TWI376231B - - Google Patents

Description

1376231 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種具有抗幽門螺旋桿菌 活性的組成物。本發明亦關於魚針草内酯 (ovatodiolide)於製造供用於殺除幽門螺旋桿菌之組成物的 用途。本發明亦關於魚針草内酯於製造供用於治療胃潰瘍 之fe"樂品的用途。 【先前技術】

幽門螺旋桿菌（//e/icohcier 外/orz·)是革蘭氏陰性、微 需氧的細®，生存於胃部及十二指腸的各區域内，幽門螺 旋桿菌自1982年被發現以來，已被證實和消化性潰癌及 胃癌具有密切關係，它會引起胃黏膜輕微的慢性發炎，甚 或導致胃及十二指腸潰瘍與胃癌’超過八成的帶原者並不 會表露病徵。 目則西方醫學上對於感染幽門螺旋桿菌的治療方式， 通常需合併下列藥物同時進行投藥：⑴抗生素類，例如： 經氨节青黴素（amoxieilHn)、克拉黴素（山_，叫、四 環黴素⑽aCycline)或甲硝唾（metr〇nidaz〇⑷等；以及⑺鉍 鹽（^則㈨、制酸劑或質子幫浦抑制劑（proton pump

inhibitor)等。由於單獨使 P 平饲便用一種抗生素容易產生抗藥性， 並且有可能使得抗筚之餡 菌因而愈發嚴重’通常會使用兩 種机生素加上鉍鹽或曾；初_ 1及質子幫浦抑制劑合併投藥，此為「三 合一療法」；其一般建議瘆 一 «•康％為兩周’但所伴隨之副作 例如：°區心、腹瀉、腊友 脹乳' 箪眩等，常因此影響到了病 服藥的順服性，進而造成& 涡人 战無法岫滅所有幽門螺旋桿菌，以 T376231 致潰瘍的復發機會大為提高。此外，幽門螺旋桿菌更可能 對其中一些抗生素產生抗藥性，造成難以根除。 口 4民間之中草樂物種類繁多且治療功效多樣，其中 不乏具有抗幽門螺旋桿菌活性之藥用植物， 比，不易有副作用的產生且因其較為天然之產物方：得:目 關患者對於此類藥用植物的接受度也相對較高，先前研究 ^ ^tmiPlurnbago zeylanica L.) ^ m^^(Paederia foetidaL.)^ Ai^4(Anis〇meles indica L.) ^ {Impatiens balsamm L.) > H M^{Alpinia zerumbet.)3. {Bonbax ceiba 亡·)：樂用植物具有高度抑制幽門螺旋桿菌之活性，其中白 ^ 萃取物具有最小抑制濃度（minimum inhibitory 峨印㈣咖’㈣）範圍為。.32至1.28毫克/毫升（黃棟樑， ,國立中興大學食品科學系頌士論文，臺灣民間藥用植物〜白 化勝抑制幽門螺旋桿菌之研究，2〇〇3);鳳仙花之萃取物具 2 j抑制’農度耗圍為〇 16至512毫克/毫升（程壤搖，國 β興大學食品暨應用生物科技學系碩士論文，臺灣民間 藥用植物〜鳳仙Α丨 幽門螺旋桿菌之研究，2 0 0 5 )，與已 知數種抗生素效果相ρ /毫升、克拉徵素之最" Μ小抑制濃度為64微克 ，執本 、 抑制濃度為〇·25微克/毫升及四環 ^之“、抑制濃度為i微克/毫升，娜， 貫驗方法有些樹# 之對於抑制幽⑽奸=顯示其該等藥用植物之萃取物 #阳。 知菌抑制活性效果與抗生素相比仍有 基於上述可异， & 則仍缺乏一種具有抗幽門螺旋桿菌 4 效具副作用之相關化合物或藥物’因此對於能有 研螺徒桿菌之技術仍存在有迫切需求，因此仍待 \改正其缺失之化合物。 【發明内容】 有銀於現有技術的前诚袖·生,〇 一本發明之目的在於提供 r r lJ幽門螺旋桿菌（歸—以p少/〇r/)生長或 :::::旋桿菌的化合物或組成物，其相較於現有技彳: 同時呈：：有較低的最小抑制濃度以及最小殺菌濃度低， 理…極低副作用’當使用於個體時，T會造成個體生 病之並可作為治療因幽門桿菌所引起之胃潰癌等疾 為了達到上述目的，本發明提供一種具有抗幽門螺旋 :囷’舌!生的組成物，其含有有效抑制螺旋桿菌生長劑量的 …針草内i旨（。^^。⑽叫以及其可接受的載劑。 ^ 4ί· J- ^ .

