TWI454291B - 植入體以及製造其之方法 - Google Patents

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植入體以及製造其之方法
本發明係有關於一種植入體以及製造其之方法，該植入體包含腎小管上皮細胞之幾丁聚醣系統，可做為極具潛力的移植材料。
於實務上，由於細胞培養的實驗週期較動物實驗短，可有效的加快研究進程，且相較於複雜的動物個體，亦提供一個相對單純的環境進行研究探索；另一方面，微生物於生物工程技術之應用又過於簡化，無法忠實呈現必須經由人類生理修飾才具有正常功能的蛋白質。小至實驗室基礎實驗，大至複製動物、基因治療，都需要成熟且穩定的細胞培養技術作為支持。因此，細胞培養對於整個生物工程技術而言，是一個不可缺少的必要過程，也可說是生物技術的核心技術之一，提供研究人員簡便的平台一窺生物世界的奧秘。
血清是培養細胞過程中不可或缺的營養因子，由於現今實驗使用之血清來源多為胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)而非人類血清，依據每批(lot)血清之來源地區可能有潛藏的地區性疾病造成血清品質不佳，再者，不同批次的血清亦可能因為品質不穩定影響細胞培養結果，侷限細胞培養產品於臨床醫學上的應用，除此之外，其他如疫苗廠商或生物製藥皆需要無血清培養基進行細胞大量培 養發酵，因此，目前許多生技公司或是研發單位競相對於無血清培養方式或配方進行研究開發。
上皮是一種多樣化的組織，具有廣泛的功能，例如選擇性擴散、吸收或分泌、物理性保護及阻隔身體。上皮細胞中的腎小管上皮細胞，於實驗操作的經驗可知，該細胞活體外的培養並不容易。於過去文獻中，若以有血清環境培養腎小管上皮細胞，常導致腎小管上皮細胞纖維化使其功能下降；然而，若以無血清方式培養，腎小管上皮細胞無法順利生長，且無法展現其相關功能，如圓頂化現象、低穿上皮電阻或是鈉鉀泵(Na+ /K+ -ATPase)活性等等，導致腎小管上皮細胞於臨床應用上受到很大的侷限。
幾丁聚醣研究的興起，很大的部分是因為該材料可作為移植材料的新選擇，而目前器官捐贈等待的人多，而來源卻很少，即使幸運與捐贈者配對成功，還是難以避免手術後非免疫代償性功能失調以及異體移植產生的排斥反應。幾丁聚醣，如上所述，具有良好的生物相容性以及低細胞毒性，且由於幾丁聚醣能夠被生物體內酵素代謝(如溶菌酶)，因此被認為是一種生物分解性的材料，提供一種植入體的新選擇。其中，幾丁聚醣-α(1-4)2-氨基-2-脫氧-β-D葡聚醣為葡萄糖胺聚醣(glycosaminoglycan，GAG)之結構類似物，而葡萄糖胺聚醣係細胞外基質主要的組成物，因此，幾丁聚醣為基底之生物材料亦刺激許多細胞附著以及生長的能力。
譬如，近年來發現幾丁聚醣能夠促進骨相關細胞之生長以及其最初附著能力，是以習知以幾丁聚醣基質多用以培養成骨或軟骨細胞。即使幾丁聚醣物理性質較差，且對於細胞分展散開、對於細胞骨架分散有其限制，然而因為幾丁聚醣優秀的生物相容性，近年來研究人員嘗試以幾丁聚醣基質培養不同種類的細胞，或者透過幾丁聚醣的修飾或混合其他成分形成共聚物以強化幾丁聚醣的應用。
即使，目前已有許多針對幾丁聚醣作為細胞培養基質以及作為移植材料的研究，然而，目前還尚未有將幾丁聚醣應用於培養腎小管上皮細胞的發現以及成果。
本發明係有關於一種植入體以及製造其之方法。該植入體係包含腎小管上皮細胞之幾丁聚醣系統，可做為極具潛力的移植材料，此外，亦提供一種培養腎小管上皮細胞之方法，係將實務操作上難以培養的腎小管上皮細胞培養於幾丁聚醣基質，且於無血清的情況下，該腎小管上皮細胞可順利生長，且正常表現其作為腎小管上皮細胞應有的通透性以及分泌吸收特徵。該包含腎小管上皮細胞之幾丁聚醣培養系統，由於不含血清且生物相容性佳，是作為移植材料的不二選擇。
