TWI376384B - - Google Patents

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1376384 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 /發珥是有關黃酮衍生物(.flav㈣dei：ivative雜為(腫瘤 壞死因子-α)拮抗劑或抑制劑之用途。 【先前技術】 類黃酮(Fl_n〇ids)是一組多酚系化合物，具有多種重要的生 物活性，例如抗發炎、抗肝毒、及抗潰瘍的作用，其亦可抑制諸 如路·糖還原Sf及貝β示呤氧化蜂(xanthine oxidase)等酶。它們是強 效抗氧化劑，具有清除自由基的能力。其中有許多具有抗過敏、 抗病毒作用，有的則可預防心企管方面的疾病。其已被證實可體 外抑制多種癌細胞系的生長’且可降低實驗動物體内的腫瘤發 展。（參考 Narayana 等人之 Indian Journal of Pharmacology 2001 ; 33:2-16) 〇 WO 01/64701(或對應之US 6,706,865)所揭示的類黃酮化合 物具有以下式(II)之化學結構

(其中R8為娜代或未經取代之苯基；R7為氫原子絲基；η為 1至4之整數），該化合物具有還原酶抑制效果、活性氧消除效果 (active oxygen extinguishing effect)、致癌作用促發抑制效果 (carcinogenesis promoti〇n inhibit〇ry 他岣、抗發炎效果等等。 落新婦抑stilbin)是-種以下式㈣所示之似观〇此化合物，

1376384 它是從Astilbe thunbergii Miq(其為虎耳草科之多年生草本植 物）的根部 '及從 Asmilaxylabra、黃妃屬（Engelhardtia)、

Lyoniaovalifolia、Engelhardtiachrysolepos、Chloranthus glarber、 落新婦(Astilbe)、microphylla等植物物質中單離出來的二氫黃酮 醇糖苷(dihydroflavonol glycoside)之一。據報導，落新婦苷具有一 些重要的生物活性，例如酸糖還原酶抑制效果、活性氧消除效果 (active oxygen extinguishing effect)、致癌作用促發抑制效果 (carcinogenesis promotion inhibitory effect)' 抗發炎效果 '等等（參 考曰本專利公開號97/30984、科/24785卜及舛/256194)，因此， 6 落新婦苷將會是作為抗過敏劑或抗癌劑的一種很有用的化合 物不過其抗發炎機制則尚未被找出來。到目前已知的一些發炎 調節劑中’ TNFa是最有效且已被定性的細胞活素之一，因此被選 用來在L929細胞增殖/細胞毒性分析試驗中測試黃酮衍生物是否 會抑制TNFa結合至TNFa_R1的作用。 TNFa在宿主防禦上佔有重要的地位，其使得對許多病原性微 生物和—些絲具有抵抗性。即使TNFa無疑具備妓的功能(主要 疋在系統性之翻）’其也可能導致病理縣；顶喊以低血壓及 多重器官衰竭為特徵之敗血性休克的發病機制中是重要角色； TNFa是癌症病患中以不正常體重下降為特徵之惡病質的主要調節 劑’ TNFa常在患有關節炎之病患的滑液(sy_ial _)中被檢測 到。TNFa可能在相當廣範圍之多種疾病中扮演重要角色，因此， 能與TNFa結合之化合物可能可以用來治療與挪咕^的多種疾 病或症狀，例如類風濕性關節炎、克隆氏症(Cr〇hn，s此·)、斑致 硬化症(plaque sclerosis)、敗血性休克、癌症、或與免疫缺乏有關之 惡病質。 【發明内容】 本發明人發現，式(I)之黃酮衍生物 (1) ο (其中“、^、^、{^與以各獨立為氫”鱼基或酯基:“為氫、 罗二基酉曰基、或〇~糖普基(O-glycoside group)[如0~氣李糖 (Orhamnose) 〇~葡萄糖苦(〇_giuc〇side)、〇_retin〇side 或 〇_木糖 苦(O-xyloside)];而二:為單鍵或雙鍵)或其藥學可接受鹽類可用於抑 制TNFa結合至TNF-R1或抑制xnFoc的釋出，因此可用作jnFcx 括抗劑或抑制.劑，以治療各種與孤仏有關的疾病或病症，如類風 濕性關節炎、克隆氏症、斑致硬化症、敗血性休克、癌症、或與免 疫缺乏有關縣病f。發明人魏，楊賴奸(myridtrin)、槲皮 皆(quercitrin)或樹皮酮-3-D-葡萄糖苷(qUercetin_3 D_gluc〇side)在 L929細胞增值/細胞毒性分析試驗中所呈現的抑制活性以IC5〇值表 示分別為116Ό3、160.77與95.74 μΜ而無細胞毒性。此外，在以 膠原引發Μ冑炎的動物模型巾，這些黃崎生物魏職抑制活 !·生。k些^贿生物是具有高纟響以抑糊或拮抗劑的可能來 源0 因此，本發方面是—種驗拮抗或抑制哺乳動物(包含 8 1376384

