TWI391488B

TWI391488B - Bupleurum cell line

Info

Publication number: TWI391488B
Application number: TW096138546A
Authority: TW
Inventors: Chung Hsiung Wang; Chih Yu Wu; Song Tay Lee
Original assignee: Univ Nat Taiwan
Priority date: 2007-10-15
Filing date: 2007-10-15
Publication date: 2013-04-01
Also published as: TW200916582A; US8088619B2; US20090098649A1

Description

豆莢螟細胞株

本發明係關於一種自昆蟲組織建立之細胞株，尤其是關於一種對豆莢螟核多角體病毒(MaviMNPV)等蟲生病原性微生物具感受性(susceptibility)，而可用於增殖豆莢螟核多角體病毒及生產重組蛋白之豆莢螟細胞株。

豆莢螟(Maruca vitrata )，屬於鱗翅目(Lepidoptera )、螟蛾科(Pyralidae )，根據統計，其寄主植物遍及豆科、胡麻科、含羞草科、蘇木科及錦葵科等五科，共包含二十屬四十種作物。此蟲主要分布於亞洲、非洲及太平洋諸島，而於台灣田間全年皆可發現豆莢螟之族群。由於其幼蟲喜咬食寄主植物之嫩葉及嫩芽，並蛀食花器及豆莢，且常會吐絲綴結葉片、花朵與豆莢，而藏匿其中取食，除導致施藥防治上之困難度增加，更對作物產量及品質影響甚鉅。例如於台灣中部地區，豆莢螟對豆科植物所造成的損失可高達30%以上；且由於近年來政府推廣休耕農田種植田菁(Sesbania cannabina )、太陽麻(Crotalaria juncea )或大豆(soy bean)等綠肥作物以培養地力之措施，使此些綠肥作物之栽種面積持續增加中，而這些綠肥作物正好皆為豆莢螟的寄主植物，再加上農民種植此些作物期間鮮少施予農藥，因此這些綠肥作物變成豆莢螟大肆繁殖的溫床，提供豆莢螟不虞匱乏的食物來源，使其族群密度大幅擴增，亦加劇豆莢螟對豆科經濟作物的危害程度。另一方面，豆莢螟在非洲亦是經年危害長豇豆(Yard long bean)等豆科植物的重要檢防疫害蟲，且為造成該地區長豇豆生產降低的主要因素，甚至於肯亞西部地區，豆莢螟常常造成80%之長豇豆產量的嚴重損失。因此，豆莢螟對經濟作物的危害以及如何有效防治其生長與蔓延，已是不容忽視的重要國際性問題。

豆莢螟之防治方法，普遍採噴灑化學藥劑毒殺其幼蟲之方式，但此法除因其幼蟲嗜吐絲藏匿之習性，而難以達到全面防治之困難外，也易引發抗藥性及藥物殘留的問題，或造成環境生態的污染及次要蟲害再猖獗等其他影響，故為取代或降低對化學藥劑的依賴，需再研發其他防治方法，其中，尤以利用昆蟲桿狀病毒(baculovirus)生產生物性農藥之防治方式最為重要。研究發現，一種昆蟲桿狀病毒：豆莢螟核多角體病毒(Maruca vitrata multiple nucleopolyhedrovirus,MaviMNPV)係為使豆莢螟幼蟲族群罹患核多角體病(nucleopolyhedrosis)並導致蟲體死亡之病原體，此種桿狀病毒感染寄主後，會產生出芽病毒(budded virus,BV)，其病毒粒子係直接從寄主細胞之細胞膜以出芽方式釋出，並造成昆蟲內部細胞與細胞間的感染，同時啟動多角體蛋白基因而產生大量的多角體蛋白(polyhedron)，此些多角體蛋白會將病毒粒子包埋於其內部，而形成包埋體(occlusion body,OB)或稱多角體(polyhedral inclusion body,PIB)，並出現於寄主細胞中的細胞核內，因此又稱為核多角體病毒(multiple nucleopolyhedrovirus,MNPV)，包埋體可從裂解之罹病蟲體釋出於外界環境，並進一步感染其他昆蟲，而誘發昆蟲間之流行病。該種核多角體病毒具有高度之寄主專一性，僅會感染無脊椎動物，不會造成人類和其他生物的傷害；此外，該種核多角體病毒的感染方式包含藉由昆蟲食入外界的病毒及經由接觸已受感染昆蟲之水平式感染，以及藉由母代傳給子代而造成垂直性感染，且實驗證明，豆莢螟核多角體病毒對豆莢螟二齡幼蟲的致死率可高達98%，此些生物特性使豆莢螟核多角體病毒極具有發展成為生物性農藥之潛力，並可應用於豆莢螟之防治上；此外，由於豆莢螟核多角體病毒係屬於昆蟲桿狀病毒，而昆蟲桿狀病毒是當今醫學及工業上生產重要外源蛋白的載體系統，故其亦具有開發成為重組蛋白表現載體之潛力。

若欲利用病毒製備可防治害蟲之生物性農藥，或將其應用於昆蟲病毒基因研究以及病毒表現載體方面，最優先的必要條件便是足夠量病毒的獲得。而由於感染昆蟲之桿狀病毒，必需生長於活細胞內方能繁殖，故直接利用蟲體繁殖或以細胞株方式增殖病毒是較可行之方式，其中，藉由人工方式大量飼養豆莢螟來製造豆莢螟核多角體病毒之方法，除其生產過程需密集之勞動力外，尚有許多難題有待克服並突破，例如：打破卵休眠的條件、人工飼料的配方以及流行病的預防等，此外，豆莢螟幼蟲體型小，每隻幼蟲可生產的病毒量有限；而另一較可行之途徑係將豆莢螟核多角體病毒於一高接受性之昆蟲細胞株中進行體外培養，此策略不僅可確保病毒於增殖之過程中，不受到其他微生物的污染，並具有容易控制與觀察之優勢，且擁有可篩選並維持高致病力豆莢螟核多角體病毒株之潛在優點。