依據本發明，魚針草内酯的衍生物可為任何不影響备、 針草内酯之抗幽門螺旋桿菌活性之經化學修飾的化合物。、 曰依據本發明，如此處所使用的用語「有效抑制幽門螺 旋桿菌生長劑量」意指能夠使得幽門螺旋桿菌 成、悴止，甚至使幽門螺旋桿菌死亡的濃度’其如本 明 所例示者，可透過活體外 最小殺菌〜； ，⑽旋桿菌最小抑制濃度或 奴固辰度予以測定而得。 本^明之組合物可以口服十A 筚.齡 服或經由植入之貯存裝置而投 樂，車乂佳的是，透過口服投筚。士 * 又 何已知無毒性、作為抑制幽門螺’明之組合物可含有任 佐劑或職形劑。螺旋桿菌生長可接受的載體' 所述的組合物可以無菌 . 如，I菌之u 了左射製備物形式存在，例 …、困 < 可注射水性蛴淫 已知之技術，使用適*之分1"種懸汁液可根據技藝中 可使用之可接-賦潤滑劑及懸浮劑而調配。 氣化鈉溶液。 ％包括甘路糖醇、水及等渗性 本發明之組合物可以钰 投荜…… 任何口服可接受之劑行進形口服 ^ 衫限於，膠囊、㈣彳、及水㈣浮液及 浴液。就錠劑而言，常 及 m ^ , ，載體包括乳糖及玉米粉；潤滑 剤，诸如，硬脂酸鎂。就膠囊而上^ ^月 糖及乾玉平^囊而έ ，可用的稀釋劑包括乳 卑C玉水粉。就水性释淫该& ^ 亦"針箪… …且成物中的活性成分， …=針草仏4可與乳化劑或懸浮劑結合。依所 疋’可添加特定甜味豳丨芬/ ★ 而 Μ及/或加味劑及/或添色劑等。 另-方面，本發明亦提供— 於殺除幽Η螺旋桿菌組成物之用途。 4製-供用 奸：L二面，本發明提供-種魚針草内酯於製造供用 於/〇療月潰殤之醫藥品的用途。 用 本發明之含魚針草内酯之組成物經 幽門螺旋桿菌生長的功效 有有效抑制 辛呈右爭彻& 士 犯以相較於現有技術的抗生 素具有更低的有效抑制濃柷生 疋以此作為一種新穎的抗 門螺旋桿菌之醫藥 造成的胃潰瘍等疾 物魚針草，因此易 純化 '分離，不會 易被應用於各種產 等應用。 品，藉以治療或預 病。由於魚針草内 於取得，且其可藉 有化學合成物之副 業，尤其如保健食 防因幽門螺旋桿菌 酯係源自本土常見 由本發明所述的方 作用問題，因而可 品、飲品、生活用 所 植 法 容 品 【實施方式】 1、 的實軛例中，提供各種魚針草内酯之應用的例示 ' 匕括具有抗幽門螺旋桿菌活性的組成物及魚針草 内酯之各種用途。 ^在本發明的一較佳的實施例中，所述的具有抗幽門螺 方疋杯菌外/0以.）活性的組成物，其含有有效抑 制螺旋桿菌生長劑量的魚針草内酯（〇vat〇di〇Hde)或其衍生 物以及其可接受的載劑。在本發明的一具體的實施例中， 其中該載劑是水性溶液。 在本發明的另一較佳的實施例中，該有效抑制螺旋桿 菌生長劑量是介於1微克/毫升與5000微克/毫升之間。 在本發明的一更佳的實施例中，該有效抑制螺旋桿菌 生長劑量是介於5微克/毫升與4000微克/毫升之間。 在本發明的一又更佳的貫施例中，該有效抑制螺旋桿 菌生長劑量是介於50微克/毫升與3000微克/毫升之間。 依據下列實施例，魚針草内酯濃度介於1 〇微克/毫升 至2 0微克/毫升之間呈現最高的抑制幽門螺旋桿菌效果。 依據本發明的組成物，其被製造成，例如，但不限於 :食品、清潔用品、飲品’其具體實施例包括：食品添加 1376231 物 '牙膏及漱口水等。 之殷 關於魚針草内酯於製造供用於殺除 m 门螺旋標从 樂品的用途，在本發明的一較佳的實施例中备困〜普 疋以介於1微克/毫升與5000微克/毫升之’、、針草内酯 螺 旋桿菌生長劑量予以投藥。 、有效抑制 在本發明的另一較佳的實施例中，其 |M . 、 …、針草内酷β "於5微克/毫升與400〇微克/毫升之 疋 桿菌生長劑量予以投藥β 的有效抑制螺旋 在本發明的一更佳的實施例中，其中 …、对卓内酯是以 =5〇微克/毫升與3000微克/毫升之間的有效抑制 桿囷生長劑量予以投藥。在本發明的一具體實施例中，魚 針草内酯是以80微克/毫升的有效抑制螺旋桿菌 予以投藥。 本發明將進一步藉由下面的實施例來作說明，但應明 瞭的是’ f玄等實施例僅為說明之用，而不應被視為本:明 的實施上的限制。 實施例 1.化學藥品與試劑 胰蛋白脒大豆培養液（tryptic soy broth，TSB)與胰蛋白 腺大丑洋菜瓊脂（tryptic s〇y agar，TSA)購自美國莫克公司 (Merck Co. U.S.A) ’ 布氏桿菌生長培養液（Brucella br〇th)購 自美國BD公司（BD Co. U.S.A);二曱基亞颯（Dimethyl sulfoxide，DMSO)、正己烷、乙酸乙酯（ethyl acetate， EtOAc)、乙腈（acetonitrile， CH3cN)與三氟乙酸 (triflU〇roacetie acid，TFA)購自美國莫克公司（Merck c〇 1376231 U.S.A) ’克拉徵素（clarithromycin，CLA)購自浙江國邦製藥 公司；甲硝唑（Metronidazole，MTZ)購自美國FDC公司。分 離液（isolate)與分份（fracti〇n)的溶液以孔徑大小ο』〗微毫 米的過濾膜（品牌為Millipore)過濾為無菌溶液，濾液收集 於無菌瓶中保存於4 °C下備用。 2. 植物材料 魚針草[Jm.iowe/e·? (L.) Kuntze]全株於 2005 年 九月採自台灣東部花蓮縣玉里鎮，與一植物學鑑定證據標 φ 本（voucher sPecimen)YMT-05-03寄存於台灣朝陽科技大學 生物科技系的植物標本室。 3. 從植物中萃取、分離與純化魚針草内酯 (ovatodiolide) 取魚針草之風乾葉子（3公斤）使用回流系統以去離子水 (兩次80公升’每次兩小時）萃取，經過充分的萃取過程， 經減壓後收集到的萃取物會濃縮形成深棕色糖漿狀，大約 為1 19公克，前述粗萃液接著被懸浮於去離子水中且以已 φ 烷成功地分離，經濃縮的己烷層（870毫克）利用矽膠管柱 (silica gel column)^^色層分析濃縮的己烷層（870毫克）， 以呈線性比例增加的極性的己烷/乙酸乙酯梯度溶液 (gradient)洗提管柱，而得到5個分份[分份丨至分份5(Fri_

