TWI451872B - 應用於美白及抗氧化之魚針草內酯 - Google Patents

Description

應用於美白及抗氧化之魚針草內酯

本發明是有關於一種魚針草內酯及含有魚針草內酯之魚針草甲醇粗萃物之用途，且特別是有關於一種用於製備美白及抗氧化之藥物之魚針草內酯及含有魚針草內酯之魚針草甲醇粗萃物之用途。

一般而言，細胞內具有多種酵素以及代謝途徑可用以最小化細胞所受之氧化傷害。紫外線輻射會造成蛋白質氧化、DNA之損害以及誘使皮膚之活性氧分子的生成，因而造成老化相關之疾病甚或黑色素(melanin)之生成。

黑色素生成自黑色素細胞(melanocyte)，且黑色素主要之功能係為抵抗皮膚遭受紫外線輻射之傷害。然而，黑色素過量之生產以及其於皮膚當中之含量累積會造成多種之皮膚病變，例如黑斑、老年斑、雀斑以及其他過度色素沉澱之相關病徵。酪氨酸酶是黑色素生成之過程當中影響反應速率決定步驟的關鍵酵素。其中，此步驟是將左旋酪氨酸(L-tyrosine)轉換為左旋多巴(L-DOPA)，而左旋多巴可再進一步地被氧化成鄰醌(O-quinone)。因此，酪氨酸酶是用以篩選抑制黑色素生成之抑制劑的首要標的。

近年來，許多黑色素生成之抑制劑被大量的應用於防止色素沉澱之皮膚保養品中。令人驚訝地是，研究報導指出黑色素生成的過程當中會產生過氧化氫以及其他之活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)，而這些活性氧分子會 使得黑色素細胞承受強大的氧化壓力(oxidative stress)。活性氧分子(ROS)例如單態氧(singlet oxygen)、氧分子(molecular oxygen)、過氧化氫(H₂ O₂ )等，其皆可起始氧化反應並產生自由基分子。自由基是具有獨立且不成對電子的原子、分子或離子。舉例言之，超氧化離子(superoxide anion)、氫氧自由基(hydroxyl radical)以及過氧化自由基(peroxyl radical)即為具有短週期特性及化學活性之三個常見的自由基。另一方面，活性氧分子清除劑(ROS scavenger)以及活性氧分子生成反應之抑制劑皆會抑制紫外線輻射誘導之黑色素生成反應，代表著活性氧分子對於黑色素生成之調控作用扮演重要的角色。因此，許多市售美白產品皆包含抗氧化劑例如維生素C及其衍生物，或者還原態的胱甘肽(reduced glutathione,GSH)，以應用於抑制黑色素生成反應。

然而，以天然植物性抗氧化劑預防以及保護受紫外線輻射傷害之人類皮膚，仍是現今美白與抗氧化的重要研究方向。

魚針草(Anisomeles indica)，為唇形科(Labiatae)之一年生草本植物，其被廣泛地運用於諸多傳統中醫學之中草藥成分。因此，本發明之目的在於提供一種魚針草之甲醇粗萃物及純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯(ovatodiolide)在皮膚改質上的應用。

本發明之一態樣是在提供一種純化自魚針草甲醇粗萃 物的魚針草內酯之用途，其係用於製備美白的藥物。

根據本發明之第一實施例，前述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中美白的藥物係用以減少哺乳類動物皮膚中黑色素含量。

根據本發明之第二實施例，前述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中該美白的藥物係用以抑制黑色素生成。

根據本發明之第三實施例，前述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中該美白的藥物係藉由抑制酪氨酸酶之活性以抑制黑色素生成。

根據本發明之第四實施例，前述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中哺乳類動物為鼠類。

根據本發明之第五實施例，前述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中哺乳類動物為人類。

本發明之另一態樣是在提供一種純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其係用於製備抗氧化的藥物。根據本發明之實施例此抗氧化之用途係用以皮膚之改質。

藉由前述之用途，使得魚針草甲醇粗萃物及其魚針草內酯可以被廣泛地應用於皮膚病學或者醫學美容上，包含抗黑色素之沉澱、美白以及抗氧化之用途。更進一步地說，依據此等用途，更可以將魚針草甲醇粗萃物及其魚針草內酯進一步添加入皮膚保養之產品使用。

