TWI396845B - 單分子反應檢測平台及其製造和使用方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於單分子檢測技術，特別係關於單分子反應之檢測平台以及其製造和使用方法。
酵素(enzyme)為生物體內執行各種關鍵性工作和功能的觸媒，而科學研究之重點多放在酵素的結構及其所行使的功能。近幾世紀以來，多數對於酵素的觀察是藉由針對一相當龐大數量的生物分子進行整體性的量測。然而，該種量測方法無法量測到單一分子的反應動力學。
另一方面，奈米相關發展已變成目前最重要的產業之一。從高科技產業到民生消費性生活用品，都有奈米科技相關產品之足跡。奈米科技所包含的領域相當廣泛，從基礎科學研究到應用科學的研發，包含生物、醫藥、物理、化學、材料及光電等。自然界亦可發現許多奈米結構的存在，例如具有蓮花效應的荷葉表皮細胞，及體內存有奈米級磁性粒子的各種昆蟲等。
近期以來，結合生物科學及奈米科技的單分子奈米科技已被廣泛的利用，且相當樂觀的提供了一個能夠克服上述整體性量測所面臨的困境，並開啟生命科學一個嶄新紀元的新契機。此項技術允許研究人員對於單分子的反應行為進行相當及時的研究。然而，雖然目前的發展有機會對於單分子進行研究的工作，這些方法多半仍需倚靠樣品濃度的控制及透過龐大數量的生物分子彼此間之反應。因此
，就算花費相當可觀的實驗數量，研究人員仍只能獲得相當有限之可用資訊。另一方面，對於陳述單分子的反應事件尚需額外可行的統計數量以針對含糊不清的部分進行確認。
例如，現行一種設計可讓酵素和受質進行交互作用的反應。該設計利用50奈米的奈米溝槽以容納酵素，以進一步限制受質進入進而產生反應的機率。該設計可有效提高受質的偵測濃度至習知方法的1000倍以上。同時，該奈米溝槽有限的體積也將有助於反應局部螢光之激發。然而，該設計具有下列缺點：
1.該設計無法保證是由單一酵素和受質進行單分子之反應。換言之，單分子反應發生的機率據估計僅有百分之一至萬分之一，故無法完全的控制。若酵素和受質的交互反應需要二至三個步驟方可完成時，此項缺點將更為顯著。
2.為釐清單分子反應含糊不清的部分，獲得統計上可信的數據往往需要龐大的實驗數據，而這將會是相當耗時之工作。
3.若受質的濃度過低，則等待單分子反應的時間將會相當冗長。這將導致酵素和受質反應的第二及第三項反應步驟發生的可能性大為降低，進而限制了量測酵素反應動力學的能力。
4.為保持單分子合理的反應可能性及偵測時間，受質濃度的動力學反應範圍必須維持在一至兩個數量級的範圍
內。
據此，業界所需要的是一種系統及方法，其可克服上述習知技術之缺點，並可擴大分子反應動力學的範圍、減少背景雜訊、增加局部受質濃度的操控以及縮小激發訊號的範圍。本發明即提供該系統及方法。
本發明揭示一種單分子反應檢測平台，包含一可透光之基材、複數個球狀粒子和一層薄膜。該可透光之基材之表面經蝕刻以形成複數個圓錐狀結構。該等球狀粒子係分別設置於該等圓錐狀結構之頂端，且該等球狀粒子之尺寸係可使一單一酵素固定於一單一球狀粒子之表面。該薄膜係沉積於該等圓錐狀結構之表面，該薄膜可作為一維波導之反射層，且該等球狀粒子係外露於該等薄膜。
本發明揭示一種單分子反應檢測平台之製造方法，包含下列步驟：設置複數個球狀粒子於一可透光之基材上；利用該等球狀粒子為面罩蝕刻該可透光之基材，使得該可透光之基材之表面形成複數個圓錐狀結構；以及沉積薄膜於該等圓錐狀結構之表面，並使該等球狀粒子外露於該等薄膜。
本發明揭示一種利用本發明之單分子反應檢測平台之檢測方法，包含下列步驟：利用載有受質之流體使該等受質和該等固定於該等球狀粒子之酵素發生反應；以及從該可透光基材底部入射雷射光以激發螢光光點於該等球狀粒子之頂端。
上文已經概略地敍述本發明之技術特徵，俾使下文之詳細描述得以獲得較佳瞭解。構成本發明之申請專利範圍標的之其它技術特徵將描述於下文。本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可瞭解，下文揭示之概念與特定實施例可作為基礎而相當輕易地予以修改或設計其它結構或製程而實現與本發明相同之目的。本發明所屬技術領域中具有通常知識者亦應可瞭解，這類等效的建構並無法脫離後附之申請專利範圍所提出之本發明的精神和範圍。