Fr5)]分別依序為153、78.7、113、291.3及130毫克重，第 四個分份4 (h4)更進一步以半製備的反相高效能液相層 析法（semi-preparative RP-HPLC)(以 〇·1%乙腈、三氟乙酸與 水比例63:37洗k，UV光波長265 nm下偵測）分離，經鍵 定確認獲得純魚針草内酯（16毫克）（Shahidui Alam ei α/ 9 1376231 2000, Fzioi㈣ρία，71: 574-576)。 高效能液相層析系統包含一島津L(m〇at高效能液相 層析幫湳，搭配-半製備反相高效能液相層析[管柱為 邮_1叫_，25㈣6毫米，内徑為46毫$粒徑（⑷ 為米]’ -SIL_1qad自動注射器，—跡μ說二 極體陣列式債測器與- CT〇-1〇A管梭怪溫器，移動相為 〇·1%乙腈、三氟乙酸與水(比例63:37)，uv摘測器波長設 定於265 nm ’資料處理以Sigma:piGt軟體程式呈現。 φ 4·幽門螺旋桿菌之品種與成長條件 .BCRC i7027取自台灣新竹生物資源保存及研 究中心（BCRC)，此幽門螺旋桿菌培養纟5毫升的騰蛋白腺 大豆培養液中（TSB)(每公升中包含路蛋白腺17么乂克、豆粉 蛋白腺3公克、葡萄糖2·5公克、氯化納5公克及•酸氫 二卸2.5公克’ρ….3)，其中包含騰蛋白腺大豆洋菜瓊 脂（TSA，每公升中包含路蛋白腺15公克、豆粉蛋白月隶5公 克' 氯化鈉5公克及瓊脂15公克’ pHi 7 3)斜面培養基， •其含冑5% (體積/體積）的去蛋白纖維綿羊血液，形成在試 官底部。前述培養液培養於微好氧瓶系統⑽⑽⑽沖叫 Μ system) (BBL)，内部填充氣體成分為5%氧氣，抓二 氧化碳與85%氮氣⑽GasPakTM Ez氣體生產系統），於3代 下.培養72小時，此細胞懸浮液以姨蛋㈣大豆培養液稀釋 至細胞濃度3xW菌落形成單位/毫升（cfu/mL)，以用於抗 菌測試。 5 ·抗幽門螺旋桿菌活性 ⑴抑制作用區測量⑽灿叫咖㈣如㈣聊叫 1376231 門螺紋柃菌對於前述分份與分離液的抗菌活性具 易感！生（sUscepUble) ’此時會使用復脂井擴散分析（哪口⑷ dlffUS1〇ySSay)來測量（以〇賴等人，1994, ^87: )每個待測5式的細菌懸浮液體積為i 00微升（濃度 為厂落形成單位/毫升）均句塗抹於跌蛋白腺大豆洋菜 € a。養皿上’其含有5%去纖維蛋白绵羊血液，於培養皿 上製^複數個井圓直徑4 7毫米，於其中分別注人$微升 的刀^ 1至5與並分別加入魚針草内醋（40 ί克/毫升；二