於本發明之一態樣中，提供一種植入體，可應用於例如角膜或腎臟植入手術。該植入體包括幾丁聚醣基質以及培養於該幾丁聚醣基質中之腎小管上皮細胞。
本發明另一態樣在於提供該植入體之製造方法，包括提供一幾丁聚醣基質，接著將上皮細胞種植於該幾丁聚醣基質上；以及加入一生長培養液，於一般細胞培養環境(37℃，5% CO2 )培養之。
上述幾丁聚醣基質，如圖1所式，係以下述步驟製得：(A)起始步驟，形成一幾丁聚醣溶液；(B)乾燥步驟，係將該幾丁聚醣溶液形成一幾丁聚醣基材；(C)中和步驟，係於該幾丁聚醣基材加入鹼性溶液；以及(D)潤洗步驟。其中，該幾丁聚醣基材的形式並無特別限制，可為薄膜、片狀或纖維狀等。
由於幾丁聚醣不溶於水，本發明所使用之幾丁聚醣溶液，係將幾丁聚醣粉末溶解於一酸性溶液中而製得，該酸性溶液可為醋酸溶液、鹽酸溶液、或乳酸溶液，較佳為醋酸溶液，該醋酸溶液濃度可為1%至5%之間，較佳為2%至3%，然本發明對此並無特別限制。
於本發明中，該幾丁聚醣溶液置於一適當容器中，使其得以進行後續的乾燥步驟。該乾燥步驟係於溫度30℃至70℃環境下進行，較佳為40℃至60℃，更佳為50℃至60℃，本發明對於乾燥溫度並無特別限制，只要能夠使該幾丁聚醣溶液乾燥即可。
乾燥後的幾丁聚醣溶液形成一幾丁聚醣基材，為了應用於細胞培養技術，將鹼性溶液加入酸性的幾丁聚醣基材中，該鹼性溶液為氫氧化鈉。
上述用於中和步驟之氫氧化鈉溶液，其當量濃度範圍較佳為0.2N至1.0N，更佳為約0.5N。
為了避免細胞因材料受到汙染，影響細胞正常生長與後續植入生物體的應用，本發明之幾丁聚醣基質的製備方法中，於該中和步驟之後更包括一滅菌步驟(C-1)。習知能夠用以滅菌的方式，只要不影響幾丁聚醣基質特性者，皆可應用於本步驟中，較佳為醫療器材使用的滅菌法，如高壓蒸氣法、放射線法、或環氧乙烷法，較佳為利用放射線法。
本發明之幾丁聚醣基質的製備方法包括最後的潤洗步驟，係以一中性溶液潤洗該幾丁聚醣基材，以去除上述步驟中可能殘留的化學溶液。上述的中性溶液較佳為生理緩衝溶液，如生理食鹽水、磷酸鹽緩衝溶液、一次水或二次水，經此步驟後，即完成本發明之幾丁聚醣基質。
將腎小管上皮細胞種植(seeding)於該幾丁聚醣基質上，待其穩定生長後，進一步加入生長培養液，並置於適當環境細胞培養環境(37℃，5% CO2 )，使細胞得以於該幾丁聚醣基質上生長，包含穩定生長的腎小管上皮細胞之幾丁聚醣基質即為本發明之植入體。
為了避免腎小管近端上皮細胞以有血清環境培養的環境下，導致其纖維化使其功能下降，本發明使用無血清生長培養液作為生長培養液，該無血清生長培養液之基底培養液係以DMEM與角質細胞無血清培養液，以1：1混合而成，然而本發明並不限於此。特別是，該無血清生長培養 液中，較佳為包括20 μg/mL至100 μg/mL牛腦垂體提取物、2 ng/mL至50 ng/mL之表皮生長因子、1 μg/mL至20 μg/mL胰島素、1 μg/mL至20 μg/mL運鐵蛋白、1 ng/mL至20 ng/mL亞硒酸鈉、以及10-1 M至10-5 M皮質醇，除上述添加劑外，更佳為包括霍亂毒素，其濃度較佳為5 ng/mL至50 ng/mL。
現在，參考隨附圖式，將於此更加詳述本發明的示例性實施例，但應注意本發明的範疇並非僅限於所舉出之實施例。本創作亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本創作之精神下進行各種修飾與變更。
分離大鼠腎近曲小管
