TWI460468B - 使用結構光照明的光學取影系統 - Google Patents

Description

使用結構光照明的光學取影系統

本揭露係關於一種使用非同調性結構照明的光學取影系統，特別係關於一種使用非同調性結構照明且超越繞射極限的散射光光學取影系統。

螢光顯微術(Fluorescent Fluorescence Microscopy)具有高靈敏度、高分子鑑別度、同時測量多重色和活體細胞影像等優點，是生物學家研究生物體內特定的微細結構的最重要的工具之一。但是，螢光顯微術具有兩個主要的問題：螢光蛋白或染劑容易光漂白而失去螢光特性，螢光影像的空間解析度也受到光繞射特性的限制，無法解析距離比半個螢光波長還要靠近的兩物體。一般廣視野螢光顯微術提供220-300 nm的橫向解析度和800-1000 nm的縱向解析度。共軛焦雷射掃描螢光顯微術利用聚焦雷射光進行快速樣品掃瞄，使用針孔遮罩去除離焦平面的螢光訊號，可提高縱向解析度到400-500 nm，並提供三維的斷面影像，但橫向解析度的增加卻有限。近年來，結構照明顯微術(structured illumination microscopy，SIM)利用結構照明圖案照射樣品，已成功地突破繞射極限，提供二維或三維解析度約兩倍的螢光影像。例如，文獻報導三維結構照明螢光顯微術能提供100 nm的橫向解析度和300 nm的縱向解析度。

其中一種應用是三維結構照明螢光顯微術(Three dimensional structured illumination fluorescence microscopy,3D-SIFM)。其主要利用三道雷射光進行干涉，產生三維的干涉照明圖案照射樣品，以將高頻率的影像資訊轉移到廣視野顯微鏡的光學傳遞函數(optical transfer function,OTF)涵蓋的範圍。根據Gustafsson et al的研究，於不同干涉照明圖案照射下產生的影像資訊經收集後，可由影像重建演算法取得高解析度螢光影像。3D-SIFM現在於橫向及縱向可提供的解析度為一般廣視野螢光影像的兩倍。

SIM相關的技術廣泛地應用在螢光樣品的量測，但尚無和光散射(light scattering)或其他顯微技術結合的報導。光散射影像可觀察透明、無螢光標記但產生高強度散射光的樣品。貴重金屬奈米粒子在生物研究和生醫領域的廣泛應用進一步使散射光成像成為常用的研究方法，以觀察細胞內結構的變化或交互作用。貴重金屬奈米粒子除了具有很高的生物相容性及穩定性之外，還具有高強度光散射性，以及抗光漂白的特性。

結構照明圖案和散射光成像結合的結構照明光散射顯微術相較於3D-SIFM，在高解析影像重建和影像測量等方面皆比較複雜。例如，3D-SIFM使用同調性或保有部分同調性的光源以形成具有明顯亮暗條紋的三維干涉圖案照射樣品。因為由樣品發出的螢光為非同調性光，先前文獻發展的非同調性影像重建研究結果(如換算公式及方法等)皆 可被沿用以得到高解析度影像。相反地，結構照明光散射光顯微術若使用具有同調性光源照射樣品，由樣品散射出的光依然保留激發光源的同調性，螢光影像重建過程中所用的換算公式及方法皆不適用於重建高解析光散射影像。利用一般光散射影像的數學公式，可以建立新的高解析光散射影像重建演算法，但因為複雜的數學換算公式及方法，限制了該演算法的進一步發展。在影像測量方面，光散射顯微術，特別是以同調光為激發光源時，由於激發光在不同介面的反射干擾，影像常重疊明暗背景條文且對比不佳。因此，一般進行影像測量常加一個小遮罩遮住介面反射光，稱之為暗視野光散射顯微術。不過，此暗視野技術減少同調光的干擾，卻也因偵測視野較小，減弱散射光的訊號和降低影像的解析度。

圖1顯示一習知的三維結構照明光學系統10。由一同調性光源11發出同調性光束形成一光路，該同調性光束被置於該光路上的一空間光調變器(spatial light modulator，SLM)12所接收。該SLM 12將原本單束入射光繞射成複數個高階光束，例如0、+1、與-1階的繞射光。為了收斂該等平行光繞射光，凸透鏡L₁ 置放於離SLM12一距離f₁ 的位置，其中f₁ 為該凸透鏡L₁ 的焦距。

