TWI394574B - Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Mitigating Physiological Fatigue - Google Patents

Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Mitigating Physiological Fatigue Download PDF

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Description

牛樟芝環己烯酮化合物在製備用於減緩生理疲勞之藥物的應用
本發明係關於一種用於抗疲勞之化合物，尤其係關於一種自牛樟芝(Antrodia camphorata )萃取物中分離純化而得且可用於減緩生理疲勞之環己烯酮化合物。
牛樟芝(Antrodia camphorata )，又稱樟芝、牛樟菇或紅樟芝等，屬於非褶菌目(Aphyllophorales )、多孔菌科(Polyporaceae )之多年生蕈菌類，為台灣特有種真菌，僅生長於台灣保育類樹種－牛樟樹(Cinnamoum kanehirai Hay)之中空腐朽心材內壁上。由於牛樟樹分布數量極為稀少，加上人為的盜伐，使得寄生於其中方能生長之野生牛樟芝數量更形稀少，且由於其子實體生長相當緩慢，生長期亦僅在六月至十月之間，因此價格非常昂貴。
牛樟芝之子實體為多年生，無柄，呈木栓質至木質，其具強烈之樟樹香氣，且形態多變化，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初生時為扁平型並呈鮮紅色，之後其周邊會呈現放射反捲狀，並向四周擴展生長，顏色亦轉變為淡紅褐色或淡黃褐色，並有許多細孔，且其係為牛樟芝之藥用價值最豐富的部位。
在台灣民俗醫學上，牛樟芝具有解毒、減輕腹瀉症狀、消炎、治療肝臟相關疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食藥用之蕈菇類，具有許多複雜的成分，已知的生理活性成分中，包括：三萜類化合物(triterpenoids)、多醣體(polysaccharides，如β－D－葡聚醣)、腺苷(adenosine)、維生素(如維生素B、菸鹼酸)、蛋白質(含免疫球蛋白)、超氧歧化酵素(superoxide dismutase,SOD)、微量元素(如：鈣、磷、鍺)、核酸、固醇類以及血壓穩定物質(如antodia acid)等，此些生理活性成分被認為具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗過敏、抗病菌、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、保護肝臟及抗疲勞等多種功效。
牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三萜類化合物是由三十個碳元素結合成六角形或五角形天然化合物之總稱，牛樟芝所具之苦味即主要來自三萜類此成分。1995年時，Cherng等人發現牛樟芝子實體萃取物中含有三種新的以麥角甾烷(ergostane)為骨架的三萜類化合物：antcin A、antcin B與antcin C(Cherng,I.H.,and Chiang,H.C.1995.Three new triterpenoids fromAntrodia cinnamomea. J.Nat.Prod.58：365－371)。Chen等人以乙醇萃取樟芝子實體後發現zhankuic acid A、zhankuic acid B及zhankuic acid C等三種三萜類化合物(Chen,C.H.,and Yang,S.W.1995.New steroid acids fromAntrodia cinnamomea ,－a fungus parasitic onCinnamomum micranthum. J.Nat.Prod.58：1655－1661)。此外，Chiang等人於1995年也由子實體萃取物中發現另外三種分別為倍半萜內酯(sesquiterpene lactone)與兩種雙酚類衍生物的新三萜類化合物，此即antrocin,4,7－二甲氧基－5－甲基－1,3－苯並二氧環(4,7－dimethoxy－5－methy－1,3－benzodioxole)與2,2',5,5'－四甲氧基－3,4,3',4'－雙－亞甲二氧基－6,6'－二甲基聯苯(2,2',5,5'－teramethoxy－3,4,3',4'－bi－methylenedioxy－6,6'－dimethylbiphenyl)(Chiang,H.C.,Wu,D.P.,Cherng,I.W.,and Ueng,C.H.1995.A sesquiterpene lactone,phenyl and biphenyl compounds fromAntrodia cinnamomea. Phytochemistry.39：613－616)。