一年生草本植物魚針草被廣泛地運用於諸多傳統中醫 學之中草藥成分。魚針草之粗萃物可以用以抑制發炎反應以及腫瘤之增生，且魚針草之水相粗萃物更具有抗阻織胺、抗痛敏以止痛之效用，魚針草之乙醇粗萃物且具有抗菌活性。

本發明提供一種純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其係藉由抑制酪氨酸酶之活性而抑制黑色素生成及/或轉移，並將之應用於美白以及皮膚之改質。另外，本發明亦提供一種減少哺乳動物皮膚中黑色素含量的方法，包括將前述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯傳輸至一哺乳動物，此哺乳動物可為鼠類或人類。其中，前述傳輸之方法可以是注射、口服或者直接塗抹於前述哺乳動物之皮膚。

此外，本發明另提供一種含有前述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯的魚針草甲醇粗萃物之用途，其係應用於抗氧化。此抗氧化之用途係用以皮膚之改質，且本發明亦提供一種哺乳動物皮膚之抗氧化的方法，包括將前述之魚針草甲醇粗萃物傳輸至一哺乳動物。其中，前述傳輸之方法可以是注射、口服或者直接塗抹於前述哺乳動物之皮膚。

前述本發明之用途的詳細試驗例揭露如后。

試驗之材料與試劑

本發明試驗例所使用之沒食子酸(Gallic acid)，左旋抗壞血酸(維生素C)(L-ascorbic acid)，福林-西奧卡特酚試劑(Folin-Ciocalteau’s phenol reagent)，二苯代苦味酰基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)，二丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)以及其他所有之化學試劑皆購於西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)或默克公司(Merck)。

試驗之植物材料、粗萃物之萃取以及魚針草內酯之純化

下列試驗例所使用之魚針草於2010年9月取自於所屬優生生物科技股份有限公司之農場(台灣，台中市)。

魚針草粗萃物之萃取及魚針草內酯之純化

在將魚針草風乾後，取7.8 kg乾燥之魚針草加以均質，進行甲醇之迴流萃取，並連續抽取四次，每次10 ml。萃取完成後將萃取液減壓濃縮，直至萃取液形成暗褐色濃稠狀(296 g,4.1% w/w)即甲醇粗萃物。此甲醇粗萃物以水回溶並以正己烷(n-hexane)脫脂，接著以氯仿(chloroform)進行分配萃取並得到氯仿層(chloroform layer)。氯仿層濃縮後(59 g)，藉由矽膠管柱層析法(silica gel chromatography)，以沖堤溶液(己烷(hexane)/乙酸乙酯(ethyl acetic acid,EtOAc))比例之改變產生漸增極性 之方式沖堤氯仿層，並依據沖堤之時間取得分成數個分管(fractions)。取魚針草內酯含量最多之分管，再藉由高效能液相層析法(HPLC)予以分離、純化而得到純化之魚針草內酯。更詳細之分離以及純化之流程為該領域具有通常知識者所熟知之習知技藝，因此在此不加以贅述。

細胞之培養

下列試驗例之B16F10(ATCC number：CRL-6475)黑色瘤細胞取自於生物資源保存及研究中心，其寄存之編號為BCRC60031。B16F10黑色瘤細胞培養於混合了10%的胎牛血清(fetal calf serum,FBS)之杜貝爾修正伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)。此外，B16F10黑色瘤細胞之培養環境為37℃以及大氣中維持5% CO₂ 濃度。

試驗例I

美白活性測試

(1)細胞外酪胺酸酶活性之分析 (蕈菇類酪胺酸酶活性試管試驗 )

於96孔盤中依序加入120μl 5mM左旋多巴(3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)、40μl待測魚針草內酯及40μl酪氨酸酶(tyrosinase)(2 units/well)及溶液後，於37℃中反應10分鐘，測波長490 nm吸光值 (O.D.₄₉₀ )。並以200 μM、400 μM麴酸(kojic acid)及去離子水為其正對照組和空白組。

