TWI386232B - 來自牛至（Ｏｒｉｇａｎｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）之新化合物及其用途 - Google Patents

Description

來自牛至( Origanum vulgare )之新化合物及其用途

本發明為一種來自牛至(Origanum vulgare )之新化合物及其用途

過去幾年裡，以傳統藥草和藥用植物應用於新的藥品和保健產品的開發與日俱增。這些天然資源已被證實可做為抗氧化劑、抗發炎和抗高血壓等相關藥物。而植物衍生物的產品在化妝品工業上也逐漸被接受且採納。因此由藥用植物、藥草和香料萃取獲得之天然成分，可發展出其他替代的食品添加物或是化妝產品是值得研究的。

牛至( Origanum vulgare )

關於牛至草(Origanum)的種類及其應用中發現，其可當作抗菌和抗氧化劑。牛至(Origanum vulgare )是一種芳香性植物，地中海區將此當作香料。先前的研究證實牛至含有很多的精油成分其主要功效應用於抗菌方面。但是，極少有關於牛至美白和抗氧化機制的研究探討。

美白

哺乳動物中，黑色素細胞刺激素(α-MSH)為發生色素沉著的必須條件。α-MSH結合上黑色素皮質素受體1(MC1R)，使環磷酸腺苷(cAMP)增加，進而活化小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，簡稱MITF)導致黑色素生成。MITF是上游調控黑色素生成的酵素，如酪胺酸酶。酪胺酸酶會使蔬果中引起不良褐變，且是動物皮膚、頭髮和眼睛產生黑色素中不可或缺的酵素。酪胺酸酶在初始的黑色素合成過程中扮演參與由L-酪胺酸酶氧化多巴以及多巴轉變為多巴醌過程。多巴醌則自動轉換為多巴色素。酪胺酸相關蛋白-2(TRP-2)/多巴色素互變酶(DOPAchrome tautomerase)(TRP2/DCT)催化多巴色素轉化為5,6-二羥基吲哚-2-羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，簡稱DHICA)。酪胺酸相關蛋白-1(TRP-1)(TRP1/DHICA氧化酶)催化氧化DHICA形成吲哚-5,6-苯酮-2-羧酸(indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid)。TRP2/DCT和TRP-1這兩個密切相關的結構作用產生不穩定醌類(quinines)，進一步聚合後產生黑色素。

表皮和真皮的色素沉澱取決於黑色素細胞數目增加或是與黑色素生成相關基因與酵素活性的影響。紫外線、慢性發炎和皮膚炎時，α-MSH釋放觸發色素沉澱。近年來，許多天然及合成物質具抑制酪胺酸酶活性，因此可作為皮膚美白劑，但是其對於皮膚的安全性上，仍有許多爭議。之前的研究指出，目前已知的幾個酪胺酸酶抑制劑，包括熊果素，麴酸和亞麻仁油酸已廣泛的使用在皮膚美白上，但卻有副作用。因此，在進行皮膚美白試驗之前必先確定其安全濃度。

抗氧化

自由基(free radical)含有一個或多個不成對電子的原子、分子或離子，化性大部分處於極不穩定的狀態，反應性較其他分子高，會搶奪鄰近分子的電子形成電子對，使其達到穩定的狀態，被搶奪電子的分子則會變得不穩定，若又具有高度的活動性則會造成連鎖反應(chain reaction)，促使自由基的產生。當自由基攻擊細胞內或外之巨大分子，如脂質、蛋白質或核酸時，則易因膜上脂質氧化而導致膜的完整性受損；蛋白質之胺基酸殘基受到氧化修飾，如羰基(carbonyl)的生成，使得重要的酵素無法活化；DNA受自由基攻擊時，會造成DNA鹼基之修飾、交插聯結(cross-link)、DNA單股(或雙股)斷裂等現象而引起基因突變等諸多傷害，而導致細胞功能異常，進而影響整個生物體的健康。許多疾病如粥狀動脈硬化、糖尿病的併發症、肌萎縮性側索硬化症、神經性病變、自體免疫性疾病及老化等的發生皆與氧化傷害有關。其中因物資充裕而發生之粥狀動脈硬化等疾病已為國人日趨嚴重的問題，有學者研究指出低密度脂蛋白(LDL)的氧化與此一疾病的發生率有極大的相關性。