該等平行繞射光經過凸透鏡L₁ 被收斂於焦點後，發散進入另一凸透鏡L₂ 。凸透鏡L₂ 被置放於離該焦點一距離f₂ 的位置並使通過的光束成為互相交會的平行光，其中f₂ 為該凸透鏡L₂ 的焦距。結構照明圖案形成於一共軛影像平面16 ，或稱一傅立葉平面，該平面16離該凸透鏡L₂ 一距離f₂ 。另一凸透鏡L₃ 被置放於離該共軛影像平面16一距離f₃ 的位置，接收該等平行光束並產生收斂光束至物鏡L_obj 。描繪於圖1中的物鏡L_obj 為一簡要示意圖，實際上一組透鏡會排列於該物鏡組17中。該物鏡L_obj 與該凸透鏡L₃ 之間的距離為兩者焦距的和(f₃ +f_obj )，其中f₃ 為該凸透鏡L₃ 的焦距，f_obj 為該物鏡L_obj 的焦距。換句話說，f₃ 是凸透鏡L₃ 與該物鏡L_obj 的後焦平面16'之間的距離；而f_obj 是該物鏡L_obj 與其後焦平面16'之間的距離。在使用一物鏡組17的狀況下，焦距f_obj 為該物鏡組17的有效焦距。平行光束經過該物鏡L_obj 後再度互相交會於另一影像平面，而承載待測樣品之載臺15設置於該影像平面上。交會的平行光束產生三維結構照明圖案於該待測樣品上，該三維結構照明圖案可進行光學切片以取得不同高度的剖面影像，組合該些影像即可重建該樣品的三維影像。

圖2顯示一習知的三維結構照明影像光學系統20。圖2的同調性光源21、空間光調變器(spatial light modulator，SLM)22、載臺25、物鏡27，以及一組光學透鏡(L₁ '、L₂ '、L₃ '、L₄ '、L₅ '、L_obj ')都與圖1中所示的相等物實質相同。惟其排列間距或有不同以方便實驗進行。一可調整式光罩23亦加入此系統20中以增加功能性。該光罩23可使本系統20操作於廣視野狀態下(只有0階繞射光通過光罩)，或二維結構照明圖案的狀態下(只有+1與-1階繞射光通過光罩)。圖2中描繪的的光罩23至於光路之外，因此沒有繞 射光被阻擋。一電荷耦合裝置(charge-coupled device，CCD)被置於一適合接收由待測物發出螢光的位置，而一實際的空間影像將由被該CCD接收的訊號重組而成。

本揭露成功組合3D-SIM與散射光顯微術以產生非同調光三維結構照明，其效果可避免散斑與複雜的同調光影像重組計算。一反射式光散射顯微鏡(reflective light scattering microscope)結合3D-SIM的裝置(SI-RLSM)揭露於本揭露中。本裝置針對100 nm的貴金屬奈米粒子可達到120 nm/430 nm的橫向/縱向解析度，並適用於含有貴金屬奈米粒子的生物樣品，重建出高解析與高對比的光散射影像。

本揭露提供一種光學系統用以產生非同調的結構照明，該系統包含：一同調性光源，發射一同調性光，其沿一光路傳遞；一空間光調變器，置放於該光路上並接收該同調性光，其中該空間光調變器產生複數道同調性繞射光，並於該等同調性繞射光交會處形成一結構照明圖案；複數個光學透鏡，置放於該光路上，並於該等同調性繞射光交會處形成至少一共軛影像平面；一旋轉或震動擴散片，置放於該至少一共軛影像平面，經配置以破壞該同調性光的同調性；一物鏡，接收複數束非同調性的繞射光；以及一載臺，置放於該物鏡的前焦平面，經配置以承載一待測物。本揭露另提供一種利用非同調性結構照明的光學取影系 統，包含一光學顯微鏡，該顯微鏡有一物鏡，具有接近一待測物的一第一側，遠離該待測物的一第二側，以及一載臺，置放於該物鏡的該第一側，經配置以向接近或遠離該物鏡的方向移動，並承載該待測物於該載臺靠近該物鏡的一面；一50/50分光鏡，置放於該光路上該物鏡的該第二側，經配置以反射一入射光並容許該待測物散射之一散射光線穿透而傳遞至一影像記錄元件；一同調性光源，經配置以發射一同調性光，其沿一光路傳遞；一空間光調變器，置放於該光路上，經配置以從該同調性光產生一結構照明圖案於該物鏡的該前焦平面；複數個光學透鏡與反射鏡，置放於該光路上，其中該結構照明圖案的至少一共軛影像平面藉由該些光學透鏡形成於該光路上；以及一旋轉擴散片，置放於該至少一共軛影像平面，經配置以破壞該同調性光的同調性。

