TWI415624B - Sulfated chondroitin - polycaprolactone graft copolymer, preparation and application thereof - Google Patents

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Description

硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物、其製法及其應用
本發明是有關於一種聚己內酯接枝共聚物的製造方法，特別是指一種硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製造方法。本發明亦提供一種硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物，及一包含該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的醫藥組成物。
癌症是一種突變的不正常細胞，不僅繁殖速度快，還具有高度侵略性和轉移性。目前治療癌症的方法有以下幾種：手術切除、放射治療，及化學藥物治療等。其中，手術切除方式通常只能延長患者的生命，治癒力不高，而放射治療及化學藥物治療方式，會對正常細胞造成危害。因此選擇一個安全、穩定、高選擇性的藥物載體，有效地傳遞藥物至癌細胞或組織將成為未來癌症藥物治療的主流。
聚己內酯系聚合物具有相當的生物相容性，因此目前許多的醫療縫線、骨釘及細胞再生模板大多含有聚己內酯，故以該聚己內酯系化合物做為藥物載體，也成為被廣泛研究的對象，且該聚己內酯在人體內可透過檸檬酸循環，代謝成二氧化碳及水排出體外，但，該聚己內酯系聚合物的生物降解速度慢，而需進一步地改質，目前已知有聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)-聚己內酯(簡稱PEG-PLC)載體及右旋糖酐(dextran)-聚己內酯載體(簡稱DEX-PLC)被廣為研究開發。
上述的PEG-PCL載體中的PEG無法被生物體分解代謝，而DEX-PCL載體易被人體免疫系統視為異物而被排斥，所以不易長時間在血流中循環；此外，此等載體的臨界微胞濃度高而不易自組裝，乘載藥物的含量不高，故不適合做為藥物的載體。期刊文獻Biomacromolecules 2008,9,2447-2457 揭示一種硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝物及其合成方式，其中，該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝物如下式所示：
其中R表示氫或。該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝物是由一經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素與該聚己內酯系聚合物反應而製得，然，該合成方式是採用傳統自由基聚合反應，故該反應無專一性、易產出副產物，且需要多重步驟才可以去除副產物，同時，該經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素或該聚己內酯系聚合物自身易進行交聯或聚合反應，導致產率低(45%～55%)。再者，所製備而得的硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝物之臨界微胞濃度較高(3.17×10-3 mg/mL)，較不易穩定存在血流循環中。
因此，發展一易純化、產率高的製備載體的方法，且該載體具有較佳臨界微胞濃度及生物相容性，同時，可提高藥物包覆率並且有效地傳遞藥物至與該藥物作用的特定細胞中，成為本技術領域者努力研究的目標之一。
因此，本發明之第一目的，即在提供一種產率高、易純化且有效控制及分析接枝率的硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製法。
於是，本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製法，係令一硫酸化軟骨素組份與一聚己內酯系聚合物於一催化劑存在下，進行原子轉移自由基聚合反應，以獲得一硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物；其中，該硫酸化軟骨素組份包含至少一經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素；及該聚己內酯系聚合物是由下式(I)所示且具有2,000至10,000的重量平均分子量範圍：
於式(I)中，R1 表示C1 ～C8 的直鏈或支鏈烷基、芳香基，或，其中，R11 表示氫或甲基，t表示45至225之整數；R2 表示，其中，R21 、R22 及R23 為相同或不同且分別地表示氫、甲基或鹵素原子，但條件是R21 、R22 及R23 中至少一者為鹵素原子；及m表示18至88之整數。