8周大的公威斯達(Wistar)大鼠以乙醚麻醉，對其腹主動脈穿刺置管後，腎臟先以50 mL的無鈣鎂HBSS潤洗(GIBCO，cat.No.14185)，接著灌入30 mL，含有60 mg膠原蛋白酶(type II，Sigma，cat.no.c6885)的鈣鎂HBSS(GIBCO，cat.No.14165)。於原位分解(in situ digest)後，該腎臟移至滅菌的培養皿並以HBSS潤洗。將該腎臟解剖並分離出腎皮質，切碎並置於含有30 mg膠原蛋白酶的HBSS，於37℃處理5分鐘。腎小管部分的製備係透過篩子(孔徑為125 um)進行分離，並以新鮮的HBSS，以500 rpm離心5分鐘的方式潤洗三次。該腎小管於4℃下，重新懸浮於 度梯度(Pharamacia Biotech，cat.no.17089101)，於4℃以14,500 rpm離心30分鐘，將腎元片段純化得到近端腎小管，即為最低的條帶(band)。將該腎小管近端組織團塊重新懸浮於生長培養液中，該生長培養液混合一份DMEM以及一份角質細胞無血清培養液(添加有50 μg/mL的牛腦垂體提取物、10 ng/mL的表皮生長因子、5 μg/mL的胰島素、5 μg/mL運鐵蛋白、5 ng/mL亞硒酸鈉、10-3 M皮質醇、0.5% DMSO、30 ng/mL霍亂毒素、以及1%抗生素)。
實施例：製備幾丁聚醣培養基
0.2 mL濃度為0.5%(w/w)之幾丁聚醣水溶液(脫乙烯基度≧85%，sigma-Aldrich，St.Louis，cat.No.c-3646)溶於3%(w/v)之醋酸中，加入24孔組織培養盤(Corning Costar)中並且於60℃乾燥48小時。接著，以0.5N氫氧化鈉對其中和1小時。該培養盤以紫外光隔夜照射後，以滅菌之磷酸鹽緩衝液(PBS)潤洗之。
比較例：製備膠原蛋白培養基
將原濃度為3.87 mg/ml之第一型膠原蛋白溶液以0.5N醋酸水溶液稀釋為濃度20 μg/ml之膠原蛋白溶液，加入組織培養盤(Corning Costar)靜置於室溫30分鐘。接著以滅菌之PBS潤洗之。
上述方法分離之腎小管近端上皮細胞分別培養於幾丁聚醣培養基(實施例)以及膠原蛋白培養基(比較例)，其培養條件皆為37℃、5%的CO2 ，每天更換上述生長培養液。接下來，針對培養於幾丁聚醣培養基與膠原蛋白培養基之腎 下來，針對培養於幾丁聚醣培養基與膠原蛋白培養基之腎小管上皮細胞生長情況以及其生理功能兩部分進行分析，如下所述：
腎小管上皮細胞之生長情況
於上述生長條件培養之腎小管上皮細胞，分別於第4天與第8天時，顯微鏡下(100X)觀察培養於幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞外觀。如圖2所示，可發現在第8天的時候，特別是幾丁聚醣培養基的腎小管上皮細胞生長情況良好，已經滿盤。
增殖細胞核抗原Ki-67的是一種與細胞週期相關的蛋白質，因此可用以作為細胞生長的指標。如圖3所示，進一步利用生長指標Ki-67對於幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞以螢光染色法進行測試，圖3紅色部分即為Ki-67，而藍色部分為細胞核(DAPI染色)，可見培養於幾丁聚醣培養基(實施例)之腎小管上皮細胞生長情況較培養於膠原蛋白培養基(比較例)者佳。
腎小管上皮細胞之生理功能
圓頂化(dome formation)通常被視為再吸收功能的重現，因此做為腎小管上皮細胞生理功能評估的首要觀察對象。如圖4所示，以活細胞螢光染劑對腎小管上皮細胞染色，其中，綠色(鈣黃綠素AM染劑，calcein AM dye)表示圓頂化的細胞，紅色(乙啶同源二聚體染劑，ethidium homodimer dye)表示死亡的細胞。螢光顯微鏡之焦點對準匯 合的生長在培養皿中的細胞層，結果可觀察腎小管上皮細胞皆有圓頂化的表現。