到了1996年，Cherng等人以同樣分析方法再度發現四種新的三萜類化合物：antcin E、antcin F、methyl antcinate G、methyl antcinate H(Cherng,I.H.,Wu,D.P.,and Chiang,H.C.1996.Triteroenoids fromAntrodia cinnamomea. Phytochemistry.41：263－267)；而Yang等人則發現了二種以麥角甾烷為骨架的新化合物zhankuic acid D、zhankuic acid E，和三種以羊毛甾烷(lanostane)為骨架的新化合物：15 α－乙醯－去氫硫色多孔菌酸(15 α－acetyl－dehydrosulphurenic acid)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)與去水硫色多孔菌酸(dehydrasulphurenic acid)(Yang,S.W.,Shen,Y.C.,and Chen,C.H.1996.Steroids and triterpenoids ofAntrodia cinnamomea －a fungus parasitic onCinnamomum micranthum. Phytochemistry.41：1389－1392)。
雖然由目前諸多之實驗可得知牛樟芝萃取物具有前述功效，且其所含成分亦陸續被分析出，但究竟萃取物中之何種有效成分可促成牛樟芝之該些功效，並未有具體之相關有效成分發表，其中牛樟芝萃取物所含可抗疲勞之成分，亦有待進一步實驗研究來釐清，故若能找出該萃取物中所含真正有效抗疲勞成分，將有利於研究牛樟芝抗疲勞之相關機轉，並對牛樟芝應用於人體減緩生理疲勞產生莫大的助益。
為明瞭牛樟芝萃取物中究竟為何成分具有抗疲勞之效果，本發明由牛樟芝萃取物中分離純化出具式(1)結構式之化合物；
其中，X係氧(O)或硫(S)，Y係氧或硫；R1 係氫基(H)、甲基(CH3 )或(CH2 )m -CH3 ，R2 係氫基、甲基或(CH2 )m -CH3 ，R3 係氫基、甲基或(CH2 )m -CH3 ，m=1~12；n=1~12。
如式(1)結構式之化合物中，較佳者為如下所示式(2)之化合物：
式(2)之化合物，其化學名為4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮(4－hydroxy－2,3－dimethoxy－6－methy－5(3,7,11－trimethyl－dodeca－2,6,10－trienyl)－cyclohex－2－enone)，分子式為C24 H38 O4 ，外觀為淡黃色粉末狀，分子量為390。
本發明中式(1)、式(2)之環己烯酮化合物係分離純化自牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但並不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。
藉由前述式(1)、式(2)之環己烯酮化合物，本發明係將其應用於減緩生理疲勞上，在80%最大攝氧量(80%O2 max)之高強度衰竭運動後，立即補充牛樟芝環己烯酮化合物有助於體內肌酸激酶(creatine phosphate kinase；CPK)與血氨(Ammonia)之代謝及其濃度之恢復，減緩因運動所致之肌肉細胞損傷，並改善因血液中血氨堆積引起之中樞疲勞及週邊疲勞現象，進而達到抗疲勞之功效。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
首先取牛樟芝(Antrodia camphorata )菌絲體、子實體或二者之混合物，利用習知萃取方式，以水或有機溶劑進行萃取，藉以取得牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物。其中，有機溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但並不以此為限。其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。
