油。

較佳地，該萃取自黃荊葉的精油包含有一範圍落在30-60%(w/w)內的倍半萜化合物、一範圍落在10-35%(w/w)內的單萜化合物以及一範圍落在15-40%(w/w)內的類萜化合物。更佳地，該萃取自黃荊葉的精油包含有一範圍落在40- 55%(w/w)內的倍半萜化合物、一範圍落在15-30%(w/w)內的單萜化合物以及一範圍落在20-30%(w/w)內的類萜化合物。

依據本發明，該萃取自黃荊葉的精油包含有一選自於由下列所構成之群組中的倍半萜化合物：石竹烯(caryophyllene)、氧化石竹烯(caryophyllene oxide)、佛術烯(eremophilene)以及它們的組合。

依據本發明，該萃取自黃荊葉的精油包含有一選自於由下列所構成之群組中的單萜化合物：檜烯(sabinene)、異丙基甲苯(cymene)以及它們的組合。

依據本發明，該萃取自黃荊葉的精油包含有一選自於由下列所構成之群組中的類萜化合物：類萜醇(terpenoid alcohol)、類萜酮(terpenoid ketone)、類萜酯(terpenoid ester)、類萜醚(terpenoid ether)以及它們的組合。較佳地，該類萜醇是忱香醇(linalool)、該類萜酯是乙酸萜品酯(terpinyl acetate)、該類萜醚是桉油醇(eucalyptol)以及該類萜酮是薄荷酮(menthone)。

依據本發明的萃取自黃荊葉的精油已經由活體外試驗(in vitro test)而被証實可以有效地抑制皮膚黑色素瘤細胞(skin melanoma cell)的黑色素生成以及酪胺酸酶活性，並且相較於習知的皮膚美白劑[例如熊果苷(arbutin)]具有更強效的黑色素生成抑制作用。

因此，本發明提供一種用於抑制黑色素生成的組成物，其包含有一如上所述的萃取自黃荊葉的精油。

依據本發明，該組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、局部地(topically)或口服地(orally)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。

依據本發明的組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。

依據本發明，該組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。較佳地，該組成物被製造成適於以 表皮內注射而被投藥的劑型。

依據本發明，該組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明，該組成物亦可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的組成物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑 (absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普^® 974P(carbopol^® 974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

本發明亦提供一種用於抑制黑色素生成的方法，其包括對一需要抑制皮膚黑色素生成的個體投予一如上所述的組成物。較佳地，該方法包括對該個體的皮膚施用一有效量的該組成物，並且歷時一足夠的時間直到黑色素被顯著地淡化。

如本文中所用的，術語“投予(administering)”與“投藥”以及“施用(application)”可被交換地使用。

如此處所用的，術語“有效量(effective amount)”意指當本發明的組成物被投予一需要抑制皮膚黑色素生成的個體時，一足以提供所欲達致之黑色素生成抑制功效並且不會對皮膚產生非所欲的不利副作用的安全用量。

如本文中所用的，術語“有效量”與“有效劑量(effective dose)”、“黑色素生成-抑制有效量(melanogenesis-inhibiting effective amount)”以及“黑色素生成-抑制有效劑量(melanogenesis-inhibiting effective dose)”可被交換地使用。

依據本發明，該組成物的有效量與施用頻率(frequency of application)會視下列因素而變化：要被抑制黑色素生成的皮膚區域之初始病況(initial condition)、投藥途徑，以及所欲達致之最終的黑色素生成抑制效果。一般而言，當依據本發明的組成物是被局部地投藥時，每次施用的有效量通常是0.01至0.05 mg/平方公分的皮膚面積，每天大約1至3次。而當依據本發明的組成物是被口服地投藥或非經腸道地投藥時，每次投藥的有效量通常是0.05至0.1 mg/Kg體重，每天大約1至3次。

基於本發明的萃取自黃荊葉的精油在抑制黑色素生成上的有利效用，本發明亦預期一如上所述的組成物供應用於製備一用來抑制黑色素生成之化妝品的用途。

依據本發明，該組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於化妝品製造技術之化妝品上可接受的佐劑(cosmetically acceptable adjuvant)。例如，該化妝品上可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