上文已相當廣泛地概述本揭露之技術特徵及優點，俾使下文之本揭露詳細描述得以獲得較佳瞭解。構成本揭露之申請專利範圍標的之其它技術特徵及優點將描述於下文。本揭露所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，可相當容易地利用下文揭示之概念與特定實施例可作為修改或設計其它結構或製程而實現與本揭露相同之目的。本揭露所屬技術領域中具有通常知識者亦應瞭解，這類等效建構無法脫離後附之申請專利範圍所界定之本揭露的精神和範圍。

本揭露所揭露的結構照明反射式光散射顯微系統(SI-RLSM)利用空間光調變器的圖案快速且準確地調變結構照明圖案的相位、方位和明暗對比，並在光學系統的結構照明圖案成像平面放置旋轉擴散片，此舉除可降低結構照明圖案成像在樣品平面的同調性。本揭露使用由M.G.L.Gustafsson et al.所提出非同調性影像重建演算法以重建高解析的光散射影像。設置於該傅立葉平面的旋轉擴散片將相位的影響消除，並將影像重建演算法從複雜的同調性光計算轉換成簡單的非同調性光計算。使用結構照明反射式光散射顯微系統的三維光學傳遞函數(optical transfer function，OTF)，減少頻率資訊重疊的效應，可進一步提高影像的解析度。

圖3顯示本揭露一實施例之有效消除光同調性的光學系統30。圖3的同調性光源31、空間光調變器(spatial light modulator，SLM)32、載臺35、物鏡37，以及一組光學透鏡(L₁ "、L₂ "、L₃ "、L₄ "、L₅ "、L_obj ")都與圖1光學系統10中所示的相等物實質相同。圖三中系統30的特徵在於置放一旋轉的全相術擴散片33於共軛影像平面36，或稱傅立葉平面。本實施例要達到的目的為產生一結構光照明圖案於光路下游的物鏡前焦平面36"，該圖案與位於載臺35上的待測樣品的重疊；同時達到降低結構光照明的同調性。旋轉的全相術擴散片33至於圖3的該位置能夠同時達到上述兩個目的。圖3的光學系統30，其中該複數個透鏡置放於特定 位置以使由該空間光調變器產生的+1與-1階繞射光靠近該物鏡L_obj "的邊緣，而繞射光聚焦於該物鏡L_obj "的後焦平面36'。

圖3顯示本揭露另一實施例，包含相似上一段描述之光學系統但具有一光罩34，用以產生廣視野或二維的結構光照明圖案。該光罩34的位置可被調整以阻擋+1與-1階繞射光而形成廣視野影像；該光罩34亦可被調整以阻擋0階繞射光而形成二維結構照明圖案，也就是說，該圖案只成像於平行該載臺35的一個面上。

圖4根據本揭露一實施例描繪一光學取影系統40。該系統40特別為達到SI-RLS的功能而設計，並具有以下光學元件：一同調性光源，例如波長為543nm的氦氖雷射41，發射同調性光並形成一光路。該同調性光經過一10X的光束擴大器42並由一相位調變的SLM散射成為多個高階(0、+1、-1)繞射光。雷射光束之後經過一透鏡組(45a、45b、45c、45d、45e)，一50/50分光鏡411，而聚焦於一物鏡47的後焦平面48，且該多束照射光交會於物鏡47的前焦平面48'並形成結構光照明圖案。其中透鏡45e可置放於該光學顯微鏡414內。

