TWI381053B - 鑑定登革病毒之專一性引子組、寡核苷酸探針、生物晶片及其鑑定方法 - Google Patents

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Description

鑑定登革病毒之專一性引子組、寡核苷酸探針、生物晶片及其鑑定方法
本發明是有關於一種鑑定登革病毒的方法，且特別是有關於一種鑑定登革病毒及其血清型的專一性引子組、寡核酸探針、生物晶片及其鑑定方法。
登革熱(dengue fever)與登革出血熱(dengue hemorrhagical fever)近年的發生有日益嚴重的趨勢，WHO估計全世界每年約有五千萬人感染登革熱，因此被視為新興傳染病中極重要的「節肢動物攜帶病毒(arbovirus)」傳染病。由於登革熱疫情發生往往會在很短的時間迅速爆發流行，且登革熱患者的病毒血症期(viremia phase)有可能只出現2-3天時間，因此臨床上如何立即、正確診斷為登革病毒感染，成為流行性傳染病防疫工作中非常重要的課題。
登革病毒根據抗原性不同，可分為Dengue 1、Dengue 2、Dengue 3、Dengue 4四個血清型。診斷登革熱的方法大致可分病毒分離及血清檢驗二種方法，病毒分離方面，以發病五日內之血清做病毒分離，分離率較高，若超過此期限，由於抗體出現病毒消失，分離不易，此法約需時二週左右；在血清診斷方面，可採病患之急性期及恢復期之血清，藉血球凝集抑制試驗、補體結合試驗及中和試驗測定抗體力價是否有意義上升，然而此種方法不但耗時，更 常因血清採取的時機不適當而影響到結果的判斷。
目前較快速的登革熱診斷方法，已開發出如血清抗體酵素連結免疫分析法(ELISA)、反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)分析或即時RT-PCR(real-time PCR)分析，適用於早期診斷且準確度高，可檢出登革病毒基因，對於登革熱流行區之檢驗助益甚大，但受限於試劑、設備、人員操作技術等因素的影響，不易普及。
由於登革熱疫情防治之黃金時期為第一個病例發病後一星期內，因此需要發展更精確、快速、方便操作的診斷技術。此外，平時能快速、正確的檢測田間病媒蚊攜帶病毒率，亦可以作為提供疫情預警制度的重要參考。
因此本發明就是在提供一種鑑定登革病毒與其血清型之專一性引子(primer)組、寡核苷酸探針(probe)及其使用方法，解決傳統登革病毒血清診斷方法耗時且準確度不足的的問題。
本發明另一方面是在提供一種鑑定登革病毒及其血清型之生物晶片及其使用方法，用以快速鑑定不同血清型之登革病毒。
根據本發明，提出一種鑑定登革病毒之專一性引子對，包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示之核苷酸序列、其互補股之核 苷酸序列、簡併序列及其衍生序列。
根據本發明，提出一種鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針及其使用方法，鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示之核苷酸序列、其互補股之核苷酸序列、簡併序列及其衍生序列。
根據本發明，提出一種鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針及其使用方法，鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24所示之核苷酸序列、其互補股之核苷酸序列、簡併序列及其衍生序列。
根據本發明，提出一種鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針及其使用方法，鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32所示之核苷酸序列、其互補股之核苷酸序列、簡併序列及其衍生序列。
根據本發明，提出一種鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針及其使用方法，鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40所示之核苷酸序列、其 互補股之核苷酸序列、簡併序列及其衍生序列。
應用上述SEQ ID NO：9~40之寡核苷酸探針鑑定登革病毒之方法包含：以登革病毒、登革熱病毒血症患者血液或病媒蚊體萃取之RNA，進行反轉錄合成cDNA，再與上述SEQ ID NO：9~40之寡核苷酸探針進行雜合反應，並由雜合反應之結果鑑定登革病毒之及其血清型。
根據本發明，提出一種快速鑑定登革熱病毒之生物晶片及其使用方法，鑑定登革病毒之生物晶片包含一基材，基材上可固著選自於SEQ ID NO：9~40所示之核苷酸序列、其互補股之核苷酸序列、簡併序列、其衍生序列及上述序列之任意組合所組成之族群。
應用上述生物晶片鑑定登革病毒之方法包含：以登革病毒、登革熱病毒血症患者血液或感染登革病毒之病媒蚊體萃取之RNA，進行反轉錄合成cDNA，再與上述SEQ ID NO：9~40之寡核苷酸探針進行雜合反應，並由雜合反應之結果鑑定登革病毒及其血清型。