昆蟲細胞株具有使病毒或其他病原性微生物於昆蟲體外繁殖複製之優點，而自1962年Grace揭示其成功建立昆蟲細胞之長期培養方法後，有源自100種以上昆蟲之數百種連續細胞株(continuous cell lines)被建立(Lynn,D.E.1999.Development of insect cell lines：virus susceptibility and applicability to prawn cell culture.Methods in Cell Sci.,21(4)：173－81.)，所培養之各昆蟲細胞株可應用於生理學、組織胚胎學及病理學等相關研究範疇上，且桿狀病毒表現載體之及重組蛋白的生產均需昆蟲細胞方可進行，且利用昆蟲桿狀病毒表現載體系統所表現的重組蛋白，具有高表現量、高生物活性、低成本及容易操作等優點，因此廣泛運用於各種高價值之醫藥用蛋白質之大量生產(Hink,W.F.,Thomsen,D.R.,Davidson,D.J.,Meyer,A.L.and Castellino,F.J.1991.Expression of three recombinant proteins using baculovirus vectors in 23 insect cell lines.Biotechnol Prog.7(1)：9－14.)。然而迄今仍未有對豆莢螟核多角體病毒具感受性之細胞株被建立，此外，病毒對細胞具有專一性，每種細胞對不同病毒之感受性皆異，因此建立合適之昆蟲細胞株係為基礎研究與後續相關應用之重要關鍵。

綜合上述所言，若可研究出對豆莢螟核多角體病毒感受性高且能穩定增殖病毒之新細胞株，將有助於相關生物性農藥的生產，達到安全且能防治害蟲之目的，並可應用於昆蟲桿狀病毒表現系統上，以製備可供醫藥或研發之用的重組蛋白。

本發明提供一種對豆莢螟核多角體病毒(MaviMNPV)具感受性之細胞株，藉以用於增殖豆莢螟核多角體病毒及生產重組蛋白，或於體外穩定量產此類昆蟲桿狀病毒(baculovirus)，而可用於生物性農藥之製備，並可應用於昆蟲桿狀病毒表現系統上，生產可供醫藥或研發之用的重組蛋白。

為達上述之目的，本發明提供一種用於增殖蟲生病原性微生物及生產重組蛋白之豆莢螟細胞株，其係分離自豆莢螟幼蟲化蛹後1－2日齡蟲蛹之內部組織，經初級培養一個月後，進行第一次之繼代培養，並於預定之時間週期，以不同成份比例之培養基再循序進行數次之繼代培養，最後可成功建立一株連續細胞株(continued cell line)，即為NTU－MV，其於中華民國食品工業發展研究所之寄存編號為BCRC 960312。此NTU－MV細胞株除可存活於TNM－FH培養液外，亦可於無血清培養基Sf900中生長。將此NTU－MV細胞株再進行選殖(subclone)後，可得另外兩株次細胞株，即為NTU－MV－1與NTU－MV－2。

於細胞株之形態方面，此三株豆莢螟細胞株(NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2)皆含有四種不同形態之細胞：圓形細胞(round cell)、梭狀細胞(spindle－shaped cell)、多棘形細胞(polymorphic)以及逗號細胞(comma cell)，其中，NTU－MV與NTU－MV－1細胞株中以多棘形細胞佔最大比例，而NTU－MV－2則是以圓形細胞為其主要組成細胞之形態。另一方面，由染色體核型分析(karyotype analysis)之結果可知，豆莢螟細胞株NTU－MV係源自於鱗翅目；而由同功異構酶分析(isoenzyme analysis)可知，三株豆莢螟細胞株：NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2和同為鱗翅目但不同科之吉普賽舞蛾細胞株、榕樹透翅毒蛾細胞株與秋行軍蟲細胞株的酵素圖譜樣式完全不同，顯示此三株豆莢螟細胞株為新建立之細胞株。此外，由豆莢螟細胞株之內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)的DNA序列相似度之比對分析可知，豆莢螟細胞株NTU－MV與豆莢螟幼蟲體之內轉錄間隔區的DNA序列相似度高達98%，而豆莢螟細胞株NTU－MV與秋行軍蟲細胞株(Sf9)之內轉錄間隔區的DNA序列相似度僅有60%，因此可證明豆莢螟細胞株NTU－MV確實係自豆莢螟幼蟲體分離而建立之細胞株。

於細胞株之特性方面，由細胞生長曲線結果可知，NTU－MV培養於含8%牛血清的TNM－FH培養液之生長速度較快，且其亦可於無血清培養基Sf900中生長；病毒感受性分析指出，所有新建立之豆莢螟細胞株：NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2皆對豆莢螟核多角體病毒具有感受性，且在感染豆莢螟核多角體病毒一週後，各細胞株有超過88%之細胞可產生豆莢螟核多角體病毒，而感染豆莢螟核多角體病毒二週後，各細胞株平均每個細胞可生產45個以上之豆莢螟核多角體病毒；此外，從受感染之豆莢螟細胞株NTU－MV與豆莢螟蟲體所生產之豆莢螟核多角體病毒之DNA限制酵素圖譜分析(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)比較結果可知，兩者所產生之豆莢螟核多角體病毒的基因組完全相同，故皆為同一種病毒，因此由上述該些結果顯示本發明成功建立可體外培養並增殖豆莢螟核多角體病毒之豆莢螟細胞株。

藉由前述細胞株之形態及特性分析結果，顯示本發明新建立之豆莢螟細胞株：NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2，除可用於體外增殖豆莢螟核多角體病毒等蟲生病原性微生物，而使此量產之微生物可進而開發成為生物性殺蟲劑並應用於害蟲防治上外，同時可作為增殖豆莢螟核多角體病毒等昆蟲桿狀病毒表現載體之宿主細胞，藉以製備用於醫藥或研發之重組蛋白。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