經萃取過後之牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，可進一步藉由高效液相層析加以分離純化，之後再對每一分液(fraction)進行與抗疲勞相關之生化測試。最後，則針對具抗疲勞效果之分液進行成分分析，將可能產生抗疲勞效果的成分再分別進一步做與抗疲勞相關之生化測試。最終即發現本發明中如式(1)/式(2)之化合物係具有減緩生理疲勞之功效。
為方便說明本發明，以下將以式(2)之4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物進行說明。此外，為證實4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物係具抗疲勞效果，本發明中係藉由檢測經80%最大攝氧量(80%O2 max)衰竭運動後之受試者體內的肌酸激酶、血乳酸、血糖、血氨及游離脂肪酸等疲勞指標，以測得牛樟芝環己烯酮化合物之抗疲勞能力。由該些生化測試結果證實4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物係具減緩運動後所致生理疲勞之功效。茲對前述實施方式詳盡說明如下：
實施例1：
4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮的分離將100克左右之牛樟芝菌絲體、子實體或二者之混合物，置入三角錐形瓶中，加入適當比例的水與醇類(例如70%以上之醇類水溶液，於20~25℃下攪拌萃取至少1小時以上，之後以濾紙及0.45 μm濾膜過濾，收集萃取液。
將前述收集之牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀(High Performance Liquid chromatography)，以RP18的層析管(column)進行分析，並以甲醇(A)及0.1%~0.5%醋酸水溶液(B)做為移動相(mobile phase)(其溶液比例係：0~10分鐘，B比例為95%~20%；10~20分鐘，B比例為20%~10%；20~35分鐘，B比例為10%~10%；35~40分鐘，B比例為10%~95%)，在每分鐘1 ml之速度下沖提，同時以紫外－可見光全波長偵測器分析。
將25分鐘至30分鐘之沖提液收集濃縮即可得淡黃色粉末狀之固體產物，此即4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮。經分析，其分子式為C24 H38 O4 ，分子量390，熔點(m.p.)為48℃~52℃。核磁共振(NMR)分析值則如下所示：1 H－NMR(CDCl3 )δ(ppm)：1.51、1.67、1.71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07與5.14。13 C－NMR(CDCl3 )δ(ppm)：12.31、16.1、16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43.34、59.22、60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、138.05、160.45與197.12。
實施例2：
80%最大攝氧量(80%O2 max)運動負荷測試為測得衰竭運動後補充樟芝環己烯酮化合物對於抗疲勞能力的影響，本試驗係利用80%最大攝氧量運動負荷來進行後續之衰竭運動，故需先測得最大攝氧量，以進一步推算出80%最大攝氧量之速度。其中，攝氧量係指心輸出量與動靜脈血氧濃度差的乘積，而最大攝氧量是指一個人在海平面上，從事最劇烈的運動時，組織細胞每分鐘所能消耗或利用氧的最高值，其係為評價心肺耐力的最佳指標，本發明係以實驗室內直接測量法，利用原地跑步機，以漸增運動負荷至最大運動負荷時，用氣體分析儀直接測量出最大攝氧量，此種漸進式遞增運動負荷持續性運動，較能誘發實際的最大攝氧能力，因此其為直接準確測量最大攝氧量之方法。
(1)受試者基本資料收集本發明係以15名年滿20歲健康自願的男性為測試對象，篩選未服用藥物、肝腎功能正常、無心血管疾病，且平日無抽煙、喝酒、及使用營養增補劑之習慣者，並量測記錄每位受試者之基本資料包括：年齡、身高、體重以及BMI值。受試者於進行正式測試前至少需空腹八小時，而於測試期間需維持正常的飲食型態，並避免服用營養補充劑或其他藥物，以避免影響實驗數據。
(2)80%最大攝氧量之運動負荷測試受試者於正式測試前必須經過二次前測，藉以求出最大攝氧量(O2 max)，並預估80%最大攝氧量的運動負荷，再進行一次80%最大攝氧量的確認試驗，以確保在此特定負荷下為受試者之80%最大攝氧量的運動強度，而其測試流程係詳述如下。
