TWI414326B - 具有骨誘導能力之骨水泥 - Google Patents

Description

具有骨誘導能力之骨水泥

本發明係關於一種骨水泥，尤指一種具有骨誘導能力之骨水泥。

臨床上常見由外傷或腫瘤移除所造成的骨缺陷，以及骨質疏鬆症造成的骨基質流失，都會讓骨頭失去支撐強度，進而影響患者的日常生活。為使上述問題能得到解決，目前已開發出骨填補材料用於植入骨缺陷以加速骨組織修補，達到恢復健康骨組織正常功能的目的。

中華民國公告第I349655號發明專利即提供一種具有生物可分解性之骨水泥及其製備方法，其係將一高分子聚富馬酸二羥丙酯(PPF)與一磷酸四鈣(TTCP)/無水磷酸氫鈣(DCPA)的雙相材料混合使用，藉以得到一具有生物可分解性之骨水泥材料。中華民國公開第201121591號發明專利則提供一多孔性骨水泥，可用於治療齒科及骨骼的缺陷和美容整形等應用，該發明藉由摻混兩種以上不同粒徑之骨骼替代材料及兩種生物體中被吸收或分解速度不同之材料，可同時兼顧骨水泥固化後的結構強度及孔隙度。

目前的骨填補材料朝向生物可吸收、分解，以及具備良好的生物相容性、適當的機械強度與孔隙度等面向發展，前述兩項先前技術即係針對此些特性所提出之技術方案。然而，此部分議題獲得改善後，便須進一步發展能夠主動促進骨缺陷修復的骨水泥組成物，以取得更佳的臨床醫療效果

有鑑於此，仍需要一種能夠主動促進或誘導骨細胞分化生長，以有效縮短骨缺陷癒合時間之骨水泥組成物。

為解決前述所提及之問題，本案提出一種具有骨誘導能力之骨水泥，其包含一粉劑及一水劑，其中該粉劑包含硫酸鈣及一鈣磷酸鹽；該水劑包含水及透明質酸。

由於磷酸鈣及硫酸鈣為骨組織中無機質的主要成份且來源豐富，具有良好的生物適應性，可做為骨填補材料的主要成分，並適合做為填補骨缺損的硬骨替代物。

透明質酸(Hyaluronic acid，HA)是由N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)所組成的重複性雙醣單元經由β-1,3及β-1,4交替鍵結所構成之線型多醣，為一天然存在的生物性高分子，過去相關研究認為其可使關節間受力均勻，讓表面較為密合，減少相對於另一骨骼的滑動或移動，並具有潤滑及吸震保護的功能。

根據上述構想，其中透明質酸之平均分子量為60,000至2,000,000。

根據上述構想，其中透明質酸之平均分子量較佳為800,000至2,000,000。

根據上述構想，其中透明質酸之平均分子量更佳為2,000,000。

根據上述構想，其中透明質酸於該水劑中之重量百分濃度為0.5%至2.5%。

根據上述構想，其中透明質酸於該水劑中之重量百分濃度較佳為2.5%。

透過添加適當分子量及濃度之透明質酸於骨水泥之水劑中，待與粉劑混合後所形成之骨水泥能夠促進或誘導骨細胞分化生長，且具有較佳之操作性與孔隙度，並能提高骨水泥之保水能力。

根據上述構想，其中該鈣磷酸鹽係選自由氫氧基磷灰石、磷 酸鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣、磷酸四鈣、磷酸八鈣及其組合所組成之群。

