TWI422685B - 篩選石斑魚種苗及／或種魚及／或加速育種之基因標誌、方法及套組 - Google Patents

Description

篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之基因標誌、方法及套組

本發明係有關一種水產養殖技術，詳言之，係有關篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之技術。

根據世界組織(FAO)之預測，世界水產品將在數年內供不應求，傳統漁撈由於過漁以及海域污染，於1992年後之捕獲量已逐年下降，且捕撈漁業之魚撈量估計已經達到極限，必須經水產養殖以彌補魚撈產品供應量不足，以應付全球市場對水產品之需求。

水產養殖業於人類文明發展上出現得極早，但直到近三十年來才開始受到重視並快速發展。我國水產養殖業以能養殖近120種苗貝類而著名國際，與日本，挪威同列世界三大水產養殖王國。

隨著海水養殖之快速發展，高密度的養殖也導致了一些新疾病的出現和蔓延，而這些病害的產生，已經嚴重影響到了海水魚類養殖的發展。目前台灣之水產養殖中，魚苗孵化部分是整個東南亞的第一名，也是魚苗及幼魚的重要輸出國，因此當疾病蔓延爆發時受到的影響也較大，再者，因為魚苗容易受到病毒的威染，一旦爆發疫情，就會造成魚苗在短時間內大量暴斃，而造成經濟上的嚴重損失。而陸上養殖方面，則在有限的土地資源下，使用高密度飼養方式，造成水質污染及地層下陷等問題，使得產量大幅縮減，疫病叢生使養殖戶經營困難。

石斑魚(Epinephelus spp.)分類上屬於硬骨魚綱鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑魚屬(Epinephelus)。石斑魚為肉食之暖水性魚類，分佈於熱帶及亞熱帶海域，此魚由於肉質細嫩豐美，自古以來就被視為桌上佳餚，也因其生活習性，過去無法以科學技術增加漁獲量。由於市場價值高為台灣與東南亞國家的最主要經濟養殖魚類。養殖石斑魚苗以往皆須經由捕撈取得，再養殖成大魚出售。多年來在不斷嘗試及研究改進之下，台灣於1982年首度以注射荷爾蒙的方式，成功繁殖馬拉巴(Epinephelus malabaricus )石斑魚，自此開啟了石斑魚的完全養殖時代，在飼養管理及種苗生產上，目前在世界上居於領先的地位。一般石斑魚養殖至少需8至12個月才達上市體型，但目前最後的養成率都不高，僅達放養魚卵的0.3%，極大原因來自養殖戶所購入之石斑魚苗優劣參雜，差異甚大，其中抗病力差之魚體往往受病毒侵襲而發病，加上高密度養殖，易使其它魚群受到病魚體內之大量病毒散布而感染。另一方面，一般養殖現場固定每隔一段時間，即必須針對不同大小之石斑魚體型採取分網養殖，以避免出現大量殘食行為之情況，因此，可顯現同時期養殖的魚卻於生長速度有明顯之差距。近幾年來，在養殖的過程中除了對於卵質無法進行鑑別以瞭解孵育率外，常常可以發現在石斑魚在從卵孵化到吋苗的這段期間內，小魚經常會有不正常如旋轉般的游動情況，稱為飛旋症(Spiralic disease)，而造成此種病徵所之疾病的死亡率極高，有時甚至高達90至100%，造成養殖業者的極大損失，已知造成此一疾病的原因是因為魚類受到神經壞死病毒(Nervous Necrosis Virus，NNV)感染後，所引起的魚體不正常游動及大量死亡的現象(Chi et al.,1997，J Fish Dis 20 185-193)。

NNV屬於野田病毒科(Nodaviridae)(Mori et al.,1992，Virology 187 368-371)的betanodavirus屬(Ball et al.,2000，Family Nodaviridae. In: Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses)，對魚類而言是一個重要的病毒性疾病，通常會感染魚苗，並且在感染後會引起魚的神經壞死(viral nervous necrosis，VNN)(Yoshikoshi及Inoue 1990，J Fish Dis 13 69-77)，腦脊髓炎(encephalomyelitis)和液泡形成、腦病和視網膜病變(vacuolating encephalopathy and retinopathy，VER)(Munday et al.,1992，Aquaculture 103 197-211；OIE，2000，Chapter 2.2.2. Viral encephalopathy and retinopathy. In: OIE Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases,3rd edn,pp. 69-73. OIE,Paris)，並造成大量死亡(Mori et al.,1992，Virology 187 368-371)。

