TWI359867B - Iridovirus vaccine - Google Patents

Description

1359867 • 觚 ^九、發明說明： A【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用以治療或預防虹彩病毒所引起之魚 類疾病之次單位疫苗及DNA疫苗，特別係與虹彩病毒之錐 體膜1白（myristylated membrane protein)相關的次 單位疫苗及DNA疫苗。 【先前技術】 目前水產養瘦大多採用高密度養殖的方式，常因疾病 *病原體之繁殖及傳播迅速而造成高死亡率。關於魚類疾 病，細菌性疾病尚可利用抗生素來治療，然而病毒性疾病 則否，所以對於病毒性的水產疫苗之需求更是迫切。 虹彩病毒科（/WdoWWdae)為雙股去氧核聽核酸病 毒（double-strand DNA virus )，型態為二十面體，會經 由胞飲作用（Endocytosis)進入細胞内，病毒複製主要 在細胞質及細胞核内進行，離心後之虹彩病毒沈澱物可看 |到類似彩虹的折射光現象，因此得名。 目前已完成定序之魚類虹彩病毒包括：如新加坡石斑 魚虫工彩病毒(Singapore grouper iridovirus)、台灣石 斑魚虹彩病毒（Taiwan grouper iridovirus ( TGIV ))、 石斑魚昏睡病虹彩病毒（Sleepy grouper iridovirus (SGI V ))、傳染性脾腎壞死虹彩病毒（Inf ect ious spleen and kidney necrosis iridovirus ( ISKNV) ) 、+条石周 虹彩病毒（Rock bream iridovirus (RBIV))、斜帶石 斑魚虹彩病毒（OSGIV)等之病毒基因已完全定序（Songet 5 110706. !359867 · /1.，2004、Tsai etal·，2005、Chuaetal.，1 994、 He et al. , 2001 > Do et al. , 2004 > Lu et al. , 2005 ) 〇 目刖已知魚類虹彩病毒的宿主已超過3〇種。其中海 水魚類包括：石斑魚類、驢科、嘉鐵魚、黑調、青甘轉、 紅甘鰺、條紋鰺、黃鰭鮪、黃錫鯛、鸚歌魚、三線雞魚、 赤鰭笛鯛及虎河豚等，淡水觀賞魚包括神仙氨、孔雀魚、 七彩麗麗和藍眼鏘等（Wang et al，2QQ6)/ 罹患虹彩病毒症的病魚，主要病徵為體表發黑、呼吸 頻率增加及食慾不振等，幾週内累積死亡率可達2〇_9〇% (Inouye et al. , 1992)。 虹彩病毒症常見於石斑魚養殖業中（Chua et al.， 1994;Ch〇uetal·，1998;趙，2〇〇3)，自魚苗到成魚皆 會發生，例如發生在鞍帶石斑（办“印力 乃π的俗名龍膽石斑）β故，針對虹彩病毒之防治， 考量到自魚苗階段起，魚體已發展出$善的免疫系統，因 鲁此利用疫苗來防治虹彩病毒係為可行。 目前常見水產疫苗可分為四種：不活化疫苗、減毒疫 苗、次單位疫苗及DNA疫苗’分述如下： 1.不活化疫苗：以化學方式或物理方式處理病原體， 而將其不活化，除去病原體感染力並保留抗原性。 2·減毒疫苗：以遺傳工程將病原體重新構築或修飾， 去除其致病部分而製備；或以傳統方式將病毒以細胞株繼 代培養多次，毒性會因此逐漸減弱，但會保留其抗原 性。 110706 6 1359867· » · •' · 3.次單位疫苗（subuni t vaccine ):利用能誘發抗體 u產生的病原體抗原，而非整個病原體，來刺激免疫保護能 力，並且係利用重組DNA技術，將一段病毒蛋白質基因構 築於表現載體上，再藉由大腸桿菌或酵母菌進行大量表現 此病毒蛋白質，並加以純化來而製備成次單元疫苗。 4. DNA疫苗：以病原體之核酸取代蛋白質來製備疫 苗，亦稱為核酸疫苗（nucleic acid vaccine)，是將可 誘發抗體之病原體抗原基因構築於適當質體上，可藉由大 籲腸桿菌來產生及純化該質體，將此疫苗（質體）打入宿主 肌肉，使宿主細胞表現病毒抗原，進而產生免疫。 