根據上述構想，其中該鈣磷酸鹽較佳係為氫氧基磷灰石或磷酸三鈣。

根據上述構想，其中該鈣磷酸鹽之含量係佔該粉劑總重量之10%至40%。

根據上述構想，其中硫酸鈣之含量係佔該粉劑總重量之60%至90%。

根據上述構想，其中氫氧基磷灰石之粒徑係為5至15微米。

根據上述構想，其中磷酸三鈣之粒徑係為5至20微米。

根據上述構想，其中硫酸鈣之粒徑係為15至35微米。

本案「具有骨誘導能力之骨水泥」將可透過以下的實施例說明而讓在此領域具通常知識者瞭解其創作精神，並可據以完成。本案的實施並非由下列實施例而限制其實施型態。

本發明的骨水泥之粉劑係包含鈣磷酸鹽與硫酸鈣，以含適當濃度及分子量之透明質酸添加於水中為水劑，兩劑混和均勻後即可於一定時間內硬化定形，作為本發明所提出之骨水泥。為確認本發明所提出之骨水泥組成物具有骨誘導能力及其他有利性質，進行了以下相關實驗，其中骨水泥之體外降解測試、生物相容性分析及動物實驗所使用之樣本條件如下所述。

骨水泥樣本A之粉劑中，氫氧基磷灰石(粒徑5~15微米)佔整體重量之25%，硫酸鈣(粒徑15~35微米)佔整體重量之75%；其水劑成分則為重量百分濃度0.5%之透明質酸(平均分子量為800,000)水溶液；取粉劑4.9 g及水劑3.4 ml混合配製成骨水泥樣本A。

骨水泥樣本B之粉劑中，磷酸三鈣(粒徑5~20微米)佔整體 重量之25%，硫酸鈣(粒徑15~35微米)佔整體重量之75%；其水劑成分則為重量百分濃度0.5%之透明質酸(平均分子量為800,000)水溶液；取粉劑5.1 g及水劑3.0 ml混合配製成骨水泥樣本B。

骨水泥樣本C之粉劑係為市售骨水泥產品NuROs 之成分；水劑則為生理食鹽水；取粉劑4.4 g及水劑1.95 ml混合配製成骨水泥樣本C。

骨水泥樣本D之粉劑係市售骨水泥產品PRO-DENSE 之成分，其中硫酸鈣佔整體重量之75%，鈣磷酸鹽佔整體重量之25%，其中鈣磷酸鹽為磷酸二鈣及顆粒狀磷酸三鈣；水劑則為生理食鹽水；取粉劑4.4 g及水劑1.04 ml混合配製成骨水泥樣本D。

體外降解測試

依前述之成分及配比將骨水泥樣本製作成圓柱狀後，置入PBS溶液中密封，以90 rpm在37℃下搖晃，在不同時間點取出於37℃烘乾24小時後再秤重。第1圖係顯示各骨水泥樣本之體外降解測試結果，其中橫軸為經過時間(日)，縱軸為剩餘重量之百分比。如第1圖所示，含有透明質酸之骨水泥樣本A及樣本B，由於含水量高，且透明質酸的存在會增加骨化成品之孔隙度，因此極易降解，大約一週後即降解超過50%，三週後僅存不到10%；而不含透明質酸之骨水泥樣本C及樣本D，在經過四週後其降解仍不超過10%。

骨水泥吸水力測試

將骨水泥填充入模具並待其硬化後，冷凍乾燥一天，秤量重量，稱為乾重。再將乾燥之骨水泥置入二次水中浸泡三小時，以鑷子夾起除去多餘水分後秤重，稱為濕重。乾重與濕重之重量差即為其所吸收之水重，所吸收之水重佔原始乾燥重量之百分比即為吸水比例，可得到下表一之數據。

由此數據可看出，添加透明質酸於骨水泥之水劑中，將提高骨水泥之吸水比例，且以不同分子量之透明質酸添加入骨水泥中，在透明質酸含量一致的情況下(重量百分濃度0.5%)，同一種骨水泥其吸水比例仍會落在相近的範圍中。含有氫氧基磷灰石成分的骨水泥(即樣本A)，其吸水比例範圍為47%~55%之間。而含有磷酸三鈣成分之骨水泥(即樣本B)，其吸水比例則落在35%~43%的範圍內。