圖4的光學系統40，其中該複數個透鏡置放於特定位置以使由該空間光調變器產生的+1與-1階繞射光靠近該物鏡47的邊緣，而繞射光聚焦於該物鏡47的後焦平面48。置放於該載臺43上的待測物散射出的光由該物鏡47接收並通過一50/50分光鏡411、一筒鏡421、以及一2X接續透鏡413， 最後進入一CCD攝相機49。本揭露一實施例中，一直立式光學顯微鏡414包含透鏡45e、分光鏡411、筒鏡421、2X接續透鏡413、物鏡47、載臺43、以及一CCD攝相機49。該載臺43由壓電傳感器(PZT)控制，並將承載的待測物向接近或遠離物鏡47的方向移動，以得到沿著z軸的光切片。

圖4的光路上標記S1、S2、以及S3三個位置。該旋轉全相術擴散片46較佳地應被置於S2而非S1的位置，理由如下所述：若該擴散片46被置於S1的位置，剛從氦氖雷射41射出的光的同調性將部分被破壞。因為同調性部分被破壞的光仍保有部分的同調性，三束具有部分同調性的繞射光互相交會後仍能產生結構光照明圖案於待測物平面上。另一方面，縱使同調性被破壞，該非同調性單束光經SLM繞射成為三束繞射光，位於該三束繞射光中相相對應同位置的點仍具有相同的相位，可被視為同調性的三個光點(coherent point triplets)，而結構光照明圖案亦可由該無數個coherent point triplets疊加而形成。綜上，當擴散片置於S1位置的情況下，結構光照明圖案的產生是由三束部分同調繞射光中同調部分與不同調部分疊加的結果。

若該擴散片置於圖4中S2的位置，光的同調性將近乎被完全破壞，而形成非同調光。因此，三束繞射光通過物鏡互相交會於置放待測物的影像平面時，並無法產生結構光照明圖案。另一方面，S2的位置位於三束繞射光線交會並形成結構照明圖案的一共軛影像平面。因此，該結構照明圖案在共軛影像平面的同調性被大大減低，可被視為近似 非同調性的結構照明圖案，並經由光路上透鏡成像於置放待測物的影像平面上。

若該擴散片置於圖4中S3的位置，相似於該擴散片置於圖4中S2位置的結構光照明圖案可在待測物的影像平面被觀察到。本揭露另一實施例中，一個以上的擴散片被置於該光學系統中。例如，在一具有兩個擴散片的光學系統中，其中一個擴散片置於S2的位置，而另一個擴散片置於S3的位置。在此光學系統中，一個相似於僅有一擴散片置於S2或S3位置的結構光照明圖案將形成，但光照明強度減弱許多。

圖5根據本揭露一實施例描繪一光學取影系統50。相較於光學取影系統40，光學取影系統50進一步包含一四分之一波板55'，置於透鏡55a及55b之間。該四分之一波板55'用以產生圓偏振光(circularly polarized light)，使得該結構光照明圖案在不同的方向上具有相近的對比。

一旋轉的全相術擴散片被使用於本揭露一實施例中。一經過表面粗化或表面光學鍍膜的旋轉擴散片被使用於本揭露另一實施例中。一旋轉的毛玻璃亦被當作一擴散片使用於本揭露另一實施例中。一經過表面粗化或表面光學鍍膜的振動擴散片被使用於本揭露另一實施例中。上述所有擴散片皆具有相同特徵：入射光可穿透該擴散片，且以光路軸為中心連續且快速地振動或旋轉。因為該擴散片對入射光進行一隨機的相位改變，較佳地，該振動或旋轉被保持於等速進行，以便消除相位對影像重建過程的影響。

本揭露一實施例中，CCD平面上的散射光訊號的振幅U _i (x ,y ,t )可被描述為： 其中散射光訊號於待測物平面的分佈為U _g (x ,y ,t )，振幅點擴散函數(point spread function，PSF)為h (x ,y )，該貴金屬奈米粒子反射影像的強度為S (x ,y )，該照射光的電場振幅為E (x ,y )，以及由旋轉擴散片產生的相位變化為(t )。當該擴散片快速旋轉時，(t )的時間平均值為0。因此，CCD所接收到的訊號強度I _i (x ,y )為散射光強度的時間平均： 本方程式適用於非同調性光的成像，如螢光影像，因此與本揭露實施例中的情況相符。