首先進行最大攝氧量測試，於受試者抵達前，需先進行氣體分析儀(Vmax Spectra,SensorMedics)之氧量及不同濃度的標準氣體校正。待受試者抵達後，使其戴上心跳偵測錶(Polar810i)並記錄安靜心跳率，並將心跳偵測帶置於靠近受試者心臟之處，且將偵測錶置於距偵測帶1公尺內。受試者先於原地跑步機(Vision,T8600)上慢跑3－5分鐘暖身適應，並自行作伸展運動，接著讓受試者站在跑步機上，戴上採氣面罩，並將採氣面罩與呼吸管相連接，且該呼吸管係與氣體分析儀相通連，藉以使受試者呼出之氣體可經採氣面罩及呼吸管而傳送至氣體分析儀中。繼而將跑步機之運轉速度固定在9.6 km/hr，測試開始時之0~3分鐘內，跑步機設定為0%坡度，開始測試3分鐘後，每3分鐘需增加跑步機3%坡度，直到受試者衰竭即停止運動。分析氣體分析儀之資料後，求出每次升坡度前1分鐘及運動衰竭前之攝氧量，而測試中所得之攝氧量的最大值即為最大攝氧量。此外，達最大攝氧量之判斷標準至少必須同時符合下列條件中的二項，方可判定為最大攝氧量：(a)受試者已盡全力無法持續運動測試(受試者腳步變慢無法隨轉帶順利前進)；(b)心跳率達(220－年齡)±10次/分；(c)呼吸商(respiratory quotient,RQ)必需大於1.1以上；(d)自覺量表(rating perceived exertion,RPE)已達18或19的階段。
藉由前測所得之最大攝氧量與負荷強度的迴歸方程式可進一步求得80%最大攝氧量的速度，此計算過程係藉由最大攝氧量測驗中所獲得的耗氧量與速度的資料，而求得速度(縱座標)和氧攝取量(橫座標)之回歸線，再將個人最大氧攝取量乘以80%，求得80%最大攝氧量時的氧攝取量，再畫線找出此點的相對速度。並需再以此負荷強度進行運動10分鐘，且測量第5－6分鐘以及最後1分鐘之攝氧量，以確定真正的80%最大攝氧量運動負荷。其結果如表一所示。
n＝15
實施例3：
牛樟芝環己烯酮化合物之抗疲勞測試運動中肌肉疲勞之廣泛定義為個體生理過程不能維持其機能在一定水準，或各器官不能維持預定的運動強度，造成身體活動疲勞的原因可包括心理、生理與生化三方面，其中，生化疲勞的潛在機轉係包括中樞與週邊疲勞兩方面，造成中樞疲勞的機制包括低血糖(hypoglycemia)、血液中關鍵胺基酸濃度的改變以及大腦中神經傳導物質濃度的改變，而週邊疲勞的機轉則有肌肉中的磷酸肌酸(phospocreatine；PC)耗竭而導致血氨增加、肌肉中的肝醣耗竭與氧氣供應不足等能量短缺現象，以及肌肉中的氫離子堆積所導致之乳酸增加、肌肉中的磷酸堆積等代謝物堆積因素。
因此，本發明係藉由分別給予受試者含有牛樟芝環己烯酮化合物以及不含牛樟芝環己烯酮化合物之安慰劑，並使受試者進行強度為前述80%最大攝氧量運動負荷之衰竭運動，同時於運動前以及運動後分析受試者體內之肌酸激酶、血乳酸、血糖、血氨及游離脂肪酸等疲勞指標的含量，而測得於衰竭運動後補充牛樟芝環己烯酮化合物之抗疲勞功效。
隨機給予受試者4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物以及不牛樟芝環己烯酮化合物之安慰劑，而安慰劑成分係可為玉米澱粉(corn starch)等任何不牛樟芝環己烯酮化合物之物質，且此測試係採用雙盲交叉設計，受試者與施測者皆不知所給予之物質成分。繼之，基於次序平衡(order balance)原則，每位受試者皆需接受下列各組測試：無運動並給予安慰劑(PR)、有運動並給予安慰劑(PE)、無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)，且接受不同組別測試之受試者在完成為期一週之該組試驗後，需於休息一週後，再繼續進行下一組測試，直到每位受試者皆完成上述四組試驗。其中，所做運動係以前述測得之80%最大攝氧量運動負荷的強度(7.61±1.87)於跑步機上進行之，並跑至受試者達運動衰竭(exhausted)為止，且於運動後給予受試者牛樟芝環己烯酮化合物或安慰劑；另外，安慰劑之給予量為每天0.2克/體重(公斤)，而牛樟芝環己烯酮化合物的給予量為每天0.2克/體重(公斤)，測試進行為期七天，並於運動前、衰竭運動後第0、0.5、1、2、24、48、72、120以及168小時進行靜脈採血，血液以含抗凝血劑(如：EDTA)之收集管收集，於3000 xg離心10分鐘，取血漿部份，並進行後續之肌酸激酶、血乳酸、血糖、血氨以及游離脂肪酸等疲勞指標之生化分析，並比較運動前以及運動後給予不同補充物質之生理及生化值的變化；所有生化分析數值均以平均數及標準誤(Mean±SEM)表示之，且該些分析數值需以重複量數二因子變異數分析(repeated