TWI419700B - 甘藷胰蛋白酶抑制因子用於治療發炎及痛敏感之用途 - Google Patents

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Description

甘藷胰蛋白酶抑制因子用於治療發炎及痛敏感之用途
本申請案主張2010年1月6日申請之美國臨時專利申請案第61/292,579號之優先權，該案之全文以引用的方式併入本文中。
使用脂多醣(LPS)激化小鼠巨噬細胞系(RAW 264.7)和活體內注射海藻糖之小鼠後掌水腫模式，在甘藷(Ipomoea batatas (L.)Lam.「台農57號」)之葉片及塊根中發現具有抗發炎和抗痛敏感效果之活性胰蛋白酶抑制因子(IbTI)。
文獻中已有兩種疼痛的描述：發炎痛和神經病理痛。發炎刺激因子，含病原體、非自身分子(例如，內毒素脂多醣)、老化或受損之自身分子，誘發細胞激素，其媒介組織於發炎的不同階段以依序且一致的方式反應，而可造成先天性免疫系統之活化、散播性血管內凝血、多器官衰竭、休克及甚至死亡(Rainsford,K.D.著，Subcell Biochem. 2007，42，3-27)。細菌LPS活化之巨噬細胞促進促炎性細胞激素如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和介白素-1β(IL-1β)之分泌。這些物質係先天性及適應性免疫的重要調節者。再者，LPS誘發大鼠肝中之可誘發之一氧化氮合成酶(iNOS)及環加氧酶-2(COX-2)的基因表現，而該COX酶具有環加氧酶和過氧化酶之功能(Ohshima等人，Mutat Res. 2005，591(1-2)，110-122)。
COX-2的表現量很低，且被生長因子和數個活化的致癌基因所強烈誘發(Hofseth L.J.及Wargovich,M.J.，J Nutr. 2007，137，183-185)。觀察到COX-2抑制因子阻礙了PGE2 之合成，而結果為其抑制了發炎並賦予鎮痛，此強調了COX-2 在前列腺素合成和發炎中之重要性(Jachak SM.Curr Opin Investig Drugs. 2007，8(5)，411-415)。
一氧化氮(NO)已被確認為一種在中央神經系統之神經傳導物，且為一強力血管舒張劑，其在生理上經由調整肌張力而調節血壓(Hibbs等人，Science 1987，235，473-476)。NO亦已被定義為在發炎和敗血症中之重要分子(Wheeler,A.P.和Bernard,G.R.，NewEngl.J.Med. 1999，340，207-214)。NO係由一氧化氮合成酶(NOS)所產生，該酶為由三種異構型組成的酶家族。神經元NOS(nNOS，第一型)和內皮NOS(eNOS，第三型)為Ca2+ -和攜鈣蛋白-依賴性的基本異構型；而鈣-依賴性的異構型(iNOS，第二型)為可誘發的。nNOS在神經傳導作用中具有功能；eNOS在血管舒張扮重要角色，而由內皮所產生的NO具有抗血栓性質。在暴露於內源性和外源性刺激因子之後，iNOS可在各種細胞中被誘發，如巨噬細胞、平滑肌細胞和肝細胞，以啟動數種不良的細胞反應以及造成包括發炎、敗血症和中風的疾病(Duval等人，Mol.Pharmacol. 1996，50，277-284；Rockey,D.C.和Chung,J.J.，Am.J.Physiol. 1996，271，260-267)。因此，iNOS誘發的NO產生，可反映發炎的程度，並提供一種評估藥物對發炎過程之效果的衡量。近期，已證明iNOS之抑制因子可提供LPS-誘發之肝毒的保護，亦已證明天然抗氧化劑如薑黃素、白藜蘆醇和茶多酚展現出對LPS-誘發之iNOS和肝損傷之抑制效果(Brouet等人，Biochem.Biophys.Re.Commun. 1995，206，535-540；Tsai等人，Br.J.Pharmacol. 1999，126，673-680；Pan等人，Biochem.Harmacol. 2000，59，357-367；Zhang,C.等人，J.Pharmacol.Exp.Ther. 2000，293，968-972)。
天然絲胺酸蛋白酶抑制因子通常表現作為偽受質(pseudo-substrates)，而在位置P1的胺基酸驅動抑制專一性(Bode,W.和Huber,R.，蛋白酶-蛋白質抑制因子間相互作用 之結構基礎，於F.X.Avile¨s(Ed.)，蛋白酶及其抑制因子之革新，Springer，柏林市，1993，81-122；Macbride等人，J.Mol.Biol. 1996，259，819-827)。絲胺酸蛋白酶抑制因子對發炎有逆作用。來自大豆的植物孔尼茲胰蛋白酶抑制因子(KTI)可藉由抑制依賴由有絲分裂促進劑活化之蛋白激酶(MAPK)之信號傳遞而抑制尿激酶表現的調升(Kobayashi等人，J Periodontal Res. 2005，40(6)，461-468)。KTI可經由抑制某些信號級聯放大而誘發促炎性反應之抑制作用。
Sohonie和Bhandarker首先發表了甘藷中TI(IbTI)之存在(J.Sci.Ind.Res. ，1954，13B，500-503)。甘藷根中IbTI佔總水溶性蛋白質約60%，且可被視為貯藏蛋白(Lin等人著，Bot.Bull.Acad.Sin. ，1980，21，1-13)。Maeshima等人確認甘藷儲藏蛋白(sporamin)為甘藷根中之主要貯藏蛋白，其佔根中總蛋白質80%(Phytochemistry ，1985，24，1899-1902)。Lin提出，甘藷儲藏蛋白(sporamin)應為甘藷中一種形式的TI，而此稍後被確認(Lin YH.甘藷之胰蛋白酶抑制因子：回顧與展望，於：Y.I.Hsing,C.H.Chou，(Eds.)，植物學之近期進展，中央研究院系列叢書，No.13，台北市出版，台灣，1993，179-185；Yeh等人，Plant Mol.Biol. 1997，33，565-570；Caj等人，Plant Mol.Biol.2003，51，839-849)。IbTI展現了去氫抗壞血酸還原酶，單去氫抗壞血酸還原酶和抗氧化劑活性，亦具血管緊縮素轉化酶抑制活性(Hou等人，J.Agric.Food Chem. 2001，49，2978-2981；Huang等人，Botanical Studies ，2008，49，101-108)。
Digiesi等人表明，注射抑酞酶，一種得自牛肺的絲胺酸型蛋白酶抑制因子，到患周邊動脈血管之病人的肌痛區或觸發區，增加了首感到痛的行走容忍極限，並減少了靜止時的疼痛強度(Digiesi等人，Pain. 1975，1，385-389)。該等作者提出，抑酞酶可能抑制了在局部缺血期間被活化的激肽原酶及組織 蛋白水解酶；然而，他們未給出任何詳情。Shih等人表明，以得自綠藻之一種膽蛋白(C-藻青素)預先或事後處理(30或50mg/kg腹腔注射)顯著地減輕以注射海藻糖所引起的對熱過敏及iNOS和COX2之誘導；同時抑制TNF-α及前列腺素E2之形成，以及抑制嗜中性白血球向發炎組織之滲入(Anesth.Analg. 2009，108，1303-1310)。
本發明之部分具體實施例係涉及一種醫藥組合物，其包含抗發炎或抗痛敏感有效量之經分離或純化的甘藷胰蛋白酶抑制因子及醫藥上可接受之載劑。該甘藷胰蛋白酶抑制因子可來自甘藷葉片或塊根。