本發明之鑑定登革病毒之方法的適用範圍包括登革病毒血清型核酸鑑別、病毒血症患者血液中登革病毒及其血清型檢驗、病媒蚊體登革病毒及其血清型檢驗、細胞培養登革病毒及其血清型檢驗、流行病學調查的快速檢測，並適用於各種學術研究單位、疾病管制單位、各型醫院及檢驗中心等。
根據上述，可知本發明之鑑定登革病毒之方法可達到下列優點：
1.精確檢測：可以精確檢驗登革病毒，同時區分出不同血清型。
2.靈敏檢測：微量病毒即可檢測，靈敏度與反轉錄聚合酶連鎖反應完全一致。
3.快速檢測：自抽取病毒RNA起，僅需三個半小時，即可獲得具體結果。
4.操作方便：抽取檢體病毒RNA、反轉錄聚合酶連鎖反應等核酸操作與放大作用均在同一個試管中完成。
5.放大的核酸片段只要於晶片上進行雜合作用，即可目視獲知結果，節省進行膠體電泳分析與染色的的麻煩。
6.經濟：僅需要一台聚合酶連鎖反應儀、及一台雜交烘箱設備即可完成操作，設備成本低廉。
登革病毒屬於單股正股RNA病毒，核酸長度約11 kb左右，不同血清型間其序列某些片段變異度頗大，欲選取作為鑑定片段極需考量其演化變異度。因此，利用美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)之基因資料庫，並以台灣周邊國家疫區為基礎，收集四種血清型登革病毒序列，再利用軟體Vector NTI® 7.0(InforMax Inc.,USA)比對類源關係後，選取共同保守區較高的區域，包括外殼蛋白(Capsid)基因片段、外套膜蛋白(Envelope)基因片段、非結構蛋白基因片段1(Non-structure protein fragment 1，NS1)和非 結構蛋白基因片段3(Non-structure protein fragment 3，NS3)等序列設計登革病毒專一性引子組，並選取四型病毒之間變異較明顯的區域做為設計寡核苷酸探針之對象。再利用原型(Prototype)的第一型登革病毒(Dengue 1 virus)、第二型登革病毒(Dengue 2 virus)、第三型登革病毒(Dengue 3 virus)及第四型登革病毒(Dengue 4 virus)等不同血清型的登革病毒進行增幅驗證。
依照本發明之實施例，首先利用上述四種血清型登革病毒之外殼蛋白基因、外套膜蛋白基因、非結構蛋白基因片段1(NS1)和非結構蛋白基因片段3(NS3)等四個片段設計專一性引子組，包含第一引子組(SEQ ID NO：1、2)、第二引子組(SEQ ID NO：3、4)、第三引子組(SEQ ID NO：5、6)及第四引子組(SEQ ID NO：7、8)。
請參照第1圖，為本發明之專一性引子組分別應用於四種血清型登革病毒進行增幅之電泳圖。
第1圖之(A)為第一引子組與四種血清型登革病毒進行增幅之電泳圖。第一引子組(SEQ ID NO：1、2)為利用四種血清型登革病毒外殼蛋白基因的共同保守區所設計出的專一性引子組，可分別在四種血清型登革病毒樣本中增幅出652鹼基對(bp)大小的片段。第1圖(A)中，”M”為分子量標記，樣本1、2、3、4分別為利用第一引子組增幅第一、二、三、四型登革病毒外殼蛋白基因之結果，樣本5為空白對照組，用以確定PCR反應無誤。
由第1圖之(A)可看到第一引子組(SEQ ID NO：1、2) 可分別在第一、二、三、四型登革病毒樣本中增幅出約0.65 kb大小的片段。
第1圖之(B)為第二引子組與四種血清型登革病毒進行增幅之電泳圖。第二引子組(SEQ ID NO：3、4)為利用四種血清型登革病毒外套膜蛋白基因的共同保守區所設計出的專一性引子組，可分別在四種血清型登革病毒樣本中增幅出777鹼基對(bp)大小的片段。第1圖(B)中，”M”為分子量標記，樣本1、2、3、4分別為利用第二引子組增幅第一、二、三、四型登革病毒外套膜蛋白基因之結果，樣本5為空白對照組，用以確定PCR反應無誤。
由第1圖之(B)可看到第二引子組(SEQ ID NO：3、4)可分別在第一、二、三、四型登革病毒樣本中增幅出約0.8 kb大小的片段。
第1圖之(C)為第三引子組與四種血清型登革病毒進行增幅之電泳圖。第三引子組(SEQ ID NO：5、6)為利用四種血清型登革病毒非結構蛋白基因片段1(NS1)的共同保守區所設計出的專一性引子組，可分別在四種血清型登革病毒樣本中增幅出419鹼基對(bp)大小的片段。第1圖(C)中，”M”為分子量標記，樣本1、2、3、4分別為利用第三引子組增幅第一、二、三、四型登革病毒NS1基因之結果，樣本5為空白對照組，用以確定PCR反應無誤。
由第1圖之(C)可看到第三引子組(SEQ ID NO：5、6)可分別在第一、二、三、四型登革病毒樣本中增幅出約0.42 kb大小的片段。
第1圖之(D)為第四引子組與四種血清型登革病毒進行增幅之電泳圖。第四引子組(SEQ ID NO：7、8)為利用四種血清型登革病毒非結構蛋白基因片段3(NS3)的共同保守區所設計出的專一性引子組，可分別在四種血清型登革病毒樣本中增幅出637鹼基對(bp)大小的片段。
第1圖(D)中，”M”為分子量標記，樣本1、2、3、4分別為利用第三引子組增幅第一、二、三、四型登革病毒NS3基因之結果，樣本5為空白對照組，用以確定PCR反應無誤。
由第1圖之(D)可看到第三引子組(SEQ ID NO：7、8)可分別在第一、二、三、四型登革病毒樣本中增幅出約0.65 kb大小的片段。