目前用以檢測魚隻是否受到神經壞死病毒感染的方法包括：(1)以光學顯微鏡觀察魚的腦部、脊索或視網膜，但是不易觀察；(2)利用電子顯微鏡、血清學方法及分子生物學方法偵測魚體內是否有病毒顆粒、病毒抗原或其核酸的存在；(3)偵測魚血清或體液中是否有抗NNV抗體或抗原存在，如以重組的病毒鞘蛋白進行酵素連結免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay，ELISA)(Huang et al.,2001，J Fish Dis 24 135-142)，是目前最常用的方法；(4)對病毒進行細胞培養，目前可用的細胞株有可適用於所有基因型的魚類NNV的SSN-1(Frerichs et al.,1996，J Gen Virol 77 2067-2071；Iwamoto et al.,1999，Dis Aquat Organ 22 37-47)和可適用於石斑魚NNV的GF-1(Chi et al.,1999，J Fish Dis 22173-182；Chi et al.,1999，Virus Res 63 107-14)；(5)利用反轉錄聚合酶鏈反應(reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，針對神經壞死病毒的RNA2進行RT-PCR，此方法雖然有效，但是所使用的引子的感受性有時會有因為不同病毒間親源關係較遠而不易偵測(Thiry et al.,1999，J Fish Dis 22 201-207)。

由於神經壞死病毒會垂直感染傳至下一代(Arimoto et al.,1992，Fish Pathol 27 191-195；Comps et al.,1996，Aquaculture 143 113-121；Yoshimizu et al.,1997，Antibody screening for the identification of nervous necrosis carriers in flounder broodstock. In: Proceedings NRIA International Workshop on New Approaches to Viral Diseases of Aquatic Animals,Kyoto,pp. 124-130；Grotmol and Totland 2000，Dis Aquat Org 39 89-96)，並影響卵的孵育率，因此目前對於病毒性神經壞死症的防治方法僅有以臭氧洗卵(Arimoto et al.,1992 Fish Pathol 27 191-195；Grotmol and Totland 2000，Dis Aquat Org 39 89-96)方式對魚卵進行消毒，以減少魚卵上之病毒，降低發病之機率，此一方法雖然可以減少魚隻發病，惟一旦養殖槽中有魚苗發病，仍會造成該養殖槽多數魚苗也受到感染，大量死亡，加上目前並無法以投藥的方式治療魚類之病毒性疾病，因此在對抗病毒性神經壞死症的研究上，仍無有效之方法。

另一方面，卵質的重要指標為孵育率多寡，由於卵之孵育率取決於卵發育的能力，而卵發育的能力定義為具有可授精及完全發育形成正常的胚胎，特別是指胚胎發生基因表現之前。同時根據先前研究指出卵生成期間(oogenesis)卵的數量、各種生長因子累積、及胚胎發育過程是決定卵質的主要關鍵。對於較低等的脊椎動物，特別是魚類，卵累積大量的營養於卵黃為胚胎發育至孵出化到第一次開始攝食所需。因此，許多研究證明卵質和卵黃生成期間(vitellogenesis)藉由卵從母系來源隔離出卵脂蛋白營養，維生素，或荷爾蒙因子可能有重要相關性。雖然於卵孵化過程有限因子的角色已多有研究，但目前可利用作為於卵質可信的分子指標非常少，同時對於如何決定卵質好壞尚無法提供合理之生化基礎。因此卵質好壞的不確定性，對於養殖魚業造成嚴重的經濟損失。由於許多基因表現及環境因素會影響卵生成期間基因表現及早期胚胎發育，但相對於先前專注於卵黃的組成研究，目前仍缺少有關於魚類母系訊息RNA(mRNA)累積於卵中所扮演的角色與瞭解，雖然他們推測與決定卵質是具有相當的重要性(Brooks et al.,1997，Rev Fish Biol Fish 7 387-416)。