本發明係由豆莢螟蟲蛹之內部組織(pupal tissue)，分離培養出對豆莢螟核多角體病毒(MaviMNPV)具感受性之一豆莢螟細胞株NTU－MV以及兩株從NTU－MV選殖出之次細胞株：NTU－MV－1與NTU－MV－2。由上述各細胞株所含細胞之外觀形態、染色體核型分析(karyotype analysis)、內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)分析及同功異構酶分析(isoenzyme analysis)結果可知，豆莢螟細胞株NTU－MV確實係源自豆莢螟蟲，而NTU－MV－1以及NTU－MV－2兩株次細胞株確實係源自NTU－MV，且三者皆為新建立之細胞株；在細胞株之特性方面，由細胞生長曲線結果可知，NTU－MV於含8%牛血清培養基之生長速度較快，且其亦可於無血清培養基Sf900中生長；而對於豆莢螟核多角體病毒感受性分析指出，所有新建立之豆莢螟細胞株：NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2皆對豆莢螟核多角體病毒具有良好之感受性，且由限制酵素圖譜分析(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)之比較結果可知，受感染之豆莢螟細胞株NTU－MV與豆莢螟蟲體所生成之豆莢螟核多角體病毒DNA的基因組完全相同，應皆屬於同一種病毒。由上述該些結果顯示，三株新建立之豆莢螟細胞株：NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2可應用於增殖豆莢螟核多角體病毒，以製造生物性殺蟲劑，並可作為豆莢螟核多角體病毒表現載體之宿主細胞，用以生產重組蛋白質。茲對豆莢螟細胞株之建立方式以及其形態及特性分析之相關測試方法詳盡說明如下：

實施例1：

豆莢螟細胞株之建立本發明係由豆莢螟蟲蛹之內部組織，分離培養出豆莢螟細胞株NTU－MV，並於中華民國96年10月03日寄存在中華民國食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 960312，再由NTU－MV選殖(subclone)出兩株次細胞株系：NTU－MV－1與NTU－MV－2。

(1)初代培養(primary culture)豆莢螟幼蟲係採自台灣台南低海拔地區，先以人工飼料，待幼蟲化蛹後，收集1－2日齡之蟲蛹，以10% Clorox溶液與70%乙醇浸泡5分鐘進行表面滅菌，再放入無菌操作台內吹乾，以昆蟲針將蟲蛹固定於操作台上，再利用碘酒擦拭蛹體表面三次，藉以再次滅菌。待蛹體風乾後，以眼科剪剪開蛹體腹部背表皮，用鑷子與微量吸管吸取蛹體內部組織，並確定蛹體內消化道的完整性，以免造成腸內菌的污染。將剪取之蛹體內部組織置於一含5 ml TNM－FH培養液之25 T培養皿內，且此培養基已添加有100 IU/ml盤尼希林(penicillin,Gibco)、100 mg/ml鏈黴素(Streptomycin,Gibco)、1.25 mg/ml抗黴菌劑(amphotericin B,Sigama)以及16%去補體之胎牛血清(FBS,Hyclone)，將其置於28℃下進行初代培養，並每隔二日觀察種殖之組織變化及細胞移行的情況。其中，TNM－FH培養液之成份及配製方式如下所述：分別秤取228.5克之Grace’s insect cell culture medium(GIBCOTM)、15克之酵母萃取物(BactoTM TC Yeastolate,Becton,Dickinson and Company)以及15克之乳蛋白水解物(Lactalbumin Enzymatic Hydrolysate,Sigma)並加入4740毫升(ml)之去離子水中，攪拌均勻後，再加入1.75克碳酸氫鈉(NaHCO3)，以10%氫氧化鈉(NaOH)將混合液之pH值調整至6.3後，再以過濾器(Gelman Laboratory；VacuCap90Filter unit 0.2 μm)過濾之，並使其滲透壓值維持於380~400 osm/kg間。最後將培養基放置於37℃培養箱中三天，確定培養基是否於配製過程中受到污染，並將未受污染之TNM－FH培養液置於4℃冰箱貯存備用。

(2)繼代培養(subculture)於初代培養一個月後進行第一次繼代培養，此時初代培養之細胞已長滿培養皿底部，需輕拍培養皿底部將部分細胞打下，再取2 ml之細胞懸浮液至新的25 T培養皿內，並加入4 ml新鮮培養基(其包含抗生素與胎牛血清)。其後，每隔14天進行一次繼代培養，並且逐漸增加細胞懸浮液之稀釋比例，使其達總體積的1/4至1/5，待細胞數目穩定成長後，則改成每隔4－7天進行繼代培養一次。在繼代培養25次後，將細胞株適應於胎牛血清濃度降低至8%的TNM－FH培養液中，且每隔5天進行一次繼代培養。

在經過50次以上之累代飼育後，可知此細胞株是屬於一連續細胞株(continuous cell lines)，且將其命名為NTU－MV，其寄存編號為BCRC 960312，此NTU－MV細胞株除可存活於TNM－FH培養液中外，亦可於無血清培養基Sf900(Invitrogen,USA)中生長，而NTU－MV細胞株培養於Sf900培養基之飼育過程及方法，係與飼育在TNM－FH培養基中相同。將此NTU－MV細胞株進行選殖後，可得兩株次細胞株：NTU－MV－1與NTU－MV－2。而此三株豆莢螟細胞株已於一年已上之時間內，連續繼代培養超過100代，顯示該三株細胞株之穩定性良好。另一方面，本發明所新建立之豆莢螟細胞株，並不以說明書中所述三株NTU－MV、NTU－MV－1以及NTU－MV－2細胞株為限，凡是自該NTU－MV、NTU－MV－1以及NTU－MV－2細胞株中再選殖(subclone)或單株化(monoclone)而得之細胞株，或是其他具有相同於NTU－MV、NTU－MV－1以及NTU－MV－2豆莢螟細胞株的任一可辨識特徵之細胞株，皆屬於本發明欲保護之範圍。