本發明之第二目的，即在提供一種具備較佳的生物相容性、較佳臨界微胞濃度及標的癌細胞能力的硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物。
於是，本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物，其係藉由上述之方法所製得。
本發明之第三目的，即在提供一種高活性組份乘載率及包覆率，且結構穩定性佳的奈米微胞型載體。
於是，本發明奈米微胞型載體，係令一如上所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物進行透析處理而形成。
本發明之第四目的，即在提供一種具有較佳釋放活性組份能力的醫藥組成物。
於是，本發明醫藥組成物，係包含一如上所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物及一活性組份。
本發明之第五目的，即在提供一種具有較佳釋放活性組份能力的醫藥組成物。
於是，本發明醫藥組成物，係包含一如上所述之奈米微胞型載體及一活性組份。
本發明之功效在於：透過原子轉移自由基聚合反應，將具有特定結構之聚己內酯系聚合物接枝至該硫酸化軟骨素組份，可有效地提高接枝率及反應的選擇性，進而減少副產物的產生，避免繁瑣的純化步驟，且簡易的製程可減少生產成本的支出。同時，透過該製法所製備而得的硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物，因具有較佳的生物相容性，當後續做為載體時，除了可提高活性組份傳遞至與活性組份作用的特定細胞的比例，且該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物為一具有疏水端及親水端的雙性分子，能有較低的臨界微胞濃度，於後續應用時，可提高活性組份的乘載率及包覆率。
本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製法，係令一硫酸化軟骨素組份與一聚己內酯系聚合物於一催化劑存在下，進行原子轉移自由基聚合反應，以獲得一硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物。
在本發明製法中，該催化劑會引發該聚己內酯系聚合物上的鹵素離去而產生自由基，接著與硫酸化軟骨素組份中所含的雙鍵進行原子轉移自由基聚合反應，而讓該聚己內酯系聚合物得以接枝至硫酸化軟骨素組份。該製法可提高反應的選擇性，產率可高達70%以上；此外，更可避免硫酸化軟骨素組份中所含之經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素發生自身交聯現象，同時可減少副產物的產生，繼而避免繁瑣的純化步驟而可減少生產成本的支出。再者，因該聚己內酯系聚合物為疏水性化合物，且該硫酸化軟骨素組份為親水性化合物，通常對於此二者進行反應所需之溶劑選擇需特別考量，但特別的是，本製法可以在非均相的條件下進行反應，即使無法找到共溶劑(co-solvent)完全將該聚己內酯系聚合物及硫酸化軟骨素組份溶解，也能有效地進行反應。本發明製法可有效地接枝不同分子量的聚己內酯系聚合物，相較於以往只能接枝約分子量2,000的聚己內酯系聚合物，本發明之製法是一大突破。
較佳地，該原子轉移自由基聚合反應的操作溫度範圍為55℃～65℃。較佳地，該原子轉移自由基聚合反應的反應時間範圍為1小時～2小時。較佳地，該硫酸化軟骨素組份與該聚己內酯系聚合物的重量比例範圍為0.1～0.9。
較佳地，該催化劑是擇自於溴化銅(copper bromide，簡稱CuBr)、氯化銅(copper chloride，簡稱CuCl)，或此等一組合。
較佳地，該原子轉移自由基聚合反應中還可添加一溶劑，該溶劑是擇自於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)、甲苯(toluene)、1,4-二烷(1,4-dioxane)、二甲苯(xylene)、苯甲醚(anisole)、二甲基甲醯胺(dimethyl formamide，簡稱DMF)、水、甲醇、乙腈(acetonitrile，簡稱ACN)、氯仿(chloroform)，或此等一組合。
該硫酸化軟骨素組份包含至少一經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素。較佳地，該經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素是一硫酸化軟骨素與一含雙鍵化合物進行聚合反應而製得，該硫酸化軟骨素是擇自於硫酸化軟骨素A(chondroitin sulfate A)、硫酸化軟骨素C(chondroitin sulfate C)、硫酸化軟骨素E(chondroitin sulfate E)或此等一組合。而該含雙鍵化合物是擇自於丙烯酸(acrylic acid)、丙烯酸酐(acrylic anhydride)、丙烯醯氯(acryol chloride)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、甲基丙烯酸酐(methacrylic anhydride)、甲基丙烯醯氯(methacryol chloride)或甲基丙烯酸酯(methyl methacrylate)。