骨水泥孔隙度測試

將骨水泥填充入模具並待其硬化後，冷凍乾燥一天，以真實高密度儀(Pycnometer)測試骨水泥孔隙度，可得到下表二之數據。

由數據可得知，添加透明質酸於骨水泥之水劑中，將提高骨水泥之孔隙度，且以不同分子量之透明質酸添加入骨水泥中，在透明質酸含量一致的情況下(重量百分濃度0.5%)，同一種骨水泥其孔隙度仍會落在相近的範圍中。含有氫氧基磷灰石成分的骨水泥(即樣本A)，其孔隙度範圍為61%~63%之間，孔隙度提升大約 6%。而含有磷酸三鈣成分之骨水泥(即樣本B)，其孔隙度則落在57%~59%的範圍內，孔隙度提升大約5%。

生物相容性分析

將鼠纖維母細胞株L929培養於96孔盤一天後與各骨水泥樣本之萃取液共同培養，經過一天及三天後觀察其生長情形，並以WST-1細胞增殖檢測法測試細胞在不同骨水泥樣本萃取液中的活性與生長差異，再以乳酸去氫酶分析法(Lactate dehydrogenase assay；LDH assay)測試萃取液之細胞毒性。最後以活/死細胞螢光染色(Live/Dead staining)觀察不同組別之間的差異。其中乳酸去氫酶測試結果計算方法為： 細胞毒性=(培養基吸光值-背景吸光值)/(細胞完全溶解後之吸光值-背景吸光值)x 100%

第2圖A顯示各骨水泥樣本第一天之WST-1測試結果，其中縱軸為440 nm~650 nm之吸光值，數值越高代表其細胞活性越強。第2圖B顯示各骨水泥樣本第一天之LDH測試結果，縱軸為細胞毒性，其數值越高代表毒性越高。參考第2圖A及第2圖B，在第一天的時間點，WST-1及LDH測試結果顯示A、B、C、D四組骨水泥樣本皆沒有對細胞存活造成顯著影響。

第3圖A及第3圖B則分別顯示各骨水泥樣本第三天之WST-1及LDH測試結果。參考第3圖A及第3圖B，在第三天的結果可以發現A、B、C三組骨水泥樣本依舊沒有明顯細胞毒性，但D組開始出現細胞毒性的反應。根據實驗操作時的觀察，推測可能是D組骨水泥樣本在初期偏酸，不利於細胞生存，而A、B、C三組骨水泥樣本則沒有引起酸鹼度偏差的問題。

第4圖A及第4圖B分別顯示L929細胞與各組骨水泥樣本萃取液培養第一天及第三天之活/死細胞螢光染色結果，其中綠色代表活細胞，紅色代表死細胞；Control為負控制組，Pos-Control為正控制組。如第4圖A及第4圖B所示，螢光染色亦可觀察 到類似WST-1及LDH測試的現象，細胞在D組骨水泥樣本萃取液中可以生長，但是死亡的細胞也相對的增加。

由上述生物相容性分析結果可知，本發明所提出之含有透明質酸成分之骨水泥樣本A及樣本B具有良好之生物相容性，未對細胞存活產生不良之影響。

動物實驗

利用手術在紐西蘭白兔兩側大腿骨外上髁(femoral condyle)製造缺陷，控制其缺陷大小及形狀，隨後植入骨填補材料，並以同一隻兔子之對側骨缺陷作為對照組，進行不同時程之實驗(一至三個月)，條件如下表五所示：

實驗兔子於手術後每隔兩週交替注射螢光劑鈣黃綠素(Calcein)及二甲酚橙(Xylenol Orange)。待犧牲兔子後，將再生之骨組織進行病理切片分析，過程為先以10%中性緩衝福馬林(neutral buffered formalin)固定，以鑽石切片機將樣本切成等厚度薄片，再以X光機拍照用以分析骨癒合密度，並以螢光解剖顯微鏡拍攝新生骨螢光。其後將樣本脫鈣後包埋於paraffin上機切片，以H&E染色(Hematoxylin and eosin staining)觀察一般形態，藉以評估骨填補材料之效用，並分析殘存之填補材料，判斷其生物分解之程度，以及是否引起免疫反應。