接著可利用專一性引子組所增幅出之外殼蛋白基因、外套膜蛋白基因、非結構蛋白基因片段1(NS1)和非結構蛋白基因片段3(NS3)片段，在四種血清型病毒之間變異較明顯的區域設計專一性寡核苷酸探針，並進行探針之專一性測試之後，得到具有血清型專一性鑑別度之寡核苷酸探針，其序列分別編號為SEQ ID NO：9~40。其中編號SEQ ID NO：9~10之寡核苷酸探針係利用第一型登革病毒之外殼蛋白基因片段序列設計，可用以鑑定第一型登革病毒。第一型登革病毒之外殼蛋白基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：41。編號SEQ ID NO：11~12之寡核苷酸探針係利用第一型登革病毒之外套膜蛋白基因片段序列設計，可用以鑑定第一型登革病毒。第一 型登革病毒之外套膜蛋白基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：42。編號SEQ ID NO：13~14之寡核苷酸探針係利用第一型登革病毒之非結構蛋白基因片段1(NS1)序列設計，可用以鑑定第一型登革病毒。第一型登革病毒之NS1基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：43。編號SEQ ID NO：15~16之寡核苷酸探針係利用第一型登革病毒之非結構蛋白基因片段3(NS3)序列設計，可用以鑑定第一型登革病毒。第一型登革病毒之NS3基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：44。
應說明的是，分別利用SEQ ID NO：41~44之全部序列、部分序列或衍生序列所製成之引子或寡核苷酸探針均可用以鑑定第一型登革病毒。其中衍生序列所製成之引子或寡核苷酸探針係指一引子或寡核苷酸探針包含一段預定序列，此預定序列包含全部或部分SEQ ID NO：41~44序列的寡核苷酸片段，預定序列含有至少16鹼基(mer)的序列與SEQ ID NO：41~44的序列相同。
編號SEQ ID NO：17~18之寡核苷酸探針係利用第二型登革病毒之外殼蛋白基因片段序列設計，可用以鑑定第二型登革病毒。第二型登革病毒之外殼蛋白基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：45。編號SEQ ID NO：19~20之寡核苷酸探針係利用第二型登革病毒之外套膜蛋白基因片段序列設計，可用以鑑定第二型登革病毒。第二型登革病毒之外套膜蛋白基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：46。編號SEQ ID NO：21~22之寡核苷酸 探針係利用第二型登革病毒之非結構蛋白基因片段1(NS1)序列設計，可用以鑑定第二型登革病毒。第二型登革病毒之NS1基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：47。編號SEQ ID NO：23~24之寡核苷酸探針係利用第二型登革病毒之非結構蛋白基因片段3(NS3)序列設計，可用以鑑定第二型登革病毒。第二型登革病毒之NS3基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：48。
分別利用SEQ ID NO：45~48之全部序列、部分序列或衍生序列所製成之引子或寡核苷酸探針均可用以鑑定第二型登革病毒。其中衍生序列所製成之引子或寡核苷酸探針係指一引子或寡核苷酸探針包含一段預定序列，此預定序列包含全部或部分SEQ ID NO：45~48序列的寡核苷酸片段，預定序列含有至少16鹼基(mer)的序列與SEQ ID NO：45~48的序列相同。
編號SEQ ID NO：25~26之寡核苷酸探針係利用第三型登革病毒之外殼蛋白基因片段序列設計，可用以鑑定第三型登革病毒。第三型登革病毒之外殼蛋白基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：49。編號SEQ ID NO：27~28之寡核苷酸探針係利用第三型登革病毒之外套膜蛋白基因片段序列設計，可用以鑑定第三型登革病毒。第三型登革病毒之外套膜蛋白基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：50。編號SEQ ID NO：29~30之寡核苷酸探針係利用第三型登革病毒之非結構蛋白基因片段1(NS1)序列設計，可用以鑑定第三型登革病毒。第三型 登革病毒之NS1基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：51。編號SEQ ID NO：31~32之寡核苷酸探針係利用第三型登革病毒之非結構蛋白基因片段3(NS3)序列設計，可用以鑑定第三型登革病毒。第三型登革病毒之NS3基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：52。