本發明選用硫酸化軟骨素做為載體的一部分，是因該硫酸化軟骨素為結締組織中的重要成份且為高分子多醣體，不會被體內的免疫系統認定為異物，且進一步地本發明將該硫酸化軟骨素進行改質，形成一經雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素，目的在於使該聚己內酯系聚合物可有效地與硫酸化軟骨素接枝，提高接枝率，並增加反應的選擇性。該經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素的製備方法包含以下步驟：將該硫酸化軟骨素與該含雙鍵化合物攪拌均勻混合，於鹼性環境下反應即可。較佳地，該硫酸化軟骨素與該含雙鍵化合物的重量比例範圍為0.05～0.8。較佳地，該反應的操作溫度範圍為25℃～30℃。較佳地，該反應的的反應時間範圍為18小時～36小時。
該聚己內酯系聚合物是經由己內酯透過開環聚合的方式而製得，該製作方式為本技術領域者所周知，故不再贅述。本發明之聚己內酯系聚合物是由下式(I)所示且具有2,000至10,000的重量平均分子量範圍：
於式(I)中，R1 表示C1 ～C8 的直鏈或支鏈烷基、芳香基，或，其中，R11 表示氫或甲基，t表示45至225之整數；R2 表示，其中，R21 、R22 及R23 為相同或不同且分別地表示氫、甲基或鹵素原子，但條件是R21 、R22 及R23 中至少一者為鹵素原子；及m表示18至88之整數。
較佳地，於該式(I)中，該R1 表示C1 ～C8 的直鏈或支鏈烷基、苯甲基(benzyl)、，其中，R11 表示氫或甲基；R3 、R4 或R5 為相同或不同，且分別地表示伸烷基或氫，但條件是三者中至少一者為伸烷基。本發明之一具體例中，該R1 表示苯甲基。
較佳地，於該式(I)中，該R2 表示，R21 、R22 及R23 為相同或不同且分別表示氫、甲基、氯原子或溴原子，但條件是該R21 、R22 及R23 中至少一者為氯原子或溴原子。
更佳地，於該式(I)中，該R2 表示 。本發明之一具體例中，該R2 表示。
本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物係藉由上述之方法所製得。
該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物具有生物相容性及生物可分解性，同時，當其包覆該活性組份(如抗癌藥物、抗氧化劑)後，在未到達與該活性組份作用的特定細胞之前不會釋放出活性組份，且可降低該活性組份於傳遞過程中被降解的機率，而在到達與該活性組份作用的特定細胞時，則會依一定速率釋放活性組份，達到治療效果。大部分做為活性組份的抗癌藥物普遍存在水溶解度低的問題，本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物因含有具有親水性的硫酸化軟骨素，且在水中可具有自組裝形成微胞的特性，因此當用來包覆抗癌藥物時，可解決抗癌藥物水溶解度低的問題，更有助於將活性組份傳遞至與該活性組份作用的特定細胞中。較佳地，以該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的總重量為100%計，該聚己內酯的含量約25 wt%～37 wt%。除上述之外，該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物還可利用硫酸化軟骨素上的酸基來與生物分子(如葉酸、胜肽、螢光分子等)反應，製備出多功能的標靶試劑。
本發明奈米微胞型載體，係令一如上所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物進行透析處理而形成。
較佳地，該透析處理是使該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物自組裝形成微胞。該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物在低濃度水溶液中不會形成微胞，當濃度超過臨界微胞濃度(critical micelle concentration，簡稱CMC)時，由於疏水性、氫鍵等分子間作用力，使得該聚己內酯的部分聚集在一起，形成疏水性的核(hydrophobic core)，而該硫酸化軟骨素的部分形成親水性的外殼(hydrophilic shell)，增加微胞結構的穩定性。在奈米醫學領域中，微胞載體是相當重要的一環，一般期望具備以下特點：微胞粒徑小、高活性組份乘載率及包覆率，且結構穩定性佳，且能長時間滯留體內，將活性組份有效地傳遞至與該活性組份作用的特定細胞等；再者，載體的粒徑更期望可控制在奈米範圍，進而增加血管滲透的選擇效果。
較佳地，該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的臨界微胞濃度值範圍為1.3×10-3 mg/mL～2.2×10-3 mg/mL。