請參照下列表1以及第1圖，其中第1圖係繪示魚針草甲醇粗萃物(以Anisomeles indica表示之)進行測定抑制蕈菇酪胺酸酶活性的測試結果。結果顯示，與空白組比較，試驗濃度為1.0、1.5和2.0 mg/mL的酪胺酸酶活性分別是71.66±1.46%、68.29±1.47%和66.46±2.36%。而200和400 μM的正向控制組kojic acid的酪胺酸酶活性則分別是56.99±0.50%和37.99±0.64%。結果顯示魚針草甲醇粗萃物具有對抑制蕈菇酪胺酸酶活性的能力。(^＊ 代表相較於空白組之p 值<0.001)

(2)細胞內酪胺酸酶活性之分析

藉由測量多巴醌(dopachrome)自氧化抑制率，以瞭解魚針草內酯(ovatodiolide)能否能抑制B16F10黑色瘤細胞之酪胺酸酶活性。將1×106個細胞數的B16F10細胞種入含有100nMα -黑素細胞刺激素(α-MSH)的培養基的10cm培養皿(petri-dish)中，於37℃，5% CO₂ 中培養24小時後，移除培養基和未貼壁的細胞後，再加入新鮮培 養基並處理不同濃度的測試樣品，再於37℃，5% CO₂ 中培養24小時後，利用磷酸鹽緩衝液(Phosphate Buffer Solution,PBS)清洗2次後，再使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)將細胞脫離培養皿，經過1500轉/分鐘之轉速離心5分鐘後，移除上清液並加入500μl的細胞裂解液(RIPA buffer)，再將其置於冰上60分鐘，每10分鐘震盪5秒，使其裂解完全。再將細胞萃取物以12000轉/分鐘之轉速於4℃離心20分鐘，抽取其上清液80μl，並加入20μl L-DOPA(2mg/ml)於96孔盤中，在37℃中反應10分鐘後，測波長490 nm吸光值(O.D.₄₉₀ )，並以培養基中含有2mM熊果素(arbutin)及0.1%二甲基亞碸(DMSO)為其正控制組和空白組，而以α -黑素細胞刺激素(α-MSH)培養24小時之細胞為控制組。

請參照下列表2以及第2圖，其中第2圖係繪示魚針草內酯(ovatodiolide)進行測定抑制B16F10黑色素瘤細胞內酪胺酸酶活性的測試結果。結果顯示，與控制組比較，魚針草內酯試驗濃度為5、12.5 μM和25 μM的酪胺酸酶活性分別是為控制組的66.8±9.31%、65.37±8.81%和50.65±3.66%。而正向控制組2mM熊果素(arbutin)的酪胺酸酶活性則為57.62±4.18%。結果顯示魚針草內酯具有抑制細胞內酪胺酸酶活性的能力。(^＊ 代表相較於控制組之p 值<0.05)

(3)細胞內黑色素含量之分析

魚針草內酯(ovatodiolide)降低B16F10黑色瘤細胞之黑色素形成試驗。將1×106個細胞數的B16F10細胞種入含有100nM α-MSH的培養基的10cm petri-dish中，於37℃，5%二氧化碳(CO₂ )中培養24小時後，移除培養基和未貼壁的細胞，再加入新鮮培養基並處理不同濃度的測試樣品，並於37℃，5% CO₂ 中培養24小時。之後，利用PBS清洗2次，使用Trypsin-EDTA將細胞脫離培養皿。脫離之細胞經過1500轉/分鐘之轉速離心5分鐘後，移除上清液並加入200μl 1N氫氧化鈉(NaOH)，並於80℃水浴槽中作用1小時，再將其放置室溫中冷卻，測波長405 nm吸光值(O.D.₄₀₅ )。並以含有2 mM熊果素(arbutin)及0.1% DMSO之培養基作為其正對照組和空白組，而以α -黑素細胞刺激素(α-MSH)培養24小時之細胞為控制組。

請參照下列表3以及第3圖，其中第3圖係繪示魚針草內酯(ovatodiolide)進行測定抑制B16F10黑色素瘤細胞內黑色素含量的測試結果。結果顯示，與控制組比較，魚針草內酯試驗濃度為5、12.5 μM和25 μM的細胞內黑色素含量分別是為控制組的94.76±3.39%、71.53±3.89%和 58.97±3.71%。而正向控制組2 mM arbutin的黑色素含量則為57.62±4.18%。因此，魚針草內酯具有抑制細胞內黑色素生成的能力。(^＊ 代表相較於控制組之p 值<0.05)