土砜為，合』）於井内與之混合，二甲基亞颯（DMS〇)為 負對照經而甲❹(MTZ)為正對照組，於微好氧瓶系統下， 内部填充氣體成分糸$。 # 。 為/()軋虱，10%二氧化碳與85%氮氣， 下。養72小時後進行抑制作用區的直徑測量。 (2)最小抑制濃度（minimum inhibit〇ry⑽她⑷抓， MIC)之測定 純化後的物質以冑脂稀釋法測定最小抑制濃度（Shungu ，知izmzcroZ)C/ze/T^;^，31: 949-950)。細 胞?錯液體積為4〇微升（最初細菌總數為3χΐ〇8菌落形成單 位/宅升_)均勾塗抹於含有5%去纖維蛋白綿羊血液的膝蛋 東大立洋菜瓊月日培養皿上’’魚針草㈣與各種分份於 營養液令之最終濃度分別為2·〇至32〇微克/毫升與32〇至 5一12·0微克’毫升，兩者所含的二甲基亞砜濃度低於2.5%， -甲基亞硬_S〇)為對照组，甲❹（μτζ)與克拉徽素 (CM併入分析（c〇侧以作為正對照組，戶斤使用的濃 度刀別為8.0至128.0微克/毫升與〇 _至〇 128微克/毫 升，於培育於内部填充氣體成分為5%氧氣，ι〇%二氧化碳 11 1376231 與⑽氫氣，37t下培養72小時的微好乳瓶系統下之後， 内部填充氣體成分為5%氧氣，10%二氧化碳與㈣氮氣， 二7C下培養72小時，將複數個菌落在培養皿上所形成的菌 落予以數出，於測試樣本（抗菌試劑）於該培養營養液中可 致使未生，菌落之最低濃度，被定義此為最小抑制濃度。 (3)最小殺菌濃度（minimum bactericidaI咖咖㈤⑽， MB C)之測定