本發明醫藥組成物係包含一如上所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物及一活性組份。
本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物為一雙性高分子，在後續做為該活性組份的載體時，由於活性組份多為疏水性，因而與該聚己內酯部分(疏水性核)具有較高的作用力，而可包覆活性組份，而硫酸化軟骨素部分(親水性殼)對活性組份提供保護能力，使得活性組份能有效地被傳遞至與該活性組份作用的特定細胞中並被吸收。
上述所稱之活性組份指的是用於診斷、治療、減輕或預防人類疾病或其他足以影響人類身體結構及生理機能之物質或組合物。較佳地，該活性組份是擇自於喜樹鹼(camptothecin，簡稱CPT)、阿黴素(doxorubicin，簡稱DOX)、托普樂肯(topotecan)、環孢靈素(cyclosporine A)、泛艾黴素(epirubicin)、雷帕霉素(rapamycin)、維生素A、維生素D、維生素E和維生素K、紫杉醇(paclitaxel)，或此等一組合。本發明之具體例中，該活性組份是喜樹鹼及阿黴素。較佳地，該該活性組份與硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的重量比例範圍為0.05～0.2。本發明醫藥組成物係包含一如上所述之奈米微胞型載體及一活性組份。該奈米微胞型載體的優點是可使活性組份避開免疫系統的摧毀，增加活性組份在血液中的穩定度，而有效地延長活性組份在血液中的滯留時間，同時增加活性組份被利用的機率。較佳地，該活性組份與奈米微胞型載體的重量比例範圍為0.05～0.2。
本發明醫藥組成物的包覆率及乘載率，依據該活性組份的種類而有不同，較佳地，該活性組份為喜樹鹼時，本發明醫藥組成物的包覆率範圍為30%～50%及乘載率範圍為3%～5%。較佳地，該活性組份為阿黴素時，本發明醫藥組成物的包覆率範圍為40%～70%及乘載率範圍為4%～7%。
<實施例> [經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素的製備]
秤取1克硫酸化軟骨素(廠商：Tohoku Miyagi，Mw=58,000 Da)，並加入50毫升二次水，攪拌至完全溶解均勻。緩慢滴入12毫升的甲基丙烯酸酐(廠商：Lancaster，Mw=90.51 g/mol)並攪拌均勻。接著，量取18毫升5N的氫氧化鈉溶液且緩慢滴入上述混合溶液，於室溫下反應兩天後，再移至4℃冰箱中靜置24小時。之後，將該反應液緩慢滴入體積為50倍的乙醇中，以轉速為6,500 rpm離心5分鐘。離心後分為兩層，下層為白色粉末狀沉澱物，上層為一混合溶液，移除上層，再加入50毫升的乙醇，重複三次，以洗去未反應的甲基丙烯酸酐及硫酸化軟骨素組份，收集白色粉末狀沉澱物，該沉澱物即為經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素。進一步地將該經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素置放於真空烘箱中乾燥。其結構分析如圖1所示。
因每個硫酸化軟骨素的結構中有三個OH基團可用來接枝甲基丙烯酸酐，因此我們定義硫酸化軟骨素上的甲基丙烯酸酐的鍵結程度最高為300，則圖1上的A表示硫酸化軟骨素之醯胺上的三個氫，而B表示甲基丙烯酸酐之甲基的三個氫，將B的積分面積與A的積分面積相除，即為該經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素的接枝率，本發明經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素的接枝率為70%。
[聚己內酯系聚合物的製備]
於溫度為100℃下加入0.24毫升的苯甲醇及14克的εε-己內酯(ε-caprolactone)進行開環聚合反應並反應2小時，可得一反應產物(分子量6,000)。將該反應產物置入反應瓶中，並除氧30分鐘。接著加入50毫升的二氯甲烷，使該反應產物溶解，之後加入三乙基胺(triethylamine，簡稱TEA)與2-溴-2-甲基丙醯溴(2-bromo-2-methylpropionyl bromide)，於冰浴中反應一天，即獲得一聚己內酯系聚合物。其結構分析如圖2所示。
[硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製備]
秤取50毫克的經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素並用水溶解，可得一第一組份。秤取100毫克的聚己內酯系聚合物並用二甲基亞碸溶解，可得一第二組份。將第一組份與第二組份混合後，冷凍並除氧三次，接著，將溴化銅與雙吡啶(bipyridine)加入，並於60℃油浴下反應2小時，即獲得一硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物，產率：70%。其結構分析如圖3所示。由圖3中可計算出接枝率及該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物中聚己內酯的含量。