人類)TNFot之醫藥組成物，包括可有效拮抗或抑制之用量的 式⑴化合物或其藥學可接受鹽類以及藥學可接受載體。 本發明第二方面是一種用於治療哺乳動物(包含人類）中 拮抗劑或抑制劑所適應之疾病或病狀的藥學組成物，包括可有效 拮抗或抑制TNFa之用量的式①化合物或其藥學可接受鹽類及藥 學可接受載體。 本發明第三方面是-種用於拮抗或抑制哺乳動物（包含人 類)TNFoc之方法’包括對該哺乳動物投與可有效结抗或抑制聊^ 之用量的式(I)化合物或其藥學可接受鹽類。 本發明第四1面是-種用於治療哺乳動物(包含人類)中蕭α 拮抗劑或抑棚所適應之疾病或病狀的方法，包括_哺乳動物 投與可有效跋❹卩制TNFa之用量的_化合物錢藥學可接 受鹽類。 【實施方式】 式(I)化合物可藉口服、非經腸(例如皮下、靜脈内、肌 内、胸骨内、輸液等等方式）、經直腸、鼻内、局部或經皮 (例如經由貼片）等路徑投與.到哺乳動物體内。式⑴化合物 或其鹽類可單獨、或合併詩可接受載體或轉劑藉任何 9 1376384 前述的路徑投與。此種投與可以單劑或多劑進行，而合適 的藥學載體包括固態稀釋劑或填料、無菌含水介質、以及 各種非毒性有機溶劑等等。 實驗 1 -Chamaesyce hirta (L) Millsp.曱醇萃取物的製備 從草本萃取物經HPLC分離出來的草本成分中發現可 能的 TNFa抑制劑化合物’把 50g Chamaesyce hirta (L) Millsp. 加以清洗並乾燥後’把曱醇加入經過稱重的乾草料（10/1, v/w)中，於室溫下萃取出草本成份，萃取過程進行3天。萃取 物經過過濾.’德液以迴轉濃縮器(Heidolph Laborote 4000)濃縮到體 積減為大約50 mL。（圖3)

2.從 Chamaesyce hirta (L) Millsp.所得曱醇萃取物的 HpLC 分析 接著進行分離，把100 μΐ草本萃取物濃縮濾液送進預先平衡的 HPLC 系統(Shimadu)中，以 TSK Gel 80"^逆相管柱(T0S0H)進行 分離β分咸用的溶劑是經過雙重蒸傑的水與絕對乙醇，以〇〜丨⑽％ 梯度、流速0.75 mL/min進行96分鐘。 流出的液體以每1分鐘為單位部份加以收集，再用 SpeedVac^Savam)乾燥之。把每一部份都再溶於ι〇〇 μΐ 1〇%乙醇中 10 1376384

以進行TNFcx抑制劑的篩選。具有TNF〇t抑制劑活性的部份則再以 HPLC純化，直到純度高於95%。 利用以上所述之步驟發現，在Chamaesyce hirta (L) Millsp. 的甲醇萃取物中有具備TNFa抑制劑活性的化合物。圖1為 Chamaesyce hirta (L) Millsp.粗製甲醇萃取物的層析圖。