返回參照圖4，本實施例中的SLM包含一圖案化物體44a，例如一圖案板、一光柵、或一液晶SLM。其中該液晶SLM(LC-SLM)的圖案可快速變換來控制該結構光照明的方位、相位、以及對比。該LC-SLM可當作二維光柵。如圖6所示，白色的像素代表該液晶經過弧度π的相調變，而黑色的像素代表該液晶未經過相調變。上方的五個方塊顯示由LC-SLM在0°及分別於五個不同的相位至的情況下產生的像素；而下方的五個方塊顯示物鏡於特定z高度時橫向xy焦平面相對應的光照明圖案。該像素顯示一週期為7，而該對應的光照明圖案橫向週期長度為274 nm。於各SLM圖案中平行移動一行像素，對應的光照明圖案的相位移動為4π/7。

相同地，於圖7上方的方塊顯示由LC-SLM在45°及分別於五個不同的相位至的情況下產生的像素；而下方的五個方塊顯示物鏡於特定z高度時橫向xy焦平面相對應的光照明圖案。該像素顯示對角週期為5，而該對應的光照明圖案橫向週期長度為277 nm。於各SLM圖案中平行移動兩像素(兩小方格)，相應的光照明圖案的相位移動為4π/5。

SLM圖案中的週期7與5具有不到1%的差距，因此相應的光照明圖案具有相近的橫向週期，其結果會使橫向解析度彼此相近。不同SLM圖案中的週期設計可以不同，但過大的週期差異會造成於不同方位具有不同解析度。白色像素、黑色像素、或具有灰階的白色像素的數目控制0階和1階繞射光強度的比值。例如，在SLM圖案上以一排白色像素取代一排黑色像素，並設定該等白色像素具有0.875 π的相位延遲，產生結構照明的0階和1階繞射光於各方位將具有相近的對比。

置放於光路上的該透鏡組用以調整該結構光照明圖案的橫向週期。在擴散片尚未置於S2位置前，多個光學透鏡之間的相互距離由以下條件決定：1)+1及-1階的繞射光需要盡量靠近物鏡邊緣，如此一來，可使結構光照明圖案的橫向週期接近繞射極限；以及2)三束繞射光需收斂並聚焦於物鏡的後焦平面，成像於共軛影像平面的結構光照明圖案才能投影到待測物的平面上，用以照射待測物。

本揭露一實施例中，一個0階的繞射光照射置放於水中且固定於玻璃表面的100 nm金奈米粒子以形成一廣視野散 射光影像。圖8比較該廣視野影像於以下情況：在一同調性光源照射下a)一全相術擴散片置於圖5的S1位置、b)一全相術擴散片置於圖5的S2位置、以及在一非同調性的鹵素燈的照射下，c)沒有擴散片。上方影像為橫向xy平面的投影，而下方影像為縱向xz平面的投影。任一個縱向投影包含三十一個影像的疊層，該等影像疊層由移動該待測物於z方向，例如以100 nm為一單位沿z方向移動。(a)影像中由於多個介面間的反射互相干擾，形成縱向週期背景雜訊，因此推論照射光仍保有部分同調性。相對地，(b)影像中幾乎無背景雜訊，而該影像與(c)影像相似。顯示將旋轉擴散片置於S2位置能有效破壞光的同調性，進而形成一準非同調影像。

圖9顯示一0°、三維結構照明圖案的理論模擬示意圖於一縱向面(xz)於左圖，並顯示三個z高度所對應的橫向面(xy)示意於右圖。該三維結構圖案由三束水平線偏振(s-polarized)同調光源交會形成，可以最大化光調變的對比。使用圓偏振光會降低光調變的對比但維持相同的週期。圖9顯示光調變週期不僅出現於橫向，亦出現於z方向(縱向)，因此可用於本揭露經由光切片收集形成的影像疊層中。承載待測物的PZT載臺精準地移動待測物於該三維結構光照明圖案的厚度方向(縱向)，而散射出的訊號則由CCD接收並進行影像重建。