環視整個石斑魚水產養殖產業結構，死亡率的控制及優質石斑魚種苗的獲得仍是養殖業未能突破之瓶頸，因此開發可篩選出石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種，提升石斑種苗產業競爭力已然刻不容緩。

發明概述

本發明成功將篩選出的免疫相關基因、成長發育相關基因及環境感應相關基因，開發出多重基因標誌、方法及檢測套組，可作為篩選出石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種，此基因標識可進一步用於提升石斑魚優質種苗的生產及發展尖端石斑魚種苗產業，對於未來開發出更有效抗病毒、高發育、與抗寒的優質石斑魚種苗品系而言，具有極大的助益，極具技術應用性及商業開發價值。

本發明提供一種用以篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之基因標誌，其包含至少一基因，其選自由下列所組成之群：免疫相關基因、成長發育相關基因及環境感應相關基因。

本發明亦提供一種篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之方法，其包含檢測石斑魚種苗及/或種魚之前述之基因標誌。

本發明再提供一種用以篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之套組，其包含可檢測前述之基因標誌之試劑。

發明詳細說明

本發明提供一種用以篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之基因標誌，其包含至少一基因，其選自由下列所組成之群：免疫相關基因、成長發育相關基因及環境感應相關基因。

由於種苗之存活與免疫系統習習相關，因此根據本發明之基因標誌包含免疫相關基因。較佳地，該免疫相關基因係選自先天或後天免疫系統由干擾素家族(Interferon family)、Mx家族(Mx family)、蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)、細胞激素(cytokines)、細胞激素接受子(cytokine receptors)、CXCR4、rag1及rag2所組成之群。

免疫系統是生物體為了抵禦外來病原與保護自體安全所衍生出之獨特防禦機制。絕大多數的動物經外來病原入侵後，生物體會被誘發出兩種型態之免疫反應，分別為體液免疫反應(humoral immunity)與細胞免疫反應(cellular immunity)。所謂體液免疫反應就是B淋巴細胞受抗原活化形成漿細胞(plasma cell)後，分泌具專一性之免疫球蛋白(immunoglobulin)，即所謂的抗體(antibody)來清除外來物之免疫反應；而細胞免疫反應則是經由已活化之T淋巴細胞直接毒殺特定之入侵病原，以保護宿主之安全。一般而言，生物防禦外來病原入侵之機制可分為兩種，一種是先天性免疫(innate immunity)或又稱為非專一性免疫(nonspecific immunity)；另一種是後天免疫(acquired immunity)或又稱為專一性免疫(specific immunity)，藉由特定之免疫細胞如B淋巴球、T淋巴球消滅特定外來物，具有抗原專一性、多樣性、記憶性與自我辨識性四大主要特性。目前已知之免疫機制多為高等脊椎動物之模式，相對於魚類這些較低等、原始的脊椎動物而言，並不能完全適用。雖然目前在多種高等脊椎動物體內所知的重要免疫器官如胸腺、脾臟在魚類體內亦有發現，且具備相同功能，但就免疫系統的結構與形態而言仍存在著明顯的差異。目前在魚類的免疫相關器官，其確切的免疫作用機制截至目前為止尚未完全明瞭，整體而言，魚類的免疫系統雖較高等哺乳動物來的原始，也較缺乏效率，但卻已經具備現今高等脊椎動物免疫系統的雛形。所有的軟骨魚類(chondrichthyan fish)與硬骨魚類(osteichthyan fish)的免疫球蛋白僅表現一種免疫球蛋白，其結構與組成類似於高等哺乳動物的IgM。近年來一些研究也發現，魚類免疫球蛋白的親合力與多樣性相較於目前已知的高等脊椎動物明顯低了許多(Wilson and Warr,1992，Rev Fish Dis 2 201-221)。在1983年Tonegawa等人發現，B淋巴球的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)與T淋巴球的T細胞受器(T cell receptor，TCR)具有多樣性的現象主要是基因隨機重組的結果(Hozumi and Tonegawa,1976，Proc Natl Acad Sci U S A 73 3628-3632;Tonegawa,1983，Nature 302 575-581)，行基因隨機重組之功能基因Rag基因，其全名為重組活化蛋白基因，會產生一種特殊的RAG蛋白質，此RAG蛋白質會將原本位於不同基因座上的V(variable)、D(diversity)、J(joining)基因片段以隨機方式接合在一起，以產生數百萬種不同的免疫球蛋白(Ig)與T細胞接受器(TCR)。因此對於免疫分子指標可做為根據本發明之基因標誌。