本發明亦包括治療發炎或痛敏感之方法，包含選擇患有發炎或痛敏感之個體，例如具水腫之個體；施用抗發炎或抗痛敏感有效量之甘藷胰蛋白酶抑制因子或包含甘藷胰蛋白酶抑制因子之組合物至該個體；其中該個體之發炎或痛敏感在施用下會減少。在施用下，該甘藷胰蛋白酶抑制因子或包含甘藷胰蛋白酶抑制因子之組合物可抑制iNOS或COX-2之產生、TNF-α之產生、NO之產生、蛋白激酶C(PKC)之產生及/或PGE2之產生。
本發明更包括甘藷胰蛋白酶抑制因子在製造用於治療發炎或痛敏感之藥劑之用途。
已發現得自甘藷(Ipomoea batatas (L.)Lam.「台農57號」)之胰蛋白酶抑制因子具有抗發炎和抗痛敏感效果。
以下所示之實例強調胰蛋白酶抑制因子之多功能，並使用體外小鼠巨噬細胞系(RAW 264.7)和Carr ICR小鼠誘發腳掌水腫兩者顯示IbTI抗氧化劑和抗發炎的某些機制。
因為過氧化氫係一發炎痛敏感之新穎中介者，其經由瞬時 受體電位香草酸亞型1-依賴性或不依賴性之機制而作用，雖然不受此理論拘束，我們的結果建議，IbTI之抗發炎效果至少部分取決於一個抗自由基機制，及取決於在蛋白質層次抑制TNF-α、iNOS、COX-2、MMP-9及可能PKC的表現(Ferreira等人，Pain. 2005，117，171-181；Keeble等人，Pain. 2009，141，135-142)。在酵素活性層次抑制MMP-9亦是相當可能的。
IbTI之一個態樣為貯藏蛋白形式的萃取物和純化物，其得自甘藷，世界上最重要的塊根作物之一，的葉片和塊根兩者。許多藥物含有無用的副作用。Rivat等人提出一種以營養為基礎的減輕疼痛策略為，從飲食中排除多胺(Rivat等人，Pain. 2008，137，125-137)。這類型的方法建議，以適當的知識，病人可從高度專業化及創新的飲食攝取操作，達到緩解症狀。相似地，萃取和純化食物中的活性成分，並施用至病人，將有益於為數眾多患有發炎和/或疼痛的人口。
NO以生理濃度在各種組織扮演神經傳導物、血管擴張劑及免疫調節劑的角色(Moncada等人，Pharmacol Rev. 43：109-142(1991))。由iNOS產生之高濃度NO已被定義為在發炎中的毒性分子(Kroncke等人，Nitric Oxide. 1997，1，107-120)。PGE2係在發炎處由COX-2產生的一多效的調節劑，其引起疼痛、流汗、及僵硬(Seibert等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 1994，91，12013-12017)。因此，iNOS和COX-2之潛在抑制因子已被認為是潛在的抗發炎藥。
如以下實例1-4所討論者，這些效果係以使用活體外脂多醣(LPS)-激化小鼠巨噬細胞系(RAW 264.7)來測量。IbTI之抑制效果亦顯示於活體內注射海藻糖之小鼠後掌水腫模式中(實例5)。當RAW 264.7巨噬細胞被以不同濃度之IbTI(0，125，250，500，和1,000μg/mL，分別相應於0，5，10，20，和40μM)和LPS(1μg/mL)處理時，偵測到顯著的對亞硝酸鹽產生之濃度依賴性抑制(見以下實例1和3)。如實例2 所見，IbTI之前處理以劑量依賴性的方式抑制了LPS誘發之TNF-α和PGE2的產生。西方墨點法顯露出，LPS誘發之iNOS和COX-2在蛋白質層次的表現皆被IbTI分別降低了77.8%和91.6%，(實例3)。IbTI之前處理以劑量依賴性的方式抑制了LPS誘發之MMP-9產生，其由SDS-酶譜法所證實(實例4)。西方墨點法顯示了，與僅以LPS處理相較，在以500和1,000μg/mL之IbTI處理之後，平均分別下調了MMP-9蛋白質表現40.1%和48.9%。
IbTI之抗痛敏感效果(0，10，20，和40mg/kg體重；腹腔注射)亦顯示於實例5的λ-海藻糖(Carr)誘發小鼠後掌水腫模式。如圖5可見者，以IbTI處理顯著地抑制了由注射Carr造成的水腫。丙二醛(MDA)係一活性種，其為氧化壓力之指標。MDA亦為一硫巴比妥酸反應物質(TBARS)。我們在被處理的掌中發現硫巴比妥酸反應物質(TBARS)形成之阻礙、MMP-9表現之阻礙，以及由IbTI產生之血清一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子(TNF)-α之抑制；以IbTI腹腔注射處理亦減少嗜中性白血球滲入發炎處，同吲哚美辛(實例6-9)。我們亦概述一種從甘藷葉片和塊根中萃取和純化IbTI的方法，而該IbTI係為便於儲存以供隨後使用的形式。
某些態樣中，IbTI透過蛋白酶抑制活性、抗氧化能力、抑制iNOS和COX2產生，以及減少TNF-α形成來發揮其抗痛敏感效果。
本文所使用的「大概」、「約」和「實質上」之用詞是指接近標示量(stated amount)的量，其仍然執行所欲之功能或達到了所欲之結果。舉例而言，「大概」、「約」和「實質上」之用詞可指比標示量小於10%內、小於5%內、小於1%內、小於0.1%內和小於0.01%之量。
「組成物」乙詞是指IbTI與其他組成分的混合物，例如稀釋劑或附加載劑。該組合物有助於施用IbTI至一生物體。 多種現存在技術領域中之用於施用組合物的技術包括，但不限於，口服、注射、噴霧、非腸道、和局部的施用。
「醫藥上可接受之載劑」乙詞是指一種物質或稀釋物，其並不顯著地廢止IbTI之生物活性及性質。「載劑」乙詞是指一種化學化合物，其有助於化合物併入細胞或組織中。
組合物可包含一或多種生理上可接受的表面活性劑、附加載劑、稀釋劑、賦形劑、平滑劑、懸劑、成膜物質、及塗層輔助，或其等之結合。用於治療用途之可接受的附加載劑或稀釋劑係由醫藥領域所熟知及描述，舉例而言，Remington藥劑學，18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)一書，該書之全文以引用的方式併入本文中。防腐劑、穩定劑、染料、甜味劑、香精、調味劑，及其類似物可被提供於該組合物中。舉例而言，可添加苯甲酸鈉、抗壞血酸和對羥苯甲酸酯作為防腐劑。此外，可使用抗氧化劑及懸劑。在各種具體實施例中，可使用醇類、酯類、硫酸化脂族醇，及其類似物作為表面活性劑；可使用蔗糖、葡萄糖、乳糖、澱粉、微晶型纖維素、結晶纖維素、甘露糖醇、輕無水矽酸鹽、鋁酸鎂、偏矽酸鋁鎂、合成矽酸鋁、碳酸鈣、碳酸氫鈉、磷酸氫鈣、羧甲基纖維素鈣、及其類似物作為賦形劑；可使用硬脂酸鎂、滑石、硬化油及其類似物作為平滑劑；可使用椰子油、橄欖油、芝麻油、花生油、大豆作物作為懸劑或潤滑劑；作為如纖維素或糖之碳水化合物之衍生物的鄰苯二甲酸醋酸纖維素、或作為聚乙烯之衍生物的醋酸甲酯-甲基丙烯酸酯共聚物，可被使用作為懸劑；以及塑化劑鄰苯二甲酸酯及其類似物可被使用作為懸劑。
該等組合物亦可被配方成如栓劑或保留灌腸之直腸組合物，例如，含有如可可脂或其他甘油酯之傳統栓劑基質。
除了前述之配方外，該等組合物亦可被配方成長期製劑(depot preparation)。此長期作用的配方可藉由植入(舉例而言皮下或肌內)或藉由肌肉注射來施用。因此，舉例而言，可 以適合的聚合或疏水材料(舉例而言，在一可接受之油中的乳劑)、或離子交換樹脂、或例如微溶鹽的微溶衍生物，來配方該等化合物。
就該組合物之某些具體實施例而言，合適的載劑可為共溶劑系統，其包含苯甲醇、非極性表面活性劑、水溶性有機聚合物，及水相。常被使用的共溶劑系統係VPD共溶劑系統，其係3% w/v之苯甲醇、8% w/v之非極性表面活性劑聚山梨醇酯80TM 、及65% w/v之聚乙二醇300的溶液，在純乙醇中製至一定體積。自然地，共溶劑系統的比例可合理地變化。再者，共溶劑系統本身可做變化：舉例而言，可使用其他低毒性非極性表面活性劑來取代聚山梨醇酯80TM ；聚乙二醇之片段大小可做變化；其他生物相容聚合物可取代聚乙二醇，例如，聚乙烯吡咯啶酮；以及其他糖或多醣可代替右旋糖。