實施例2：

細胞株之細胞外觀形態觀察分別將該三株豆莢螟細胞株NTU－MV、NTU－MV－1以及NTU－MV－2置於位相差顯微鏡(Olympus IX－71)之視野下，觀察其細胞形態，並根據標準放大倍數(calibrated magnification factor)分別於該三株豆莢螟細胞株中各測得30個細胞之大小，並取其平均測量值，以代表最終之細胞大小數值，其結果如第一圖及表一所示。

請參閱第一圖，該圖係三株新建立之豆莢螟細胞株於位相差顯微鏡下所觀察到之形態。由圖中可知，此三株豆莢螟細胞株NTU－MV(B)、NTU－MV－1(C)以及NTU－MV－2(D)皆由四種不同形態之細胞所組成，其包含：圓形細胞(round cell,R)、梭狀細胞(spindle－shaped cell,SP)、多棘形細胞(polymorphic cell,P)以及逗號細胞(comma cell,C)；而各豆莢螟細胞株中所含之主要細胞形態以及各形態細胞之分布量，皆不盡相同，請參閱表1，其中，NTU－MV與NTU－MV－1細胞株中以多棘形細胞佔最大比例(分別佔35%和36.5%)；而NTU－MV－2則是以圓形細胞為其主要組成細胞之形態(佔82%)。另一方面，在進行初代培養期間，可觀察到由豆莢螟蛹體組織繁衍之NTU－MV(A)細胞會自行移動至培養皿底部，而形成貼附型細胞(attachment cell)。

實施例3：

豆莢螟細胞株生長曲線之測定為測定不同培養基成分對對豆莢螟細胞株NTU－MV生長之影響，本試驗係以含不同濃度胎牛血清之TNM－FH培養液以及無血清培養基Sf900進行測試，觀察並比較各培養基中，豆莢螟細胞株NTU－MV之生長狀況以及其細胞分裂一次所需之族群倍增時間(population doubling time)。

於25 T培養皿內接種1×10⁶ 之長至對數期的NTU－MV豆莢螟細胞，培養皿內分別加入含16%、8%與4%胎牛血清與無胎牛血清之TNM－FH培養液，以及無胎牛血清培養基Sf900(Invitrogen,USA)，並於28℃之定溫培養箱進行培養。每隔24小時取出培養皿，於顯微鏡下計數細胞數量，並計算細胞之族群倍增時間(Kuchler,R.J.1997.Development of animal cell populations in vitro.In：Kuchler,R.J.(Ed.),Biochemical Methods in Cell Culture and Virology.Dowden,Hutchingon,and Ross,Inc.Press,Stroudsburg,pp.90－113.)，其結果如第二圖所示。

請參閱第二圖，該圖係豆莢螟細胞株NTU－MV於含不同比例胎牛血清濃度之TNM－FH培養液以及無血清之Sf900培養基中之生長曲線。由圖中可知，此豆莢螟細胞株NTU－MV於含有0%、4%、8%與16%胎牛血清之TNM－FH培養液中，其族群倍增時間分別為49.9、33.84、27.97以及28.16小時；而於無血清之Sf900培養基中，其族群倍增時間則為36.62小時。其中，培養於含8%胎牛血清TNM－FH培養液之NTU－MV所需族群倍增時間較短，意即其生長速度明顯較培養於上述其他培養基中快，顯示若未來需大量繁殖豆莢螟細胞株NTU－MV時，含8%胎牛血清濃度之TNM－FH培養液較符合產業上生產快速之需求。

另一方面，體外培養動物細胞時，通常會因應不同細胞株之生長需求而添加濃度為5%－20%之血清，作為營養、附加及緩衝之用，而當血清濃度低至2%以下時，會導致細胞生長過於緩慢，故其對於許多細胞而言，是正常生長的必要添加物。然而血清價格昂貴且其係來自於動物，因此其成分及各成分之含量，可能會隨所採取血清之動物個體的健康狀態而改變，故使用不同批之血清進行細胞培養，不一定可得到再現性之結果，而此試驗結果顯示豆莢螟細胞株NTU－MV可於無血清之TNM－FH培養基中生長，除證明此細胞株之生長穩定性外，亦顯示其可以較低價格之無血清培養基來增殖，此有助於量產時降低所需成本以及便於重組蛋白之純化回收，大幅提高其產業利用性。此外，無血清培養基，只要不含血清即可，並非以此為限定，可使用混合有能使豆莢螟細胞株NTU－MV維持、生育必要之非血清成分所製作之培養基等，例如市售之其他無血清培養基亦可應用於此。

實施例4：

豆莢螟細胞株之染色體核型分析(Karyotype analysis)昆蟲細胞染色體數目，依其容易判別程度可分為三級，其中以雙翅目(Diptera)之染色體較大，數目較少(2n＝6－8)且最容易判別；直翅目(Orthoptera)昆蟲次之(8－16n)；而鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲含有微染色體(microchromosomes)且中心粒(centromere)不明顯，為最難區別，數目通常為25~256條左右。為鑑別豆莢螟細胞株之親緣歸屬，本試驗係利用染色體核型分析，檢測豆莢螟細胞株NTU－MV之染色體於細胞中分佈的情況及其染色體數目，藉以判定豆莢螟細胞株NTU－MV所含染色體之特性及其分類地位所屬之目(order)。

自培養基中取出含有1×10⁶ 細胞數之長至對數期的豆莢螟細胞株NTU－MV，以1000 xg離心10分鐘並去除培養基，再以含1/3生長培養液(growth medium)之5ml高張溶液(hypotonic medium)懸浮細胞，靜置10分鐘使細胞脹大後，再次離心沉澱細胞並去除上清液，加入四倍體積量之固定液(其係由甲醇與冰醋酸以3：1比例所組成)，靜置20分鐘以固定細胞組織，再次離心沉澱並更換新的固定液，重複此步驟三次。取一片以100%冰冷甲醇濕潤之戴玻片，並將上述已固定之細胞液滴至玻片上，使其自然散開，風乾此戴玻片後，以Giemsa染劑染7分鐘，以蓋玻片封膠保存，並於顯微鏡下觀察染色體形狀並計算其數目，其結果如第三圖所示。