防止氧化之最主要方法為除去氧氣，其次為去除自氧化的促進因子，因此，所謂之抗氧化劑(antioxidant)即為任何可延緩脂肪的氧化性酸敗，或其他物質氧化的物質。就生體而言，凡可保護生體基質對抗氧化劑，不論在食品系統中或生物系統中，抗氧化劑之存在與否，是防止脂質過氧化之最主要因素，而理想之抗氧化劑應具備之條件有以下幾項：(a)低濃度即具有效果。(b)適用性廣。(c)無不良之口感氣味或顏色。(d)不具毒性。(e)價格低廉。抗氧化劑若依其作用機制區分，則可分為自由基終止劑(free radical terminatos)、還原劑(reducants)或氧清除劑(oxygen scavengers)、金屬螯合劑(metal chelators)、酵素型抗氧化劑(enzymic antioxidants)及過氧化分解劑(peroxide decomposers)。

自由基終止劑一般亦稱為一級抗氧化劑(primary antioxidants)，是藉由提供氫原子以達到抗氧化作用，該類抗氧化劑可提供主要之抗氧化效果，於此類之抗氧化劑大部份是酚類化合物，如五倍子酸丙酯(propyl gallate，簡稱PG)、丁基羥基甲氧苯(butylated hydroxyanisole，簡稱BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，簡稱BHT)及第三丁氫醌(tertiary-butyl hydroquinone，簡稱TBHQ)等。還原劑或氧之清除劑的抗氧化機制在於移轉氫原子或清除氧分子，如生育醇(α-tocopherol)憑藉其與過氧化自由基之反應速率比過氧化自由基與脂質之反應速率快，而達到抗氧化之作用。螯合劑或助抗氧化劑此類物質本身不具抗氧化功能，但因其結構上有一未共用電子對(unshared pain of electrons)，能與促氧化過渡金屬(Fe²⁺ 和Cu²⁺ )結合，形成穩定之化合物而抑制油脂之自氧化反應，此類物質可以檸檬酸(citric acid)、聚合磷酸鹽類(polyphosphates)、二胺次乙基四醋酸(EDTA)及其鹽類為代表。過氧化物分解劑之代表為硫代丙酸二月桂酯(dilauryl thiopropionate)和硫二丙酸(thiodipropionic acid)，其作用機制為將脂質過氧化物分解成安定之最終產物。

近年來，許多研究探討具有抗氧化能力的植物及其活性，作為抗氧化性食品選擇的依據。

本發明提供一種具下式之化合物

其中R₁ 係羥基或C_1-6 烷氧基；R₂ 係羥基或C_1-6 烷氧基；但R₁ 、R₂ 不同時為羥基。

本發明化合物中，較佳R₁ 係羥基；較佳R₂ 係甲氧基。

是以，本發明之最佳化合物係

本發明亦提供包含本發明化合物之組合物。本發明之組合物具有美白與抗氧化能力，可應用於美白或抗老化個體皮膚，亦可作為化妝品、保養品或保健食品之原料。接受本發明組合物之個體包括但非限於哺乳動物。

在本發明之較佳實施例中，本發明之組合物具有抑制黑色素生成之能力。在本發明之最佳實施例中，本發明之組合物係抑制小眼畸形相關轉錄因子(MITF)、酪胺酸酶或酪胺酸相關蛋白-2(TRP-2)之蛋白質表現。

在本發明之較佳實施例中，本發明之組合物具有清除自由基之能力。在本發明之最佳實施例中，該自由基係DPPH自由基及ABTS自由基。

在本發明之較佳實施例中，本發明之組合物係降低細胞內活性氧(ROSs)之含量，並具有抑制脂質過氧化之能力。

本說明書及申請專利範圍中所用之詞語『包含』、『具有』、『包括』或『含有』為包括在內的或開放式的，且其不排除額外未引用之元件或方法步驟。

術語『抑制』、『減少』或『防止』或該等術語之任何變體當用於申請專利範圍及/或說明書中時包括任何可量測之減少或完全抑制以達成所需之結果。

如說明書及/或申請專利範圍中所使用之術語『有效』意謂足以實現所需、所期望或所預計之結果。

本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。

實施例1　材料與方法 試驗材料

牛至(0. vulgare )購自傳統中藥店，樣品經由丁秀玉教授驗證後，其乾燥樣本存放在嘉南藥理科技大學。酪胺酸酶、左旋多巴(L-DOPA)、熊果素和維他命購自西格瑪化學公司(Sigma Chemical Co.,St. Louis,USA)。