緊密連接(Tight junction，TJ)是維持黏膜上皮機械屏障和通透性的重要結構，而緊密連接蛋白ZO-1是其重要組成蛋白之一，該蛋白參與調節細胞物質轉運和維持上皮極性的重要功能。圖5為幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞以螢光染色法以及西方墨點法測試其緊密連接蛋白ZO-1的表現，可見無論培養於於幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)，腎小管上皮細胞均表現有緊密連接蛋白ZO-1。
鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是廣泛表現於腎小管上皮細胞絨毛的一種酵素，該酵素活性亦用以作為臨床腎臟功能的指標之一。比較幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞之鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，APL)，圖6所示，培養於幾丁聚醣培養基(實施例)者較膠原蛋白培養基(比較例)者多了約4倍的鹼性磷酸酶活性。
跨上皮電阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)值是用來判斷細胞單層膜的完整性以及離子傳輸的指標。將腎小管上皮細胞分別培養於幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)約7至9日，直到細胞長成一單層結構。圖7中，以膠原蛋白培養基(比較例)細胞之跨上皮電阻值為100%，則幾丁聚醣培養基(實施例)組別細胞所 展現的跨上皮電阻值僅為其之四分之一，顯示較高之水與離子通透性。
最後針對鈉鉀泵(Na+ /K+ -ATPase)進行分析。鈉鉀是一種位於細胞膜上離子匣式跨膜ATP酶，將細胞內相對高濃度的鉀離子送進細胞，並將相對低濃度的鈉離子送出細胞以維持細胞保持在靜止電位，由此可知，鈉鉀泵功能也是表皮細胞生理重要指標之一。利用鈉鉀泵抗體對腎小管上皮細胞進行染色(紅色)，並利用雷射掃描式顯微鏡觀察。如圖8所示，培養於幾丁聚醣培養基(實施例)之腎小管上皮細胞廣泛的表現鈉鉀泵，而培養於膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞鈉鉀泵表現明顯減少許多，此外，由西方墨點法偵測鈉鉀泵α-1子單元的表現可發現其表現量於幾丁聚醣培養基(實施例)之細胞明顯多於膠原蛋白培養基(比較例)之細胞。
作為角膜植入體
首先如上述方法製得一幾丁聚醣基材，並將腎小管上皮細胞培養於該幾丁聚醣基材上並添加生長培養液，待細胞穩定生長後，即可將含有腎小管上皮細胞之幾丁聚醣基質作為植入體。以4隻重約2.0至2.4公斤的紐西蘭大白兔做為對象，將植入體置入紐西蘭大白兔的右眼。具體的實驗步驟係消毒並確保操作現場無菌後，將6毫米的鞏膜切口用狹縫刀以及高黏稠劑(Healon；Amersham Pharmacia Biotech AB公司)注入紐西蘭大白兔眼睛前房。將上述植入體置入前房，並固定於角膜基質，接著，以10-0尼龍縫線(Mani， Tochigi，Japan)將傷口縫合(如圖9所示)。觀察植入該植入體的紐西蘭大白兔眼睛期間，在未額外添加免疫抑制劑的情況下，並未觀察到兔子對於該植入體有如發炎等等排斥的不良反應，證實該植入體具有生物相容性。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
S1-S4‧‧‧操作流程
圖1係本發明之操作流程。
圖2係根據本發明一實施例，於顯微鏡下(100X)之幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞外觀。
圖3係根據本發明一實施例，以螢光染色法測試幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞之生長指標Ki-67。