圖10顯示本揭露一實施例中一縱向(xz)三維結構照明圖案，旋轉擴散片分別置於圖5的(a)S1位置與(b)S2位置。 本實施例中，該疊層影像由沿z軸方向以一次移動100 nm的方式移動一片載臺上的矽晶圓。該結構光照明圖案由交會0、+1、以及-1階的繞射光而形成。在光路上沒有任何擴散片的情況下，當三束同調繞射光交會於置放該待測物的前焦平面時，三維結構光照明圖案具有一無限長的縱向影像如圖9所示。相對地，於光學系統中置入一旋轉擴散片減少了三維結構光照明圖案的縱向長度。參見圖10(a)，該結構光照明圖案由於三束繞射光同調部分與非同調部分於置放待測物的前焦平面疊加，因此具有一有限的縱向長度。參見圖10(b)，產生於待測物平面的該三維結構光照明圖案具有一相等於顯微鏡景深的縱向厚度。圖10顯示置放擴散片於S2位置最能有效破壞光的同調性，也因此SI-RLS的影像重建能夠使用先前建立的非同調光影像重建方法。

圖11顯示置放於水中且固定於玻璃表面的100 nm金奈米顆粒的(a)廣視野影像，以及(b)SI-RLS影像的投影，其中上面的方格是橫向面(xy)影像的投影，中間的方格是縱向面(xz)影像的投影，(c)是單顆金奈米粒子的橫向和縱向剖面曲線，連接實線為高斯函數的最佳適解曲線。該SI-RLS影像於橫向與縱向都顯示較佳的影像對比與解析度。廣視野影像中的金奈米粒子平均的半高寬(full width at half maximum,FWHM)分別為262±6 nm/867±19 nm(橫向/縱向)。相應的SI-RLS影像中的金奈米粒子平均的半高寬(FWHM)分別為117±10 nm/428±18 nm(橫向/縱向)。橫向解析度高了2.2倍而縱向解析度高了2.0倍。此種解析度接 近使用螢光的三維結構照明顯微術(3D-SIM)。

圖12(a)顯示海拉細胞的差分干涉二維影像，此時複數個100 nm的金奈米粒子已被海拉細胞吞噬。相較於圖12(a)，圖12(b)顯示100 nm金奈米粒子的三維廣視野影像(由鹵素燈照射)，圖12(c)顯示100 nm金奈米粒子的SI-RLS影像投影。該SI-RLS影像達到低背景雜訊以及高解析度的目的，令觀察者能夠清楚區分鄰近的金奈米粒子。圖12顯示該SI-RLSM系統在生物研究上的應用。

本揭露之技術內容及技術特點已揭示如上，然而本揭露所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，在不背離後附申請專利範圍所界定之本揭露精神和範圍內，本揭露之教示及揭示可作種種之替換及修飾。例如，上文揭示之許多製程可以不同之方法實施或以其它製程予以取代，或者採用上述二種方式之組合。

此外，本案之權利範圍並不侷限於上文揭示之特定實施例的製程、機台、製造、物質之成份、裝置、方法或步驟。本揭露所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，基於本揭露教示及揭示製程、機台、製造、物質之成份、裝置、方法或步驟，無論現在已存在或日後開發者，其與本案實施例揭示者係以實質相同的方式執行實質相同的功能，而達到實質相同的結果，亦可使用於本揭露。因此，以下之申請專利範圍係用以涵蓋用以此類製程、機台、製造、物質之成份、裝置、方法或步驟。