目前對於虹彩病毒疫苗之研究，以減毒疫苗與不活化 疫苗為主，如 JP 91 76043、JP 2007197454、TW 0901 09900 等。對於虹彩病毒之基因片段應用則多用於疾病之快速檢 測，如 JP 7284399揭露利用核苷酸還原酶基因 (ribonucleioside reductase gene )設計可供診斷虹彩 $病毒用的引子對、’CN 1827778則揭露利用ATPase基因片 段進行即時螢光定量PCR檢測之方法。 另外，亦有使用嘉臘魚虹彩病毒之I肖蛋白（Major capsid protein ; MCP)製成次單位疫苗及DNA疫苗之研 究，其結果顯示次單元疫苗並無良好保護能力，且DNA 疫苗的保護效果遠低於不活化疫苗（Caipang et al., 2006a ; Caipang et al.，2006b ; JP 20061 37724)。由於 MCP蛋白質位於病毒内，並未裸露在病毒外部，因此不易 被宿主的免疫系統彳貞測到。此外，JP 2006137724所揭露 7 110706 1359867.. *► ·

的彔喝魚虹衫病毒之DNA疫苗，A 發明之戽列进4 〃、所揭路之DNA序列與本 月之序列截然不同，故上述鞘 个 明之虹參由主丨 之DNA疫苗，與本發 之虹矽病I外套膜蛋白DNa 明。 又田大相逛庭，在此先行敘 田 因此’對於魚類之虹彩病毒症而言，仍待發展有效疫 【發明内容】 料上揭目的，本發料、提供—種虹彩病毒之次單位 起之备：广_職1110 ’用以治療或預防虹彩病毒所引 =疾病，該次單位疫苗包括··虹彩病毒外套膜上之 蛋白質或其胜肽片段，及醫藥上可接受之载劑。 依據本發明，該蛋白質係為錐體膜蛋白 (myristylated membrane pr〇tein，MMP)。錐體膜蛋白 ，虹相毒外套膜上之蛋白質，具有穿膜構造暴露於病 母表面，可作為誘發宿主免疫反應之抗原。 依據本發明’該载劑係為供該蛋白質或胜肽片段溶於 其中者，且該載劑可維持該蛋白質或胜肽片段之穩定性， 且視需要可增加本發明疫苗之免疫力誘發。在實施例中， 該載劑可為，舉例但非限定’水、緩衝溶液、佐劑或賦形 劑。在實施例中，緩衝溶液為，舉例但非限定，磷酸緩衝 食鹽水（PBS)、一般食鹽水、Tris緩衝溶液、磷酸鹽等。 在實施例中，佐劑為，舉例但非限定，弗氏完全佐劑 (Freund s complete ad juvant )、弗氏不完全佐劑、氫 氧化鋁、羥基磷酸硫酸鋁、二甲基二十八烷基溴化銨 8 110706 <多(=)、單磷醜M(MPL)、海藻糖雙分支酸鹽（)、 ，為尺、或油性佐劑等。於較佳實施例中，該載 d為水洛性佐劑或可被魚類吸收之油性佐劑。 m明，可利用基因工程之一般方法製備而得虹 :二：★早位疫苗所包含之蛋白質或胜肽片段。於較佳 "例中’該蛋白質或胜狀月段係利用下列方法製備：將 對應於該蛋白質哎胜肽片p 體，料細 ^段構築於表現載 :肽體轉殖至宿主細胞’以表現該抗原之蛋白質或 ，肽片及自該宿主細胞分離該抗原之蛋白質或胜狀片 ‘。該值主細胞為可使帶有該虫工 量表現者，舉例㈣限制，大腸桿1_母8載 水明，該魚類可為淡水魚類、淡海水魚類或海 7、’ 4佳貫施例中’該魚類係為淡海水魚類或海水 鱲魚、黑鯛、青甘〜二=為石斑魚類、鱸科、嘉 纖^ _/甘〜Α甘鰺、條紋鰺、黃鰭鮪、黃錫鯛、 、二線雞魚、赤鰭笛鯛或虎河豚。 依^本發明，該次單位疫苗可經由注射、口服及/或 次泡而給予，分別詳述如下： 注射法：不經消化道而將抗原接種到魚體内（如腹腔 注射、肌肉注射）。 ▲又包法是目則免疫稚魚最方便之方法。浸泡型疫苗 抗原主要由”進入體内’而皮膚、侧線及腸管亦為抗 吸收之器官。 口服法·直接將疫苗添加至㈣内施用。 110706 9 1359867 • » 本發明又提供一種虹彩病毒之dna疫苗（dna vaccine)，用以治療或預防虹彩病毒所引起之魚類疾病， 該DMA ☆田包括.編碼虹彩病毒外套膜蛋白之去氧核糖核 酸（DNA)或該DNA之部分片段，用以攜帶該DNA之載體， 及醫藥上可接受之載劑。 依據本發明’碎DNA;係編碼錐體膜蛋白，其中錐體臈 蛋白為虹彩病毒外套膜上之蛋白質，具有穿膜構造暴露 鲁於病毒表面，可作為誘發宿主免疫反應之抗原。 