接枝率的計算：將5.1 ppm位置上聚己內酯中苯甲基上的兩個氫之積分面積(B)，與4.4 ppm位置上硫酸化軟骨素重覆單位中的兩個氫之積分面積(A)相除，計算出每個硫酸化軟骨素重複單元上接枝聚己內酯的莫耳含量。
聚己內酯含量的計算：(接枝率×聚己內酯系聚合物分子量)÷[(硫酸化軟骨素重覆單位分子量×(100-接枝率))+(接枝率×聚己內酯系聚合物分子量)]，其中，本發明之實施例的硫酸化軟骨素重覆單位分子量為528克/莫耳。
[奈米微胞型載體的製備]
將10毫克的硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物溶於5毫升的60℃的二甲基亞碸及4μL(trifluoroacetic acid，以下簡稱TFA)後，倒入一透析膜(廠商：Merck)中，並利用透析膜達到純化效果，而該透析膜可讓分子量為6,000～8,000的分子通過，且每三小時更換一次去離子水，經過三天的透析處理，即可獲得一奈米微胞型載體。
[醫藥組成物的製備]
將10毫克的硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物溶於5毫升的60℃之二甲基亞碸及4μL TFA的溶液中，形成第一溶液。將1毫克的喜樹鹼溶於二甲基亞碸中，形成第二溶液。將第一溶液和第二溶液混合後，置入一透析膜(廠商：Merck)中，接著放入2公升的純水中透析，每隔三小時換水一次，透析兩天。待透析結束後，將透析膜裡面的液體倒出，冷凍乾燥。將冷凍乾燥完後的產物用水回溶後，再以濾紙過濾掉剩餘未被包覆的喜樹鹼，收集濾液，並進行冷凍乾燥，即可得到該醫藥組成物，且該醫藥組成物的喜樹鹼之乘載率為4%。
<評價項目> 1.　臨界微胞濃度值量測：
將上述製得之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物與去離子水混合而配製為濃度2 mg/mL的溶液。再將上述溶液分別稀釋為不同濃度(1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.03125 mg/mL、0.0156 mg/mL、0.0078 mg/mL、0.004 mg/mL、0.002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.0005 mg/mL、0.00025 mg/mL、0.0001 mg/mL、0.00005 mg/mL)，並於上述15個不同濃度之溶液及濃度2 mg/mL的溶液中，分別加入濃度為6.0×10-7 M的焦油腦(pyrene)，接著利用螢光光譜儀進行測量分析，該螢光激發波長與發射波長分別設為339 nm及390 nm，該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物經激發後，會放射出波長為339及334的光，收集該波長為339及334的放射強度值並相除，可得一波長為339及334的放射強度比值與濃度對數的曲線圖(如圖4)，由該圖4中可計算出該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的臨界微胞濃度值。
2.　肺癌細胞CRL-5802毒性測試：
(a)　硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物對肺癌細胞CRL-5802毒性測試：在一個96-井培養盤中，分別加入5000 cells/well的CRL-5802，並於100 μL杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，以下簡稱DMEM，廠牌：Invitrogen)(37℃，5% CO2 )中進行細胞培養24小時，培養期間定時更換細胞培養液以並確保細胞生長並且存活。之後，將上述製得之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物與去離子水混合而配製為濃度2 mg/mL的溶液，再以DMEM培養基稀釋為不同濃度(1000 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL和20 μg/mL)，形成5個不同濃度的溶液，接著，將該等5個不同濃度的溶液及濃度2 mg/mL的溶液分別加入對應含有細胞的培養盤中，使得該等溶液的濃度分別改變為500 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL及1000 μg/mL，再繼續培養24小時。接著，將每個含有細胞的培養盤中分別加入50mL的溴化噻唑藍四唑(thiazolyl blue tetrazolium bromide，簡稱MTT)試劑培養3小時後，以轉速1500 rpm進行20分鐘的離心，並取出上層液。之後，分別加入100 μL的二甲基亞碸於每個含有細胞的培養盤中，均勻震盪15分鐘，再以酵素免疫分析儀量測，並收集每個含有細胞的培養盤中之溶液對波長490nm之吸收值，並透過計算可畫出一長條圖(如圖5)，由該圖5可知，該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物對肺癌細胞CRL-5802的毒性結果。