measurement two way ANOVA)進行組內、組間各採血點之差異檢定，並以杜凱氏事後比較法(Tukey's honestly significant difference)進行事後比較，而統計後達顯著水準的臨界值定為α＝0.05，而該些生化值之分析方式及其結果係詳述如下：(1)肌酸激酶(creatine phosphate kinase；CPK)之分析人體骨骼肌、心肌、腦及前列腺等器官均會產生血清肌酸激酶，其中以骨骼肌含量最豐富，占全身總量96%之多；正常情況時，血清中之肌酸激酶活性很低，而當運動時肌肉收縮過程中，肌酸激酶可催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)與磷酸肌酸(phosphate creatine,PC)之間的高能磷酸鍵，其化學反應式為： 以確保劇烈運動時可快速提供肌肉收縮所需能量以及促進ATP的再合成。而運動過程中會促使肌酸激酶活性增高之原因，係由於運動時缺氧，使得代謝產物堆積，細胞內外鈣離子恆定失衡，引起肌細胞膜的通透性增增高，或造成肌細胞膜受到損傷例如肌肉牽拉的機械損傷或產生血腫，進而促使肌酸激酶釋入血液循環，因此肌酸激酶常被用作運動強度與肌肉細胞損傷之指標酵素。
本發明量測血液中肌酸激酶濃度之方法，係利用乾式自動血液分析測量儀(Johnson & Johnson DT－60 Ⅱ)，並藉由酵素作用及比色測定之原理而測得。於定量的血漿中加入磷酸肌酸葡萄糖氧化酶(creatine phosphate glucose oxidase)反應後，再加入4－胺基安替比林(4－aminoantipyrine)及1,7－二羥基萘(1,7－dihydroxynaphthalene)，經過氧化酶(peroxidase)作用後產生白色化合物，並於680 nm波長下測定其吸光度，再換算得肌酸激酶濃度，結果如表二及第一圖所示。
n＝15，數值以「平均數±標準誤」表示＊ 表示p<.05：與前測比有差異存在；a 表示p<.05：顯著大於同時間點的PR組b 表示p<.05：顯著大於同時間點的PE組；c 表示p<.05：顯著大於同時間點的DR組d 表示p<.05：顯著大於同時間點的DE組
由表二與第一圖可知，進行80%最大攝氧量之高強度衰竭運動後，有運動並給予安慰劑(PE)之組別於運動後0、0.5、1、2及24小時，其肌酸激酶濃度值便持續增加且均顯著(p<0.05)高於運動前安靜時之肌酸激酶濃度，此亦表示受試者運動強度已達到肌肉損傷程度；同時有運動並給予安慰劑(PE)之組別所示肌酸激酶濃度值顯著地(p<0.05)高於無運動並給予安慰劑(PR)與無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)兩組別所示數值，且該兩組未經衰竭運動之組別(PR與DR)直到運動後120小時才沒有差異存在。
運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)之組別，在高強度的衰竭運動後，其肌酸激酶濃度僅在運動後立即上升，於運動後0.5小時之後即恢復至運動前之濃度水準。此外，有運動並給予安慰劑(PE)之組別進行衰竭運動後，其肌酸激酶濃度顯著地(p<0.05)高於有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)之組別，且此種濃度差異由進行衰竭運動後持續至運動後1小時，並於運動後72小時仍可觀察到此現象，此結果顯示，於衰竭運動後立即補充牛樟芝環己烯酮化合物，可有效降低代表肌肉損傷指標之肌酸激酶濃度，有助於減緩運動後所產生之生理疲勞。
(2)飯前血糖(Blood glucose)之分析運動時，伴隨肌肉收縮時鈣離子之釋放及腎上腺素(epinephrine)的分泌，可活化磷酸化酶(phosphorylase)以增加肌肉中肝醣分解速率，同時增加之腎上腺素亦使肝臟加速肝醣分解反應(glycogenolysis)，進而使血液中血糖濃度增加。於80%最大攝氧量之高強度衰竭運動下所產生的疲勞常導因於體內血糖於氧化代謝過程中持續利用，產生低血糖的現象，而造成肌肉中肝醣之耗盡，因此，檢測運動時體內之醣類利用狀況，可作為觀察生理疲勞的指標之一。