依據本發明，該組成物亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agent)、止癢劑(antipruritic)、止痛劑(analgesic)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、 傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 實施例1. 製備黃荊葉的精油(essential oil ofVitex negundo Linn leaves)

首先，將2公斤採自於台中區農業改良場(Taichung District Agricultural Research and Extension Station)之新鮮的黃荊葉片置於一Clevenger-類型裝置(Clevenger-type apparatus)的蒸餾釜(still pot)中，繼而加入2000 mL的二次水(ddH₂ O)並在100℃下進行水蒸餾(hydrodistillation)歷時2小時。在水蒸餾的過程中，所產生的揮發性組分(volatile components)在通過一連接於該蒸餾釜的頂端的冷凝器(condenser)時會被凝結而形成冷凝液(condensate)，接著流入至一與該冷凝器相連接的蒸餾集液器(still receiver)內。接著，將該蒸餾集液器置於室溫下並靜置歷時30分鐘，而使得冷凝液形成一水性層(aqueous layer)以及一位於該水性層上方的油性層(oily layer)。之後，收集該油性層，而得到 一黃荊葉的精油，繼而將之置於一玻璃瓶內並予以密封，然後儲存於4℃的冰箱中備用。

實施例2. 黃荊葉的精油的氣相層析-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析

為了瞭解本發明所獲得的黃荊葉的精油的化學成分，依據上面實施例1所得到的黃荊葉的精油被拿來進行氣相層析-質譜法分析。

實驗方法：

本實驗所使用的GC-MS分析儀器如下：Thermo GC-MS系統(Trace DSQ-Mass Spectrometer,MSD 201351,Thermo,Minneapolis,MN,USA)；分析管柱為Equity^TM-5 毛細管管柱(Supelco,St.Louis,MO,USA)，它具有一為30 m的長度以及一為0.25 mm的內徑(inside diameter)，並且使用一具有一為0.25 μm之厚度的薄膜(film)。而GC-MS操作條件被顯示於下面的表1中。

首先，將一含有8種已知的C₅ -C₁₂ 正烷烴類化合物(C₅ -C₁₂ n -alkane compounds)的分析溶液(analytical solution)(Method DM 471 Standard Mixture 4,D471-D,Ultra Scientific)以及一含有16種已知的C₁₀ -C₂₅ 正烷烴類化合物的分析溶液[DRO Mixture(Tennessee-Mississippi),UST-210,Ultra Scientific]以一為1：1(v/v)的比例予以混合均勻，藉此而得到一標準溶液(standard solution)。接著，對所得到的標準溶液以及該黃荊葉精油各取0.01 mL，繼而分別注射(injection)至GC-MS分析儀器中來進行分析，藉此可依序得到該標準溶液以及該黃荊葉的精油中所含有的各個成分的 線性滯留指數[linear retention indices(RIs)]以及質譜(mass spectra)。之後，將各個成分所測得的線性滯留指數(RIs)分別拿來與習知文獻中所發表之化合物的線性滯留指數(Vandendool,H.et al .(1963),Journal of Chromatography ,11：463-471)作比對，並且將各個成分所測得的質譜分別拿來與Trace DSQ-MASS光譜資料庫(Trace DSQ-MASS spectra database,Thermo,USA)以及Wiley和NIST質譜資料庫(Wiley and NIST mass spectral databases)當中的已知化合物的質譜作比對，俾以鑑定出在該黃荊葉的精油中所含有的化合物種類。

結果：

下面表2顯示本發明的黃荊葉的精油經由氣相層析-質譜法分析所得到的成分分析結果。從表2可見，在該黃荊葉的精油所含有的化合物當中，含量比例最高者是倍半萜(sesquiterpene)(44.41%)，其次依序為類萜(terpenoid)(28.66%)[包括類萜酯(terpenoid ester)(14.77%)、類萜醇(terpenoid alcohol)(8.53%)、類萜酮(terpenoid ketone)(4.96%)以及類萜醚(terpenoid ether)(0.4%)]以及單萜(monoterpene)(25.15%)。