分別利用SEQ ID NO：49~52之全部序列、部分序列或衍生序列所製成之引子或寡核苷酸探針均可用以鑑定第三型登革病毒。其中衍生序列所製成之引子或寡核苷酸探針係指一引子或寡核苷酸探針包含一段預定序列，此預定序列包含全部或部分SEQ ID NO：49~52序列的寡核苷酸片段，預定序列含有至少16鹼基(mer)的序列與SEQ ID NO：49~52的序列相同。
編號SEQ ID NO：33~34之寡核苷酸探針係利用第四型登革病毒之外殼蛋白基因片段序列設計，可用以鑑定第四型登革病毒。第四型登革病毒之外殼蛋白基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：53。編號SEQ ID NO：35~36之寡核苷酸探針係利用第四型登革病毒之外套膜蛋白基因片段序列設計，可用以鑑定第四型登革病毒。第四型登革病毒之外套膜蛋白基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：54。編號SEQ ID NO：37~38之寡核苷酸探針係利用第四型登革病毒之非結構蛋白基因片段1(NS1)序列設計，可用以鑑定第四型登革病毒。第四型登革病毒之NS1基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：55。編號SEQ ID NO：39~40之寡核苷酸探針係利用 第四型登革病毒之非結構蛋白基因片段3(NS3)序列設計，可用以鑑定第四型登革病毒。第四型登革病毒之NS3基因片段序列參見序列識別號碼SEQ ID NO：56。
分別利用SEQ ID NO：53~56之全部序列、部分序列或衍生序列所製成之引子或寡核苷酸探針均可用以鑑定第四型登革病毒。其中衍生序列所製成之引子或寡核苷酸探針係指一引子或寡核苷酸探針包含一段預定序列，此預定序列包含全部或部分SEQ ID NO：53~56序列的寡核苷酸片段，預定序列含有至少16鹼基(mer)的序列與SEQ ID NO：53~56的序列相同。
將上述之具有血清型專一性鑑別度之寡核苷酸探針(SEQ ID NO：9~40)或上述之預定序列製成生物晶片，可快速鑑定不同血清型的登革病毒。用以鑑定登革熱病毒之生物晶片包含基材及固著於基材上之寡核苷酸探針，其中基材之材質可包含尼龍膜、高分子材料、矽片或玻璃。
生物晶片之製作方法包含分別將30微莫耳濃度(μM)之合成專一性寡核苷酸探針溶液分別加入孔盤中，再用點片機點在設定的位置，置於45℃烘烤1-2分鐘，最後再以紫外線交聯器(UV cross linker)於0.8焦爾，6分鐘的條件下將寡核苷酸探針固定在晶片上。
請參照第2圖，為本發明實施例之生物晶片的寡核苷酸探針施佈示意圖。其中，每一點上所標示之數字代表序列識別編號之數字，數字1~8代表序列為SEQ ID NO：9~16之寡核苷酸探針，可與含有第一型登革病毒的去氧核 醣核酸樣品產生專一性雜合，而在晶片相對應之位置呈色。標示數字9~16之點代表序列為SEQ ID NO：17~24之寡核苷酸探針，可與含有第二型登革病毒的去氧核醣核酸樣品產生專一性雜合。標示數字為17~24之點代表序列分別為SEQ ID NO：25~32之寡核苷酸探針，可與含有第三型登革病毒的去氧核醣核酸樣品產生專一性雜合。標示數字為25~32之點代表序列分別為SEQ ID NO：33~40之寡核苷酸探針，可與含有第四型登革病毒序列的去氧核醣核酸樣品產生專一性雜合。英文字母”PC”代表陽性控制組(positive control)，為不同血清型的登革病毒之高度保留區的DNA片段(5'-ATGGGWGARGCAGCHGSDATYTTCATGA C-3')，用以確認樣本萃取及反轉錄聚合酶連鎖反應無誤，字母”C”則代表控制組，用以確認雜合反應無誤。
請參照第3圖，為利用本發明之生物晶片鑑定登革病毒的方法流程圖，包含：(a)萃取待測樣本之總核醣核酸(total RNA)，其中待測樣本total RNA之來源可為登革病毒、登革病毒病毒血症患者血液或病媒蚊體；(b)進行反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)，反轉錄total RNA並增幅互補去氧核醣核酸(cDNA)。其中，RT-PCR係採取多目標PCR(Multiplex-PCR)模式，加入四組PCR引子對混合在一起使用； (c)使用本發明之生物晶片與增幅之cDNA片段進行雜合反應；以及(d)鑑定步驟(c)之雜合反應結果，依照色斑之有無鑑定登革病毒之血清型。
依照本發明之實施例，萃取待測樣本之total RNA的方法包含利用QIAamp viral RNA kit(QIAGEN,CA USA)，並根據其說明書進行萃取。
將萃取的total RNA反轉錄合成cDNA的方法係利用SuperScript one-step RT-PCR kit(Invitrogen,Carlsbad,CA USA)並依其步驟進行反應。利用多目標PCR模式，將四組專一性引子組，包括第一引子組(SEQ ID NO：1、2)、第二引子組(SEQ ID NO：3、4)、第三引子組(SEQ ID NO：5、6)及第四引子組(SEQ ID NO：7、8)混合在一起使用，並分別以不同血清型登革病毒萃取的total RNA來增幅cDNA。聚合酶連鎖反應係以聚合酶連鎖反應儀進行，利用具有生物素(Biotin)標定的引子進行聚合酶連鎖反應，可得到具有生物素標定的cDNA片段，即為雜合反應之標的(target)。反應後之產物可進行雜合反應。