(b)　醫藥組成物對肺癌細胞CRL-5802毒性測試：在一個96-井培養盤中，分別加入5000 cells/well的CRL-5802，並於100 μL DMEM培養基(37℃，5% CO2 )中進行細胞培養24小時，培養期間定時更換細胞培養液以並確保細胞生長並且存活。之後，將上述醫藥組成物與DMEM培養基混合而配製為濃度250 μg/mL的溶液(喜樹鹼的濃度為10 μg/mL)，接著再以DMEM培養基稀釋為不同濃度的溶液，且該等溶液中喜樹鹼的濃度分別為4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL和0.04 μg/mL。將該等6個不同喜樹鹼濃度的溶液與濃度250 μg/mL的溶液分別加入對應的含有細胞的培養盤中，使得該等溶液中喜樹鹼的濃度分別改變為2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、0.02 μg/mL及5 μg/mL，再繼續培養24小時。接著，將培養液吸出，用100 μL的磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline，簡稱PBS)分別加入至每個含有細胞的培養盤中，再將PBS緩衝液吸出後，重新回補新的100 μL的培養液，繼續分別培養24小時與48小時。之後，將每個含有細胞的培養盤分別加入50 μL的MTT試劑培養3小時後，以轉速1500 rpm進行20分鐘的離心，並取出上層液，接著分別加入100 μL的二甲基亞碸於每個含有細胞的培養盤中，並均勻震盪15分鐘，再以酵素免疫分析儀量測，並收集每個含有細胞的培養盤中之溶液對波長490nm之吸收值。由該等吸收值並透過計算可畫出一長條圖(如圖6)，由該圖6可知，該醫藥組成物對肺癌細胞CRL-5802的毒性結果。
(c)　喜樹鹼對肺癌細胞CRL-5802毒性測試：該測試的過程如同上述2(a)，不同的地方在於：將喜樹鹼與二甲基亞碸混合而配製為濃度2 mg/mL的溶液，取80 μL上述的溶液加入7.92毫升的DMEM培養基稀釋成20 μg/mL，再以DMEM培養基稀釋為不同濃度(10 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.2 μg/mL和0.1 μg/mL)，形成6個不同濃度的溶液，將該等6個不同濃度的溶液與濃度20 μg/mL的溶液分別加入對應的含有細胞的培養盤中，使得該等溶液的濃度分別改變為5 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.1 μg/mL和0.05 μg/mL及10 μg/mL，再繼續培養24，接著，將培養液吸出，用100μL的PBS分別加入至每個含有細胞的培養盤中，再將PBS緩衝液吸出後，重新回補新的100μL的培養液，繼續分別培養24小時與48小時，其數據結果如圖6。
上述的2(a)～2(c)測試數據以下列公式計算：
即可獲得該細胞存活率(%)的結果，其中，OD490(實驗組)指的是上述2(a)～2(c)測試數據，而OD490(對照組)指的是肺癌細胞CRL-5802於波長490nm之吸收值。
3.　細胞吞噬能力：
將直徑為18 mm之蓋玻片浸泡於0.1N的HCl溶液一天，之後以二次水沖洗，並以拭淨紙拭乾，再浸泡於75%酒精中。以滅菌過的鑷子將浸泡於酒精的蓋玻片取出並在本生燈上過火，使殘餘在蓋玻片上的酒精揮發。
將蓋玻片置入一個12-井培養盤中，再以1×105 cells/well的CRL-5802細胞培養於盤中的蓋玻片上，培養液為含有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，簡稱FBS)的DMEM培養基。培養24小時後，將包覆有4% Nile red的硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物加入至含有細胞的培養盤中。培養30分鐘後，將含有細胞的培養盤中的培養液全部吸出，利用PBS緩衝液清洗含有細胞的蓋坡片五次。加入1mL/well的3.7%三聚甲醛(paraformaldehyde)，接著將其置放在37℃的培養箱中培養30分鐘，隨後將三聚甲醛吸除，再以PBS清洗五次。
接著，加入1mL/well的0.1% Triton X-100(廠商：Fluka)，並培養5分鐘，隨後將Triton X-100吸除，再以PBS清洗五次。再加入0.5mL/well的0.5μg/mL之4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，簡稱DAPI)將細胞核染色，並培養5分鐘，隨後將DAPI吸除，再以PBS清洗五次。取一片載玻片並在其中央滴上一滴螢光染色抗退劑(fluorescent mounting medium，廠牌：DakoCytomation)，同時將已處理好的蓋玻片從盤中夾出，將含有細胞貼附的面朝下而覆蓋在載玻片上。利用透明指甲油沿著蓋玻片邊緣封片使之固定，待指甲油自然陰乾後使用雷射共軛聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Mircroscope，廠牌：Olympus，型號：FV500)觀測，其觀測結果如附件1所示。