請參閱第三圖，該圖係豆莢螟細胞株NTU－MV之染色體形狀及數量分布。由第三A圖中可知，此豆莢螟細胞株NTU－MV之染色體呈細小點狀；從第三B圖之細胞中染色體分佈狀況可知，其染色體數目呈常態分布，染色體數目則界於16到268條之間，其中具有42條染色體之細胞數目為最多，而平均約為68.14條(第三B圖)。由上述豆莢螟細胞株NTU－MV的染色體形狀及數目分析結果可知，豆莢螟細胞株NTU－MV所含染色體係具有典型鱗翅目昆蟲細胞株之染色體特性，故本發明所建立之豆莢螟細胞株NTU－MV確實源自於鱗翅目。

實施例5：

豆莢螟細胞株之同功異構酶分析為進一步分析三株豆莢螟細胞株(NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2)之種源以及其與同為鱗翅目之昆蟲細胞株間之差異，本試驗係利用同功異構酶(isoenzyme)可催化同一化學反應，但因各酶所具有不同結構與物理特性之差異，而於電泳分離時會影響各分子之泳動速率，藉此電泳圖譜之異同，以區分並鑑定分析物間之差異性。

於內含血清之TNM－FH培養液中，分別增殖下列昆蟲細胞株之細胞：三株豆莢螟細胞株：NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2、源於毒蛾科之吉普賽舞蛾細胞株(Lymantria dispar cell line)：IPLB－LD－652Y與榕樹透翅毒蛾細胞株(Perina nuda cell line)：NTU－PN－HF；同時以無血清培養基Sf900增殖豆莢螟細胞株NTU－MV以及源於夜蛾科之秋行軍蟲細胞株(Spodoptera frugiperda cell line)：Sf9。自此些培養皿內取出各細胞，先於4℃下以70 xg離心10分鐘，去除細胞培養液，再以500 μ l之二次去離子水，重新懸浮細胞沉澱物(使其濃度為1.5×10⁸ /ml)，並反覆施予液態氮冷凍及37℃水浴解凍之溫差處理五次，以促使細胞分解，且將分解後之細胞，以8500 xg離心5分鐘後，收集上清液部份，此為製備樣品。接著分別取10－20 μ l之上述製備樣品，以10%聚乙醯銨膠(polyacrylamide gel)於20毫安培(mA)下進行2小時之電泳後，將電泳膠以下列三種同功異構酶：酯酶(esterase)、蘋果酸去氫酶(malate dehydrogenase,MDH)、乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)進行膠片之活性染色，而其結果如第四圖所示。

請參閱第四圖，該圖係培養於TNM－FH之三株豆莢螟細胞株NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2，與其他昆蟲細胞株：吉普賽舞蛾細胞株、榕樹透翅毒蛾細胞株，以及培養於無血清培養液Sf900之NTU－MV細胞株與秋行軍蟲細胞株之同功異構酶電泳圖譜。由圖中可知，三株豆莢螟細胞株：NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2之酯酶、蘋果酸去氫酶與乳酸去氫酶的酵素圖譜，所顯現之條紋數目及泳動距離皆相同，此表示該些細胞株皆屬於同一群類，且經次培養所得之豆莢螟細胞株：NTU－MV－1與NTU－MV－2確實係源自NTU－MV；而相較於同為鱗翅目但不同科之吉普賽舞蛾細胞株、榕樹透翅毒蛾細胞株與秋行軍蟲細胞株的酵素圖譜樣式則完全無相似之處，此顯示本發明所建立之三株豆莢螟細胞株NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2為前所未見之新細胞株。此外，當豆莢螟細胞株NTU－MV培養於無血清培養基Sf900時，其所呈現之酵素圖譜樣式與培養於含血清之TNM－FH培養基所示電泳條帶分佈形態相似，意即以無血清培養基所增殖之豆莢螟細胞株NTU－MV，其細胞特徵與種源仍維持不變，不會因為血清的缺乏而培養出不同特徵的細胞株。

實施例6：

豆莢螟細胞株之內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)分析真核生物的核糖體核酸(ribosomal DNA,rDNA)為一群成縱線排列(tandem array)的重複性基因(repeated gene families)，位於染色體的核仁組成中心(nuceolar organizer region)。並且各個重複單位間皆能保持其相似性，此現象可能受到不等重(unequal recombination)和基因轉變(gene conversion)的調控。此外，每個重複單位(repeat unit)中，包含一段可被轉錄的密碼序列(coding sequence)：包含18S、5.8S及28S rRNA等三個基因區，且此三區之之序列，在不同物種間相當類似，而5.8S rRNA基因分別與18S及28S rRNA基因間各有一個內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)，此內轉錄間隔區(ITS)於不同物種間之長度及序列上常有很大變異。故本試驗係藉由分析豆莢螟幼蟲、豆莢螟細胞株NTU－MV以及秋行軍蟲細胞株(Sf9)所含內轉錄間隔區(ITS)之特定序列，以鑑別豆莢螟細胞株NTU－MV之親緣性及所屬類別。

分別自豆莢螟幼蟲體、豆莢螟細胞株NTU－MV以及其他昆蟲細胞株：秋行軍蟲細胞株(Sf9)中萃取出DNA。接著利用引子ITS1與ITS2進行聚合酶鏈鎖反應，其中，引子ITS1之序列為：5’ CCCCATAAACGAGGAATTCC 3’，引子ITS2之序列為：5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’，而每一反應總體積為50 μl，其反應內容物包括：50 ng上述萃取之DNA、1倍之反應溶液(含2 mM MgSO4)、200 μM dNTP、2.5 U HiFi polymerase以及1 μM引子；反應條件及溫度變化依序為：94℃反應2分鐘，再以94℃反應15秒、60℃反應30秒、68℃反應3分鐘為一循環，並重複此循環40次後，溫度調整至72℃再反應15分鐘。將此PCR反應後之產物以經溴化乙烷(ethidium bromide)預染之1%瓊脂電泳膠片，於TAE緩衝溶液中進行電泳分析，回收DNA並與T&A cloning vector(Promega Co.)行接合反應(ligation)。將此接合後之質體與勝任細胞行轉型作用(transformation)，經菌體培養、複製及質體抽取後，進行核酸定序反應，反應後的核酸混合物，再以DNA定序儀(biosystems 377 DNA sequencer)讀取定序之DNA序列，其結果如第五圖所示。