將生物素標定的target片段與如第2圖所示之本發明的生物晶片上之寡核苷酸探針進行雜合。依照本發明之實施例，進行雜合反應之方法包含在晶片每一反應槽先加入200微升(μl)雜合反應液，再加入適量經94℃ 5分鐘加熱變性之生物素標定的target片段與之混合，置於43℃環境下1小時，以進行雜合反應。之後以200 μl的緩衝清洗液 (washing buffer)分別清洗3次，洗去未雜合的target片段，再加入200 μl的阻斷劑(blocking reagent；含有0.2 μl streptavidin conjugated alkaline phosphatase,Strep-AP)反應30分鐘，再以200 μl緩衝清洗液清洗3次，加入200 μl顯色劑(4 μl NBT/BCIP與196 μl detection buffer)於晶片反應槽中，置於暗室反應5分鐘，隨即呈色。反應後以清水清洗並烘乾，以出現色斑的有無判定登革病毒的種類。
請參照第4圖，為利用第一型登革病毒之cDNA樣本測試本發明之生物晶片之探針的專一性結果。對照第2圖之寡核苷酸探針施佈示意圖，以第一型登革病毒之cDNA樣本與本發明之生物晶片上之寡核苷酸探針雜合的結果顯示，試驗組只有第1~8號的點有呈色，陽性控制組(PC)及控制組(C)亦有呈色，故可確認RNA萃取、RT-PCR反應及雜合反應均無誤。其中，1~8點代表序列為SEQ ID NO：9~16之寡核苷酸探針，因此SEQ ID NO：9~16之寡核苷酸探針可與含有第一型登革病毒之樣品產生專一性雜合，可用以準確鑑定第一型登革病毒。
請參照第5圖，為利用第二型登革病毒之cDNA樣本測試本發明之生物晶片之探針的專一性結果。對照第2圖之寡核苷酸探針施佈示意圖，以第二型登革病毒之cDNA樣本與本發明之生物晶片上之寡核苷酸探針雜合的結果顯示，試驗組只有第9~16號的點有呈色，陽性控制組(PC)及控制組(C)亦有呈色，故可確認RNA萃取、RT-PCR反應及雜合反應均無誤。其中，9~16點代表序列為SEQ ID NO：17~24之寡核苷酸探針，因此SEQ ID NO：17~24之寡核苷酸探針可與含有第二型登革病毒之樣品產生專一性雜合，可用以準確鑑定第二型登革病毒。
請參照第6圖，為利用第三型登革病毒之cDNA樣本測試本發明之生物晶片之探針的專一性結果。對照第2圖之寡核苷酸探針施佈示意圖，以第三型登革病毒之cDNA樣本與本發明之生物晶片上之寡核苷酸探針雜合的結果顯示，試驗組只有第17~24號的點有呈色，陽性控制組(PC)及控制組(C)亦有呈色，故可確認RNA萃取、RT-PCR反應及雜合反應均無誤。其中，17~24點代表序列為SEQ ID NO：25~32之寡核苷酸探針，因此SEQ ID NO：25~32之寡核苷酸探針可與含有第三型登革病毒之樣品產生專一性雜合，可用以準確鑑定第三型登革病毒。
請參照第7圖，為利用第四型登革病毒之cDNA樣本測試本發明之生物晶片之探針的專一性結果。對照第2圖之寡核苷酸探針施佈示意圖，以第四型登革病毒之cDNA樣本與本發明之生物晶片上之寡核苷酸探針雜合的結果顯示，試驗組只有第25~32號的點有呈色，陽性控制組(PC)及控制組(C)亦有呈色，故可確認RNA萃取、RT-PCR反應及雜合反應均無誤。其中，25~32點代表序列為SEQ ID NO：33~40之寡核苷酸探針，因此SEQ ID NO：33~40之寡核苷酸探針可與含有第四型登革病毒之樣品產生專一性雜合，可用以準確鑑定第四型登革病毒。
依照本發明之實施例，本發明之生物晶片可包含上述 SEQ ID NO：9~40所示之核苷酸序列、其互補股之核苷酸序列、簡併序列及其衍生序列。此處所指之衍生序列係於序列SEQ ID NO：9~40之3'端或5'端修飾核苷酸序列，使其仍和原序列具有70%以上相似性之寡核苷酸序列。
雖然本發明已以數實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：
第1圖為本發明之專一性引子組分別應用於四種血清型登革病毒進行增幅之電泳圖。
第2圖為本發明之生物晶片的寡核苷酸探針施佈示意圖。
第3圖係繪示依照本發明實施例的一種以生物晶片鑑定登革病毒的方法流程圖。
第4圖為利用第一型登革病毒之cDNA樣本測試本發明之生物晶片之探針的專一性結果。
第5圖為利用第二型登革病毒之cDNA樣本測試本發明之生物晶片之探針的專一性結果。
第6圖為利用第三型登革病毒之cDNA樣本測試本發 明之生物晶片之探針的專一性結果。
第7圖為利用第四型登革病毒之cDNA樣本測試本發明之生物晶片之探針的專一性結果。
<110> 國立中興大學
<120> 鑑定登革病毒之專一性引子組、寡核苷酸探針、生物晶片及其鑑定方法
<160> 56
<210> SEQ ID NO：1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> Primer bind
<223> 登革病毒之外殼蛋白基因引子
<400> 1
<210> SEQ ID NO：2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> Primer bind
<223> 登革病毒之外殼蛋白基因引子
<400> 2