本發明量測血糖濃度之方法，係利用乾式自動血液分析測量儀(Johnson & Johnson DT－60 Ⅱ)，並藉由酵素作用及比色測定之原理而測得。於定量的血漿中加入葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)反應後，再加入4－胺基安替比林(4－aminoantipyrine)及1,7－二羥基萘(1,7－dihydroxynaphthalene)，經過氧化酶(peroxidase)作用後產生紅色化合物，其反應式如下： 並於555 nm波長下測定其吸光度，再換算得血糖濃度，結果如表三及第二圖所示。
表三、受試者進行衰竭運動或無運動並分別補充安慰劑或牛樟芝環己烯酮化合物後，各時間點之血糖濃度(mg/dl)
由表三與第二圖可知，有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)之組別，於80%最大攝氧量之高強度衰竭運動後，其血糖濃度值與無運動並給予安慰劑(PR)以及無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)組別有顯著的(p<0.05)差異；此外，有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)兩組別，在80%最大攝氧量之高強度衰竭運動後0.5小時之飯前血糖濃度均會恢復至未運動前之水平並接近安靜值，此結果顯示，於運動後補充樟芝環己烯酮化合物對飯前血糖的代謝並無影響。
(3)血氨(Ammonia)之分析血氨為蛋白質之代謝產物，其主要是由於體內呤核循環(purine nucleotide cycle；PNC)中胺基酸的分解以及腺呤核單磷酸(adenosine monophosphate；AMP)去胺基作用所形成，而運動時因體內磷酸肌酸(creatine phosphate)的耗盡，使得組織中的腺嘌呤核苷酸(adeninenucleotide)分解，以加速ATP的再合成，此時會產生大量的血氨，而血氨濃度的增加會改變中樞神經系統的作用，使得細胞外的pH值、電解質濃度及神經傳導物質濃度受到改變，並干擾克氏循環(Krebs cycle)，造成疲勞的產生，因此，血氨堆積亦是造成中樞疲勞及週邊疲勞的因素之一，故血氨常會被用來作為疲勞的指標之一。
本發明量測血氨濃度之方法，係利用乾式自動血液分析測量儀(Johnson & Johnson DT－60 Ⅱ)，並藉由比色測定之原理，於定量的血漿中加入呈色劑溴酚藍(bromphenol blue)，作用後產生藍色化合物，其反應式如下：NH3 ＋Bromphenol blue → Blue dye並於605 nm波長下測定其吸光度，再換算得血氨濃度，結果如表四及第三圖所示。
表四、受試者進行衰竭運動或無運動並分別補充安慰劑或牛樟芝環己烯酮化合物後，各時間點之血氨濃度(μg/dl)
由表四與第三圖可知，有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)之組別，於80%最大攝氧量之高強度衰竭運動後，其血氨濃度值顯著地(p<0.05)高於無運動並給予安慰劑(PR)以及無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)的組別。有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)兩組之血氨濃度，在運動後1小時即逐漸恢復，且於該時間點之血氨濃度數值與運動前測得之血氨濃度比較後並無顯著(p>0.05)的差異存在；而於運動後2小時，有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)組別與有運動並給予安慰劑(PE)組別間之血氨濃度數值在統計上出現顯著的(p<0.05)差異。此外，由表四與第三圖中亦可觀察到，於運動後24小時，有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)組別顯示之血氨濃度顯著地(p<0.05)低於未運動前，而於此相同時間點，同樣經過衰竭運動的有運動並給予安慰劑(PE)組別之血氨濃度係近似於未運動前的數值，並無出現上述血氨濃度顯著降低的效果，因此，由上述結果顯示，於運動後補充牛樟芝環己烯酮化合物有助於血氨的代謝，使運動後堆積於體內之血氨可快速代謝，進而減緩衰竭運動後所產生之生理疲勞。
(4)血乳酸(Lactate)之分析乳酸是肌肉及肝臟中肝醣、葡萄糖經無氧糖解作用代謝形成之產物，在安靜的狀態下，乳酸的生成量較少，當激烈或長時間運動時，組織缺氧情形較明顯，無氧代謝速度加快，而當乳酸之生成速率高於粒線體氧化代謝乳酸的速率時，就會造成增加之乳酸逐漸堆積於肌肉中。乳酸的堆積會促使肌肉中的氫離子濃度上升、pH值下降，此反而會抑制醣酵解的磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)之活性，造成醣解作用速率減弱及ATP再合成率減少，另因氫離子濃度增加，影響肌漿網中鈣離子的釋放與降低肌纖維的收縮能力，所以乳酸大量的堆積，將會加速疲勞反應的發生，因此，血乳酸常被用作疲勞的指標之一。