若有須要，組合物可以於包裝或配藥裝置中的方式呈現，其可含有一或多個含IbTI之單位劑量形式。該包裝可，舉例而言，包含金屬或塑膠箔，例如，氣泡包裝。該包裝或配藥裝置可附有施用的說明。該包裝或配藥裝置亦可附有有關該容器之聲明，以監管醫藥品之製造、使用或販賣的政府機構所規定之形式，其聲明係體現由人類或獸醫藥物管理局之核准。這樣的聲明，舉例而言，可為由美國食品和藥物管理局對於處方藥所認可的標籤，或經認可之產品說明書。包含本發明化合物之被配方至一相容的醫藥載劑的組合物，亦可被製備、放置於合適的容器、並貼上用於治療所指示狀況的標籤。
在某些具體實施例中，於醫藥產業中，配方醫藥組合物時，提供實質上純的材料是標準的做法。因此，在某些具體實施例中，「實質上純的」是指配方醫藥品所需的純度的量，其可含有，舉例而言，小量的其他不影響醫藥用途之合適度的物質。在某些具體實施例中，該實質上純的化合物含有至少約96%重量之該化合物，如至少約97%、98%、99%、或100% 之IbTI。
「稀釋劑」乙詞是指被稀釋於水中的化學化合物，其將溶解感興趣之組合物，並穩定該化合物之生物上活性。本技術領域中，溶解於緩衝溶液中的鹽類被利用做為稀釋劑。常用的緩衝溶液係磷酸緩衝生理鹽水，因其相似於人類血液的鹽條件。因為緩衝鹽可在低濃度下控制溶液的pH，緩衝稀釋劑罕有調整化合物的生物活性。在此處，「賦形劑」乙詞是指被添加入組合物之惰性物質以提供該組合物，不限於，體積、一致性、穩定性、結合能力、潤滑、崩解能力等。「稀釋劑」係賦形劑的一種。
「發炎」乙詞是指身體對刺激因子和有害刺激的反應。此反應可牽涉到由物理傷害、感染或局部免疫反應所啟始的液體、血漿蛋白和白血球的局部聚集。發炎可為急性的，在傷害或免疫反應啟始後立即發生。慢性發炎可能會發生一段長時間且可能伴隨著自體免疫疾病、過敏、有害的刺激因子或慢性感染。發炎可含有蛋白質的產生，其影響其他細胞、組織、器官和感染物的功能。這些蛋白質包括，但不限於，細胞激素、淋巴介質、介白素、化學激動因子、補體、抗體，和組織胺。除了別的以外，發炎亦可附帶其他化學個體如一氧化氮、COX-2活動、前列腺素合成、環加氧酶、過氧化酶。發炎狀態可牽涉到吞噬細胞、樹狀細胞、肥胖細胞、嗜鹼性球、淋巴球、T細胞、B細胞、自然殺手細胞、嗜中性白血球、和嗜酸性球。個體可能會體驗到疼痛、熱的感覺，組織紅腫，及功能喪失。
「抗發炎」乙詞是指發炎之中介者的抑制、干擾、調整，或減少。有許多可能的機制參予抑制發炎，亦有許多可能的抗發炎活動的表現。抗發炎效果的一個徵兆，舉例而言，可為iNOS和COX-2蛋白質表現的減少。相似的，MMP-9或MMP-2蛋白質表現相較於未經處理的疾病狀態可能會被壓抑。抗發炎 效果可藉由活性氧族或自由基之減少以及脂質氧化作用的減少來觀察出。以IbTI成功治療的臨床表現可包括，個體之疼痛閾值升高、或疼痛嚴重度或持續期間的減少。習知技藝者會明瞭，有許多成功的抗發炎指標治療。
「痛敏感」乙詞是指對疼痛的敏感度提高，其可能係身體或心理失調、或疾病進展之結果。疼痛可能是一個不愉快的感覺和/或情感體驗，由實際或潛在的組織損傷所引起。疼痛可能伴隨著焦慮、出汗、噁心和生命體徵變化。慢性疼痛是持續性疼痛，其持續時間超過正常癒合時間。痛敏感可能區域化於個體的各別區域，也可能涵蓋整個身體。區域化的疼痛可能與受傷有關，其導致組織損傷處的敏感性或周圍未損傷組織的敏感性。痛敏感可能由發炎、組織受傷、過敏、自體免疫及其他疾病進展所引起。
「抗痛敏感」乙詞是指疼痛的中介者和體驗的乙詞是指發炎之中介者的抑制、干擾、減少，或調整。抗痛敏感的成功治療可而表現於個體中，如調整疼痛症狀之特徵、發作、位置和持續期間。該治療可減少使疼痛加劇之因子或促進使疼痛減輕之因子。抗痛敏感治療可能以如同上述之對發炎之調整的方式或以其他機制來操作。
「有效量」乙詞是指能達到所欲結果之量。在某些具體實施例中，有效量之IbTI係能改善發炎和/或痛敏感之量，舉例而言，在一哺乳類個體(例如，人類)。此處揭露之所需作為一劑量之有效量IbTI將取決於施用的路徑、治療的動物類型包括人類、以及所考量的特定動物的物理特徵。劑量可被訂製成能達到所欲效果，但將取決於如體重、飲食、所使用藥物等因子，以及其他熟習此醫療技藝者能辨識出的因子。更特定而言，一有效量意指，IbTI之含量，其有效於緩解或改善被治療個體之發炎和/或痛敏感，或避免一疑似正在發展發炎或痛敏感之個體的症狀。決定一有效量以及確認出疑似正在發展發炎 或痛敏感之個體係屬熟習此藝者能力範圍內。如同對於熟習此藝者將顯而易見者，欲施用的在體內的有益劑量，以及特定施用模式將依所治療之年齡、體重、哺乳類物種，以及使用IbTI之特定用途而不同。所需能達到所與結果的有效劑量濃度之決定，可由熟習此藝者使用常規藥理學方法所完成。典型地，人類臨床應用開始於低劑量濃度，其劑量濃度將增加直到所欲效果被達成。另擇地，使用已建立之藥理學方法之可接受的體外研究可被用以建立以本方法所確認之組合物有益的劑量及施用路徑。
在非人類動物研究中，潛力產品之應用開始於高劑量濃度，而劑量濃度將降低直到所欲效果不再被達成且副作用消失。劑量範圍可為很廣，取決於所欲效果及治療適應症。劑量可為約10微克/公斤至100毫克/公斤，依體重。另擇地，劑量可基於病人的表面積來計算，如熟習此藝者所知者。
確切的配方、施用路徑和IbTI的劑量可以由各醫生鑑於病人的情況來選擇。施用至病人的組合物的劑量範圍可自約0.5至約1000mg/kg，依病人之體重。該劑量可如病人所需者，為單一劑或在一或多天的療程中一系列之二或更多劑。在IbTI用於抗發炎或抗痛敏感治療的人類劑量已備建立的情形下，該治療可包括該已建立之人類劑量的約0.1%至約500%之劑量。
如熟習此藝者將所知者，在某些情形，可能有必要施用IbTI超過或甚至遠超過較佳劑量範圍，為了有效和積極治療特別地具攻擊性的失調或狀況。在某些具體實施例中，化合物將被施用一段持續治療的期間，舉例而言一周或更多，或多月或多年。
此處使用的「載劑」乙詞是指一種化學化合物，其有助於化合物併入細胞或組織中。
「來自(Derived from)」是指IbTI之本身及/或原始來源。 IbTI原先係自甘藷純化出。然而，「來自」亦指製造或純化自其他非甘藷的來源之IbTI，其產生實質上相似的胰蛋白酶抑制因子。舉例而言，「來自IbTI」亦包括藉由合成手段製造出的IbTI。IbTI組合物可以已知的方式被製造，例如，藉由傳統的混合、溶解、成粒、製糖衣，研磨，乳化，封囊，埋入(entrapping)或製藥片程序，或藉由某些尚未被揭示的方法。
IbTI是一種多功能蛋白質，具有兩對雙硫鍵(Cys81-Cys128；Cys177-Cys184)，其胰蛋白酶抑制活性在兩對雙硫鍵完整時為最大。當一雙硫鍵存在時，保有部分胰蛋白酶抑制活性。
「甘藷塊根」是指來自旋花科家族的甘藷(Ipomoea batatas )。塊根係塊狀的根，其擴大作為植物的貯存器官。
「治療」乙詞是指對一個體施用IbTI本身，或IbTI混合其他活性成分(作為結合治療)、或適合的載劑或賦形劑的組合物。IbTI之施用包含口、直腸、穿黏膜、局部的、或腸道施用；非腸道傳送，包括肌內、皮下、靜脈，髓內注射，以及腦脊髓膜內、直接腦內(direct intraventricular)、腹內、鼻內、或眼內注射。IbTI之施用包括持續或控制釋放劑型，包括積存注射、滲透泵、藥丸、皮膚滲透貼(包括電傳導)，及其類似物，長時間和/或定時，以預定的速率節奏地施用。