依據本發明，該DNA之序列係SEQIDN〇1及其突變 序列。其中，該突變序列係為不改變其所編碼之錐體膜蛋 白之折疊及構形（conformation)之突變序列，且突變之 序列與SEQ ID NO. 1之序列相同性為以上。. 依據本發明，該DNA疫苗可依本領域習知方法製備。 於較佳實施例中，該DNA疫苗之製備方法包括下列步驟： 將該DNA構築於表現載體，及將構築有該DNA之 鲁與醫藥上可接受之載劑混合。 依據本發明’該載劑係為該DNA可溶於其中者，且該 载劑可維持該DNA之穩定性、，且視需要可增加本發明之= 田之免疫力誘發。在實施例中，該載劑可為，舉例但非限 定，水、緩衝溶液、佐劑或賦形劑。在實施例中，緩衝溶 液為’舉例但非限定’磷酸緩衝食鹽水（pBS)、一般食鹽 水、Tris緩衝溶液、磷酸鹽等。在實施例中，佐劑為， 舉例但非限定，弗氏完全佐劑（Freund，s compiete adjuvant)、弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁、羥基磷酸硫酸 110706 10 1359867 ·* · “鋁、二曱基二十八烷基溴化銨（DDA )、單磷酰脂A ( MPL)、 ‘海藻糖雙分支酸鹽（TDM )、多醣體、礦物油、或油性佐劑 等。於較佳實施例中，該載劑為水溶性佐劑或可被魚類吸 收之油性佐劑。 ： 依據本發明，該魚類可為淡水魚類、淡海水魚類或海 水魚類；於較佳實施例中，該魚類係為淡海水魚類或海水 魚類；於更佳實施例中，該魚類係為石斑魚類、鱸科、嘉 鱲魚、黑鯛、青甘鰺、紅甘鰺、條紋鰺、黃鰭鮪、黃錫鯛、 ®鸚歌魚、三線雞魚、赤鰭笛鯛或虎河豚。 依據本發明，該DNA疫苗可經由注射、口服及/或浸 泡而給予，該三種給予方法係如前所述。. 【實施方式】 以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方 式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之内容瞭解本 發明之其他優點與功效。 一、虹彩病毒OSGIV-8L之DNA萃取與質體構築 虹彩病毒之純化輿DNA萃取： 自確認罹患虹彩病毒症之龍膽石斑病魚，取1克脾臟 組織，自其中抽取病毒液，並以習知方法萃取該病毒液之 DNA，並利用PCR以虹彩病毒專一性引子（P3-IRB5 : 5*-GTACGGGGCTTGA TGATGACGT-3‘ 及 P4-IRB5 ： 54-CCTTGTGTCGTGTCTGGCCGAG-3* ) (Sudthongkon g et al., 2002)與1. 5%洋菜膠體電泳分析確認所萃取之DNA為虹彩 11 110706 1359867 “的胺基酸序列比對可得100%的相似度，以及與傳染性胰 ^臟及腎臟壞死病毒（ISKNV)之核酸序列比對得到94%的 ，相似度。 ' 比對結果證明上述虹彩病毒間親緣關係相當接近，加 上各虹彩病毒株之間雖然會因突變而使基因序列改變，但 病毒間通常含有相當高的相似性和保守性的序列。因此， • ! 本發明之虹彩病毒疫苗，可廣泛的適用於各地區所發現的 不同魚種之虹彩病毒。

• 穿膜結構預測結表如第3圖所示。將本發明之DNA 序列推演成.胺基酸序列，顯示其所含之開放讀碼區（ORF) / · 有485個胺基酸，並利用軟體ExPASy Proteomics tools '進行分析，已知若分析值大於.18，則推論此蛋白含有穿 膜結構，結果顯示OSGIV-8L的預測值為63.47，可能含 有三嗰穿膜結構。因此，本發明0SGIV-8L所編碼之蛋白 質，應位於病毒外套膜上，可作為良好抗原。 二、虹彩病毒次單位疫苗之建構 次單位疫苗質體的建構： 將 0SGIV-8L 接合至 pGEX-4T-3 載體（Amersham)形 成帶有0SGIV-8L之質體（pGEX-4T-8L)，將所得質體轉形 入勝任細胞E. coH BL21(DE3)。 