本發明量測血乳酸濃度之方法，係利用乾式自動血液分析測量儀(Johnson & Johnson DT－60 Ⅱ)，並藉由酵素作用及比色測定之原理，於定量的血漿中加入乳酸氧化酶(lactate oxidase)反應後，再加入4－胺基安替比林(4－aminoantipyrine)及1,7－二羥基萘(1,7－dihydroxynaphthalene)，經過氧化酶(peroxidase)作用後產生紅色化合物，其反應式如下： 並於540 nm波長下測定其吸光度，再換算得血乳酸濃度，結果如表五及第四圖所示。
由表五與第四圖可知，有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)之組別，於80%最大攝氧量之高強度衰竭運動後0.5小時內，其血乳酸濃度值顯著地(p<0.05)高於無運動並給予安慰劑(PR)以及無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)的組別，且該有運動兩組組別(PE及DE)之運動強度的介入與無運動組別(PR及DR)所呈現之血乳酸濃度值亦均有顯著差異(p<0.05)。有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)兩組之血氨濃度，在運動後1小時即逐漸恢復並接近運動前之安靜值，且於該時間點之血氨濃度數值與運動前測得之血乳酸濃度比較後並無顯著的差異存在(p>0.05)，此結果顯示，於運動後補充樟芝環己烯酮化合物對血乳酸的代謝並無影響。
(5)游離脂肪酸(free fatty acid)之分析游離脂肪酸的產生乃由肌纖維間的脂肪組織，或細胞內三酸甘油酯水解而來。耐力運動時，儲存於肌肉中的肝醣會隨之耗盡，而隨著運動持續的時間增加，醣解作用速率將會逐漸減弱，體內能量的利用趨於脂肪酸的利用，此時ATP的產生便減少，因而造成疲勞；此外，當脂肪分解速率提高，使得血漿中游離脂肪酸濃度增加時，游離脂肪酸會與血中色胺酸(Tryptophan)相互競爭白蛋白(Albumin)上的結合位置，造成血中游離色胺酸增加，色胺酸為血清素的前驅物，當色胺酸進入腦中，則會使血清素合成速率增加。當腦中血清素增加時，會損壞中樞神經某方面的作用系統，如：降低多巴胺(Dopamine)的活性，亦會導致疲勞的產生及睡眠反應，因此，血液中游離脂肪酸之濃度可作為脂解及產生疲勞之指標。
本發明量測游離脂肪酸濃度之方法，係利用酵素作用及比色測定之原理，於定量的血漿中加入於定量的血漿中加入醯基輔酶A合成酶(acyl CoA synthetase)、醯基輔酶A氧化酶(acyl CoA oxidase)反應之，再經過氧化酶(peroxidase)作用後產生紫色化合物，其反應式如下： 4－AAP：4－aminoantipyrine TOOS：N－ethyl－N－(2－hydroxy－3－sulphopropyl)m－toluidine並於550 nm波長下測定其吸光度，再換算得血乳酸濃度，結果如表六及第五圖所示。
n＝15，數值以「平均數±標準誤」表示＊ 表示p<.05：與前測比有差異存在；a 表示p<.05：顯著大於同時間點的PR組b 表示p<.05：顯著大於同時間點的PE組；c 表示p<.05：顯著大於同時間點的DR組d 表示p<.05：顯著大於同時間點的DE組
由表六與第五圖可知，有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)之組別，於80%最大攝氧量之高強度衰竭運動後2小時內，其血中游離脂肪酸濃度值顯著地(p<0.05)高於無運動並給予安慰劑(PR)以及無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)的組別。而有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)兩組在運動後之各時間測試點所測得之血中游離脂肪酸濃度值皆無顯著差異(p>0.05)，此結果顯示，於運動後補充樟芝環己烯酮化合物對血中游離脂肪酸的代謝並無影響。