應注意的是，主治醫生會知道如何和何時終止、中斷或調整起因於毒性反應或器官功能障礙的治療。相反地，如果沒有足夠的臨床反應(毒性反應除外)，主治醫師也會知道要調整治療到更高的濃度。在治療感興趣的失調上，施用劑量的幅度將隨欲治療的病情嚴重程度及施用的路徑而不同。病情嚴重程度可能，舉例而言，以標準預後方法做部分地評估。又，劑量和也許劑量頻率也將根據年齡、體重、和個別病人的反應。可以上述所討論者相提並論的方案可被用於獸藥。
雖然確切的劑量將依個別情況而定，在大多數情況下，可 作出概括劑量。就成人患者，每日給藥方案可為，舉例而言，口服劑量約0.1mg至2000mg的IbTI，或約1mg至500mg左右，如5至200mg。在其他具體實施例中，使用靜脈、皮下或肌肉注射劑量約0.01mg到約100mg的IbTI，或約0.1mg至約60mg，如約1至約40mg。在某些具體實施例中，每天施用該組合物1至4次。另擇地，可用持續靜脈輸注來施用本發明之組合物，較佳地以每天高達1000mg的劑量。
劑量數量和間隔可被單獨調節，以提供足以維持抗發炎或抗痛敏感效果的或最低有效濃度(MEC)的IbTI血漿濃度。MEC將因人而異，但可從體外數據估計。要達到MEC的劑量將取決於個別的特性與施用路徑。然而，可使用HPLC分析或生物檢定來測定個體的血漿濃度和發炎程度。
亦可使用MEC值來測定劑量間隔。可使用攝生法來施用IbTI組合物，其維持血將濃度高於MEC 10-90%倍，較佳地在30-90%之間且最佳地在50-90%之間。但在局部施用或選擇性吸收，IbTI之有效局部濃度可能不與血將濃度相關。
藉由遵循健康的飲食，許多許多疾病和健康問題都可以被減輕或甚至治癒。食物和蔬菜中的化學化合物和蛋白質越來越多地被確認為具有身體中代謝和生理反應的的連結。食物提供元素和化合物，其被攝入、消化、吸收，並經由血液循環供應體內細胞。植物類食物的消耗提供了有利的基本營養素的來源。在這個攝取、消化、吸收的過程中，如蛋白質、碳水化合物和脂肪等營養素，被分解成它們的組成分子。由於各人食物消化和吸收的不同，難以預料對於每個人的絕對效益。事實上，某些人可能不會體驗到全部的益處，因為遺傳、消化模式、體重，以及攝入的化學物質可能會干擾食品成分的作用，如飲酒和吸煙。因此，藥物的施用和其他藥理活性物質需要純化並添加載劑，以達到在體內的足夠高的濃度，以對人體產生正向的變化。本發明的優點之一是純化以及與載劑結合，其允許一 藥理上有效劑量，以對病人施用。以IbTI和一藥裡載劑的治療可能在治療發炎和痛敏感方面優於來自食物群組之藥理活性成分的原始或未純化的原料。
可以已知的方法來評估此處揭露的IbTI組合物之藥效和毒性。舉例而言，可藉由對細胞系，例如哺乳類細胞系，較佳為人類細胞系，測定體外之毒性，來建立組合物的毒理學。這類研究的結果往往預測了在動物體內的毒性，如哺乳類動物，或更特定而言，人類。另擇地，在一動物模式中特定組合物的毒性，例如小鼠、大鼠、兔子、或猴子，可藉由已知方法來測定。特定化合物的療效可使用數種公認方法來建立，例如體外方法、動物模式、或人體臨床試驗。幾乎每個等級由發炎和疼痛體驗導致的狀況，都存在公認的體外模式。當選擇一模式以測定療效，熟習此藝者可藉當前技術水平的指引來選擇合適的模式、劑量，和施用路徑，以及制度。當然，亦可使用人體臨床試驗來測定一化合物在人體內的療效。可評估與發炎和疼痛有關的標記來測定治療的效果。舉例而言，可在治療之前、期間、之後抽血以量化這些標記。指示發炎的蛋白質包括細胞激素、化學激動因子、前列腺素、纖維蛋白、免疫球蛋白和緩激肽。可藉由計量血中以及受傷處這些蛋白質的數量及細胞類型，來達到治療的療效觀察。
「iNOS」是指可誘發之一氧化氮合成酶。iNOS係一酶，其催化了一氧化氮的產生。「iNOS產生」是指可誘發之一氧化氮合成酶之蛋白質、RNA或DNA形式之合成。「抑制iNOS」是指減少、改善或抑制個體的細胞、組織或身體中之iNOS的量、濃度或功能。iNOS之抑制亦可能經由體內之iNOS的消除或減少穩定性而發生。
「抑制NO產生」是指減少、改善或抑制一氧化氮的量、濃度或功能改變。
「COX-2」乙詞是指環加氧酶-2，一種負責產生如類前列 腺素(prostanoid)、前列腺素、前列腺環素(prostacyclin)、及凝血脂素之分子的蛋白質。「抑制COX-2產生」乙詞是指是指減少、改善或抑制個體的細胞、組織或身體中之COX-2的量、濃度或功能。
「TNF-α」是指腫瘤壞死因子-α。「抑制TNF-α產生」乙詞是指減少、改善或抑制TNF-α的量、濃度或功能改變。
「抑制PGE產生」乙詞是指減少、改善或抑制前列腺素E2的量、濃度或功能改變。該抑制可發生在個體的細胞、組織或器官中。
「失調」乙詞是指一種疾病、生理失衡、感染，身體或心理傷害、或被認為是健康體內恆定狀態之偏差。
「水腫」是指身體組織含有過多量的組織液在間質空間中的區域或全身性的狀況。水腫可能起因於，舉例而言，對毛細血管壁通透性增加、淋巴阻塞、發炎狀態、存在細菌毒素、毒液或組織胺。
MDA的產生可能是起因於自由基攻擊細胞膜。MDA偵測生物樣品中脂質的氧化降解。MDA產生可能與自由基對細胞膜之攻擊有關。「抑制MDA產生」是指此類氧化壓力的降低，且可藉由觀察到降解之脂質及/或自由基之量、濃度或分布的減少。
蛋白激酶C係一酶族，其經由將胺基酸磷酸化來調節蛋白質的功能。「抑制蛋白激酶C(PKC)產生」是指由調節PKC活性所造成的抗發炎或抗痛敏感效果。可藉由降低或提高PKC之量、濃度或活性來引起PKC活性之調節。調節作用可以能藉由改變磷酸化的目標而發生。
實例
LPS(來自大腸桿菌的內毒素，血清型0127：B8)以及其他化學品係購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，USA)。TNF-α ELISA試驗套組以及前列腺素E2免疫試驗套組(試驗 Designs Inc.，Ann Arbor，USA)、抗-iNOS、抗-COX-2、抗-MMP-9、及抗-β-肌動蛋白抗體(Santa Cruz，USA)以及一蛋白質試驗套組(Bio-Rad Laboratories Ltd.，Watford，Herts，U.K.)由如上所示處獲得。聚-(偏二氟乙烯)膜(Immobilon-P)係自Millipore Corp.(Bedford，MA，USA)獲得。
雄性ICR小鼠(18-25g)係自BioLASCO Taiwan Co.,Ltd獲得。在實驗前，將動物置於塑膠玻璃籠內，恆溫22±1℃下，相對溼度55±5%，以及12小時黑暗/12小時光照的給光制度，至少2週。牠們被給予任意採食的食物和水。所有的實驗程序皆根據NIH實驗動物管照與使用指南來進行。安慰劑組被給予皮下注射0.1ml/10g食鹽水，使用彎鈍27號針頭連接至1ml注射器。所有的測試皆在國際病痛研究協會的指南下進行(Zimmermann,M.著，於清醒動物中研究實驗性疼痛的倫理準則。Pain. 1983，16，109-110)。
計算三重測定的平均值。使用司徒頓試驗來比較二治療。當p<0.05、p<0.01或p<0.001時，差異被認為是統計上顯著的。
實例1A：甘藷胰蛋白酶抑制因子(IbTI)對RAW 264.7巨噬細胞之脂多醣(LPS)誘發之細胞生存力之影響。