Chamaesyce hirta (L) Millsp.的粗製甲醇萃取物以 tsk Gel ODS 80TM (TOSOH)逆相管柱分離，該管柱裏的凝膠顆粒大小為5 μηι，而管柱大小為250 X 4.6 mm。所用的移動相為h2〇(a液)與絕 對乙醇(B液)的混合物’流速為0.75 mL/min。管柱依序用以下所示 者沖提：0% B液沖提最初的5分鐘；線性梯度〇〜15% b液沖提 15分鐘；15〜50% B液沖提60分鐘；50〜100% B液沖提1〇分鐘； 以及100% B液沖提6分鐘》以波長280 nm進行偵測，彳貞測靈敏 度為 0.01 AUFS。 3. L929細胞分析 (1)細胞培養 在含有10%馬血清、1% ρ/s與1°/。非必需胺基酸之Eagie，s最 低基本培養液(Minimal Essential Medium，MEM)中培養 L929 細 胞。匯集之L929細胞以2 ml PBS (填駿鹽緩衝鹽水， phosphate-buffered saline)溶液清洗，然後以1 mi ιχ胰蛋白酶加以 11 1376384 消化後，再將其懸浮於完全培養液重 贷成畏。抽取200 μΐ細胞懸浮液，以 供細胞密度計算之用，而其餘的縣 幻瑟于夜則以1500rpm離心5分鐘。 去除上清液’把完全培養液加入 以稀釋細胞至1.5 X 105細胞/ml 將觸μΐ細胞懸浮液加入96孔平底微滴定盤之各孔中，且於％ C〇2氣氛及37°C中溫育24小時。 (2) TNFa活性分析 將粗製草本萃取物再懸浮於lx PBS中，以0.22哗過 慮器滅菌。令多種濃度之草本萃取物與等體積之市f 〇2 11咖1 一起溫f 1小時。在該1小時預溫育過程結束之前，將該溫 育了 24小時之96孔盤中的培養液移出，把含有4㈣丨放線菌素 D (ACti_yein取5M新鮮培養液加人該％孔盤中。將該％ ^ 含有草本萃祕與挪仏舰育混合_移職有含放線菌素D 之培養㈣96孔财，而達到放關素D最終濃度為2 μ§/πιΐ、 TNFoc最終濃度為G.l ng/ml。減關素D (2蛛骑顶此（〇 ι ng/ml)的混合物加人作為雜對败，峨t齡d 2卩咖丨則作 為陰性對照、心於緩和搖動後，在抓溫育器中於5% c〇2氣氛 下溫育24小時。 (3)細胞毒性 把相同於TNFcx活性分析試驗所用的試樣加入裝有含放線菌 12 1376384 素D之培養液的96孔盤中，使放線菌素D最終濃度為2 μβ/πι1。 藉緩和搖動使其均勻混合後’在37°C溫育器中於5% C〇2氣氛下 溫育24小時。將50 μΙΧΤΤ混合物(XTT-1: ΧΤΤ-2 = 50:1)加入各孔 中，於CO〗溫育器中溫育4小時。以ELISA(酶聯免疫吸附測定， enzyme-linked immunosorbent assay)測讀儀以 O.D·(光學密度） 490/630 nm 測讀。 (4)TNFa活性抑制與細胞毒性的計算 TNFa抑制％ = O.D.ftg 液η — O.D_tmf〇+放線s 素 d QQ°/0 O-D.放線 ——〇.D.*nsiFct+故線苗*〇 細胞毒性％ =. X.1.00%. O.D.

故煉a素D 4.槲皮苷與揚梅樹皮苷的鑑定 (1)薄層層析 為進行TLC(薄層層析）實驗，使用預先塗覆矽膠(Siiica gel)60F254(E. Merck)的薄片，用毛細管把試樣點在薄片 上’以UV觀測箱（Gamag)掃描薄片。使用的溶劑系統在 純樹皮苷而言為氣仿：甲醇：乙酸乙酯/甲醇=20/1.5，而 在純楊梅樹皮苷而言為乙酸乙醋/甲醇=6/1。單離出來的槲 皮苷與楊梅樹皮苷其TLC均顯現出單點，其心值在這些 13 1376384 溶劑系統下分別為0.63與0.6。 (2) LC/MS 光譜 以LC/MS(液相層析質譜儀）(Varian)取得分子離子的大 氣壓電喷霧質譜(atmospheric pressure ionization with ESI mass spectrum)，使用的移動相為水/乙醇。樹皮普質譜數 據：445(M+H)+(圖8)，楊梅樹皮苷質譜數據：461(M+H) + (圖 9)。 (3) HPLC 圖譜 在此實驗中取得槲皮苷與楊梅樹皮苷的HPLC圖譜。