另一方面，Mx屬於干擾素的下游調控基因，可藉由Mx基因以辨別魚隻是否受病毒感染，表現抗病毒基因蛋白相對表示魚隻處於干擾素表現活化狀態下，此時魚隻先天性免疫系統可能是處於警戒，而就此可以做一環境管理的警急措施，防止病原的擴散。

由於種苗之存活及卵孵化與成長習習相關，因此根據本發明之基因標誌包含成長發育相關基因，較佳地，其中該成長發育相關基因係選自由IGF-I、IGF-II、IGF受體Ib、p53、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine，sparc)、肌肉倍增基因(myostatin)、MyoD、凝集素(Lectin)及環素B所組成之群。

類胰島素成長因子I和II是多肽分子，已知可刺激許多脊椎動物細胞增生和分化，IGF mRNAs也出現在硬骨魚未受精的卵和早期的胚胎中(Greene and Chen,1999，Mol Reprod Dev 54 348-361；Perrot et al.,1999，Gen Comp Endocrinol 116 445-460)。

腫瘤抑制子p53於已分化的細胞中的細胞週期和細胞凋亡扮演一重要的角色，其對於細胞正常的發育所必須的，於硬骨魚中母系來源的p53轉錄子表現豐富於卵和早期的胚胎中(Cheng et al.,1997，Mol Mar Biol Biotechnol 6 88-97)，但對於包含於卵發育的能力仍未知。

於卵成長期間，環素B RNA於卵生長期間的儲存相關，環素B蛋白累積與分解是直接與早期細胞週期中H1磷酸酵素活性有關(Hartley et al.,1996，Dev Biol 173 408-419)，間接支持環素B累積可以控制早期胚胎細胞週期發生時間(Murray and Kirschner et al.,1989，Nature 339 275-280)。

肌肉倍增基因(myostatin)，亦稱為第八號生長分化因子(Growth and differentiation factor-8，GDF-8)，為轉化生長因子TGF-β家族中之成員。肌肉倍增基因可負向調控肌肉的生長分化。硬骨魚類的肌肉倍增基因表現則較無組織特異性，在許多組織中都可偵測到，但仍以肌肉組織中之相對表現量較高。

富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白，又稱骨結締蛋白(osteonectin)或BM40，為一種細胞基質醣蛋白，富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白主要表現於胚胎發育過程中，對細胞分化、組織鈣化生成、骨骼發育、型態及器官發育有極大影響，當於生物成體時此蛋白的表現量則降低。富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白專司細胞與細胞外基質之間的溝通橋樑，屬於調控性的蛋白質(Bornstein等人，J Cell Biol 1995；130：503-506)。除了對細胞的影響之外，在活體實驗中，在sparc基因剔除的老鼠(Bradshaw等人，2003)，可觀察到皮膚組成發生異常改變，脂肪層增厚，此外，內臟間的脂肪及附睪脂肪墊皆顯著增厚，脂肪細胞之體積亦變大及數目增多，血液中由脂肪細胞所分泌的瘦蛋白濃度上升，故推測富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白可能與調控脂肪有關(Chavey等人，Obisity 2006；14：1890-1897)。由於sparc基因所調控的功能如外觀的發育、細胞週期、免疫功能(Rempel等人，Genes Immun 2007；8：1-13)和脂肪生成都與養殖漁業的價值息息相關，為魚類研究上很重要的基因(廖中健，國立成功大學生物科技研究所碩士論文，2006)。