旦於凍存管(cryogenic vials)中利用兩倍連續稀釋試驗法 測量分離液與控制組的抗菌試劑(克拉黴素與甲硝旬之稀釋 培養液最小殺菌濃度（MBC)(Zaidi心/，2_，制 細Λ 32. 63 1.636)，幽門螺旋桿㈣浮於布氏桿菌生長培養 液中接著被予以稀釋至成1><1〇7菌落形成單位/毫升的， 混合物取，其中魚針草内醋最終濃度S 10 S 16〇微克/毫 升’數個各種分份的濃度為8〇 i 128〇微克，毫升，克拉黴 素濃度為0.25至4微克/毫升，甲硝唾濃度$ 16〇至2鳩 微克合成-混合液。，此混合液於微好氧狀態下 Y c培月1小時，培育完成後，將此培養液分為每一等分i 〇〇 微升:並塗採於含有5%去纖維蛋白綿羊血液的騰蛋白腺大 且洋菜瓊脂培養皿上，以測量可生長之菌落數目，將此培 養皿於微好氧瓶系統下，内部填充氣體成分為5%氧氣， 二氧化碳與85。錢氣，机下培育72小時，觀察測試樣本。 完全抑制可見之細菌生長於騰蛋㈣大豆洋菜填脂培養盟 上之最低濃度，定義此濃度為最小殺菌濃度（MBc)，最終 二曱基亞砜濃度於測定時需低於2%(體積/體積）且於声 對細菌生長無任何影.響。 、濃度 1376231 6 ·統計分析 所有的數據資料以平均數加減標準差声 於- at门 表不’且為源自 於/、-人不同的實驗，統計分析以鄧奈特單 … 史異數分析 檢定（Dunnett，s one-way ANOVA test)計曾，并心 ;τ π ,並將顯著菩里 定於值小於0.001。 ” 結果 1 _抑制作用區測量 表1呈現表示數個各種分份與取自备 .’、、叫早星部的备針 • 草内酯於於活體外抗幽門螺旋桿菌活性 ”’、 w 1 、 αΤ (in vitro ml咖。n)所得結果。於此t部萃取液與數個各種 可發現分份卜分份2、分份3 '分份4與分份5 ^現此

微活性，其中分份4活性最高（33毫来大之抑制環），、M 卓内酿於所有測試產物中表現出最高的活性，每—圓护井 中含有200微克可產生34毫米大之抑制環甲石肖。坐於測試 時作為-標準藥物表現出-抑制環是小於魚針草内酷。 表從水萃取以及使用已烷盥矽脒普虹 A 以呈線性比例増加極性的己燒/乙si、乙r描声：六J t ??離’ ^ 門螺旋桿菌活」圍dfcrr二洗m #