請參閱第五圖，該圖係豆莢螟幼蟲體、豆莢螟細胞株NTU－MV以及秋行軍蟲細胞株(Sf9)所含內轉錄間隔區(ITS)DNA序列圖譜之比對結果。由圖中之序列圖譜比對結果可知，豆莢螟細胞株NTU－MV與豆莢螟幼蟲體之內轉錄間隔區(ITS)的DNA序列相似度高達98%，而豆莢螟細胞株NTU－MV與秋行軍蟲細胞株(Sf9)之內轉錄間隔區(ITS)的DNA序列相似度僅有60%，因此可證明豆莢螟細胞株NTU－MV確實係自豆莢螟幼蟲體分離而建立之細胞株。

實施例7：

豆莢螟細胞株之病毒感受性分析為確認新建立之豆莢螟細胞株NTU－MV及其次細胞株NTU－MV－1與NTU－MV－2對豆莢螟核多角體病毒(MaviMNPV)之感受性，並測定感染後之病毒增殖量，此係利用顯微鏡觀察細胞株對病毒之感受能力以及受感染細胞之病變形態，並計算含有病毒包埋體(occlusion body,OB)之細胞數，以表示細胞病變程度及細胞株之病毒致病力。

首先需進行待測試病毒之包埋體和病毒粒子的純化。取罹病之蟲體或受感染之細胞，加入適量的二次蒸餾水加以研磨後，經過濾後，於4℃下以1,600 xg離心30分鐘使包埋體沈澱，倒除上清液。將沈澱之包埋體以3倍體積的二次蒸餾水使其再懸浮，加入等體積的細胞溶解液使細胞破碎，再於4℃，1500 xg下離心30分鐘後，將沈澱之包埋體以二次蒸餾水使其再懸浮，將此懸浮液利用40%~65%(W/W)的蔗糖連續密度梯度(sucrose gradient centrifugation)加以純化並離心之，可得到純化之包埋體。將純化之包埋體，於室溫下以鹼性溶液溶解之，以便釋出內含之病毒粒子，再以5000 xg離心10分鐘，以去除未溶解之包埋體，再利用40~65%的蔗糖重量百分濃度連續密度梯度於4℃下離心一小時，可看見白色的核多角體病毒條帶，將其收集後再以3倍體積的TE緩衝液稀釋。再於4℃下離心30分鐘，將病毒粒子沉澱，倒除上清液後再以少量TE緩衝液使病毒粒子再懸浮，將其儲存於4℃備用。

(1)豆莢螟株對豆莢螟核多角體病毒之感受性將長至對數期之豆莢螟細胞株NTU－MV，接種豆莢螟核多角體病毒的病毒溶液，經過一小時之貼附作用(adsorption)後，去除病毒溶液，加入新鮮TNM－FH培養液，置於28℃恆溫培養箱中培養3天後，利用位相差顯微鏡(Olympus IX－71)觀察含有病毒包埋體之細胞，並以電子顯微鏡觀察病毒包埋體之構造形態，其結果如第六圖及第七圖所示。

請參閱第六圖，該圖係新建立豆莢螟細胞株NTU－MV在接種豆莢螟核多角體病毒三天後所呈現之細胞形態。由圖中可觀察到，豆莢螟細胞株NTU－MV在接種豆莢螟核多角體病毒72小時後，其所含細胞出現有因受病毒感染而呈細胞核腫脹之典型細胞病變現象(typical cytopathogenic effects)，且部份受感染細胞之細胞核內則出現有病毒之包埋體，亦即多角體病毒；此結果顯示新建立之豆莢螟細胞株NTU－MV可受豆莢螟核多角體病毒之感染，並對豆莢螟核多角體病毒具有高感受性。

請參閱第七圖，該圖係新建立豆莢螟細胞株NTU－MV在接種豆莢螟核多角體病毒三天後，受感染細胞所含多角體病毒顆粒。由於昆蟲細胞受感染後期，昆蟲細胞核內會出現許多增殖之病毒顆粒(virion,V)，各病毒顆粒主要係由核蛋白質鞘(nucleocapsid,N)與包覆於核蛋白質鞘外之病毒外膜(virion envelope,VE)所組成，同時病毒之多角體蛋白基因會開始啟動，並產生多角體蛋白(polyhedron,Ph)，而病毒顆粒會隨機封埋於多角體蛋白(Ph)內，進而形成包埋體(OB)，亦稱為核多角體(polyhedral inclusion body,PIB)。故從第七B圖中可觀察到，受感染昆蟲細胞之細胞核中出現有未被多角體蛋白(polyhedron,Ph)包埋之病毒顆粒(viron,V)或成群聚集之病毒粒子群(virogenic stroma,VS)以及包埋有病毒顆粒之多角體蛋白(Ph)，且細胞核內出現有染色質於細胞核膜邊緣聚集形成染色質團(C)之細胞凋亡前的現象；而從第七A圖中可進一步觀察到單一個包埋體(OB)之構造形態，包埋體(OB)係由多角體蛋白(Ph)包埋住一個至多個病毒顆粒(V)所形成，而單一個病毒顆粒(V)又由病毒外膜(VE)包覆數個核蛋白質鞘(N)而形成，並將病毒顆粒(V)層層封埋於包埋體(OB)內，直到被感染細胞被分解後，包埋體(OB)才會釋出進而造成蟲與蟲之間的感染。