10‧‧‧三維結構照明光學系統

11‧‧‧同調光源

12‧‧‧空間光調變器

15‧‧‧載臺

16‧‧‧共軛影像平面

16'‧‧‧後焦平面

17‧‧‧物鏡

20‧‧‧光學取影系統

21‧‧‧同調光源

22‧‧‧空間光調變器

23‧‧‧光罩

24‧‧‧電荷耦合相機

25‧‧‧載臺

26‧‧‧分光鏡

27‧‧‧物鏡

30‧‧‧光學系統

31‧‧‧同調性光源

32‧‧‧空間光調變器

33‧‧‧擴散片

34‧‧‧光罩

35‧‧‧載臺

36‧‧‧共軛影像平面

36'‧‧‧後焦平面

36"‧‧‧前焦平面

37‧‧‧物鏡

40‧‧‧光學取影系統

41‧‧‧雷射

42‧‧‧光束放大鏡

43‧‧‧載臺

44‧‧‧空間光調變器

44a‧‧‧圖案化物件

45a‧‧‧透鏡

45b‧‧‧透鏡

45c‧‧‧透鏡

45d‧‧‧透鏡

45e‧‧‧透鏡

46‧‧‧擴散片

47‧‧‧物鏡

48‧‧‧後焦平面

48'‧‧‧前焦平面

49‧‧‧電荷耦合相機

411‧‧‧50/50分光鏡

412‧‧‧筒鏡

413‧‧‧接續鏡組

414‧‧‧光學顯微鏡

50‧‧‧光學取影系統

55a‧‧‧透鏡

55b‧‧‧透鏡

55c‧‧‧透鏡

55d‧‧‧透鏡

55'‧‧‧四分之一波板

56‧‧‧擴散片

圖1顯示一結構照明光學系統；圖2顯示一結構照明光學取影系統；圖3係根據本揭露一實施例之有效破壞光同調性的一光學系統；圖4係根據本揭露一實施例之有效破壞光同調性的一光學取影系統；圖5係根據本揭露一實施例之有效破壞光同調性的一光學取影系統；圖6係根據本揭露一實施例之空間光調變器圖案的一種(0°，五個相位)及其相應的結構照明圖案於一特定Z軸高度；圖7係根據本揭露一實施例之空間光調變器圖案的一種(45°，五個相位)及其相應的結構照明圖案於一特定Z軸高度；圖8顯示利用0階繞射光照射100 nm金奈米顆粒的廣視野影像，旋轉式擴散片置於(a)S1，(b)S2，以及(c)鹵素燈照射且無擴散片，其中上面是橫向面(xy)影像的投影，下面是縱向面(xz)影像的投影；圖9顯示一0°、三維結構照明圖案的理論模擬示意圖於一縱向面(xz)，並顯示三個z高度所對應的橫向面(xy)示意圖；圖10顯示本揭露一實施例中一實驗測量縱向(xz)三維結構照明圖案，旋轉擴散片分別置於(a)S1，(b)S2； 圖11顯示置放於水中且固定於玻璃表面的100nm金奈米顆粒的(a)廣視野影像，以及(b)SI-RLS影像的投影，其中上面的方格是橫向面(xy)影像的投影，中間的方格是縱向面(xz)影像的投影，(c)是單顆金奈米粒子的橫向和縱向剖面曲線，連接實線為高斯函數的最佳適解曲線；以及圖12顯示海拉細胞的(a)差分干涉二維影像，以及於(a)方框中100 nm金奈米粒子的(b)廣視野影像，與(c)SI-RLS影像的投影。

30‧‧‧光學系統

31‧‧‧同調性光源

32‧‧‧空間光調變器

33‧‧‧擴散片

34‧‧‧光罩

35‧‧‧載臺

36‧‧‧共軛影像平面

36'‧‧‧後焦平面

36"‧‧‧前焦平面

37‧‧‧物鏡

Claims (27)