試驗例II

抗氧化活性測試

(1)二苯代苦味酰基 (1,1-diphenyl-2-picryl-hydyazyl,DPPH )自由基清除能力測定

先配製0.4 mM DPPH甲醇溶液後，取96孔盤，於每個孔洞中加入100μl不同濃度的魚針草甲醇粗萃物，再接著添加25μl DPPH甲醇溶液並均勻混合，放置室溫反應30分鐘後，使用多功能微量盤偵測儀(ELISA reader)測讀波長490nm之吸光值(O.D.₄₉₀ )。此實驗正控制組為維生素C。DPPH捕捉能力(%)之計算公式為{[A0-(A1-B1)]/A0}×100%；A0=空白試劑(blank)；A1=測試試劑(test sample)；B1=測試試劑背景值。

請參照下列表4以及第4圖，其中第4圖係繪示魚針草甲醇粗萃物進行測定DPPH自由基清除能力的測試結 果。結果顯示，與空白組比較，試驗濃度為0.05、0.1、0.25、0.5和1.0 mg/mL的DPPH清除能力分別是8.41±0.56%、23.82±1.19%、56.68±0.83%、84.70±0.43%和83.62±0.35%。而0.025和0.05 mg/mL的正向控制組維生素C(Vitamin C,Vit.C)的DPPH清除能力則分別是91.81±0.35%和92.46±0.25%。結果顯示魚針草粗萃物具有DPPH自由基清除能力。(^＊ 代表相較於空白組之p 值<0.001)

(2)螯合金屬離子之能力測定

先取1ml待測試劑於試管中，加入0.05 ml 1mM氯化亞鐵(FeCl2)甲醇溶液，混合均勻，避光靜置30秒。再加入0.1 ml 5mM菲洛嗪(Ferrozine)溶液。混合均勻後避光靜置反應10分鐘後。於波長562 nm測吸光值(O.D.₅₆₂ )。此實驗正控制組為乙二胺四乙酸(EDTA)。亞鐵離子抑制率(%)之計算公式為[(A0-A1)/A0]×100%；A0=空白試劑(blank)；A1=測試試劑(test sample)。

請參照下列表5以及第5圖，其中第5圖係繪示魚針草甲醇粗萃物進行測定對金屬離子螯合能力測試。結果顯示，與空白組比較，試驗濃度為0.125、0.25、0.5和1.0 mg/mL的金屬離子螯合能力分別是14.99±4.07%、37.65±3.90%、 78.51±1.74%和91.26±1.24%。而0.025、0.05和0.1 mg/mL的正向控制組Na₂ EDTA的金屬離子螯合能力則分別是95.24±2.15%、99.53±0.05%和99.03±0.89%。結果顯示魚針草甲醇粗萃物具有金屬離子螯合能力，由此得知魚針草甲醇粗萃物具有明顯的抗氧化能力。(^＊ 代表相較於空白組之p 值<0.001)

(3)還原能力測定 (Determination of reducing power )

先取0.25ml待測試劑於試管中，再加入0.25 ml 0.2M的磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffer)(pH 6.6)和0.25ml 1%赤血鹽(Potassium ferricyanide(III)；K3Fe(CN)6)後，混合均勻，放置於50℃水浴槽中反應20分鐘後立即冰浴冷卻，再加入0.25ml 10%三氯酯酸(Trichloroacetic acid；TCA)混合，以3000轉/分鐘轉速離心10分鐘；取0.5ml上清液、再加入0.5 ml去離子水和0.1ml 0.1%氯化鐵(FeCl₃ )混合，避光靜置10分鐘後，於波長700 nm測吸光值(O.D.₇₀₀ )。此實驗正控制組為維生素C。還原能力(%)之計算公式為[(A1-A0)/(C-A0)]×100%；A0=空白試劑(blank)；A1=測試試劑(test sample)；C=最高濃度之正 控制組(positive control)。

請參照下列表6以及第6圖，其中第6圖係繪示魚針草甲醇萃取物進行測定對金屬離子氧化的還原能力測試結果。結果顯示，與空白組比較，試驗濃度為0.125、0.25、0.5和1.0 mg/mL的還原能力分別是15.52±0.18%、24.37±0.90%、38.15±0.99%和70.88±1.93%。而0.025和0.05 mg/mL的正向控制組維生素C的還原能力則分別是56.02±0.89%和100.00±1.41%。結果顯示魚針草甲醇粗萃物具有對金屬離子氧化的還原能力。(^＊ 代表相較於空白組之p 值<0.001)