(2)豆莢螟核多角體病毒之定量試驗分別將長至對數期之豆莢螟細胞株NTU－MV及其次細胞株NTU－MV－1與NTU－MV－2培養在TNM－FH培養液，以及培養在無血清培養基(Sf900)且長至對數期之豆莢螟細胞株NTU－MV，接種上述純化之豆莢螟核多角體病毒，經過一小時之貼附作用(adsorption)後，去除病毒溶液，加入適當之新鮮培養基，置於28℃恆溫培養箱中培養14天，每天利用位相差顯微鏡(Olympus IX－71)觀察並計算含有病毒包埋體之細胞數，以表示細胞病變程度及細胞株之病毒致病力，其結果如第八圖及第九圖所示。

請參閱第八圖，該圖係培養於TNM－FH培養液之新建立豆莢螟細胞株NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2，以及培養於無血清培養基Sf900之NTU－MV，在接種豆莢螟核多角體病毒七天後產生多角體病毒的細胞數比例。由圖中可觀察到，無論是培養於TNM－FH培養液之豆莢螟細胞株NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2，或是培養於無血清培養基(Sf900)之NTU－MV，於病毒感染一周後，其皆有超過88%以上之細胞可產生多角體病毒。

請參閱第九圖，該圖係新建立豆莢螟細胞株NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2，以及培養於無血清培養基Sf900之NTU－MV，在接種豆莢螟核多角體病毒一星期及兩星期後，各細胞平均產生之多角體病毒數量。由圖中可觀察到，在病毒感染一周時，NTU－MV－2(MV2)細胞株之每個細胞便可生產25個多角體病毒，而各細胞株在病毒感染二周後，平均每個細胞可生產45個以上的多角體病毒，僅培養於無血清培養基Sf900之NTU－MV(MVSF900)細胞株之病毒產量較低，其平均每個細胞可生產25個多角體病毒。

故綜合上述測試結果，可利用此三株豆莢螟細胞株：NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2對多角體病毒之感受性，應用於豆莢螟桿狀病毒之增殖，以製造生物性殺蟲劑，並可作為利用豆莢螟桿狀病毒構築之表現載體，生產重組蛋白質之宿主細胞。

實施例8：

豆莢螟細胞株生成之豆莢螟核多角體病毒的限制酵素圖譜分析(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)為確認新建立之豆莢螟細胞株NTU－MV所產生之豆莢螟核多角體病毒，係相同於感染豆莢螟蟲之豆莢螟核多角體病毒，此係利用限制酵素圖譜分析(RFLP)，藉由三種限制酵素分別處理豆莢螟細胞株NTU－MV及豆莢螟蟲各別所含豆莢螟核多角體病毒之DNA，並比對兩DNA圖譜之相似程度，鑑別NTU－MV所含豆莢螟核多角體病毒與感染豆莢螟蟲之豆莢螟核多角體病毒之異同。

(1)豆莢螟核多角體病毒所含DNA之純化分別自受病毒感染之豆莢螟幼蟲體及豆莢螟細胞株NTU－MV中純化出豆莢螟核多角體病毒，再各取1ml純化之核多角體病毒粒子，並加入1/10體積的1M KCl和10% SLS及10mg/ml proteinase K，置於55℃下作用2－3小時後，經酚萃取，除去溶液中的蛋白質，再以2倍體積的絕對酒精沈澱基因組DNA(genomic DNA)並放置於－20℃，隔夜後取出以1000 xg離心30分鐘，使DNA完全沈澱下來，再倒去上清液並加入70%的酒精以洗去過多的鹽類，以10,000 xg離心15分鐘將DNA沈澱下來後，去上清液並將離心管倒置，等酒精完全揮發後，將DNA保存在－20℃冰箱備用。

(2)豆莢螟核多角體病毒DNA之限制酵素圖譜分析將上述自受病毒感染之豆莢螟幼蟲體及豆莢螟細胞株NTU－MV中萃取之豆莢螟核多角體病毒DNA，分別利用三種限制酵素：EcoR I、Hind Ⅲ及Pst I，於37℃下與病毒DNA進行水解反應1小時，藉以裁切該些病毒之DNA，並將反應後之病毒DNA片段以經溴化乙烷(ethidium bromide)預染之瓊脂電泳膠片，於TAE緩衝溶液中進行電泳分析，其結果如第十圖所示。

請參閱第十圖，該圖係利用限制酵素圖譜分析豆莢螟細胞株NTU－MV與豆莢螟蟲個別所含豆莢螟核多角體病毒DNA之電泳圖。由圖中可觀察到，相對於電泳片兩側之分子標示(M)，自豆莢螟細胞株NTU－MV萃取之病毒DNA，與從豆莢螟蟲體內萃取所得之病毒DNA，經三種限制酵素：EcoR I、Hind Ⅲ及Pst I裁切後，各限制酵素所裁切出之病毒DNA片段大小都相同，故為同一種病毒，意即豆莢螟細胞株NTU－MV所產生之豆莢螟核多角體病毒係與感染豆莢螟蟲之豆莢螟核多角體病毒的基因組完全相同，此亦證明豆莢螟核多角體病毒確實可以新建立之豆莢螟細胞株NTU－MV於體外培養且大量增殖之。

第一圖係本發明實施例三株豆莢螟細胞株NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2於位相差顯微鏡下所觀察到之細胞形態圖。(A)圖係NTU－MV細胞於初代培養時，自豆莢螟蛹體組織移動至培養皿底部之細胞形態，(B)圖係NTU－MV之細胞形態，(C)圖係NTU－MV－1之細胞形態，(D)圖係NTU－MV－2之細胞形態，圖中各細胞株所含主要四種細胞形式之代號分別為C：逗號細胞、R：圓形細胞、P：多棘形細胞以及SP：梭狀細胞。所有圖示之放大倍率皆相同；橫線表示100 μm。