1. 一種使用非同調性結構照明的光學取影系統，包含：一光學顯微鏡，包含：一物鏡，具有接近一待測物的一第一側、遠離該待測物的一第二側、一前焦平面以及一後焦平面，其中該前焦平面與該待測物交疊；以及一載臺，置放於該物鏡的該第一側，經配置以向接近或遠離該物鏡的方向移動，並承載該待測物於該載臺靠近該物鏡的一面；一同調性光源，經配置以發射一同調性光，其沿一光路傳遞；一50/50分光鏡，置放於該光路上，經配置以於該物鏡的該第二側反射一入射光，並容許該待測物散射之一散射光線穿透而傳遞至一影像記錄元件；一空間光調變器，置放於該光路上，經配置以從該同調性光產生一結構照明圖案於該物鏡的該前焦平面；複數個光學透鏡，置放於該光路上，其中該結構照明圖案的至少一共軛影像平面係藉由該些光學透鏡形成於該光路上；以及一旋轉擴散片，置放於該至少一共軛影像平面，經配置以破壞該同調性光的同調性。
2. 根據請求項1所述的光學取影系統，另包含一四分之一波板，置放於該光路上。
3. 根據請求項1所述的光學取影系統，另包含一電荷耦合元件(CCD)，置放於該物鏡的該第二側，經配置以接收由該 散射光線。
4. 根據請求項1所述的光學取影系統，其中該空間光調變器包含一圖案化物件、一光柵或一液晶空間光調變器。
5. 根據請求項4所述的光學取影系統，其中該空間光調變器包含複數個像素，且一部份的像素經控制以改變該同調性光的相位。
6. 根據請求項4所述的光學取影系統，其中該空間光調變器經配置以從該同調性光源產生至少0、+1以及-1階的繞射光。
7. 根據請求項4所述的光學取影系統，其中該結構照明圖案係由複數道光線交會或投射該圖案化物件之圖案而產生。
8. 根據請求項4所述的系統，其中該空間光調變器改變該結構照明圖案的相位與方向。
9. 根據請求項8所述的光學取影系統，其中具有不同方向的該結構照明圖案之週期實質相同。
10. 根據請求項1所述的光學取影系統，其中該結構照明圖案包含二維或三維圖案。
11. 根據請求項1所述的光學取影系統，其中該複數個透鏡置放於複數個特定位置以形成至少一共軛影像平面於該光路上，且三道繞射光在該至少一共軛影像平面交會。
12. 根據請求項1所述的光學取影系統，其中該複數個透鏡置放於複數個特定位置，使得該空間光調變器產生的+1與-1階繞射光靠近該物鏡的邊緣。
13. 根據請求項12所述的光學取影系統，其中該複數個透鏡置放於複數個特定位置，使得該空間光調變器產生的該繞射 光聚焦於該物鏡的該後焦平面。
14. 根據請求項1所述的光學取影系統，其中該旋轉擴散片包含該同調性光源可穿透的一平板或一磨砂玻璃，且該擴散片具有一粗化表面或一光學鍍膜表面以破壞該同調性光的同調性。
15. 根據請求項14所述的光學取影系統，其中該擴散片連續地沿該光路之中心進行360度旋轉。
16. 根據請求項14所述的光學取影系統，其中該擴散片沿該光路之中心連續且快速地震動。
17. 根據請求項1所述的光學取影系統，其中該載臺係由一壓電傳感器控制以朝向接近或遠離該物鏡的方向移動。
18. 一種產生非同調性結構照明的光學系統，包含：一同調性光源，發射一同調性光，其沿一光路傳遞；一空間光調變器，置放於該光路上並接收該同調性光，其中空間光調變器從該同調性光產生複數道同調性繞射光，並於該等同調性繞射光交會處形成一結構照明圖案；複數個光學透鏡，置放於該光路上，並於該等同調性繞射光交會處形成至少一共軛影像平面；一旋轉擴散片，置放於該至少一共軛影像平面，經配置以破壞該同調性光的同調性以產生複數道非同調性繞射光；一物鏡，接收該等非同調性繞射光；以及一載臺，置放於該物鏡之前焦平面，經配置以承載一待測物。
19. 根據請求項18所述的光學系統，其中該空間光調變器包含一圖案化物件、一光柵或一液晶空間光調變器。
20. 根據請求項19所述的光學系統，其中該結構照明圖案係由該複數個光線交會或投射該圖案化物件之圖案而產生。
21. 根據請求項18所述的光學系統，其中該空間光調變器經配置以從該同調性光源產生至少0、+1以及-1階的繞射光。
22. 根據請求項18所述的光學系統，其中該旋轉擴散片包含該光源可穿透的一平板或一磨砂玻璃，且該擴散片具有一粗化表面或一光學鍍膜表面以破壞該同調性光的同調性。
23. 根據請求項22所述的光學系統，其中該擴散片連續地沿該光路之中心進行360度旋轉。
24. 根據請求項22所述的光學系統，其中該擴散片沿該光路之中心連續且快速地震動。
25. 根據請求項18所述的光學系統，其中該結構照明圖案包含二維或三維圖案。
26. 根據請求項18所述的光學系統，其中該複數個透鏡置放於複數個特定位置，使得該空間光調變器產生的+1與-1階繞射光靠近該物鏡的邊緣。
27. 根據請求項26所述的光學系統，其中該複數個透鏡置放於複數個特定位置，使得該空間光調變器產生的該繞射光聚焦於該物鏡的該後焦平面。