本發明在此所探討的方向為一種單分子反應檢測平台及其製造及使用方法。為了能徹底地瞭解本發明，將在下列的描述中提出詳盡的步驟及組成。顯然地，本發明的施行並未限定於本發明技術領域之技藝者所熟習的特殊細節。另一方面，眾所周知的組成或步驟並未描述於細節中，以避免造成本發明不必要之限制。本發明的較佳實施例會詳細描述如下，然而除了這些詳細描述之外，本發明還可以廣泛地施行在其他的實施例中，且本發明的範圍不受限定，其以之後的專利範圍為準。
圖1顯示本發明之一實施例之單分子反應檢測平台之示意圖。如圖1所示，該單分子反應檢測平台100包含一基材102及複數個球狀粒子104。該基材102為一可透光之基材，並由熔融氧化矽所構成。該基材102之表面係經由蝕刻以形成複數個圓錐狀結構，其中該等圓錐狀結構係以六方最密方式排列。
圖2顯示本發明之一實施例之單分子反應檢測平台之局部示意圖。如圖2所示，該球狀粒子104係由金所構成，並設置於該圓錐狀結構之頂端，且該球狀粒子104之尺寸係可使一單一酵素固定於一單一球狀粒子104之表面。該圓錐狀結構之表面係由一鋁製薄膜106所覆蓋，而該球狀粒子104則外露於該鋁製薄膜106。該鋁製薄膜106可作為一維波導之反射層。
在本發明之一實施例中，該等球狀粒子104皆分別透過硫醇類分子以鍵結方式連接於一標記有螢光之蛋白質。據此，該單分子反應檢測平台100係包含該等各連接一螢光蛋白質之球狀粒子104，此種結構即可應用於大規模的單分子反應螢光檢測。
圖3顯示本發明之一實施例之單分子反應檢測平台之製造方法之流程圖。在步驟302，設置複數個球狀粒子於一可透光之基材上，並進入步驟304。在步驟304，利用該等球狀粒子為面罩蝕刻該可透光之基材，使得該可透光之基材之表面形成複數個圓錐狀結構，並進入步驟306。在步驟306，沉積薄膜於該等圓錐狀結構之表面，並使該等球狀粒子外露於該薄膜。
在本發明之一實施例中，步驟302係由下列方式實現。首先，準備一由熔融氧化矽(fused silica)所構成之基材。其次，以旋轉塗佈法(spin coating)將複數個聚苯乙烯球(polystyrene bead)以六方最密方式排列於該基材之表面，其中該等聚苯乙烯球之半徑為400-1000奈米。接著，
利用氧電漿短暫處理增大聚苯乙烯球間之空隙，再利用電子槍蒸鍍方式將金沉積於該等聚苯乙烯球間之空隙。再來，移除該等聚苯乙烯球。最後，以退火製程以使該金之沉積物內聚形成該等球狀粒子，其中該等球狀粒子之半徑為20-40奈米。
在本發明之另一實施例中，步驟304係由下列方式實現。藉由反應性離子蝕刻(reactive ion etching)技術，並利用該等球狀粒子作為蝕刻該基材之面罩對該基材進行蝕刻。其中，該反應性離子蝕刻係利用CF4
和O2
作為主要蝕刻之氣體，並透過四次循環方式蝕刻該基材。值得注意的是，藉由改變CF4
和O2
之比例關係，即可控制該等圓錐狀結構之及該等球狀粒子之形狀及尺寸。在本實施例中，CF4
和O2
之比例關係係由初始之10：5逐漸改變至5：10。在蝕刻完成後，該等球狀粒子之半徑為4-10奈米，且該等圓錐狀結構之頂端係稍大於該等球狀粒子。
在本發明之又一實施例中，步驟306係由下列方式實現。首先，利用電子槍蒸鍍方式將鋁沉積於該基材之表面。再來，藉由退火製程使該等球狀粒子頂端之薄膜向外擴散以露出該等球狀粒子之頂端。
圖4顯示本發明之另一實施例之單分子反應檢測平台之製造方法之流程圖。如圖4所示，步驟402至406類似於圖3之製造方法之步驟302至306。在步驟408，移除殘留於該球狀粒子表面之高分子物質，並進入410。在步驟410，鍵結硫醇類分子於該等球狀粒子表面，並進入412。在步驟412
，透過該等硫醇類分子分別鍵結一蛋白質分子於各球狀粒子表面。
在本發明之一實施例中，步驟408係透過氧電漿或其他溶液以浸泡方式移除蝕刻後殘留之高分子物質。在本發明之另一實施例中，該等硫醇類分子係帶有胺基或COOH基之硫醇類分子。在本發明之又一實施例中，該等蛋白質係標記有螢光之蛋白質。