鼠科巨噬細胞系RAW 264.7(BCRC No.60001)係購自食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心(BCRC)(新竹，台灣)。細胞被培養在含有添加了10%胎牛血清(FBS，Sigma，USA)的Dulbecco的改良Eagle培養基(DMEM，Sigma，St.Louis，MO，USA)的塑膠皿中，於一於37℃ CO2 培養箱中(空氣中有5% CO2 )，並於每3日以含0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA之無Ca2+ -、Mg2+ -磷酸緩衝鹽液(DPBS)稀釋細胞1：5倍進行次培養。就生存力試驗而言，細胞(2 x 105 )被培養在含有添加了10%FBS的DMEM的96-孔盤中一天， 以變成接進鋪滿的。接著在IbTI不存在或存在下(0，5，10，20，40μM)(0，125，250，500，1,000μg/mL)以1μg/mL LPS(脂多醣)培養細胞24小時。在以LPS培養之前1小時添加IbTI。使用MTT試驗計量細胞生存力：以DPBS清洗細胞兩次，並於37℃以100μL之0.5mg/mL MTT培養2小時以測試細胞生存力(MTT，(3-[4,5-二甲基噻唑-2]-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)(Klebe,R.J.以蜂窩板與非致命活體染色來快速選殖哺乳類細胞。In Vitro. 1984，20，127-132)。接著丟棄培養液，並添加100μL二甲亞碸(DMSO)。經培養30分鐘後，使用微量培養盤判讀器讀取570nm之吸光度。對細胞生存力的IbTI治療結果可見於圖1A。
實例1B：甘藷胰蛋白酶抑制因子(IbTI)對RAW 264.7巨噬細胞之脂多醣(LPS)誘發之NO產生之影響。
以同實例1A所述處理細胞，並以革利士反應(Griess reaction)測定培養基與血清中一氧化氮/亞硝酸鹽濃度，其反映了細胞內一氧化氮合成酶活性。於37℃在LPS(1μg/mL)存在下以IbTI(0，125，250，500，1,000μg/mL)培養細胞24小時。接著，細胞被分散至96孔盤中，且100mL每個上清液與同體積之革利士試劑(1%胺苯磺醯胺，0.1%鹽酸萘乙二胺及5%磷酸)混合，並在室溫下培養10分鐘。使用亞硝酸鈉生成標準曲線，藉由540nm之吸光度計量亞硝酸鹽濃度(Fiddler R.N.用於分析肉類和肉類製品中亞硝酸鹽的改良AOAC方法之合作研究J Assoc of Anal Chem. 1977，60，594-599)。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「#」與控制組的樣本相比較。「*」(p<0.05)和「**」(p<0.01)與僅有LPS組相比較。見圖1B。
以LPS(1μg/mL)處理24小時後，培養液中亞硝酸鹽 濃度增加。當RAW264.7巨噬細胞被以不同濃度的IbTI以及LPS(1μg/mL)處理24小時，IbTI明顯地抑制了亞硝酸鹽產生(圖1B)。IbTI於1,000μg/mL並無干擾亞硝酸鹽和革利士試劑之間的反應。無激化之巨噬細胞，在培養液中經24小時培養後，產生了亞硝酸鹽之背景值。當以不同濃度之IbTI(0，125，250，500，和1000μg/mL，分別對應至0，5，10，20，和40μM)以及LPS(1μg/mL)處理RAW 264.7巨噬細胞24小時，偵測到顯著濃度依賴性抑制亞硝酸鹽的產生。當與僅有LPS組相比較時，不是有以125μg/mL IbTI處理之組的顯著亞硝酸鹽產生之減少(p<0.05)，就是有分別以250，500和1,000μg/mL IbTI處理之組的非常或高度顯著減少(p<0.01或p<0.001)。
實例2A & 2B：甘藷胰蛋白酶抑制因子對由LPS-誘發之RAW 264.7巨噬細胞所產生之TNF-α和PGE2的效果
於37℃在LPS(1μg/mL)存在下以IbTI(0，125，250，500，和1,000μg/mL)培養細胞(1 x 106 /孔)24小時。使用市售之酶聯免疫吸附檢定法(ELISA)來測定在培養基和血清中之TNF-α之濃度。使用微量培養盤判讀器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)於405nm光度測定TNF-α之濃度(圖2A)。
TNF-α促成了發炎過程中許多其他細胞激素的產生，特別是IL-1β和IL-6之產生(Locksley,R.M.；Killeen,N.；Lenardo,M.J.TNF與TNF受體超家族：整合哺乳動物生物學。Cell. 2001，104，487-501)。我們測試了IbTI對LPS誘發之上調TNF-α的效果。對照組中對TNF-α專一之ELISA偵測到極低量之TNF-α蛋白質(圖2A)。以LPS培養24小時，在以LPS培養之前1小時添加IbTI，其以劑量依賴性的方式抑制了大腸桿菌LPS(1μg/mL)所誘發了大量的TNF-α產生，在最 高劑量時(1,000μg/mL)達到15%之抑制。因此，IbTI很明顯地阻礙了LPS誘發之TNF-α蛋白質之產生(p<0.01)。
使用前列腺素E2 免疫試驗套組來測定PGE2 。使用微量培養盤判讀器(Molecular Devices，USA)於405nm測定PGE2 之濃度。見圖2A & 2B。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「#」與控制組的樣本相比較。「**」(p<0.01)與僅有LPS組相比較。
LPS之處理證明了PGE2 產生之增加。因此，我們研究IbTI對巨噬細胞中LPS誘發之PGE2 產生之影響。在以LPS(1μg/mL)處理24小時後，培養液中PGE2 之量明顯地升高，且當與僅有LPS組相比較時，500或1,000μg/mL之IbTI在LPS(1μg/mL)存在下可顯著地抑制在RAW 264.7巨噬細胞中LPS誘發之PGE2 的產生(p<0.01)(圖2B)。
實例3A & B：在LPS-激化RAW264.7細胞中，甘藷胰蛋白酶抑制因子對iNOS和COX-2蛋白質表現之抑制
在IbTI不存在或存在下，以1μg/ml LPS培養細胞24小時。
接著以700g離心10分鐘蒐集細胞，接著在4℃以打散沉澱物細胞裂解緩衝液(40mM Tris-HCl(pH 8.0)，1% NP-40，1mM苯甲基磺醯氟(PMSF)，150mM NaCl)15分鐘。先將細胞裂解液於12.5% SDS-聚丙烯醯胺凝膠分成部分(每凝膠通道50μg之蛋白質)，再轉印至膜上(Immobilon-P膜，Millipore，Bedford，MA，USA)，其為根據製造商所描述者。於室溫下以5%脫脂奶粉將該等膜阻斷(block)2小時，接著以第一抗體培養。經培養後，以含0.05% Tween之磷酸緩衝鹽液(PBST)清洗該等膜三次，每次10分鐘，接著以抗兔鹼性磷酸酶標記抗體培養，以PBST清洗三次，每次10分鐘，並使用NBT(四唑硝基藍)/BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽) (Sigma，USA)呈色。第二抗體(山羊抗兔Ig之Fc部分)係Sigma(USA)之產品。使用β-肌動蛋白作為指標，以確保各凝膠通道之裝載相等。亦以考馬斯亮藍染墨點，以確認每個凝膠通道存在有等量的蛋白質萃取物。
為了研究NO產生之抑制作用是否起因於iNOS和COX-2蛋白質濃度的減少，藉由來研究IbTI對iNOS和COX-2蛋白質表現的效果。等量之蛋白質(50μg/lane)被SDS-PAGE分解，接著轉印至一硝化纖維素膜，並使用專一的抗體來偵測iNOS和COX-2蛋白質。