根據本發明亦利用石斑魚卵與組織二維電泳圖譜進行差異性蛋白比較與篩選，經由蛋白質定序工作後，進行石斑發育與免疫功能相關基因的選殖，其中熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)超家族(superfamily)中之sHsp、Hsp 70及Hsp 90具不同表現，因此根據本發明之基因標誌包含環境感應相關基因，較佳地，因此該環境感應相關基因係選自由熱休克蛋白超家族、熱休克同源蛋白70(heat shock cognate 70，HSC70)及熱休克因子(heat shock factor，HSF)超家族所組成之群。

根據本發明之各基因序列係已為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知，其係公開於前述各文獻或基因庫中，故本發明所屬技術領域中具通常知識者可設計合宜之檢測方法，以偵測該等基因之表現量，例如使用聚合酶鏈反應、反轉錄聚合酶鏈反應、即時聚合酶鏈反應等方法檢測基因之表現，或使用針對各基因產物特定之抗體以偵測該等基因產物之含量，並據以代表該基因之表現。較佳地，其係利用反轉錄聚合酶連鎖反應檢測該基因標誌之表現量；更佳地，其係利用即時反轉錄聚合酶連鎖反應檢測該基因標誌之表現量。本發明所屬技術領域中具通常知識者可利用相關商用序列分析軟體設計合宜之引子。

於本發明之一較佳具體實施例中，其係利用單一步驟複式反應式(one-step multiplex)分子檢測法檢測該基因標誌之表現量，例如同時使用針對不同基因設計之引子，同時進行聚合酶鏈反應。

本發明亦提供一種篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之方法，其包含檢測石斑魚種苗及/或種魚之前述之基因標誌。

較佳地，其係檢測石斑魚之卵或種魚魚鰭中該基因標誌。

本發明再提供一種用以篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之套組，其包含可檢測前述之基因標誌之試劑。

較佳地，根據本發明之套組包含反轉錄聚合酶連鎖反應之試劑；更佳地，其包含即時反轉錄聚合酶連鎖反應之試劑，及其包含針對該基因標誌特異之引子。

另一方面，根據本發明之套組包含單一步驟複式反應式分子檢測法之試劑。

於本發明之實施例中，針對免疫相關基因、成長發育相關基因及環境感應相關基因中四種標的基因標誌，進行RT-PCR條件調整，包含四種特異性引子序列設計、特異性引子相對反應濃度、擴增反應流程溫度與時間、整體反應試劑濃度等，並已完成石斑基因標誌多重檢測最佳化實施條件，可篩選出該基因標誌表現量高之種苗、種魚或魚卵。利用大量自養殖現場之石斑魚苗檢體，以最佳化條件之多重基因標誌檢測方法進行重複測試，並收集關於基因標誌多引子檢測反應區間結果，進行後續資料分析及修正設計，整合出一標準檢測流程，可作為用以篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之基因標誌，具備有效及高準確度之特性，且檢測方式為採用多重基因同時檢測，因此具備快速、便利性及成本低之優勢，有利於實際進入水產養殖產業協助漁民進行檢測作業，且已應用於點帶石斑、龍膽石斑之基因篩選。

茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。

實例1

材料及方法

石斑魚苗檢體採集

收集南部地區石斑魚種苗檢體，將各養殖場石斑魚檢體進行解剖或分解，從檢體中分離出RNA，以進行後續相關標的基因檢測。

利用RT-PCR技術進行多重標的基因標誌之條件測試與修正

(1)核酸之萃取

取石斑魚組織約100 mg放入微量離心管中，加入1 mL的TRIzolR試劑，用研磨棒研磨均勻，於室溫下靜置5分鐘；加入200 μL冰的氯仿，劇烈震盪20秒後在室溫下靜置5分鐘；以12000 x g在4℃下離心15分鐘；小心吸取上清液至另一新的微量離心管中，加入500 μL的異丙醇，劇烈震盪20秒後在室溫下靜置10分鐘；以12000 x g在4℃下離心15分鐘，去除上清液，以75%的酒精沖洗沉澱物，劇烈震盪20秒後，8500 x g在室溫下離心10分鐘；將上清液吸乾，殘留的酒精在室溫下風乾約十分鐘，以100 μL DEPC-處理之H₂ O回溶沉澱物，保存於-70℃冰箱中備用。