實驗方法

熔點測定使用熔點測定儀(MEL-TEMP 50/60 CYCLES，110-120伏特-200瓦特)。旋光度使用偏光計(SCHMIDT HAENSCH,POLARTRONIC NH8)測得。UV光譜利用分光光度計(Shimadzu,UV-160)獲得，而紅外光光譜則是利用光譜儀(ThermoMattson,IR 300)獲得。核磁共振氫光譜利用液態超導核磁共振儀(BRUKER AVANCE 500 Solution-NMR spectrometer)在500MHz記錄。碳光譜則是利用液態超導核磁共振儀(BRUKER AVANCE 500 Solution-NMR spectrometer at 125MHz in CD₃ OD)獲得。快速原子撞擊質譜(FABMS)利用質量光譜儀(JEOL TMSD-100)分析獲得。高效能液相層析儀(Shim-pack PREP-phenyl column,Shimaduz Corporation)則是利用逆相層析法。

實施例2　牛至苷(origanoside)的純化分離及結構鑑定

稱取牛至10.0公斤將藥材磨成細粉後使用95%的乙醇萃取，共得到萃取物為930.0g，將此萃取物利用不同極性的溶媒進行系統性的分配萃取。首先用正已烷和95%甲醇作分配萃取，得到正己烷層(90.0g)。將95%甲醇層濃縮去除甲醇後，用乙酸乙酯和水進行分配萃取，取得乙酸乙酯層(195.0g)及水層(835.0g)。乙酸乙酯層以甲醇當沖提液進行分子篩(LH-20)純化分離得到四個部份。第三個部份再以製備型低壓逆相層析柱(Lobar RP-8)，用溶媒甲醇和精製水(50:50)當沖提液進行純化分離，之後再用高壓製備型液相層析儀(HPLC)以甲醇和精製水(95:5)純化分離得到一新酚苷化合物(50.7mg)，並將之命名為牛至苷(origanoside)。

牛至苷為橘色固體；熔點為140-141度；旋光度為-160.5°(c =0.81,MeOH)；紫外線的吸收值為208,212,262和292nm.紅外線的吸收值為3403,1636cm^-1 ；高解析質譜儀(HRFAB-MS)測得數據為436.1350，其分子式為C₂₁ H₂₄ O₁₀ ；FAB質譜儀測的的分子量為436；核磁共振儀¹ H and¹³ C NMR測得之數據呈現在表一。牛至苷化合物是經由各種光譜分析證實其結構式，如圖一。

實施例3　細胞培養和試驗

人類纖維母細胞(Hs68)和老鼠黑色素瘤細胞(B16F0)從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,Rock-ville,Maryland)購得。細胞培養在DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium medium)培養基(GIBCO,Grand Island,NY)、10%胎牛血清(Hazelton Product,Denver,PA,USA)加入1%盤尼西林-鏈黴素後，在5% CO₂ ，37℃培養箱內培養。試劑溶在100% DMSO裡，濃度為100mg/ml。原始濃度稀釋至加入培養液中所需濃度。DMSO的最終濃度不超過0.1%。

細胞存活度試驗

將100μl 1.5×10⁵ 細胞/ml的細胞數培養在96孔培養盤(96-well plate)中，並在37℃、5% CO₂ 培養箱中生長24小時以上。加入不同濃度的牛至苷，經過72小時之後，利用MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)試驗測量其存活度。細胞培養至一定的時間之後，加入MTT溶液(0.5mg/ml)四個小時後，再加入200μl DMSO溶解沉澱物(Formazan)，以570nm波長下測得吸光值(BioTek,Synergy^TM 2,USA)。