圖3A係一個來自兩個分開實驗的代表西方墨點圖。其結果顯示，小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞中，在LPS(1μg/mL)存在下以IbTI(0，250，500，和1,000μg/mL)培養24小時，劑量依賴性地抑制了iNOS蛋白質表現(圖3A)。亦進行同墨點的β -肌動蛋白之偵測，作為內部控制。使用Kodak Quantity軟體(分子成像軟體系統，Kodak)分析三個獨立實驗的蛋白質帶的強度。
圖3B中，參照LPS-激化培養物來計算iNOS及COX-2蛋白質之相對濃度。與僅有LPS組相比較，在以1,000μg/mL之IbTI處理後，iNOS和COX-2蛋白分別被平均下調77.8%和91.6%(圖3B)。
三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與僅有LPS組相比較。
實例4：在LPS-激化RAW264.7細胞中，甘藷胰蛋白酶抑制因子對MMP-9和MMP-2蛋白質表現之抑制
在以LPS(1μg/ml)培養細胞24小時之前，先以IbTI前處理細胞(0，10，20，和40μM)(0，250，500，和1,000μg/mL)1小時(A)接著製備懸浮細胞，使用SDS-PAGE酶 譜法偵測MMP-9和MMP-2之活性。(B)參照LPS-激化控制培養物來計算MMP-9及MMP-2蛋白質之相對濃度。(C)使用對MMP-9專一之抗體顯示了，在以LPS-激化之RAW264.7細胞中IbTI抑制MMP-9蛋白質之表現。使用β-肌動蛋白作為內部控制。(D)參照LPS-激化控制培養物來計算MMP-9蛋白質之相對濃度。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「***」(p<0.001)與陽性控制組相比較。見圖4。
在發炎處，MMP族在降解和重塑細胞外基質扮演了重要的角色。在LPS-激化RAW264.7巨噬細胞中，MMP-9被大量誘發。IbTI之處理可抑制激化巨噬細胞中MMP-9之誘發(圖4A)。與僅有LPS組相比較，1,000μg/mL之IbTI顯著地降低了MMP-9表現，如SDS-PAGE酶譜法所示者(p<0.001)(圖4B)。
在圖4C中，藉由西方墨點法來分析MMP-9蛋白質之濃度，以測定在LPS-激化RAW 264.7細胞中IbTI對MMP-9產生之抑制機制。MMP-9蛋白質之表現在未激化之細胞中幾乎偵側不到，但在LPS(1μg/mL)刺激後顯著地增加(圖4C)。以IbTI(0，250，500，和1,000μg/mL)處理LPS-激化巨噬細胞，導致劑量依賴性地在蛋白質層次MMP-9表現之抑制。亦進行同墨點的β -肌動蛋白之偵測，作為內部控制。使用Kodak Quantity軟體(分子成像軟體系統，Kodak)分析三個獨立實驗的蛋白質帶的強度，顯示了與僅有LPS組相比較，在以500和1,000μg/mL之IbTI處理後，MMP-9蛋白分別被平均下調40.1%和48.9%(圖4D)(p<0.001)。
實例5：甘藷胰蛋白酶抑制因子和吲哚美辛(Indo)對由λ-海藻糖引起之小鼠後掌水腫之影響
如圖5所示，藉由Carr引起之小鼠後掌水腫試驗來測定 IbTI之抗發炎活性。雄性ICR小鼠(每組八隻)，18g至25g，在實驗前被禁食24小時，得自由取用水。在每個實驗之前，製備1% Carr的食鹽水懸浮液50μL，並將之注射入小鼠右後腳掌的蹠側。IbTI或吲哚美辛被懸浮於Tween-80之0.9%(w/v)食鹽水溶液。Tween-80之最終濃度不超過5%且不引起任何可偵測到的發炎。Carr處理之兩小時後，以腹腔注射施用劑量10，20和40mg/kg之IbTI。作為陽性控制組，在以Carr處理之前，以腹腔注射施用劑量10mg/kg之吲哚美辛(Mascolo等人，J Ethnopharmacol. 1989，27，129-140)。在注射Carr後即刻，以及施用致水腫劑後1，2，3，4和5小時之間隔使用一器官充滿度測量器(型號7159，Ugo Basile，Varese，Italy)來測量腳掌體積。使用a/b比來評估所引起的水腫程度，其中a係Carr處理後之右後腳掌體積，而b係Carr處理前之右後腳掌體積。
如圖5所示，Carr誘發腳掌水腫。在Carr刺激5小時後，IbTI(40mg/kg)顯著地預防了(p<0.05)腳掌水腫的發展。吲哚美辛(10mg/kg)，作為陽性控制組，在Carr注射後3，4和5小時顯著地降低了腳掌水腫(p<0.01或p<0.001)。
Carr測試對非類固醇抗發炎藥高度敏感，而早已被接受為研究新藥物療法之有用的發炎模式(Just等人，Planta Med. 1998，64，404-407)。經Carr注射之腳掌水腫的程度於注射後4小時為最高峰。統計分析指出，IbTI和吲哚美辛顯著地抑制了由Carr注射引起之水腫的發展。眾所皆知，由Carr誘發之水腫之特徵在於，前列腺素以及其他慢反應之化合物之存在，例如緩激肽，其之後誘發了前列腺素和其他自泌物質的生物合成，其負責發炎滲出液之形成(Spector,W.G.& Willoughb,D.A.Bacteriol Rev. 1963，27，117-154；Ueno等人，Life Sci. 2000，66，155-160)。此外，在Carr誘發之大鼠腳掌水腫模式中，類前列腺素(prostanoid)之產生被證實係藉由一個正向回饋 機制而經過血清的COX-2表現(Dudhgaonkar等人，Life Sci.2006，78，1044-1058)。因此，一個建議是，IbTI之作用機制可能與前列腺素合成之抑制有關，如就吲哚美辛在抑制由Carr誘發之發炎過程的抗發炎機制所述者(Kirkova等人，General Pharmacology.1992，23，503-507)。
三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與λ-海藻糖(Carr)組相比較。
實例6：甘藷胰蛋白酶抑制因子和吲哚美辛(Indo)對小鼠腳掌丙二醛(MDA)濃度之影響
藉由硫巴比妥酸反應物質(TBARS)方法來評估丙二醛(MDA)；見圖6(Tatum等人，Lipids. 1990，25，226-229)。其原理為，MDA與硫巴比妥酸在高溫反應並形成一紅色的複合TBARS。於532nm測定TBARS之吸光度。每個值以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「###」(p<0.001)為與控制組相比較。「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與λ-海藻糖(Carr)組相比較。
圖6顯示了，在注射Carr後5小時，10mg/kg之IbTI非常顯著地降低了水腫腳掌中MDA濃度(p<0.01)；且在注射Carr後5小時，20或40mg/kg之IbTI高度顯著地降低了水腫腳掌中MDA濃度(p<0.001)。
某些文獻證明了，由Carr誘發之發炎效果可能與自由基有關。當施用Carr 1-5小時，自由基、前列腺素和NO將被釋出(Janero,D.R.著，Free Radic Biol Med. 1990，9，515-540)。水腫效果在第三小時升至最高峰(Tonussi等人，Pain. 1999，82，81-87)。MDA產生係起因於自由基攻擊細胞膜(Salvemini 等人，Eur J Pharmacol. 1996，303，217-220)。因此，發炎效果會導致MDA之累積。
實例7：IbTI和吲哚美辛(Indo)對小鼠中海藻糖(Carr)誘發之TNF-α(圖7.A)和NO(圖7.B)之血漿中濃度在第五個小時的影響