實施例3. 黃荊葉的精油在抑制黑色素生成(inhibition of melanogenesis)上的效用評估

在本實施例中，申請人選用帶有α-促黑素細胞素(α-MSH)誘發的黑色素生成[α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)-induced melanogenesis]的B16F10細胞來進行活體外試驗，並以黑色素含量(melanin content)以及酪胺酸酶活性(tyrosinase activity)來作為黑色素生成(melanogenesis)的指標，俾以評估本發明的黃荊葉的精油在抑制黑色素生成上的效用。

實驗材料： A、製備黃荊葉的精油的儲備溶液(stock solution)：

將在上面的實施例1當中所製得的黃荊葉的精油以二甲亞(dimethylsulfoxide，DMSO)予以稀釋，而得到一濃度為360 mg/mL的儲備溶液以供下面的實驗之用。

B、老鼠皮膚黑色素瘤(mouse skin melanoma)細胞株B16F10的來源與培養：

在本實施例中所使用的老鼠皮膚黑色素瘤細胞株B16F10(BCRC 60031)(對應於ATCC CRL-6475)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)。

B16F10細胞被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(Hyclone Laboratories,Logan,Utah)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(Gibco,USA)、100 IU/mL盤尼西林(penicillin)以及50 μg/mL鏈黴素(streptomycin)]的9-cm培養皿(9-cm petri dish)中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO₂ 的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS)來洗滌細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO₂ 的培養箱中進行培養。

實驗方法 ： A、以黃荊葉的精油以及熊果苷來處理帶有α-MSH誘發的黑色素生成(α-MSH-induced melanogenesis)的B16F10細胞：

首先，將B16F10細胞分別接種至含有1 mL的DMEM[添加有10% FBS、100 IU/mL盤尼西林、50 μg/mL鏈黴素以及100 nM α-MSH)]的24-井培養盤(24-well plate)(5×10⁴ 細胞/井)中，接著在培養箱(37℃，5% CO₂ )中進行培養歷時24小時，而使得B16F10細胞被誘發黑色素生成。

之後，將被誘發黑色素生成的B16F10細胞分為5組，其中包括1個對照組(control)、1個正對照組(positive control)以及3個實驗組(亦即，實驗組1、2以及3)。接著， 各組細胞被更換以不含有α-MSH的新鮮DMEM(添加有10% FBS、100 IU/mL盤尼西林以及50 μg/mL鏈黴素)，繼而將適量之依據上面“實驗材料”的第A項所得到的儲備溶液添加至實驗組1、2以及3中，而使得實驗組1、2以及3分別具有一最終濃度為0.6 mg/mL、0.8 mg/mL以及1.0 mg/mL的黃荊葉的精油。另外，正對照組被添加以熊果苷(54.5 mg/mL)(Sigma)至一最終濃度為0.545 mg/mL，而對照組被添加以DMSO至一最終濃度為0.3%(v/v)。各組細胞在培養箱(37℃，5% CO₂ )中進行培養歷時24小時後，收取細胞培養物並將之拿來進行下面第B項與第C項的實驗。

B、黑色素含量的測定：

有關黑色素含量的測定是參考Tsuboiet al .(1998),Pigment Cell Res .,11：275-282當中所述的方法來進行，並略作修改。簡言之，將在上面“實驗方法”的第A項當中所得到的各組細胞培養物以PBS清洗共計2次，繼而分別加入500 μL的胰蛋白酶-EDTA以使細胞自培養盤的底部脫離。之後，加入2 mL新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性，然後以量吸管將所形成的混合溶液吸取至15 mL的離心管中並於5,000 g下予以離心歷時5分鐘。在移除上澄液之後，以500 μL的1 N NaOH來充分散浮所得到的沉澱物，然後於60℃下進行加熱處理歷時60分鐘。接著，對所形成的混合物各取出200 μL，並於405 nm的波長下以一分光光度計(spectrophotometer)(Thermo Scientific,Vantaa,Finland)來量測吸光值(OD₄₀₅ )。