利用MTT試驗測定於B16和Hs68細胞中加入不同濃度的樣品(0、5、10、20、50和100μg/ml)，測定牛至苷的安全濃度。結果呈現在圖2，牛至苷在0到100μg/ml皆不具毒性，且在高劑量100μg/ml時增加Hs68細胞的存活度。根據早期的美白產品篩選，40μg/ml濃度為基礎門檻，因此結果顯示牛至苷不具毒性，且之後的試驗以10和20μg/ml兩個濃度點進行抑制酪胺酸酶等試驗。

MRTH(3-methyl-bezothiazolinone hydrazone)活性試驗

利用比色試驗測量酪胺酸酶的多巴(DOPA)氧化酵素活性，當左旋多巴變成多巴醌(DOPAquinone)時，多巴醌可以和MBTH反應，成粉紅色，在508nm波長下有吸光值。將1ml 1.5×10⁵ 細胞/ml細胞數的B16細胞培養在24孔培養盤(24-well multidishes)中，並在37℃、5% CO₂ 培養箱中生長24小時以上。加入α-MSH和不同濃度的牛至苷，作用72小時後，移除培養基，用PBS清洗過後，加入1%界面活性劑(Triton X-100)，以冷凍後解凍方式打破細胞(-80℃ 30分鐘、25℃ 25分鐘、37℃ 5分鐘)後，加入190μl的MBTH混合物(10mM MBTH、1.1mM左旋多巴、4%二甲基甲醯胺)，於37℃反應4小時，以508nm測量吸光值(BioTek,Synergy^TM 2,USA)。

細胞內酪胺酸酶試驗

將1ml 1.5×10⁵ 細胞/ml的細胞數培養在24孔培養盤(24-well multidishes)中，並在37℃、5% CO₂ 培養箱中生長24小時以上。加入α-MSH和不同濃度的牛至苷，作用72小時後，移除培養基，用PBS清洗過後，加入1%界面活性劑(Triton X-100)，以冷凍後解凍方式打破細胞(-80℃ 30分鐘、25℃ 25分鐘、37℃ 5分鐘)後，加入100μl10mM左旋多巴，於37℃反應4小時，以475nm測量吸光值(BioTek,Synergy^TM 2,USA)。

牛至苷抑制酪胺酸酶活性的能力

酪胺酸酶的參與，影響黑色素合成的速率。調節色素的形成取決於抑制或是刺激酪胺酸酶的活性，因此，皮膚科醫生和化妝品業者可藉由抑制酪胺酸酶的活性等，來改善治療病人色素沉澱方面的疾病。以濃度10和20μg/ml的牛至苷、熊果素及維他命C作用於B16細胞72小時後，結果於圖3A中顯示，牛至苷對於B16細胞的酪胺酸酶的抑制率接近於16.9到28.6%，而MBTH試驗的抑制率約39.4到59.2%。牛至苷在MBTH試驗裡，抑制多巴酵素活性呈現藥物依賴性增加(10和20μg/ml)(圖3B)。牛至苷與熊果素和維他命C比較，結果顯示牛至苷對於多巴酵素的抑制率相當有效。這些結果證明，牛至苷抑制黑色素合成主要是降低細胞內多巴酵素活性的能力。

定量分析MCIR、MITF、酪胺酸酶、TRP-1和TRP-2的表現

1.5×10⁵ 細胞/ml之B16細胞，加入α-MSH(1μM)和20μg/ml的牛至苷經過72小時後，加入MC1R、MITF、酪胺酸酶、TRP-1及TRP-2抗體(以1比300的比例配置於PBS中)。加入0.5% BSA(PBS-BSA)及0.1%疊氮化鈉(sodium azide)，在4℃下染色45分鐘。再使用冰的PBS清洗2次後，加入螢光異硫氰酸鹽(FITC)結合抗小鼠IgG於4℃培養30分鐘。使用冰的PBS清洗細胞，再使用4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定。細胞核使用螢光染劑赫斯特33342(Hoechst 33342)染色。使用螢光免疫染色實驗觀察MC1R、MITF、酪胺酸酶、TRP-1及TRP-2表現量。細胞核則使用多功能微量盤分析儀(Multi-Detection Microplate Reader)，用Gene5^TM 軟體分析獲得。當細胞經過藥物濃度處理後，螢光百分比為FITC強度比上螢光染劑強度。