圖5顯示本發明之一實施例之利用單分子反應檢測平台之檢測方法之流程圖，其中該單分子反應檢測平台即根據本發明所提供之單分子反應檢測平台。在步驟502，利用載有受質之流體使該等受質和固定於該單分子反應檢測平台之球狀粒子上之酵素發生反應，以產生可受激發而產生螢光之產物，並進入步驟504。在步驟504，從該單分子反應檢測平台之可透光基材底部入射雷射光以激發該些產物而產生螢光光點於該等球狀粒子之頂端。
在本發明之一實施例中，步驟502係透過交流電滲透(alternative current electro-osmosis flow，AC EOF)裝置促使該流體流向該等球狀粒子，以使該等受質和該等酵素發生反應。在本發明之另一實施例中，該入射之雷射光係透過鋁薄膜之一維波導傳遞至該等球狀粒子之頂端形成半徑侷限於100奈米以下之螢光光點。在本發明之又一實施例中，該受質之濃度範圍係介於1μM至1fM之間，且該受質流動的時距介於0.1-100ms之間。在本發明之另一實施例中，該激發之螢光係由一濾光器所過濾，並由一敏感式TE冷卻電
荷耦合裝置接收訊號並呈像。
在本發明之另一實施例中，可藉由有限時域差分法(finite difference time domain)計算雷射光之穿透率及其在整個圓錐狀結構之分布情況。在本發明之又一實施例中，可藉由近場光學微影技術量測該等圓錐狀結構和該等球狀粒子對於近場光學分布的關係，其中該近場光學微影技術係藉由塗佈一層感光層薄膜於該基材上，並透過光源掃描式顯微鏡捕捉近場光學影像的分布。
綜上所述，本發明所提供之單分子反應檢測平台及其製造及使用方法，可特別針對單分子反應進行檢測而不需大量量測數據之收集，例如其可用以檢測近年來一種新穎的質子及幫浦酵素間之反應。應用本發明之實施例，研究人員可詳細描述單一生物分子的反應，或是精確的呈現單一生物分子在毫秒的時間內移動奈米等級之距離。再者，應用本發明之實施例，研究人員即可克服直接觀察巨大而複雜的細胞化學反應程序同步的問題。相較於習知技術的種種缺點，本發明所提供之單分子反應檢測平台及其製造及使用方法實可為學術界或業界在單分子反應的層級上開拓一條嶄新的道路。
本發明之技術內容及技術特點已揭示如上，然而熟悉本項技術之人士仍可能基於本發明之教示及揭示而作種種不背離本發明精神之替換及修飾。因此，本發明之保護範圍應不限於實施例所揭示者，而應包括各種不背離本發明之替換及修飾，並為以下之申請專利範圍所涵蓋。
100‧‧‧單分子反應檢測平台
102‧‧‧基材
104‧‧‧球狀粒子
106‧‧‧薄膜
302~306‧‧‧步驟
402~412‧‧‧步驟
502~504‧‧‧步驟
圖1顯示本發明之一實施例之單分子反應檢測平台之示意圖；圖2顯示本發明之一實施例之單分子反應檢測平台之局部示意圖；圖3顯示本發明之一實施例之單分子反應檢測平台之製造方法之流程圖；圖4顯示本發明之另一實施例之單分子反應檢測平台之製造方法之流程圖；以及圖5顯示本發明之一實施例之利用單分子反應檢測平台之檢測方法之流程圖。
102‧‧‧基材
104‧‧‧球狀粒子
106‧‧‧薄膜
Claims (39)
- 一種單分子反應檢測平台，包含：一可透光之基材，其表面經蝕刻以形成複數個圓錐狀結構；複數個分別設置於該等圓錐狀結構頂端之球狀粒子，其中該等球狀粒子之尺寸係可使一單一酵素固定於一單一球狀粒子之表面；以及沉積於該等圓錐狀結構表面之薄膜，其中該薄膜可作為一維波導之反射層，且該等球狀粒子係外露於該薄膜。
- 根據請求項1之檢測平台，其中該基材之材料為熔融氧化矽。
- 根據請求項1之檢測平台，其中該等球狀粒子之材料為金。
- 根據請求項1之檢測平台，其中該等球狀粒子之半徑為4-10奈米。
- 根據請求項1之檢測平台，其中該等圓錐狀結構係以六方最密方式排列。
- 根據請求項1之檢測平台，其中該等圓錐狀結構之頂端係稍大於該等球狀粒子。
- 根據請求項1之檢測平台，其中該薄膜之材料為鋁。
- 根據請求項1之檢測平台，其中各球狀粒子之頂端係連接至一帶有螢光之酵素。