使用 Shimadu HPLC 系統與 TSK Gel ODS 80ΤΜ (5μηι) TOSOH 逆相管柱(4.6 χ 250 mm)，移動相含有乙醇與水，而得到參考標 準。槲皮苷的HPLC分析顯現單一峰，停留時間為46.3 min (圖4)，而楊梅樹皮苷的停留時間為51.8 min (圖5)。進行 此分析時，使用以下的HPLC條件： 梯度時間（min) B液（乙醇） % 0〜5 0 5〜20 0〜15 20 〜80 15 〜50 80 〜90 50-100 90 〜96 100 A 液：H20 流速：0.75 mL/min 14 1376384

偵測波長：280 nm 注射體積：100 pL (4) W-NMR 光譜 圖10所示為槲皮苷的1H-NMR光譜。〖H-NMR^OOMHz，丙酮 -d6) 5:0.91(3H，d，J=6.0Hz，Me 鼠李糖）、3.31-4.20(吼111,糖質子）、 5.52(lH,dJ=1.2Hz,H-l )、6.26(lH，d，J=1.8Hz,H-6)、 6.47(lH,d,J=1.8Hz,H-8) 、 6.99(lH,d,J=7.8Hz,H-5,)、

7.40(lH，dd，J=2.4,7.8Hz,H-6，）、7.50(lH，dJ=2.4Hz,H-2V

圖11所示為楊梅樹皮苷的iji-NMR光譜。 WNMReOOMI^CDsOD) 5:0.96(3H，d，J=6.0Hz，Me 鼠李糖）、 3.31-4.20(4H，m，糖質子)、5.3i (iH，d，J=1.2 Ηζ，Η-Γ)、6.26 (lH，d,J=1.8 Ηζ，Η·6)、6.36 (lH，d，J=2.4 Hz,H-8)、6.95(2H,s，H-2,及 H-6 V 5.以L929細胞增殖/細胞毒性試驗評估槲皮苷、楊梅樹皮 苷與槲皮嗣-3-D葡萄糖苷作為TNFa活性抑制劑之功效 槲皮苦、揚梅樹皮苷與槲皮酮_3-d葡萄糖苷對TNFa活 性之抑制功效，係以前述1>11：〇1活性分析與細胞毒性分析方式測定 之。由試驗結果可知’槲皮苷、楊梅樹皮苷與槲皮__3_D葡 萄糖苷皆可有效抑制TNFa活性，同時不會造成細胞毒性。 樹皮普對L929細胞系之TNFa活性抑制功效及細胞毒性 15 广 結果係如第6圖所示，麵中X㈣稀釋，皮苷濃度&皮普 原始濃度為760 μΜ，並以經4倍連續稀釋[即19()㈣、47 5⑽、 η.87 μΜ與2.96 μΜ]之槲皮苦進行試驗)，γ軸為馨α活性抑 制比率，且由圖巾抑制分_果可知㈣料制·α活性之 IC5。值約$職77 μΜ，且於此濃度下並無發現細胞毒性。 