利用免疫螢光分析法和流式細胞儀評估MITF、酪胺酸酶和TRP-2的表現

改變黑色素合成相關蛋白，於B16細胞中包含MITF、酪胺酸酶及TRP-2，依序加入α-MSH(1μM)處理20μg/ml牛至苷，藉由免疫螢光染色法及流式細胞儀評估。牛至苷經培養72h後，細胞使用老鼠對抗MITF、酪胺酸酶及TRP-2(抗體以1比300的比例配置於PBS中)。加入0.5% BSA(PBS-BSA)及0.1%疊氮化鈉，4℃染色一小時。使用冰的PBS清洗細胞之後和FITC結合抗小鼠IgG(1比500)於4℃培養30分鐘。細胞核使用0.1μg/ml的螢光染劑赫斯特33342(Hoechst 33342)染色，而後置於螢光顯微鏡下觀察。在細胞進行流式細胞儀分析前完成，加入兩個使用冰的1倍BPS清洗步驟。數據使用軟體(WinMDI)分析。

牛至苷調控影響酪胺酸酶相關蛋白質表現

黑色素合成藉由通過多重途徑，哺乳動物中，α-MSH結合至MCIR，增加cAMP，啟動活化MITF。MITF是個有效轉錄活化酪胺酸酶的因子，且TRP-2和TRP-1表現被認為是黑色素細胞生長的關鍵調節者。為了確定牛至苷的分子機制是否是藉由阻斷B16細胞中黑色素生成，經20μg/ml的牛至苷作用於B16細胞72小時後，使用免疫螢光染色法定量分析MC1R、MITF、酪胺酸酶、TRP-2及TRP-1的表現量及DNA含量。於圖4A中顯示，經牛至苷處理的B16細胞中，MITF、酪胺酸酶和TRP-2的表現量與對照組相比，表現明顯降低。而MC1R和TRP-1的表現量與未對照組相比則無明顯變化。經牛至苷作用於B16後，DNA含量並無減少，且細胞核也無變化(圖4B)，與由細胞存活度試驗證實結果相同，牛至苷不會造成細胞毒殺。更進一步以流式細胞儀分析證實，經過20μg/ml的牛至苷作用於B16細胞後，MITF與TRP-2之表現量減少(圖4C)。結果顯示牛至苷藉由調節降低MITF、酪胺酸酶及TRP-2的表現量，進而減少黑色素生成。

實施例4　動物試驗 製備含有牛至苷的凝膠

卡波940(940，為一種聚丙烯酸聚合物)由路博潤先進材料公司(Lubrizol Advanced Materials,Inc.,USA)所捐贈。牛至苷凝膠之製備係藉由將1%卡波姆940分散於混合物的水中。濃度為0.02%w/w的牛至苷與卡波姆940粉末一同被加入正常的生理食鹽水(0.9%NaCl(aq))中，然後以磁力攪拌6小時。加入0.01%三乙醇胺(triethanolamine)以加速分散速率，並中和至pH值為7.4。

動物塗抹牛至苷凝膠的美白效果

選擇五週大C57BL/6J品系的老鼠，約20-50公克重，由台灣台北國家中央動物實驗室獲得。在整個實驗中，老鼠被安置在不銹鋼籠子裡，溫度保持在25±2℃和日夜週期為12小時。在進行實驗前，老鼠有七天的適應期。當老鼠除毛之後，經過一天的休息，每隻老鼠沿著脊椎骨分成兩部分，右邊塗抹0.1g的凝膠樣品(控制組)，左邊則塗抹含有牛至苷的凝膠樣品(實驗組)。12隻老鼠每天塗抹及測定凝膠樣品和牛至苷凝膠樣品的比色值。色差計(DermaScan High Frequency Ultrasound, DSM II Colormeter, Crypro LN2, DermaLab and Dermaspectrometer, Cortex Technology)用來評估吸光值。在此標準儀器組中，包含測定：CIE-Lab (WLED optimized)、E &M (紅斑&黑色素)和RGB值。L *值為比色值的代表、a *代表顏色在紅/綠軸上表現程度，b *代表黃/藍軸上顏色表現程度。根據RGB值，量化紅斑(E )和黑色素(M )的色素分佈。以色差計測定試驗前和試驗後的L *a *b *和E /M 值。