黑色素含量(%)是藉由將所測得的吸光值(OD₄₀₅ )代入下 列公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100

其中：A=黑色素含量(%)

B=各組所測得的OD₄₀₅ 吸光值

C=對照組所測得的OD₄₀₅ 吸光值

另外，該黃荊葉的精油抑制50%黑色素含量的濃度(50% inhibition concentration,IC₅₀ )是藉由計算黃荊葉的精油會降低經α-MSH處理的B16F10細胞的吸光值達50%(與對照組的細胞相較之下)的濃度而從曲線的線性部份被測定出(n=3)。

C、酪胺酸酶活性的測定：

有關酪胺酸酶活性的測定是參考Yang J.-Y.et al .(2006),Acta Pharmacol .Sin .,27：1467-1473當中所述的方法來進行，並略作修改。簡言之，將在上面“實驗方法”的第A項當中所得到的細胞培養物以PBS予以清洗2次，繼而加入500 μL的溶解緩衝液(lysis buffer)[含有1.0%(v/v)Triton X-100、50 mM PBS(pH 7.5)以及0.1 mM苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)]並使用超音波清潔器(Ultrasonic cleaner)(Model UC-10200BDT,Chrom Tech)來對細胞進行超音波均質處理(ultrasonic homogenization treatment)。接著，對所得到的各組細胞均質物(cell homogenates)各取100 μL，繼而加入200 μL新鮮配製的L-3,4-二羥基苯丙胺酸(L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA) 溶液[0.1%(v/v)，配於PBS中]並於37℃下進行反應歷時30分鐘。之後，對所形成的混合物各取出200 μL，並於490 nm的波長下以一微型盤讀取儀Gen 5^TM (microplate reader Gen 5^TM )(BIO-TEK Instrument,Winooski,VT,USA)來量測吸光值(OD₄₉₀ )。

酪胺酸酶活性(%)是藉由將所測得的吸光值(OD₄₉₀ )代入下列公式(2)而被計算出：公式(2)：D=(E/F)×100

其中：D=酪胺酸酶活性(%)

E=各組所測得的OD₄₉₀ 吸光值

F=對照組所測得的OD₄₉₀ 吸光值

另外，該黃荊葉的精油抑制50%酪胺酸酶活性的濃度(50% inhibition concentration,IC₅₀ )是藉由計算黃荊葉的精油會降低經α-MSH處理的B16F10細胞的吸光值達50%(與對照組的細胞相較之下)的濃度而從曲線的線性部份被測定出(n=3)。

D、統計學分析(statistical analysis)：

在本實施例中，各組的實驗被重複3次，所得到的實驗數據是採用SPSS 12.0(SPSS INC.,Chicago,IL,USA)統計軟體來進行統計分析，並以平均值±標準偏差(Standard Deviation,S.D.)來表示。所有的數據是藉由變異數分析(analysis of variance,ANOVA)來作分析，俾以評估各個實驗組或正對照組與對照組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p <0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。

結果： A、黑色素含量的測定：

圖1顯示被誘發黑色素生成的B16F10細胞在以不同濃度的黃荊葉的精油予以處理後所測得的黑色素含量。從圖1可見，與對照組相較之下，實驗組1至3的細胞的黑色素含量皆有顯著的降低，並且會隨著該黃荊葉的精油之濃度的增加而更趨於明顯。另外，當與正對照組作比較時，實驗組1至3的細胞的黑色素含量亦都有降低。特別地，該黃荊葉的精油的抑制50%黑色素生成的濃度(IC₅₀ )約為0.86 mg/mL。這個實驗結果顯示：依據本發明的黃荊葉的精油對於經α-MSH處理的B16F10細胞的黑色素生成具有一強效的抑制作用。

B、酪胺酸酶活性的測定：

圖2顯示被誘發黑色素生成的B16F10細胞在以不同濃度的黃荊葉的精油予以處理後所測得的酪胺酸酶活性。從圖2可見，與對照組相較之下，實驗組1至3的細胞的酪胺酸酶活性皆有顯著的降低，並且會隨著該黃荊葉的精油之濃度的增加而更趨於明顯。另外，當與正對照組作比較時，實驗組1至3的細胞的酪胺酸酶活性亦都有降低。特別地，該黃荊葉的精油的抑制50%酪胺酸酶活性的濃度(IC₅₀ )約為0.43 mg/mL。這個實驗結果顯示：依據本發明的黃荊葉的精油能夠有效地抑制經α-MSH處理的B16F10細胞的酪胺酸酶活性。