第二圖係本發明實施例豆莢螟細胞株NTU－MV分別培養於含不同比例胎牛血清(FBS)之TNM－FH培養液以及無血清培養基Sf900中之生長曲線圖。×：0% FBS；□：4% FBS；▲：8% FBS；△：16% FBS；○：Sf900。垂直線代表三次獨立試驗之標準偏差值。

第三圖係本發明實施例利用染色體核型分析豆莢螟細胞株NTU－MV染色體之形態及其於細胞中之數量與分布狀況圖。(A)圖係豆莢螟細胞株NTU－MV的染色體形態；橫線表示12.5 μm。(B)圖係在100個NTU－MV細胞中，染色體於細胞中之數量與分布狀況。

第四圖係本發明實施例以不同培養液飼育之豆莢螟細胞株與其他細胞株之同功異構酶電泳圖譜。(A)圖係酯酶，(B)圖係蘋果酸去氫酶，(C)圖係乳酸去氫酶；各電泳道上方之標號分別為：(1)榕樹透翅毒蛾細胞株、(2)吉普賽舞蛾細胞株、(3)NTU－MV(TNM－FH)、(4)NTU－MV－1(TNM－FH)、(5)NTU－MV－2(TNM－FH)、(6)NTU－MV(Sf900)、(7)秋行軍蟲細胞株。

第五圖係本發明實施例新建立豆莢螟細胞株NTU－MV之內轉錄間隔區(ITS)分析之DNA序列圖譜。MV－CELL：豆莢螟細胞株NTU－MV；MV－LARVAE：豆莢螟蟲體；SF9－CELL：秋行軍蟲細胞株。黑底白字者代表相同之DNA序列。

第六圖係本發明實施例新建立豆莢螟細胞株NTU－MV在接種豆莢螟核多角體病毒三天後，受感染細胞所呈現之細胞病變形態。橫線表示50 μm。

第七圖係本發明實施例新建立豆莢螟細胞株NTU－MV在接種豆莢螟核多角體病毒三天後，受感染細胞內所含之豆莢螟核多角體病毒。(A)圖係單個病毒包埋體(OB)顆粒，橫線表示100 nm；(B)圖係NTU－MV細胞內之豆莢螟核多角體病毒。圖中之代號分別為C：染色質體、CA：多角體外膜萼、VE：病毒外膜、V：病毒顆粒、VS：病毒粒子群、Ph：多角體蛋白、N：核蛋白質鞘。橫線表示1 μm。

第八圖係本發明實施例豆莢螟細胞株NTU－MV、NTU－MV－1與NTU－MV－2在接種豆莢螟核多角體病毒七天後產生多角體病毒之細胞數比例。圖中◆：NTU－MV(TNM－FH)；■：NTU－MV－1(TNM－FH)；▲：NTU－MV－2(TNM－FH)；×：NTU－MV(Sf900)

第九圖係本發明實施例豆莢螟細胞株NTU－MV(MV)、NTU－MV－1(MV1)與NTU－MV－2(MV2)，以及培養於無血清培養基Sf900之NTU－MV(MVSF900)，在接種豆莢螟核多角體病毒一星期及兩星期後，各細胞平均產生之多角體病毒數量。圖中：接種豆莢螟核多角體病毒一星期後，各細胞平均產生之多角體病毒數量；：接種豆莢螟核多角體病毒二星期後，各細胞平均產生之多角體病毒數量。

第十圖係本發明實施例利用三種限制酵素：EcoR I、Hind Ⅲ及Pst I分析豆莢螟細胞株NTU－MV(C)與豆莢螟蟲(L)個別所含豆莢螟核多角體病毒DNA之電泳圖。圖中，第一行：λ/Hind Ⅲ DNA marker，其分子量(Kb)標記顯示於電泳圖左側；第二行：經EcoR I裁切之NTU－MV(C)DNA片段；第三行：經EcoR I裁切之豆莢螟蟲(L)DNA片段；第四行：經Hind Ⅲ裁切之NTU－MV(C)DNA片段；第五行：經Hind Ⅲ裁切之豆莢螟蟲(L)DNA片段；第六行：經Pst I裁切之NTU－MV(C)DNA片段經Pst I；第七行：經Pst I裁切之豆莢螟蟲(L)DNA片段；第八行：Gen－100 DNA Ladder，其分子量(Kb)標記顯示於電泳圖右側。

Claims

一種豆莢螟細胞株，其係命名為NTU-MV細胞株，該NTU-MV細胞株係為一連續細胞株且於中華民國食品工業發展研究所之寄存編號為BCRC 960312。
如申請專利範圍第1項所述之豆莢螟細胞株，其中該NTU-MV細胞株可於無血清培養基中生長繁殖。
如申請專利範圍第2項所述之豆莢螟細胞株，其中該無血清培養基係為Sf900。
如申請專利範圍第1項所述之豆莢螟細胞株，其中該NTU-MV細胞株係建立自豆莢螟(Maruca vitrata) 之蟲蛹組織。
如申請專利範圍第1項所述之豆莢螟細胞株，其中該NTU-MV細胞株對蟲生病原性微生物具感受性(susceptibility)。
如申請專利範圍第5項所述之豆莢螟細胞株，其中該NTU-MV細胞株係用於增殖該蟲生病原性微生物及表現蛋白質。
如申請專利範圍第6項所述之豆莢螟細胞株，其中該蟲生病原性微生物係為昆蟲桿狀病毒 (baculovirus)。
如申請專利範圍第7項所述之豆莢螟細胞株，其中該昆蟲桿狀病毒係為豆莢螟核多角體病毒(Maruca vitrata multiple nucleopolyhedrovirus,MaviMNPV)。
如申請專利範圍第8項所述之豆莢螟細胞株，其中該蟲生病原性微生物進一步包含該豆莢螟核多角體病毒之各感染時期產物：出芽病毒、包埋體病毒或病毒DNA。
如申請專利範圍第8項所述之豆莢螟細胞株，其中該蛋白質係為利用該豆莢螟核多角體病毒所構築之表現載體，並以該NTU-MV細胞株為宿主細胞所表現之重組蛋白質。