楊梅樹皮苦對L929細胞系之聊崎性抑制功效及細胞 毒性結果知於第7圖中，關中χ軸為娜之楊梅樹皮苦濃度 (楊梅樹皮苦原始濃度為_ μΜ ’並以經4倍連續稀釋[即16〇 μΜ 40 μΜ、1 〇 μΜ與2.5 μΜ]之楊梅樹皮苷進行試驗），γ軸為 TNF-α活性抑制比率’且由圖中抑制分析結果可知楊梅樹皮苷抑 制TNF-α活性之^值約為116 〇3 μΜ，且未發現存有細胞毒性。 槲皮i^-3-D葡萄糖苷對L929細胞系之活性抑制功 效及細胞毒性結果係示於第12圖中，圖巾χ軸為黃_物質之濃 度’用以進行測試之黃酮類物質包含槲皮酮-3-D葡萄糖苷（其於 圖中代逮為q_G1u)以及另兩種黃鲷類物質（其於圖中代號為 Q_Rha與M_Rha)，Y軸為TNF-cx活性抑制比率，且由圖中抑制 分析結果可知财酮ID㈣料抑制TNF_a活性之“值約 為95.74，忙5〇值之測定係利用熟習技藝人士所熟知的方式測定。 6.楊梅樹皮茌與槲皮酮_3_D葡萄糖苷對於以膠原引發關 節炎的老鼠的抗發炎效果 1376384 使用由BioLasco所供應的SPF級SD老鼠進行實驗。在 進行實驗前，於收到老鼠之後，令其適應4天。對每—隻老鼠進行 秤重、抽金檢驗、測量爪體積及其他相關紀錄，將老氣以牛勝原 II-IFA(不完全Freund’s佐劑，由Sigma供應)（「牛膠原jha」在 以下簡寫為CII-IFA)免疫注射及加強(boostering)注射，以引發關節 炎(以下簡稱「CIA」係「collagen-induced arthritis」，即「膠原弓丨發 之關節炎」）。CIA老鼠被分成6組，且每天注射實驗藥物(分別為 楊梅樹皮苷及槲皮酮-3-D葡萄糖苷）。使用地塞米松 (dexamethaS〇ne)(0.2mg)作為陽性對照組，而5%乙醇作為陰性對照 組。治療期間為7天。測量體重與爪體積，於第0、3、6、1〇與 14天抽血檢驗。 於最後一次給藥之6天後，犧牲所有老鼠。取出感染的後爪進 行組織分析。就實驗藥物治療之前、治療期間及治療之後的體重與 爪體積加以測量並作比較。 於加強注射之後第9天，發現有膠原引發之關節炎，後爪體積 腫至正常後爪的2至2.5倍(見圖13-1 ’其中圖13-la顯示CII-IFA 注射前之後爪’圖13_lb顯示膠原引發關節炎的後爪，可觀察到浮 腫與紅斑）。經揚梅樹皮苷治療的那一組在持續治療6天後， 顯示出後爪之水腫體積減小，為65.98%。於治療停止後第 17 3天與第7天時’揚梅樹皮苦、Λ σ療組的水腫分別降低為 55.95%與 50.93%(見圖 13_2。Α '、圖13-2a顯示揚梅樹皮苷

治療組的左後爪體積變化，體穑τη A 積Γ〇為CII-IFA注射前、T1為治 療前、T3為治療第6天、T4盥T5八 、 刀別為投與之後的第3天與7 天；圖13-2b顯示治療組與非