利用比色計測量可證明皮膚顏色的變化。以L *a *b *和紅斑黑色素(E /M )將12隻老鼠皮膚顏色量化。如表2，塗抹牛至苷凝膠十天後和塗抹凝膠樣品(控制組)比較，塗抹牛至苷凝膠的老鼠，L *增加、a *些微減少和b *沒有明顯變化。且塗抹牛至苷凝膠後，紅斑值(E )和黑色素值(M )皆明顯低於控制組和未塗抹凝膠的老鼠。結果顯示，牛至苷凝膠可使皮膚變明亮且可抑制紅斑和黑色素的生成。因此牛至苷可作為皮膚美白化妝產品之新原料。

實施例5　牛至苷之抗氧化能力評估 DPPH自由基清除效力測定

將配製成不同濃度之萃取液樣品，依序加入0.01M磷酸鈉緩衝溶液(pH 7.4、0.15M NaCl)及500μl新鮮配置的250μM DPPH乙醇溶液，震盪後於暗室靜置20分鐘，以分光光度計檢測517nm之吸光值。當吸光值越低表示樣品清除DPPH自由基的能力越強，以[1-(樣品於517nm之吸光值/未添加樣品之控制組於517nm之吸光值)]×100%得到清除效應百分率(scavenging effects%)。

ABTS自由基清除效力測定

取不同濃度之萃取液樣品，依序加入0.01M磷酸鈉緩衝溶液(pH 7.4、0.15M NaCl)緩衝溶液及500μl 0.175mM ABTS溶液，震盪後於暗室靜置10分鐘，以分光光度計檢測734nm之吸光值。當吸光值越表示樣品清除ABTS自由基的能力越強，以[1-(樣品於734nm之吸光值/未添加樣品之控制組於734nm之吸光值)]×100%得到清除效應百分率(Scavenging effects%)。另以不同濃度的水溶性维生素E(trolox)清除ABTS陽離子自由基的能力作為標準曲線。

DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl)為一種最簡易之抗自由基方法測試，主要利用DPPH化合物在乙醇溶液中能自行產生穩定之自由基，並呈現紫色反應。當DPPH自由基接收電子形成電子對時，其於517nm之吸收波峰將會降低或消失。故藉由測定517nm的吸收值之變化來判定樣品是否具有提供氫原子以清除自由基的能力。ABTS與過硫酸鉀(potassium persulfate,K₂ S₂ O₈ )產生氧化反應，形成安定的藍綠色水溶性‧ABTS⁺ 陽離子自由基。‧ABTS⁺ 在415nm、645nm、734nm及815nm有吸光帶，但當‧ABTS⁺ 被抗氧化劑還原，或與另一個自由基結合時，吸光值會降低或消失，故可利用此一特性來測試樣品提供氫質子以清除自由基之能力，因此當吸光值越低時，表示樣品對‧ABTS⁺ 自由基之清除能力越強。加入不同濃度的牛至苷後(1、5、10、15、20和100μg/ml)測試其抗氧化能力。結果顯示，牛至苷在DPPH試驗中高濃度100μg/ml下達到76.87%的抑制率，在ABTS陽離子清除自由基試驗中，高達了98%的抑制率，如圖5和6所示。

抑制脂質過氧化能力的測定

為測試樣品對脂質過氧化的影響，以微脂粒做為模擬體內細胞膜的不飽和脂肪酸，添加的維他命C可將鐵離子(Fe³⁺ )還原成亞鐵離子(Fe²⁺ )，催化微脂粒產生脂質過氧化，在高溫下硫巴比妥酸(TBA)會和脂質氧化後的產物丙二醛(MDA)反應形成粉紅色的硫巴比妥酸反應物質(TBARS)，於532nm測得的吸光值可知過氧化情形。