<210> SEQ ID NO：3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> Primer bind
<223> 登革病毒之外套膜蛋白基因引子
<400> 3
<210> SEQ ID NO：4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> Primer bind
<223> 登革病毒之外套膜蛋白基因引子
<400> 4
<210> SEQ ID NO：5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> Primer bind
<223> 登革病毒之非結構蛋白基因1(NS1)引子
<400> 5
<210> SEQ ID NO：6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> Primer bind
<223> 登革病毒之非結構蛋白基因1(NS1)引子
<400> 6
<210> SEQ ID NO：7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> Primer bind
<223> 登革病毒之非結構蛋白基因3(NS3)引子
<400> 7
<210> SEQ ID NO：8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> Primer bind
<223> 登革病毒之非結構蛋白基因3(NS3)引子
<400> 8
<210> SEQ ID NO：9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 9
<210> SEQ ID NO：10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 10
<210> SEQ ID NO：11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 11
<210> SEQ ID NO：12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 12
<210> SEQ ID NO：13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 13
<210> SEQ ID NO：14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 14
<210> SEQ ID NO：15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 15
<210> SEQ ID NO：16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第一型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 16
<210> SEQ ID NO：17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 17
<210> SEQ ID NO：18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 18
<210> SEQ ID NO：19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 19
<210> SEQ ID NO：20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 20
<210> SEQ ID NO：21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 21
<210> SEQ ID NO：22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 22
<210> SEQ ID NO：23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 23
<210> SEQ ID NO：24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第二型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 24
<210> SEQ ID NO：25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 25
<210> SEQ ID NO：26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 26
<210> SEQ ID NO：27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 27