Fa療組於不同時間點作比較 時，以體積變化計算出來的爪水腫Ώ ^ KT3-TW) %，丁4 為 Mti_T4/Ti t〇) %，* Τ5 為 ΗΤ1-棚-_。槲皮酮_3·〇葡萄糖苦之治療組顯示，與 非治療組相較下’在治療_水腫體積百分㈣微下降 (8.59%)。於停止投藥後的第3天水腫體積下降百分比減至 24.93%，於第7增加到8〇.47%(見圖η·3，其中圖m 顯示槲皮酮·3則萄糖|治療組的左後爪體積，其中體積τ〇 疋庄射CIIIFA之則者，T1為在治療之前者，τ3為在治療之第6 天者，丁4與丁5分別為在投與後之第3天與第7天者。 圖13-3b顯 示與非治療組於不同時間點作比較時’以體積變化計算出之 爪水腫百分比’其中 T3 為 1·(Τ3-Τ1/Τ1-Τ0)%，T4 為 1-(T1-T4/T1-T0) %，而Τ5為1-(Τ1-Τ5/Τ1-Τ0)%)。而地塞米松治療組則顯示水 腫降低百分比在第3天與第7天分別為28.21%及29.97% (見圖13-4,其中圖13_4a顯示地塞米松治療組的左後爪體積， 1376384 體積TO為在注射CII-IFA之前者，T1為在治療之前者，T3為在治 療之第6天者，Τ4與Τ5分別為在投與後之第3天與第7天者；圖 13-4b顯示在與非治療組於不同時間點作比較時，以體積變化 計算出之爪水腫百分比，其中T3為1-(Τ3-Τ1/Τ1-ΤΌ)%，T4為 1-(Τ1-Τ4/Τ1-Τ0)%，而 Τ5 為 1-(Τ1-Τ5/Τ1-Τ0)%)。在所有產生關 節炎的樣本中觀察到的組織病理學變化有：鬆散的結締組 織、關節周圍淋巴球浸潤、關節周圍的水腫以及滑膜内襯 細胞的增殖（見圖13-6至圖13」10)，但在正常樣本中則並無 這些情形（見圖13-5)。圖13-5顯示未經膠原II免疫注射之 關節的正常組織切片。圖13-6顯示患有CIA並經楊梅樹皮 苷治療（腹膜内）之鼠的組織病理切片，其中觀察到細胞增 殖及淋巴球浸潤的現象。圖13-7顯示患有CIA且經槲皮酮 -3-D葡萄糖苷治療（腹膜内）之鼠的組織病理切片，其中觀 察到滑膜内襯細胞之增殖以及淋巴球浸潤的現象。圖13-8 顯示患有CIA且經地塞米松治療（腹膜内）之鼠的組織病理切 片，其中可觀察到滑膜内襯細胞之增殖以及紅血球與一些 淋巴球的浸潤。圖13-9顯示患有CIA且經5%乙醇治療（腹 膜内）之鼠的組織病理切片，其中可觀察到滑膜内襯細胞之 增殖以及淋巴球的浸潤。圖13-10顯示患有CIA且經地塞

C 19 1376384 米松治療之鼠的組織病理切片，其中可觀察到關節周圍水 腫以及淋巴球的浸潤。 【圖式簡單說明】 茲提供所附圖式以進一步了解本發明的内容，這些圖式說明 本發明的一些實施態樣，其僅供說明之用，而非用以限制本發明。 圖 1 為 Chamaesyce hirta (L) Millsp.甲醇萃取物的 HPLC 層 析圖； 圖2顯示Chamaesyce hirta (L) Millsp.曱醇萃取物的L929細 胞分析試驗結果； 圖3說明從Chamaesyce hirta (L) Millsp.甲醇萃取物分離出 槲皮苷與楊梅樹皮苷的過程； 圖4為槲皮苷的HPLC層析圖； 圖5為楊梅樹皮苷的HPLC層析圖； 圖6顯示槲皮苦的L929細胞分析試驗結果； 圖7顯不楊梅樹皮苦的L 92 9細胞分析試驗結果， 圖8為槲皮苷的LC/MS圖譜； 圖9為楊梅樹皮苷的LC/MS圖譜；. 圖10為槲皮苷的1H-NMR光譜； «c···C； 20 1376384

圖11為楊梅樹皮苷的1H-NMR光譜；

Mi 補充丨 圖12顯示以楊梅樹皮苷、槲皮苷、與槲皮酮-3-D葡萄糖苷進 行抑制分析試驗所得到的結果；以及 圖13-1至13-10顯示利用以膠原引發關節炎之老鼠進行活體内試 驗所得到的結果。

Claims (1)

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公 十、申請專利範圍： L -種用於治療哺乳動物(包含人類)中施拮抗劑或抑制劑所 適應之疾病或病狀的醫藥組成物，包括可有效拮抗或抑制 TNFa之却)化合物或錢學可接受_及藥學可接受載體，

其中R1、R2、R3、R4、R5與R6各獨立為羥基;而二為單鍵或雙 鍵。 2.如申睛專利範圍第1項之醫藥組成物’其中該疾病或病狀為類 風濕式_節炎、克隆氏症、斑致硬化症、敗血性休克、癌症、 或與免疫缺乏有關的惡病質。 % 22 1376384 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 無 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化 學式=

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