5.　藥物釋放能力：
於1毫克的上述醫藥組成物中分別加入1毫升且pH=7.4的PBS緩衝液及0.1M且pH=7.4的PBS(含有10% FBS)緩衝液。將該等緩衝液置於37℃的培養箱(incubator)中，並依序在不同時間點，以12,000rpm進行離心5分鐘，取出上層液，以紫外光分光光度計分別量測在368nm之吸收值，並於1、2、3、4、7、8、9、12、24、48、72、96、120及144小時候量測，每次重複量測三次，最後以平均值表示之。收集該等吸收值並計算出釋放喜樹鹼的濃度，將時間對釋放喜樹鹼的濃度做一曲線圖(如圖7)，由該圖7可知，該醫藥組成物存在血清或無血清時釋放喜樹鹼的能力。
6.　醫藥組成物乘載率：
秤取1毫克之上述的醫藥組成物溶於2毫升的60℃之二甲基亞碸及4μL TFA後，將該溶液以紫外光分光度計測量，偵測波長368nm的吸收值並換算得到喜樹鹼的含量，進而可計算出該醫藥組成物乘載喜樹鹼的乘載率，該乘載率(%)=(喜樹鹼的含量/醫藥組成物總重)×100%。
7.　醫藥組成物包覆率：
秤取1毫克之上述的醫藥組成物溶於2毫升的60℃之二甲基亞碸及4μL TFA後，將該溶液以紫外光分光度計測量，偵測波長368nm的吸收值並換算得到喜樹鹼的含量，進而可計算出該醫藥組成物包覆喜樹鹼的包覆率，該包覆率(%)=(喜樹鹼的含量/喜樹鹼的總量)×100%。
<數據分析及結果>
參閱圖3可知，本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製法確實產率高達70%，且有較佳的接枝率。
參閱圖4可知，本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的臨界微胞濃度為1.3×10-3 mg/mL，表示該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物只需要在極低的濃度就可形成微胞，且具有較佳自組裝的能力。
參閱圖5可知，當硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的濃度達1mg/mL時，CRL-5802細胞的存活率仍達80%以上，表示該硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物對CRL-5802細胞是無明顯的毒性。
參閱圖6可知，本發明醫藥組成物毒殺CRL-5802細胞的能力比僅使用喜樹鹼來的佳，如本發明含有1μg/mL之喜樹鹼的醫藥組成物，其CRL-5802細胞存活率只剩下15%左右，反觀僅使用1μg/mL的喜樹鹼，該CRL-5802細胞存活率仍高達30%左右，而且本發明醫藥組成物隨著時間增加對CRL-5802細胞有顯著的毒殺效果，表示本發明醫藥組成物有較佳的釋放活性組份的能力，才能達到較佳的毒殺效果。
參閱圖7可知，本發明之醫藥組成物隨著時間增加，可有效地釋放喜樹鹼，且於20小時內可釋放高達75%的喜樹鹼，表示本發明醫藥組成物有較佳的釋放活性組份的能力。再者，當存在有血清時，可模擬應用於人體時的情況，來證明本發明醫藥組成物釋放喜樹鹼的能力是否會受影響，由圖7可知，即使存在有血清下，本發明醫藥組成物於20小時內仍可釋放高達75%的喜樹鹼，且隨著時間增加可有效地釋放喜樹鹼。
經由醫藥組成物乘載率的結果可知，本發明醫藥組成物乘載阿黴素的乘載率約4.7%，而乘載喜樹鹼的乘載率約3.9%±0.15。
參閱附件1可知，藉由雷射共軛聚焦顯微鏡觀察細胞在30分鐘時是否將奈米微胞型載體吞噬進去，紅色螢光為Nile red，從附件1中可看出CRL-5802細胞將奈米微胞型載體吞入，表示本發明之奈米微胞型載體具有較佳的CRL-5802細胞相容性。
綜上所述，本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製法透過原子轉移自由基聚合反應，將該聚己內酯系聚合物接枝至該硫酸化軟骨素組份，可有效地提高接枝率及反應的選擇性，進而減少副產物的產生，避免繁瑣的純化步驟，且簡易的製程可減少生產成本的支出。同時，透過該製法所製備而得的硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物，因具有較佳的生物相容性及較低臨界微胞濃度，當做為載體時，可提高活性組份傳遞至癌細胞的比例、較佳的活性組份包覆率、乘載率及較佳的釋放活性組份的能力，故確實能達成本發明之目的。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