(2)反轉錄聚合酶鏈反應檢測

將上步驟抽取之RNA樣本，利用免疫相關基因Mx、成長相關基因IGF II、發育相關基因SPARC及環境感應相關基因Hsp 90等四種標的基因標誌之特異性引子(如下表1所示)，進行RT-PCR檢測。將上步驟抽取之RNA樣本取2 μL，加入5 μL MMLV反轉錄聚合酶緩衝液(5x)、特異性引子1 μL(20 μM)，補水至23 μL，於70℃下作用10分鐘後置於冰上冷卻；加入dNTP(10 mM)及MMLV反轉錄聚合酶各1 μL後，於42℃下作用60分鐘、95℃去活化15分鐘。取cDNA樣本5 μL，分別加入兩端特異性引子(20 μM)各1 μL、10 x PCR緩衝液5 μL、Tag聚合酶1 μL、dNTP 1 μL最後補足二次水至50 μL均勻混合，進行反應，條件為94℃ 5分鐘、之後於(94℃ 40秒、55℃ 40秒、72℃ 40秒)連續35個循環，最後以72℃ 5分鐘完成反應。

(3)核酸瓊脂膠體電泳分析

先配製1.5%的膠體；取1.8 g瓊脂粉末加入0.5 TBE緩衝液120 mL，加熱至沸騰，使粉末完全溶解，用攪拌石緩慢攪勻冷卻，冷卻至約60℃後，倒入鑄膠槽中，於室溫下凝固半小時。取鑄好的電泳膠片置入電泳槽中，倒入0.5 TBE緩衝液覆蓋膠片，將欲分析的樣本、DNA階梯標記與6倍DNA裝載染劑混合均勻後，鑄入膠片的井，以110伏特的電壓進行電泳30分鐘；取出膠片浸泡於溴化乙錠染劑10分鐘，泡在自來水中退染5分鐘，於紫外線照膠箱中觀察結果，並存取檔案。

多重基因標誌分子檢測結果數據分析

針對多重基因標誌擴增之結果，採用冷螢光分析技術，進行數據分析及統計，並同時與一般RT-PCR數據結果統合比較。

結果

石斑魚多重基因標誌檢測方法之變因調整及結果

(1)多重引子序列設計：

由於多重基因進行檢測時，將同時包含四種功能基因標的之擴增引子，因此，四種擴增引子組必須具備相當之特異性，方能避免引子對與引子對間，發生錯誤配對之情形，造成非預期目標基因之產物；或者造成干擾情形，導致某些目標基因可擴增產物，某些目標基因無法正常進行擴增反應。

(2)多重引子相對比例濃度：

進行多重引子同時擴增反應時，各引子對間之反應靈敏程度並非完全一致，因此，需透過調整引子對間之相對比例濃度，將其重新組合為可於同一擴增條件反應下，各引子皆擁有針對標的基因快速結合並擴增之能力。

(3)多重引子擴增作用溫度及反應循環數：

擴增反應之作用溫度主要關連者乃引子對本身之序列設計，包含其片段當中核苷酸之鍵結能力強弱，但又因本實例為一同時多重反應，仍需考量各引子對間在各不同反應溫度下，是否會產生干擾或反應不同步之情形，因此本實驗針對不同設計之多重引子組合進行連串之梯度升溫擴增反應，同時，亦將反應循環數之變因納入，以求得一最佳之作用溫度及反應循環時間，使引子對可充分反應且靈敏度高。

(4)整體試劑反應濃度：

多重基因標誌檢測之原理為提供一適當反應環境，使特異性引子對結合至目標基因之模股，進行作用。因此，反應環境之除溫度、反應時間之物理因素，尚包含緩衝液鹽類濃度、單一核苷酸濃度及聚合酵素濃度等化學變因。

本檢測方法經上述之變因調整，最終已可同時且準確擴增出四種反應產物如下：148bp，SPARC；219bp，Mx；313bp，Hsp 90；389bp，IGF II。如圖1所示。