13 2.最小抑制濃度 蜡，吁：引用矽膠管柱色層分析分離得到魚針草内 離的二：刀f:之抗菌活性表示於表2 17，由分份4中所分 2、， 十草内自曰之抗幽門螺旋桿菌活性於活體外進行測 4亚利用瓊脂稀釋 示 .法冽试最小抑制濃度，正對照組表現顯 ,,\ 的生長，然而負對照組並無任何微生物生長， 4 s °養基與其測試條件為無菌的指標’參考抗生素（曱硝 /Λ ^立徵素）之最小抑制濃度分別4 64微克/毫升與0.032 ^毫升以純一甲基亞硬（DMS〇)不具有抗菌活性為控制 組’魚針草内㈣濃度16微克/毫升時表現出最高的抑制 幽門螺旋桿菌效果。

J：份1 >512 >512' ^512 256" >512 32-512 80-1280 ~?¥Τ 魚針草内酯 克拉黴素 曱硝嗤 >1280 >1280 >1280' 320 : 320 一 2-32 0.008-0.128 8-128 數據為三次實驗之平均值 顯著差異定於p值小於0.05 16 0.032 64 10-160 0.25-4 160-2560 80b 1 2560 3·最小殺菌濃度 純分離液對抗幽門螺旋桿菌的最小殺菌濃度濃度範圍 為10至160微克/毫升’從表2可觀察到魚針草内酯之最 低乘小殺菌濃度紀錄為8 0微克/毫升，標準藥物之克拉黴 1376231 素與曱硝唑為正控制組，其最小殺菌濃度分別為1微克/毫 升與2560微克/毫升，於測試中發現最小殺菌濃度小於抗 菌值，因此推測此分離液於低濃度時可抑制細菌生長，於 高濃度時具有殺_作用。 【圖式簡單說明】 (無） 【主要元件符號說明】 (無）

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Claims (1)

13*76231 七 申請專利範圍： 101年8月16曰修正替換頁 1. 一種具有抗幽門螺旋桿菌{Helicobacter pylori)活性 的組成物，其含有有效抑制螺旋桿菌生長劑量的魚針草内 酯（ovatodiolide)或其衍生物以及其可接受的載劑，前述魚針 草内酯的衍生物係經化學修飾的魚針草内酯化合物其係 不影響魚針草内酯之抗幽門螺旋桿菌活性。 2.如申明專利範圍第1項所述之具有抗幽門螺旋桿菌 活性的組成物，其中該有效抑制螺旋桿菌生長劑量是介於j 微克/毫升與5000微克/毫升之間。 3. 如申請專利範圍第1項所述之具有抗幽門螺旋桿菌 活性的組成物，其中該有效抑制螺旋桿菌生長劑量是介於5 微克/毫升與4000微克/毫升之間。 4. 如申4專利範圍f 1項所述之具有抗幽門螺旋桿菌 活性的組成物，其中該有效抑制螺旋桿菌生長劑量是介於 50微克/毫升與3000微克/毫升之間。 + 5.如申請專利範圍第！至4項任—項所述之具有抗幽門 螺旋桿菌活性的組成物，其中該載劑是水性溶液。 6. —種魚針草内酯於製造供用於殺除幽門螺旋桿菌 組成物的用途。 干之 7.如申請專利範圍第6項所述之用途，复中 B人 /、T…、針草内雖 疋以"於1微克/毫升與5000微克/毫升之間的有效 旋桿菌生長劑量予以投藥。 1轉 針草内酯 效抑制螺 8.如申請專利範圍第6項所述之用途，其中# 疋以’丨於5微克/毫升與4〇〇〇微克/毫升之間的有 方疋才干菌生長劑量予以投藥。 16 职 6231 ·' 101年8月16日修正替換頁 9.如申請專利範圍第6項所述之用途，其中魚針草内酷 是以介於50微克/毫升與3〇〇〇微克/毫升之間的有效 旋桿菌生長劑量予以投藥。 呷制螺 的用種魚針草内能於製造供用於治療胃潰瘍之醫藥品 17