(4)2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid),ABTS.+ )自由基清除能力測定

先取1.5ml去離子水於試管中，再加入0.25ml 1mM ABTS溶液混合均勻、隨即加入0.25ml 0.5mM的過氧化氫(H₂ O₂ )溶液和0.25ml的過氧化酶(peroxidase)(44 units/ml)，避光反應1小時後，取出試管加入0.25 ml配製完成之待測試劑，再次均勻混合，避光反應10分鐘，於波長734 nm測吸光值(O.D.₇₃₄ )。此實驗正控制組為維生 素C。ABTS.+自由基清除率(%)之計算公式為[(A1-A0)/(C-A0)]×100%；A0=空白試劑(blank)；A1=測試試劑(test sample)；C=最高濃度之正控制組(positive control)。

請參照下列表7以及第7圖，其中第7圖係繪示魚針草甲醇萃取物進行測定ABTS^.+ 自由基清除能力的測試結果。結果顯示，與空白組比較，試驗濃度為0.125、0.25、0.5和1.0 mg/mL的ABTS^.+ 自由基清除能力分別是28.92±7.14%、49.02±8.62%、69.78±0.79%和95.48±3.91%。而0.025和0.05 mg/mL的正向控制組維生素C的ABTS^.+ 自由基清除能力則分別是60.36±1.47%和100±1.15%。結果顯示魚針草甲醇粗萃物具有ABTS^.+ 自由基清除能力。(^＊ 代表相較於空白組之p 值<0.001)

由上述本發明實施方式可知，應用本發明具有下列優點：

1.魚針草甲醇粗萃物具有突出之抗氧化功效，而黑色素生成之途徑與氧化作用密切相關，因此魚針草甲醇粗萃物更可以藉由抗氧化之特性而達到美白之效果。

2.魚針草內酯以及含有魚針草內酯的魚針草甲醇粗 萃物可以被廣泛地應用於皮膚病學或者醫學美容上，包含抗黑色素之沉澱、美白以及抗氧化等等皮膚改質之用途。

3.依據此等用途，更可以將魚針草內酯以及含有魚針草內酯的魚針草甲醇粗萃物進一步直接添加入皮膚保養之產品使用，且未來亦可再經由後製處理後以直接注射之方式將其直接傳輸至人類而進行皮膚之改質。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖係繪示魚針草甲醇萃取物進行測定抑制蕈菇酪胺酸酶活性的測試結果。

第2圖係繪示魚針草內酯進行測定抑制B16F10黑色素瘤細胞內酪胺酸酶活性的測試結果。

第3圖係繪示魚針草內酯進行測定抑制B16F10黑色素瘤細胞內黑色素含量的測試結果。

第4圖係繪示魚針草甲醇粗萃物進行測定DPPH自由基清除能力的測試結果。

第5圖係繪示魚針草甲醇粗萃物進行測定對金屬離子螯合能力測試。

第6圖係繪示魚針草甲醇粗萃物進行測定對金屬離子 氧化的還原能力測試結果。

第7圖係繪示魚針草甲醇粗萃物進行測定ABTS^.+ 自由基清除能力的測試結果。

Claims (9)

1. 一種純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其係用於製備美白的藥物。
2. 如請求項1所述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中該美白的藥物係用以減少哺乳動物皮膚中黑色素含量。
3. 如請求項2所述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中該美白的藥物係用以抑制黑色素生成。
4. 如請求項3所述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中該美白的藥物係藉由抑制酪氨酸酶之活性以抑制黑色素生成。
5. 如請求項2所述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中該哺乳動物為鼠類。
6. 如請求項2所述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，，其中該哺乳動物為人類。
7. 如請求項1所述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚 針草內酯之用途，其中該美白的藥物係用以皮膚之改質。
8. 一種純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其係用於製備抗氧化的藥物。
9. 如請求項8所述之純化自魚針草甲醇粗萃物的魚針草內酯之用途，其中該抗氧化的藥物係用以皮膚之改質。