圖4係根據本發明一實施例，以活細胞螢光染劑對腎小管上皮細胞染色確認圓頂化現象發生。
圖5係根據本發明一實施例，以螢光染色法及西方墨點法測試幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1之表現。
圖6係根據本發明一實施例，幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之腎小管上皮細胞鹼性磷酸酶活性。
圖7係根據本發明一實施例，幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之近端腎小管之跨上皮電阻值。
圖8係根據本發明一實施例，以免疫染色法及西方墨點法測試幾丁聚醣培養基(實施例)與膠原蛋白培養基(比較例)之近端腎小管之鈉鉀泵。
圖9係根據本發明一實施例，將植入體移植入紐西蘭大白兔的右眼。
S1-S4‧‧‧操作流程

Claims (14)

  1. 一種植入體，係由一幾丁聚醣基質以及一腎小管上皮細胞所組成；其中，該腎小管上皮細胞係培養於該幾丁聚醣基質中。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之植入體，其中，該腎小管上皮細胞係一腎小管近端上皮細胞。
  3. 一種植入體製造方法，包括：提供一幾丁聚醣基質，種植一腎小管上皮細胞於該幾丁聚醣基質上；以及添加一生長培養液，其係一無血清生長培養液，且包括一牛腦垂體提取物、一表皮生長因子、一胰島素、一運鐵蛋白、一亞硒酸鈉、以及一皮質醇。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之植入體製造方法，其中，該幾丁聚醣基質係以下述步驟製得：(A)起始步驟，形成一幾丁聚醣溶液；(B)乾燥步驟，係將該幾丁聚醣溶液形成一幾丁聚醣基材；(C)中和步驟，係於該幾丁聚醣基材加入鹼性溶液；以及(D)潤洗步驟。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之植入體製造方法，該幾丁聚醣溶液係將幾丁聚醣粉末溶解於一酸性溶液中而製得。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之植入體製造方法，其中，該酸性溶液為一醋酸溶液、一鹽酸溶液、或一乳酸溶液。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之植入體製造方法，其中，該乾燥步驟係於溫度30℃至70℃環境下進行。
  8. 如申請專利範圍第4項所述之植入體製造方法，其中，該鹼性溶液為一氫氧化鈉。
  9. 如申請專利範圍第4項所述之植入體製造方法，其中，於該(C)步驟之後更包括一滅菌步驟(C-1)。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之植入體製造方法，其中，該滅菌步驟(C-1)係一高壓蒸氣法、一放射線法、或一環氧乙烷法。
  11. 如申請專利範圍第4項所述之植入體製造方法，其中，該潤洗步驟(D)係以一中性溶液潤洗該幾丁聚醣基材。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之植入體製造方法，其中，該中性溶液係生理食鹽水、磷酸鹽緩衝液、一次水或二次水。
  13. 如申請專利範圍第3項所述之植入體製造方法，其中，該腎小管上皮細胞係一腎小管近端上皮細胞。
  14. 如申請專利範圍第3項所述之植入體製造方法，其中，該無血清生長培養液中，更包括一霍亂毒素。
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