取10mM的微脂粒懸浮液1.6μl和0.55μl的10mM硫酸亞鐵、0.55μl的10mM的維他命C、75.75μl的緩衝溶液和1.25μl不同濃度的化合物分別混合均勻，於37℃下反應一個小時，再加入40μl的硫巴比妥酸試劑和5.4μl的0.1M二胺次乙基四醋酸，在100℃加熱反應20分鐘後，冷卻靜置，以12000rpm離心10分鐘，取100μl上清液於532nm測丙二醛含量。

牛至苷對微脂粒脂質過氧化的抑制能力結果如圖7所示，可知牛至苷的抑制能力會隨著濃度的增加而增加，在最高濃度100μg/ml下，牛至苷的抑制率為61.4%，優於維他命C 49.5%的抑制率。由以上結果可知，牛至苷對於亞鐵離子/維他命C引起的脂質過氧化有抑制效果，而具有保護細胞膜的作用。

細胞內活性氧(reactive oxygen species，簡稱ROS)的含量試驗

利用老鼠肝細胞株(BNLCL2)加入1μl牛至苷作用72小時後，以PBS清洗，加入新鮮的培養液(DMEM)，再加入1μl 0.1mM的過氧化氫0.1mM，作用一小時後，移除培養液，PBS清洗過，再加入新鮮培養液，加1μl 10μM DCFH-DA(2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate)於37℃下作用一小時後，移除培養液，加入定量PBS，測螢光值。

當細胞受到過氧化氫作用時，會經過一連串的反應產生活性氧，利用DCFH-DA對細胞進行染色，再用流式細胞儀偵測所發散的螢光即可得知活性氧數量。實驗結果得知，經過牛至苷作用的老鼠正常肝細胞和維他命，熊果素兩種已熟知的抗氧化劑相比較，牛至苷比兩種抗氧化劑，更能保護細胞免於活性氧的攻擊(如圖8)。

硫巴比妥酸反應物質試驗

硫巴比妥酸反應物質是活性氧破壞細胞膜脂質引發脂質過氧化作用的產物，為一重要的氧化傷害指標。當自由基攻擊細胞膜上的磷脂質，因磷脂質含有大量的不飽和脂肪酸，而引起脂質過氧化反應，產物為丙二醛。其在酸性環境下和兩分子的丙二醛會結合生成粉紅色物質(TBA-MDA)，於532nm有最大吸收波，藉此特性可知樣品是否有抑制丙二醛生成的效果。

取5μl組織液和10μl不同濃度的牛至苷分別混合均勻後，依序加入5μl的100μM的硫酸亞鐵和0.1mM的維他命C。在37℃培養箱裡靜置一個小時後，加入25μl的28%三氯醋酸(trichloroacetic acid，簡稱TCA)和19μl 1%的硫巴比妥酸，經過80℃的水浴20分鐘，14000轉離心10分鐘後，以分光光度計檢測其532nm的吸光值。

以20和100μg/ml濃度的牛至苷，觀察其抑制老鼠肝臟及腦組織組織中之丙二醛含量，評估其抑制組織脂質過氧化之影響情形，結果如圖9，經過牛至苷處理過的肝組織液，其抑制丙二醛生成達40.2到67.9%；而經過牛至苷處理過的腦組織液，其抑制丙二醛生成達66.9到83.4%，尤其是牛至苷抑制腦組織液丙二醛生成作用比水溶性维生素E(trolox)之作用(抑制49.3到64.0%)好。以上結果表示，牛至苷能有效抑制脂質過氧化。

統計分析

實驗結果以平均值±標準偏差來表示。成對樣本及非成對樣本在統計學上的明顯差異分別以獨立及成對學生氏t檢定(independent and paired Student’st -test)來決定。當控制組和超過一個以上的實驗組相比較時，使用單因素方差或雙向方差重複測量。無論何時，ANOVA數據出現差異時，便執行丹內特檢定(Dunnett’s test)或學生-紐曼-柯爾檢定(Student-Newman-Keuls test)。使用統計繪圖軟體(SigmaPlot software,Version 8.0,San Rafael,CA,USA)進行數據分析和圖像表示。