- 根據請求項8之檢測平台，其中該等球狀粒子係透過硫醇類分子以鍵結方式連接於該等酵素。
- 根據請求項8之檢測平台，其中該螢光為Cy3之螢光。
- 一種單分子反應檢測平台之製造方法，包含下列步驟：設置複數個球狀粒子於一可透光之基材上；利用該等球狀粒子為面罩蝕刻該可透光之基材，使得該可透光之基材之表面形成複數個圓錐狀結構；以及沉積薄膜於該等圓錐狀結構之表面，並進行退火製程以使該等球狀粒子外露於該薄膜。
- 根據請求項11之製造方法，其中該設置該等球狀粒子於該可透光之基材之步驟，包含下列次步驟：利用旋轉塗佈法將複數個聚苯乙烯球旋佈於該可透光之基材之表面；蒸鍍構成該等球狀粒子之材料於該等聚苯乙烯球間之空隙；移除該等聚苯乙烯球；以及藉由退火製程以使構成該等球狀粒子之該材料形成該等球狀粒子。
- 根據請求項12之製造方法，其中該等聚苯乙烯球之半徑為400-1000奈米。
- 根據請求項11之製造方法，其中該基材之材料為熔融氧化矽。
- 根據請求項11之製造方法，其中該等球狀粒子之材料為金。
- 根據請求項11之製造方法，其中該等球狀粒子係以六方最密方式排列。
- 根據請求項11之製造方法，其中該等球狀粒子於蝕刻前之半徑為20-40奈米。
- 根據請求項11之製造方法，其中該等球狀粒子於蝕刻後之半徑為4-10奈米。
- 根據請求項11之製造方法，其中該蝕刻步驟係利用乾蝕刻技術。
- 根據請求項19之製造方法，其中該蝕刻步驟係利用反應性離子蝕刻技術。
- 根據請求項20之製造方法，其中該反應性離子蝕刻過程係利用CF4 和O2 作為主要之氣體。
- 根據請求項21之製造方法，其中該反應性離子蝕刻過程係係透過四次循環方式實現。
- 根據請求項22之製造方法，其中在該反應性離子蝕刻過程中，CF4 和O2 之比例關係係由初始之10：5逐漸改變至5：10。
- 根據請求項11之製造方法，其中該沉積薄膜之步驟，包含下列次步驟：蒸鍍該薄膜於該可透光之基材之表面；以及藉由該退火製程使該等球狀粒子頂端之薄膜向外擴散以露出該等球狀粒子之頂端。
- 根據請求項11之製造方法，其進一步包含下列步驟：連接硫醇類分子於該等球狀粒子；以及透過該等硫醇類分子分別連接一酵素於各球狀粒子。
- 根據請求項25之製造方法，其中在連接硫醇類分子之步驟前，係先以溶液浸泡或乾蝕刻方式移除蝕刻後殘留於該球 狀粒子表面之高分子物質。
- 根據請求項26之製造方法，其係透過浸泡該可透光基材於氧電漿或溶液中以移除蝕刻後殘留於該球狀粒子表面之高分子物質。
- 根據請求項25之製造方法，該等硫醇類分子係帶有胺基或COOH基之硫醇類分子。
- 根據請求項25之製造方法，該等酵素係帶有螢光。
- 根據請求項29之製造方法，該等酵素為Cy3螢光之酵素。
- 一種利用如請求項1所述之單分子反應檢測平台之檢測方法，包含下列步驟：利用載有受質之流體使該等受質和該等固定於該等球狀粒子之酵素發生反應，以產生可受激發而產生螢光之產物；以及從該可透光基材底部入射雷射光以激發該些產物而產生螢光光點於該等球狀粒子之頂端。
- 根據請求項31之檢測方法，其係利用交流電滲透裝置促使該流體流向該等球狀粒子。
- 根據請求項31之檢測方法，其中該等螢光光點之半徑小於100奈米。
- 根據請求項31之檢測方法，其中該受質之濃度範圍係介於1μM至1fM之間。
- 根據請求項31之檢測方法，其中該受質流動的時距介於0.1-100ms之間。
- 根據請求項31之檢測方法，其中該激發之螢光係由一濾光 器所過濾，並由一冷卻電荷耦合裝置接收訊號並呈像。
- 根據請求項31之檢測方法，其進一步包含下列步驟：利用有限時域差分法計算該入射之雷射光之穿透率及其在該等圓錐狀結構之分布情況；以及藉由近場光學微影技術量測該等圓錐狀結構和該等球狀粒子對於近場光學分布的關係。
- 根據請求項37之檢測方法，其中該近場光學微影技術係藉由塗佈感光層薄膜於該基材上，並透過一光源掃描式顯微鏡捕捉近場光學影像的分布。
- 根據請求項31之檢測方法，其中該受質及酵素間之反應為質子及幫浦酵素間之反應。
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