<210> SEQ ID NO：28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 28
<210> SEQ ID NO：29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 29
<210> SEQ ID NO：30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 30
<210> SEQ ID NO：31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 31
<210> SEQ ID NO：32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第三型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 32
<210> SEQ ID NO：33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 33
<210> SEQ ID NO：34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 34
<210> SEQ ID NO：35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 35
<210> SEQ ID NO：36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 36
<210> SEQ ID NO：37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 37
<210> SEQ ID NO：38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 38
<210> SEQ ID NO：39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 39
<210> SEQ ID NO：40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鑑定第四型登革病毒之寡核苷酸探針
<400> 40
<210> SEQ ID NO：41
<211> 652
<212> DNA
<213> Dengue 1 virus
<220> capsid sequence
<223> 鑑定第一型登革病毒之特徵區域
<400> 41
<210> SEQ ID NO：42
<211> 777
<212> DNA
<213> Dengue 1 virus
<220> envelope sequence
<223> 鑑定第一型登革病毒之特徵區域
<400> 42
<210> SEQ ID NO：43
<211> 419
<212> DNA
<213> Dengue 1 virus
<220> non-structure protein 1 sequence
<223> 鑑定第一型登革病毒之特徵區域
<400> 43
<210> SEQ ID NO：44
<211> 637
<212> DNA
<213> Dengue 1 virus
<220> non-structure protein 3 sequence
<223> 鑑定第一型登革病毒之特徵區域
<400> 44
<210> SEQ ID NO：45
<211> 652
<212> DNA
<213> Dengue 2 virus
<220> capsid sequence
<223> 鑑定第二型登革病毒之特徵區域
<400> 45
<210> SEQ ID NO：46
<211> 777
<212> DNA
<213> Dengue2 virus
<220> envelope sequence
<223> 鑑定第二型登革病毒之特徵區域
<400> 46
<210> SEQ ID NO：47
<211> 419
<212> DNA
<213> Dengue 2 virus
<220> non-structure protein 1 sequence
<223> 鑑定第二型登革病毒之特徵區域
<400> 47
<210> SEQ ID NO：48
<211> 637
<212> DNA
<213> Dengue 2 virus
<220> non-structure protein 3 sequence
<223> 鑑定第二型登革病毒之特徵區域
<400> 48
<210> SEQ ID NO：49
<211> 652
<212> DNA
<213> Dengue 3 virus
<220> capsid sequence
<223> 鑑定第三型登革病毒之特徵區域
<400> 49
<210> SEQ ID NO：50
<211> 777
<212> DNA
<213> Dengue 3 virus
<220> envelope sequence
<223> 鑑定第三型登革病毒之特徵區域
<400> 50
<210> SEQ ID NO：51
<211> 419