越來越多的研究顯是抗氧化是抗老化的重要步驟，如果能夠消除過多的氧化自由基，對於許多自由基引起或是老化的相關疾病都能預防。經過以上實驗，牛至苷在ABTS和DPPH清除自由基能力上皆有不錯的效果，尤其是硫巴比妥酸反應物質試驗中，對於腦組織液中產生的丙二醛有高抑制率。在體內活性氧試驗，可以得知，牛至苷更具有保護細胞的能力。這些實驗，證明了牛至苷有抗氧化的能力，未來可以發展成為天然抗氧化保養品或保健食品。

一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之細胞、動物及其製造程序與方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。

本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。

說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。

在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

圖1、牛至苷的結構(C21H24O10)，分子量為436。

圖2、B16和Hs68細胞經過牛至苷處理後的細胞存活度。利用MTT試驗測試，經牛至苷處理72小時後B16和Hs68細胞之細胞存活度。

圖3、以濃度10和20μg/ml的牛至苷、熊果素和維他命C作用於B16細胞72小時後，抑制細胞內酪胺酸酶(A)和MBTH活性(B)的能力。

圖4、經牛至苷作用於B16細胞後，MC1R、MITF、酪胺酸酶、TRP-2和TRP-1的蛋白質表現。以濃度20μg/ml的牛至苷作用於B16細胞72小時後，以PBS清洗細胞，再用4%三聚甲醛固定。細胞核染色使用螢光染劑赫斯特33342(Hoechst 33342)(藍色)和使用結合特定蛋白的螢光標定FITC(綠色)。(A)MC1R、MITF、酪胺酸酶、TRP-2和TRP-1的蛋白質表現，利用免疫螢光定量分析。(B)於螢光顯微鏡(200×)下觀察MC1R、MITF、酪胺酸酶、TRP-2和TRP-1的蛋白質表現量。(C)透過流式細胞儀分析MITF、酪胺酸酶和T肝-2的蛋白質表現量。

圖5、牛至苷之DPPH自由基清除能力。

圖6、牛至苷之ABTS清除自由基試驗。

圖7、牛至苷對微脂粒的抑制脂質過氧化能力。。

圖8、經牛至苷作用過後的細胞內活性氧(ROSs)的含量。

圖9、牛至苷對老鼠肝組織和腦組織中，抑制脂質過氧化的能力。

附件1為圖4B之彩色示意圖。

Claims (16)

1. 一種具下式之化合物 其中R₁ 係羥基或C_1-6 烷氧基；R₂ 係羥基或C_1-6 烷氧基；但R₁ 、R₂ 不同時為羥基。
2. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中R₁ 係羥基。
3. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中R₂ 係甲氧基。
4. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其係
5. 一種組合物，其包含具下式之化合物 其中R₁ 係羥基或C_1-6 烷氧基；R₂ 係羥基或C_1-6 烷氧基；但R₁ 、R₂ 不同時為羥基。
6. 根據申請專利範圍第5項之組合物，其中化合物係
7. 根據申請專利範圍第5項之組合物，其具有美白與抗氧化能力。
8. 根據申請專利範圍第7項之組合物，其可應用於美白或抗老化個體皮膚。
9. 根據申請專利範圍第8項之組合物，其中該個體係哺乳類動物。
10. 根據申請專利範圍第7項之組合物，其可作為化妝品、保養品或保健食品之原料。
11. 根據申請專利範圍第7項之組合物，其具有抑制黑色素生成之能力。
12. 根據申請專利範圍第11項之組合物，其係抑制小眼畸形相關轉錄因子(MITF)、酪胺酸酶或酪胺酸相關蛋白-2(TRP-2)之蛋白質表現。
13. 根據申請專利範圍第7項之組合物，其具有清除自由基之能力。
14. 根據申請專利範圍第13項之組合物，其中該自由基為DPPH自由基及ABTS自由基。
15. 根據申請專利範圍第7項之組合物，其係降低細胞內活性氧(ROSs)之含量。
16. 根據申請專利範圍第7項之組合物，其具有抑制脂質過氧化之能力。