三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「###」(p<0.001)為與控制組相比較。「*」(p<0.05)、「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與λ-海藻糖(Carr)組相比較。
在注射Carr後5小時，40mg/kg之IbTI非常顯著地降低了血漿中TNF-α濃度(p<0.01)(圖7A)。在注射Carr後5小時，IbTI(10，20和40mg/kg)降低了血漿中NO濃度。10mg/kg之IbTI顯著地降低了血漿中NO濃度(p<0.05)；且20和40mg/kg之IbTI分別非常顯著和高度顯著地降低了血漿中NO濃度(p<0.01或p<0.001)(圖7B)。
TNF-α係Carr誘發之發炎作用的一中介者，且能誘發激肽和白三烯進一步釋出，其被認為在持久的疼痛反應的維持扮演重要的角色(Cuzzocrea等人，Life Sci. 1997，60，215-220)。在本研究中，我們發現IbTI在注射Carr後降低了血漿中TNF-α濃度。
L-精胺酸-NO途徑已被認為在Carr誘發之發炎反應中扮演重要的角色(Cuzzocrea等人，Life Sci. 1997，60，215-220)。我們目前的結果亦確認，Carr誘發之腳掌水腫導致NO之產生。NO合成酶之可誘發的異構型之表現，已被認為是發炎中重要的中介者(Cuzzocrea等人，Life Sci. 1997，60，215-220)。
實例8：小鼠後腳掌在皮下注射0.9%鹽水(控制組)或海藻糖(Carr)後之組織切片，以蘇木精和曙紅染色
注射Carr入小鼠右後腳掌的蹠側後5小時採腳掌之生物檢體，用於組織學檢驗。於室溫下，以具1.85%甲醛和1%醋 酸之溶液固定組織切片1星期，接著以梯度乙醇脫水並包埋於石蠟中(Sherwood Medical，St.Louis，MO，USA)。以二甲苯除去切片(厚度5μm)之石蠟，並以蘇木精和曙紅染色。所有的樣本皆以BH2 Olympus顯微鏡(Japan)觀察及攝影。從控制組、Carr組、Indo組和以IbTI處理組(40mg/kg)每組中隨機選出3-5片組織切片。計算每個範圍內的嗜中性白血球之數量(400 x)，並計算每個組織切片之5個範圍的平均數。
控制組鼠(圖8A)：顯示了正常真皮與皮下組織的外觀，沒有任何顯著的損害。圖8B在僅皮下注射Carr後，有中度的血管外紅血球及大量的發炎白血球(主要為嗜中性白血球)出血滲入小鼠之皮下間質組織。又，皮下組織層之細節顯示了具滲出液之水腫造成之間質空間擴大。圖8.C相較於僅皮下注射Carr，吲哚美辛(Indo)顯著地降低了出血、水腫和發炎細胞滲入的程度。相較於僅皮下注射Carr，IbTI(40mg/kg)顯著地顯示型態上的改變(圖8D)(100 x.)。計算每個範圍內的嗜中性白血球之數量(400 x)，並計算每個組織切片之5個範圍的平均數(圖8E)。「**」(p<0.01)與Carr組相比較。
控制組小鼠之腳掌生物檢體顯示了明顯的滲入至結締組織。滲入累積在膠原纖維之間，並至細胞間隙中。控制組顯示了正常真皮與皮下組織的外觀，沒有任何顯著的損害(圖8A)。在僅皮下注射Carr後，有中度的血管外紅血球及大量的發炎白血球(主要為嗜中性白血球)出血滲入小鼠之皮下間質組織。又，皮下組織層之細節顯示了具滲出液之水腫造成之間質空間擴大(圖8B)。Carr加IbTI(40mg/kg)組顯示了對Carr之發炎反應的減少。事實上，發炎細胞數量減少，而且只限於在血管附近地區。細胞間隙沒有表現出任何細胞滲入。膠原纖維形狀是正常的，並顯示出細胞間隙之減少。又，皮下結締組織沒有被損害。相較於僅有Carr，在皮下注射Carr與IbTI後，觀察到顯著的型態上的改變。損害顯示沒有出血且減少了 發炎嗜中性白血球滲入至皮下組織間質組織中的數量(圖8C)。又，在間質空間中沒有看到水腫(100×)。在Carr處理下，發現嗜中性白血球增加(P<0.001)。吲哚美辛(10mg/kg)，作為陽性控制組，顯著地降低了發炎嗜中性白血球滲入的數量(p<0.01)(圖8D)。與Carr處理組相比較，IbTI，同吲哚美辛，可顯著地降低嗜中性白血球數量(P<0.01)(圖8.E)。
實例9：甘藷胰蛋白酶抑制因子(IbTI)和吲哚美辛(Indo)對小鼠中由λ-海藻糖引起之MMP-9和MMP-2表現之影響
為進行SDS-PAGE酶譜法，在非還原性條件下，將培養液(20μl/樣本)於以1mg/mL明膠浸漬之8%(w/v)SDS-PAGE膠上進行電泳。藉由於室溫下以2.5% Triton X-100培養1小時，來回復(renature)膠中蛋白質的原性。以0.1%考馬斯亮藍R-250溶液染該膠。在此試驗中，清楚區域相對藍色背景顯示酶解活動(gelatinolytic activity)(Birkedal-Hansen,H.& Taylor,R.E.Biochem.Biophys.Res.Commun. 1982，107，1173-1178)。
製備懸浮組織，並使用SDS-PAGE酶譜法偵測MMP-9和MMP-2活性(圖9A)參照空白組來計算MMP-9和MMP-2蛋白質之相對濃度(圖9B)。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與λ-海藻糖(Carr)組相比較。
在Raw 264.7巨噬細胞中以IbTI處理對MMP-9和MMP-2表現的抑制作用。在以LPS(1μg/ml)培養細胞24小時之前，先以IbTI前處理細胞(0，10，20，和40μM)(0，250，500，和1,000μg/mL)1小時。
在本研究中，在注射Carr後5小時，40mg/kg之IbTI降低了腳掌中MMP-9濃度(p<0.01)(圖9A)，如同吲哚美辛 (10mg/kg；p<0.01)。以IbTI處理可抑制激化巨噬細胞中MMP-9之誘發(圖9B)。
MMP係一群含Zn之酶，其降解多種細胞外基質(ECM)中的組成分，包括膠原、蛋白多醣、明膠、纖維連接蛋白，和醣蛋白(McCawley L.J.& Matrisian,L.M.Curr.Opin.Cell Biol. 2001，13，534-540)。MMP影響發炎反應之結果、血管生成，並造成細胞外基質相關生長因子和細胞激素之釋出，其調節許多此類流程(Mott,J.D.& Werb,Z.Current Opinions in Cellular Biology. 2004，16，558-564)。MMP-9，即在多種細胞系如角質形成細胞、嗜中性白血球和巨噬細胞中表現的92kDa之明膠酶B，被增加及活化於許多種發炎及惡性疾病中如牙周炎和牙冠周炎。其表現及活化亦由許多發炎細胞激素TNF-α所誘發(Sorsa等人，Annals of Medicine. 2006，38，306-321)。在本研究中，IbTI被確認為可降低在LPS-激化巨噬細胞中MMP-9之誘發。先前已發現數種抗發炎劑抑制了激化細胞中MMP-9之誘發。
實例10：甘藷IbTI之萃取與純化
新鮮的甘藷(Ipomoea batatas (L.)Lam.「台農57號」)塊根係購自當地市場。樣本被清洗、剝皮，切成條狀並立即萃取(Huang等人，Plant Sci ，2005，169，423-431)。