<212> DNA
<213> Dengue 3 virus
<220> non-structure protein 1 sequence
<223> 鑑定第三型登革病毒之特徵區域
<400> 51
<210> SEQ ID NO：52
<211> 637
<212> DNA
<213> Dengue 3 virus
<220> non-structure protein 3 sequence
<223> 鑑定第三型登革病毒之特徵區域
<400> 52
<210> SEQ ID NO：53
<211> 652
<212> DNA
<213> Dengue 4 virus
<220> capsid sequence
<223> 鑑定第四型登革病毒之特徵區域
<400> 53
<210> SEQ ID NO：54
<211> 777
<212> DNA
<213> Dengue 4 virus
<220> envelope sequence
<223> 鑑定第四型登革病毒之特徵區域
<400> 54
<210> SEQ ID NO：55
<211> 419
<212> DNA
<213> Dengue 4 virus
<220> non-structure protein 1 sequence
<223> 鑑定第四型登革病毒之特徵區域
<400> 55
<210> SEQ ID NO：56
<211> 637
<212> DNA
<213> Dengue 4 virus
<220> non-structure protein 3 sequence
<223> 鑑定第四型登革病毒之特徵區域
<400> 56

Claims (14)

  1. 一種用於鑑定登革病毒之寡核苷酸探針，係包含SEQ ID NO：9~40所示之核苷酸序列。
  2. 一種鑑定登革病毒之方法，包含：(a)萃取待測樣本之總核醣核酸：(b)進行反轉錄聚合酶連鎖反應，反轉錄步驟(a)之產物並增幅出互補去氧核醣核酸；(c)使用具有標記分子標定之寡核苷酸探針與步驟(b)之產物進行雜合反應，其中該寡核苷酸探針係包含SEQ ID NO：9~40所示之核苷酸序列；(d)進行呈色反應，使用標記分子標記與該寡核苷酸探針雜合之該產物，以形成色斑；以及(e)鑑定步驟(c)之雜合反應結果，依照步驟(d)之該色斑之有無，以鑑定該待測樣本所含登革病毒之血清型。
  3. 如申請專利範圍第2項所述鑑定登革病毒之方法，其中該待測樣本總核醣核酸之來源可為登革病毒、登革熱病毒血症患者血液或病媒蚊體。
  4. 如申請專利範圍第2項所述鑑定登革病毒之方法，其中該反轉錄聚合酶連鎖反應係採取多目標PCR模式。
  5. 如申請專利範圍第4項所述鑑定登革病毒之方法，其中該多目標PCR所採用的專一性引子組包含第一引子組(SEQ ID NO：1、2)、第二引子組(SEQ ID NO：3、4)、第三引子組(SEQ ID NO：5、6)及第四引子組(SEQ ID NO：7、8)。
  6. 如申請專利範圍第2項所述鑑定登革病毒之方法，其中該標記分子標記為生物素(Biotin)。
  7. 一種用於鑑定登革病毒之生物晶片，包含一基材；以及一寡核苷酸探針，固著於該基材上，該寡核苷酸探針係包含SEQ ID NO：9~40所示之核苷酸序列。
  8. 如申請專利範圍第7項所述用於鑑定登革病毒之生物晶片，其中該基材之材質包含尼龍膜、高分子材料、矽片或玻璃。
  9. 一種利用申請專利範圍第7項所述之生物晶片鑑定登革病毒之方法，包含：(a)萃取待測樣本之總核醣核酸；(b)進行反轉錄聚合酶連鎖反應，反轉錄步驟(a)之產物並增幅出互補去氧核醣核酸； (c)使用申請專利範圍第7項所述之生物晶片與步驟(b)之產物進行雜合反應；(d)進行呈色反應，使用該標記分子標記與該寡核苷酸探針雜合之該產物，以形成色斑；以及(e)鑑定步驟(c)之雜合反應結果，依照步驟(d)之該色斑之有無，以鑑定該待測樣本所含登革病毒之血清型。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之生物晶片鑑定登革病毒之方法，其中步驟(c)之該待測樣本總核醣核酸之來源可為登革病毒、登革熱病毒血症患者血液或病媒蚊體。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之生物晶片鑑定登革病毒之方法，其中步驟(b)之該反轉錄聚合酶連鎖反應係採取多目標PCR模式。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之生物晶片鑑定登革病毒之方法，其中該多目標PCR所採用的專一性引子組包含第一引子組(SEQ ID NO：1、2)、第二引子組(SEQ ID NO：3、4)、第三引子組(SEQ ID NO：5、6)及第四引子組(SEQ ID NO：7、8)。
  13. 如申請專利範圍第9項所述之生物晶片鑑定登革病毒之方法，其中該標記分子為生物素(Biotin)。
  14. 一種登革病毒鑑定套組，包含至少一寡核苷酸探針，該至少一寡核苷酸探針係選自於由SEQ ID NO：9~40所示之核苷酸序列其互補股之核苷酸序列。
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