第5圖A、B、C分別為動物實驗第4週、第8週及第12週 各組之切片結果，左上為硬骨切片外觀，右上為切片H&E染色結果，左下為新生骨螢光觀察結果，右下則為切片X光分析結果，每組圖皆以同一片切片作為代表。參考第5圖A，由第4週的樣本可觀察到，四組缺損的切片皆沒有明顯硬骨修補的現象。所有骨水泥皆大部分殘留在缺損中，而控制組骨缺損內則充滿軟組織。由螢光染色觀察新生鈣沉積，可發現缺損的邊緣有形成新生骨的現象。參考第5圖B，第8週的骨缺損中，以A組的修復程度最為明顯，不過可看出仍有部分骨水泥殘留。而B、C組修復程度則次之。控制組缺損內仍充滿軟組織，沒有觀察到有明顯硬骨修復的現象，初步觀察仍與第4週結果類似，以軟組織佔大多數。參考第5圖C，第12週的骨缺損中，A、B、C三組皆有修補的現象，其中又以B組的修補最為明顯。C組的缺損中有的可看到骨水泥殘留，而C組的缺損修補程度與控制組接近。

硬骨分化測試

在硬骨分化測試中，係將平均分子量60,000、800,000與2,000,000之透明質酸分別加入骨水泥樣本A及B之水劑中，重量百分濃度皆為2.5%，再分別與粉劑混合固化後製成錠狀。骨水泥錠經過UV照射十二小時滅菌，再以含10% FBS之α-MEM 40 ml在37℃下以100 rpm搖晃萃取二天。取萃取液上清液經3000 rpm離心15分鐘，以0.45μm過濾器過濾，再將萃取液中透明質酸之濃度皆調整至0.5 mg/ml，以此溶液用於培養MC3T3-E1骨前驅細胞，在未添加誘導因子的狀況下培養三天。除了A~D組骨水泥樣本外，另有不含萃取液之單純誘導控制組(positive control，Pos)與未誘導控制組(negative control，Con)兩組作為比較。最後以茜素紅(Alizarin Red)做礦化染色，並測定405 nm吸光值。硬骨分化測試所使用之樣本條件如下所述。

骨水泥樣本A之粉劑中，氫氧基磷灰石(粒徑5~15微米)佔整體重量之25%，硫酸鈣(粒徑15~35微米)佔整體重量之75%； 其水劑則為重量百分濃度2.5%之透明質酸水溶液，並依水劑中添加透明質酸之分子量又可分為A-60K、A-800K及A-2000K三組；取粉劑4.9 g及水劑3.4 ml混合配製成骨水泥樣本A。

骨水泥樣本B之粉劑中，磷酸三鈣(粒徑5~20微米)佔整體重量之25%，硫酸鈣(粒徑15~35微米)佔整體重量之75%；其水劑則為重量百分濃度2.5%之透明質酸水溶液，並依水劑中添加透明質酸之分子量又可分為B-60K、B-800K及B-2000K三組；取粉劑5.1 g及水劑3.0 ml混合配製成骨水泥樣本B。

骨水泥樣本C之粉劑係為市售骨水泥產品NuROs 之成分；水劑則為生理食鹽水；取粉劑4.4 g及水劑1.95 ml混合配製成骨水泥樣本C。

骨水泥樣本D之粉劑係市售骨水泥產品PRO-DENSE 之成分，其中硫酸鈣佔整體重量之75%，鈣磷酸鹽佔整體重量之25%，其中鈣磷酸鹽為磷酸二鈣及顆粒狀磷酸三鈣；水劑則為生理食鹽水；取粉劑4.4 g及水劑1.04 ml混合配製成骨水泥樣本D。

單純誘導控制組(Pos)之成分包含α-MEM、10%的FBS、1%抗生素、10mM之β甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate)以及50 μg/mL之抗壞血酸。