綜合以上的實驗結果可知：相較於目前常被使用的皮膚美白劑(例如熊果苷)，本發明的黃荊葉的精油可以更有效地抑制細胞內酪胺酸酶的活性以及黑色素的生成，進而達到皮膚美白(skin whitening)的效用。因此，申請人認為：依據本發明的黃荊葉的精油具有發展成為一黑色素合成抑制劑(melanin synthesis inhibitor)(亦即皮膚美白劑)的高潛力。

圖1顯示被誘發黑色素生成的B16F10細胞在以不同濃度的黃荊葉的精油予以處理後所測得的黑色素含量，其中對照組表示被處理以0.3%(v/v)DMSO的細胞；實驗組1至3分別表示被處理以0.6 mg/mL、0.8 mg/mL以及1.0 mg/mL的黃荊葉的精油的細胞；正對照組表示被處理以0.545 mg/mL熊果苷的細胞；以及“＊”與“＊ ＊ ＊”分別表示：當與對照組作比較，p <0.05與p <0.001；以及圖2顯示被誘發黑色素生成的B16F10細胞在以不同濃度的黃荊葉的精油予以處理後所測得的酪胺酸酶活性，其中對照組表示被處理以0.3%(v/v)DMSO的細胞；實驗組1至3分別表示被處理以0.6 mg/mL、0.8 mg/mL以及1.0 mg/mL的黃荊葉的精油的細胞；正對照組表示被處理以0.545 mg/mL熊果苷的細胞；以及“＊”與“＊ ＊ ＊”分別表示：當與對照組作比較，p <0.05與p <0.001。

Claims (11)

1. 一種萃取自黃荊葉的精油供應用於製備一用來抑制黑色素生成之醫藥品的用途，該萃取自黃荊葉的精油包含有一或多種萜烯類化合物，其中該萜烯類化合物是選自於單萜、倍半萜或類萜化合物。
2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該單萜化合物是選自於下列所構成的群組：檜烯、異丙基甲苯以及它們的組合。
3. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該倍半萜化合物是選自於下列所構成的群組：石竹烯、氧化石竹烯、佛術烯以及它們的組合。
4. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該類萜化合物是選自於下列所構成的群組：類萜醇、類萜酮、類萜酯、類萜醚以及它們的組合。
5. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該萃取自黃荊葉的精油是藉由對黃荊葉進行一選自於由下列所構成之群組中的萃取處理而被製得：水蒸餾、蒸汽蒸餾、水蒸汽蒸餾以及超臨界流體萃取。
6. 一種萃取自黃荊葉的精油供應用於製備一用來抑制黑色素生成之化妝品的用途，該萃取自黃荊葉的精油包含有一或多種萜烯類化合物，其中該萜烯類化合物是選自於單萜、倍半萜或類萜化合物。
7. 如申請專利範圍第6項的用途，其中該單萜化合物是選自於下列所構成的群組：檜烯、異丙基甲苯以及它們的 組合。
8. 如申請專利範圍第6項的用途，其中該倍半萜化合物是選自於下列所構成的群組：石竹烯、氧化石竹烯、佛術烯以及它們的組合。
9. 如申請專利範圍第6項的用途，其中該類萜化合物是選自於下列所構成的群組：類萜醇、類萜酮、類萜酯、類萜醚以及它們的組合。
10. 如申請專利範圍第6項的用途，其中該萃取自黃荊葉的精油是藉由對黃荊葉進行一選自於由下列所構成之群組中的萃取處理而被製得：水蒸餾、蒸汽蒸餾、水蒸汽蒸餾以及超臨界流體萃取。
11. 如申請專利範圍第6項的用途，其中該化妝品是呈一供局部施用的形式。