根據Huang等人之方法，自甘藷塊根萃取與純化IbTI係於4℃下進行(Huang等人，J.Agric.Food Chem. 2007，55，2548-2553)。塊根被切成條狀，並立即以四份(W/v)含100mM NaCl、1%(w/v)抗壞血酸鹽及1%(w/v)聚乙烯聚咯烷酮(PVPP)之100mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.9)在一均質機中萃取30秒(四次)。將均質物過濾四層棉布並以12,000×g離心30分鐘兩次。其粗萃取物直接裝入一胰蛋白酶-瓊脂糖凝膠4B親和柱(1.0 x 10cm)，並藉由改變pH值以0.2M KCl 緩衝液(pH 2.0)將被吸附的IbTI洗提(Huang，等人，J.Agric.Food Chem. 2007，55，6000-6006)。將該萃取物去鹽，並以Centricon 10濃縮，接著凍乾以備進一步使用。純化之IbTI的SDS-PAGE分析顯示了具分子質量約25kDa的單體。產率為8.3%(純化之TI蛋白質150mg，比上粗萃取物總蛋白質1,800mg，等於8.3%)。
所引用之文獻之全文以引用的方式併入本文中。
圖1：甘藷胰蛋白酶抑制因子(IbTI)對RAW 264.7巨噬細胞之脂多醣(LPS)誘發之細胞生存力(A)和NO產生(B)之影響。在無或有IbTI存在下(0，5，10，20，40μM)(0，125，250，500，1,000μg/mL)，以1μg/ml LPS培養細胞24小時。在以LPS培養之前1小時添加IbTI。使用MTT測定來進行細胞生存力測定。使用革利士試劑來測定培養基中亞硝酸鹽濃度。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「#」與控制組的樣本相比較。「*」(p<0.05)和「**」(p<0.01)與僅有LPS組相比較。
圖2：甘藷胰蛋白酶抑制因子對由以LPS誘發之RAW264.7巨噬細胞所產生之TNF-α(圖2A)和PGE2(圖2b)之影響。在無或有IbTI存在下(0，5，10，20，和40μM)(0，125，250，500，和1,000μg/mL)，以1μg/mlLPS培養細胞24小時。在以LPS培養之前1小時添加IbTI。蒐集培養基，用於TNF-α和PGE2 ELISA套組之測定。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「#」與控制組的樣本相比較。「**」(p<0.01)與僅有LPS組相比較。
圖3：在以LPS-激化之RAW264.7細胞中，甘藷胰蛋白酶抑制因子抑制iNOS和COX-2蛋白質之表現。在無或有IbTI 存在下(0，5，10，20，和40μM)(0，125，250，500，和1,000μg/mL)，以1μg/ml LPS培養細胞24小時。在以LPS培養之前1小時添加IbTI。接著製備經裂解之細胞並使用對iNOS和COX-2專一之抗體進行西方墨點法。使用β-肌動蛋白作為內部控制。(A)顯示一個來自兩個分開實驗的代表西方墨點圖。(B)參照LPS-激化培養物來計算iNOS及COX-2蛋白質之相對濃度。「#」與控制組的樣本相比較。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與僅有LPS組相比較。
圖4：在以LPS-激化之RAW264.7細胞中，甘藷胰蛋白酶抑制因子抑制MMP-9和MMP-2蛋白質之表現。在以LPS(1μg/ml)培養細胞24小時之前，先以IbTI前處理細胞(0，10，20，和40μM)(0，250，500，和1,000μg/mL)1小時。(A)接著製備懸浮細胞，使用SDS-PAGE酶譜法偵測MMP-9和MMP-2之活性。(B)參照LPS-激化培養物來計算MMP-9及MMP-2蛋白質之相對濃度。(C)使用對MMP-9專一之抗體顯示了，在以LPS-激化之RAW264.7細胞中IbTI抑制MMP-9蛋白質之表現。使用β-肌動蛋白作為內部控制。(D)參照LPS-激化培養物來計算MMP-9蛋白質之相對濃度。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「***」(p<0.001)與陽性控制組相比較。
圖5：甘藷胰蛋白酶抑制因子和吲哚美辛(Indo)對由λ-海藻糖引起之小鼠後掌水腫之影響。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與λ-海藻糖(Carr)組相比較。
圖6：甘藷胰蛋白酶抑制因子和吲哚美辛(Indo)對小鼠腳掌MDA濃度之影響。每個值以均值±標準差(mean±S.D.) 來表示。「###」(p<0.001)為與控制組相比較。「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與λ-海藻糖(Carr)組相比較。
圖7：IbTI和吲哚美辛(Indo)對小鼠中海藻糖(Carr)誘發之TNF-α(A)和NO(B)之血漿中濃度在第五個小時的影響。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「###」(p<0.001)為與控制組相比較。「*」(p<0.05)、「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與λ-海藻糖(Carr)組相比較。
圖8：小鼠後腳掌在皮下注射0.9%鹽水(控制組)或海藻糖(Carr)後之組織切片，以蘇木精和曙紅染色。(A)控制組鼠：顯示了正常真皮與皮下組織的外觀，沒有任何顯著的損害。(B)在僅皮下注射Carr後，有中度的血管外紅血球及大量的發炎白血球(主要為嗜中性白血球)出血滲入小鼠之皮下間質組織。又，皮下組織層之細節顯示了具滲出液之水腫造成之間質空間擴大。(C)相較於僅皮下注射Carr，吲哚美辛(Indo)顯著地降低了出血、水腫和發炎細胞滲入的程度。(D)相較於僅皮下注射Carr，IbTI(40mg/kg)顯著地顯示型態上的改變。(100 x.)(E)計算每個範圍內的嗜中性白血球之數量(400 x)，並計算每個組織切片之5個範圍的平均數。「**」(p<0.01)與Carr組相比較。
圖9：甘藷胰蛋白酶抑制因子(IbTI)和吲哚美辛(Indo)對小鼠中由λ-海藻糖引起之MMP-9和MMP-2表現之影響。(A)製被懸浮組織，並使用SDS-PAGE酶譜法偵測MMP-9和MMP-2活性。(B)參照空白組來計算MMP-9和MMP-2蛋白質之相對濃度。三個不同的試驗，每個重複進行三次，其數據以均值±標準差(mean±S.D.)來表示。「**」(p<0.01)和「***」(p<0.001)與λ-海藻糖(Carr)組相比較。

Claims (8)

  1. 一種甘藷(Ipomoea batatas )胰蛋白酶抑制因子在製備用於治療急性發炎或痛敏感之醫藥組合物之用途。
  2. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該甘藷胰蛋白酶抑制因子係來自甘藷葉片或塊根。
  3. 根據申請專利範圍第1項之用途，其抑制iNOS或COX-2之產生。
  4. 根據申請專利範圍第1項之用途，其抑制TNF-α之產生。
  5. 根據申請專利範圍第1項之用途，其抑制PGE2 之產生。
  6. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該急性發炎或痛敏感係與水腫有關。
  7. 根據申請專利範圍第1項之用途，其抑制NO之產生。
  8. 根據申請專利範圍第1項之用途，其抑制蛋白激酶C(PKC)之產生。
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