圖1是一NMR圖，說明本發明經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素的較佳實施例的結構分析； 圖2是一NMR圖，說明本發明聚己內酯系聚合物的較佳實施例的結構分析； 圖3是一NMR圖，說明本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的較佳實施例的結構分析；圖4是一曲線圖，說明本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的較佳實施例的臨界微胞濃度值；圖5是一長條圖，說明本發明硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的較佳實施例對CRL-5802細胞的毒性結果；圖6是一長條圖，說明本發明醫藥組成物的較佳實施例毒殺CRL-5802細胞的能力；及圖7是一曲線圖，說明本發明醫藥組成物的較佳實施例釋放喜樹鹼的能力。
圖8是一照片，說明本發明奈米微胞型載體的較佳實施例被CRL-5802細胞吞噬的情形。

Claims (11)

  1. 一種硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製備方法，係令一硫酸化軟骨素組份與一聚己內酯系聚合物於一催化劑存在下，進行原子轉移自由基聚合反應，以獲得一硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物；其中，該硫酸化軟骨素組份包含至少一經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素；及該聚己內酯系聚合物是由下式(I)所示且具有2,000至10,000的重量平均分子量範圍： 於式(I)中，R1 表示C1 ~C8 的直鏈或支鏈烷基、芳香基，或，其中，R11 表示氫或甲基，t表示45至225之整數；R2 表示，其中，R21 、R22 及R23 為相同或不同且分別地表示氫、甲基或鹵素原子，但條件是R21 、R22 及R23 中至少一者為鹵素原子；及m表示18至88之整數。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯 接枝共聚物的製備方法，其中，該含雙鍵化合物是擇自於丙烯酸、丙烯酸酐、丙烯醯氯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯醯氯或甲基丙烯酸酯。
  3. 根據申請專利範圍第1項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製備方法，其中，該硫酸化軟骨素組份與該聚己內酯系聚合物的重量比例範圍為0.1~0.9。
  4. 根據申請專利範圍第1項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製備方法，其中，該經含雙鍵化合物修飾之硫酸化軟骨素是一硫酸化軟骨素與該含雙鍵化合物進行聚合反應而製得。
  5. 根據申請專利範圍第1項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製備方法，其中，該硫酸化軟骨素與該含雙鍵化合物的重量比例範圍為0.05~0.8。
  6. 根據申請專利範圍第1項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製備方法，其中，於該式(I)中，該R1 表示C1 ~C8 的直鏈或支鏈烷基、苯甲基、，或，其中，R11 表示氫或甲基；R3 、R4 或R5 為相同或不同，且分別地表示伸烷基或氫，但條件是三者中至少一者為伸烷基。
  7. 根據申請專利範圍第1項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯 接枝共聚物的製備方法，其中，於該式(I)中，該R2 表示，R21 、R22 及R23 為相同或不同且分別表示氫、甲基、氯原子或溴原子，但條件是該R21 、R22 及R23 中至少一者為氯原子或溴原子。
  8. 一種硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物，其係藉由如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物的製備方法所製得。
  9. 一種奈米微胞型載體，係令一如申請專利範圍第8項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物進行透析處理而形成。
  10. 一種醫藥組成物，係包含一如申請專利範圍第8項所述之硫酸化軟骨素-聚己內酯接枝共聚物及一活性組份。
  11. 一種醫藥組成物，係包含一如申請專利範圍第9項所述之奈米微胞型載體及一活性組份。
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倪筱真，製備不同型態結構的硫酸化軟骨素-聚已內酯奈米粒子作為具指標的功能的藥物載體，高雄醫學大學醫藥暨應用化學研究所碩士論文，2010年11月25日 *
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