未誘導控制組(Con)之成分則包含α-MEM、10%的FBS以及1%抗生素。

在硬骨分化測試中，將萃取液中透明質酸的含量皆調整為0.5 mg/ml，目的在確認不同分子量之透明質酸，其刺激骨前驅細胞分化的能力是否有差異。第6圖A為第二次硬骨分化測試於第14天之顯微鏡觀察結果(放大倍率50倍)，第6圖B則為相對應之量化結果(縱軸為相對於未誘導控制組之405 nm吸光值比率)；第6圖C則為第二次硬骨分化測試於第21天之顯微鏡觀察結果，第6圖D為相對應之量化結果。由第6圖A~D可知A組含低分子量透明質酸(平均分子量60,000)及高分子量透明質酸(平均分子量2,000,000)之骨水泥有顯著之刺激分化的效果，且高 分子量的促硬骨分化能力非常明顯，初期(14天)約是使用生長因子刺激分化效果的六倍，中期效果(21天)約為兩倍。

經由以上實驗證實添加透明質酸成分於骨填補材中會增加材料之生物相容性，且有幫助硬骨細胞生長的現象。本發明使用含高分子量透明質酸之骨填補材料亦證實其促進骨前驅細胞的硬骨分化效果明顯。此外，添加透明質酸之骨填補材料，其黏稠度增加，可防止體液沖刷，另一方面又可保水並控制固化時間，透明質酸之潤滑效果亦可令骨填補材料的注射性提升。

本發明除可以一般塗抹方式使用之外，若材料混合後於硬化前填充於注射器中，可經由注射方式注入難以填塞之硬骨缺損孔隙中，並可應用於骨科及牙科醫材、骨替代物等領域。

以上所提僅是本案的較佳實施例態樣，並非用於限定本案的實施範圍，任何在此領域具有通常知識者，在不脫離本案的精神與範圍下所作的諸般變化與修飾，都不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

第1圖顯示各骨水泥樣本之體外降解測試結果。

第2圖A顯示各骨水泥樣本第一天之WST-1測試結果。

第2圖B顯示各骨水泥樣本第一天之LDH測試結果。

第3圖A顯示各骨水泥樣本第三天之WST-1測試結果。

第3圖B顯示各骨水泥樣本第三天之LDH測試結果。

第4圖A顯示L929細胞與各組骨水泥樣本萃取液培養第一天之活/死細胞螢光染色結果。

第4圖B顯示L929細胞與各組骨水泥樣本萃取液培養第三天之活/死細胞螢光染色結果。

第5圖A為動物實驗第4週之切片結果。

第5圖B為動物實驗第8週之切片結果。

第5圖C為動物實驗第12週之切片結果。

第6圖A顯示硬骨分化測試於第14天之顯微鏡觀察結果。

第6圖B顯示硬骨分化測試於第14天之量化結果。

第6圖C顯示硬骨分化測試於第21天之顯微鏡觀察結果。

第6圖D顯示硬骨分化測試於第21天之量化結果。

Claims (9)

1. 一種具有骨誘導能力之骨水泥，其包含一粉劑及一水劑，其中該粉劑包含硫酸鈣及一氫氧基磷灰石；該水劑包含水及透明質酸；而該氫氧基磷灰石之粒徑係為5至15微米。
2. 如申請專利範圍第1項所述之骨水泥，其中透明質酸之平均分子量為60,000至2,000,000。
3. 如申請專利範圍第2項所述之骨水泥，其中透明質酸之平均分子量為800,000至2,000,000。
4. 如申請專利範圍第3項所述之骨水泥，其中透明質酸之平均分子量為2,000,000。
5. 如申請專利範圍第1項所述之骨水泥，其中透明質酸於該水劑中之重量百分濃度為0.5%至2.5%。
6. 如申請專利範圍第5項所述之骨水泥，其中透明質酸於該水劑中之重量百分濃度為2.5%。
7. 如申請專利範圍第1項所述之骨水泥，其中該氫氧基磷灰石之含量係佔該粉劑總重量之10%至40%。
8. 如申請專利範圍第1項所述之骨水泥，其中硫酸鈣之含量係佔該粉劑總重量之60%至90%。
9. 如申請專利範圍第1項所述之骨水泥，其中硫酸鈣之粒徑係為15至35微米。