田間試驗結果

本實驗於布袋、北門、將軍、七股、四草、鯤鯓、茄萣、永安、林園、林邊、枋寮等各地石斑養殖魚場，共收集20批次，達100尾魚體樣本，並依標準檢測程序，進行多重基因標誌檢測套組的池畔田間檢測作業，其結果如表2所示。

本實例另將初期20批次之檢測區間結果整合統計，當中包含生長、發育、免疫、抗逆境之各基因表現數據，可大致瞭解目前台灣養殖石斑魚之基因多樣性分佈情況，如圖2所示。

實例2

如前實例2所述之方法將篩選的公母魚，惟其中使用之基因標誌為Mx、IGF II、肌肉倍增基因(MSTN)及SPARC，隨機受精後，檢測A、B兩不同場次的卵其分子指標與孵化後的存活率，分析兩者之間的關聯性，經免疫及生長功能基因於A、B場次之表現量比較(圖3)，可得到B場次之魚卵於各基因之表現量皆較A場次理想，取A、B兩場次相同的魚苗數量，追蹤其孵化後的存活狀況，可觀察到B場之魚卵存活與生長情形皆較A場次佳，如下表3所示。

圖1為最佳化石斑基因標誌多重檢測技術，將具有抗病、生長、發育與抗逆境指標四種標的基因進行最佳化實施條件組合，由圖中可見多重基因擴增條帶，可同時於389bp、313bp、219bp、148bp出現擴增反應，另外，亦同時進行一般單一RT-PCR反應，圖中並可顯示，多重擴增反應與一般RT-PCR反應之反應靈敏度相當接近。

圖2顯台灣石斑魚基因分佈與多樣性情況。將20批次之田間試驗數據進行統計分析，以基因表現量之強弱劃分反應區間，由強至弱平均劃分A、B、C、D、E五個區域(A：表現量最高之頂標區，B：表現量次高之前標區，C：表現量持平之均標區，D：表現量次低之後標區，E：表現量最低之底標區)，再以生長(Growth)、發育(Development)、免疫(Immune)、抗逆境(Stress induce)之功能進行歸類，由圖中可見石斑魚各基因之多樣性分佈情況。

圖3為免疫及生長功能基因於A、B場次魚卵之表現量比較圖。

<110>　國立成功大學

<120>　篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之基因標誌、方法及套組

<130>　無

<160>　8

<170>　PatentIn version 3.3

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<212>　DNA

<213>　人工序列

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<210>　7

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　7

<210>　8

<211>　22

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　8

(無元件符號說明)

Claims (12)

1. 一種用以篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之基因標誌，其包含Mx基因、IGF-II基因、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine，sparc)基因及成長發育相關或環境感應相關基因，其中該成長發育相關或環境感應相關基因係選自由熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP 90)及肌肉倍增(myostatin)基因所組成之群。
2. 一種篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之方法，其包含檢測石斑魚種苗及/或種魚之根據請求項1之基因標誌。
3. 根據請求項2之方法，其係利用反轉錄聚合酶連鎖反應檢測該基因標誌之表現量。
4. 根據請求項3之方法，其係利用SEQ ID Nos.1至8所示序列之引子進行反轉錄聚合酶連鎖反應檢測該基因標誌之表現量。
5. 根據請求項3之方法，其係利用即時反轉錄聚合酶連鎖反應檢測該基因標誌之表現量。
6. 根據請求項2之方法，其係利用單一步驟複式反應式(one-step multiplex)分子檢測法檢測該基因標誌之表現量。
7. 根據請求項2之方法，其係檢測石斑魚之卵或種魚之魚鰭中該基因標誌。
8. 一種用以篩選石斑魚種苗及/或種魚及/或加速育種之套 組，其包含可檢測根據請求項1之基因標誌之試劑。
9. 根據請求項8之套組，其包含反轉錄聚合酶連鎖反應之試劑。
10. 根據請求項9之套組，其包含即時反轉錄聚合酶連鎖反應之試劑。
11. 根據請求項8之套組，其包含針對該基因標誌特異之引子，其中該引子具有SEQ ID Nos.1至8所示序列。
12. 根據請求項8之套組，其包含單一步驟複式反應式分子檢測法之試劑。