本綜上所述，發明結果顯示在80%最大攝氧量之高強度衰竭運動後立即補充樟芝環己烯酮化合物，肌酸激酶的濃度僅在運動後立即顯著上升，0.5小時後其肌酸激酶濃度即恢復至運動前水準，此結果顯示在衰竭運動後立即補充樟芝對於肌酸激酶的代謝具有顯著(p<0.05)效果；而在運動後血氨的代謝上，衰竭運動後立即補充樟芝環己烯酮化合物(DE)之組別在運動後2小時，其恢復效果顯著(p<0.05)優於未補充樟芝環己烯酮化合物(PE)之組別；此外，血糖、血乳酸及游離脂肪酸等疲勞指標，在有運動並給予安慰劑(PE)以及有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)兩組之間並沒有顯著的差異。因此，於80%最大攝氧量之高強度衰竭運動後立即補充樟芝環己烯酮化合物係有助於體內肌酸激酶與血氨之恢復，進而達到減緩生理疲勞之功效。
第一圖係本發明實施例受試者進行衰竭運動或無運動後，分別補充安慰劑或牛樟芝環己烯酮化合物，於各時間點之體內肌酸激酶濃度結果。圖中□：無運動並給予安慰劑(PR)；■：有運動並給予安慰劑(PE)；△：無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)；▲：有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)。
第二圖係本發明實施例受試者進行衰竭運動或無運動後，分別補充安慰劑或牛樟芝環己烯酮化合物，於各時間點之體內血糖濃度結果。圖中□：無運動並給予安慰劑(PR)；■：有運動並給予安慰劑(PE)；△：無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)；▲：有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)。
第三圖係本發明實施例受試者進行衰竭運動或無運動後，分別補充安慰劑或牛樟芝環己烯酮化合物，於各時間點之體內血氨濃度結果。圖中□：無運動並給予安慰劑(PR)；■：有運動並給予安慰劑(PE)；△：無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)；▲：有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)。
第四圖係本發明實施例受試者進行衰竭運動或無運動後，分別補充安慰劑或牛樟芝環己烯酮化合物，於各時間點之體內血乳酸濃度結果。圖中□：無運動並給予安慰劑(PR)；■：有運動並給予安慰劑(PE)；△：無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)；▲：有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)。
第五圖係本發明實施例受試者進行衰竭運動或無運動後，分別補充安慰劑或牛樟芝環己烯酮化合物，於各時間點之體內游離脂肪酸濃度結果。圖中□：無運動並給予安慰劑(PR)；■：有運動並給予安慰劑(PE)；△：無運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DR)；▲：有運動並給予牛樟芝環己烯酮化合物(DE)。

Claims (5)

  1. 一種具有下列結構式之化合物在製備用於減緩生理疲勞之藥物的應用， 其中，X係氧(O)或硫(S)，Y係氧或硫；R1 係氫基(H)、甲基(CH3 )或(CH2 )m -CH3 ，R2 係氫基、甲基或(CH2 )m -CH3 ，R3 係氫基、甲基或(CH2 )m -CH3 ，m=1~12；n=1~12。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之應用，其中該化合物係4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5-(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,11-trymethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone)。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之應用，其中該化合物係由牛樟芝之乙醇萃取物中所分離製得。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之應用，其中該化合物係藉由促進運動後體內肌酸激酶(creatine phosphate kinase)的代謝而可抗疲勞。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之應用，其中該運動係為80%最大攝氧量之高強度衰竭運動。
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