次單位疫苗之蛋白質表現： 以IPTG誘導蛋白質大量表現後，以離心與超音波震 蘯將菌體打破，再利用麩胺基硫凝膠（Glutathione 13 110706 1359867 • « …agarose ) (SIGMA)系統進行病毒融合蛋白質純化，其中上 •清液與麩胺基硫凝膠混合並充填至微量管柱（M i n i column)，再將融合蛋白質洗提出，即為0SGIV-8L編碼 蛋白貪，可作為次單位疫苗供後續應用。 以IPTG誘導之蛋白質表現及其純化後所得產物，利 用SDS-PAGE檢驗，結果如第4圖所示。經純化後可得75 Kd之蛋白質產物，與預期相符。 將上述作為次單位疫苗之0SGIV-8L編碼蛋白貧用以 籲免疫小鼠，以獲得抗血清。取該小鼠抗血清與0SGIV-8L 編碼蛋白質進行西方墨點法，結果如第5圖所示，顯示次 單位疫苗所產生之蛋白質確實可與抗血清結合，亦即本發 明之次單位疫苗確實具備誘發抗體之效力。 三、 虹彩病毒DNA疫苗之建構 將 0SGIV-8L 與載體 pcDNA3.l/V5-His-T0P0 鲁（Invitrogen)接合，形成DNA疫苗質體，命名為 pcDNA3.1-8L。 四、 虹彩病毒DNA疫苗之體外（i·/3 W iro)之表現 細胞轉染（Transfection): 將石斑魚腦細胞株（Grouper brain cell 1 ; GBC1) 進行細胞繼代培養於四孔培養盤中。將 4微克 pcDNA3. ：l-8L之DNA疫苗溶於200微升1)不含FBS之 L-15 培養液（溶液 1)，取 8 微升 Lipofectamine 2000 14 110706 1359867 • _ «

Unvitrogen)稀釋於200微升不含FBS之L-15培養液（溶 、液2 )後.，於室溫作用5分鐘’接著將溶液1 .及溶液2均 勻混和’再於室溫作用20分鐘後，分別取1〇〇微升加入 四孔培養孔中，於28。(：培養6小時後，再置換成新鮮含 10%FBS之L-15培養液，繼續培養18小時後，以4%曱 醛溶液固定細胞’並進行細胞免疫螢光染色。結果如第6 圖所示。 於第6圖中可見GBC1之細胞質部分出現螢光反應’ •證明將DNA疫苗（PCDNA3.1-8L)轉染入細胞時，可於細 胞中正常表現蛋白質。且部分細胞膜亦出現螢光反應，表 示由pcDNA3.卜8L所表現的蛋白質可嵌入細胞膜，亦即 0SGIV-8L編碼蛋白質確實如前述分析結果（第3圖所 示）’為一穿膜蛋白質，可作為引起免疫反應之抗原。 五、龍膽石斑對虹彩病毒疫苗之抗體反應 ❿龍膽石斑對次箪位蒋苗之杭艚反麻、： 將25微克（eg)及50微克的虹彩病毒次單位疫苗 分別與弗氏完全佐劑以1 : 1等體積混合，取1〇〇微升混 、合液以腹腔注射方式投予至體重約50克之龍膽石斑，^ 於 >主射後第19天追加免疫。於實驗期間，每隔三天進行 尾部採血，將血液樣本於4。(：下放置16小時，再於4〇c以 3000xg離心1〇分鐘，而後取上清液進行EUsa，分析抗 體濃度。結果如第7圖所示。 由第7圖可知，免疫後第13天起，魚體血清之抗 110706 15 1359867 « 一 力4貝明顯升高，並在第1 9天追加免疫後，於第26天起抗 體大幅度升高，證實本發明之次單位疫苗確實可誘發魚體 產生免疫反應。再者，施予50微克之次單位疫苗之抗體 力價較施予25微克OSGIV-8L者高。故，於後續之疫苗 保護力測試時，以50微克次單位疫苗作為單次注射劑量。 龍膽石斑對DNA痏苗之抗艚及鹿： 將20微克的虹彩病毒⑽八疫苗溶於1〇〇微升pBs， 以肌肉注射方式投予至體重約5〇克之龍膽石斑。於實驗 J間母隔二天進行尾部採企，將血液樣本於放置16 小時，再於4°C以3000xg離心1〇分鐘，而後取上清液進 行ELISA ’分析抗體濃度。 結果如第8圖所示’免疫後第13天起，魚體血清之 抗體力！開始明顯升高，且在第23天後抗體力價持續維 持在最高點，至實驗結束之第54天皆未下降，顯示本發 明之DNA疫苗具有良好且持久的免疫誘發性。 ’、、虹彩病毒疫苗保護力測試 實驗動物： 取體重約10克之龍膽石斑魚苗，以pCR方式確認無 虹彩病毒感染。飼養條件為：海水鹽度為2()邮，水溫 維持在28± 2t。 氮Ji石斑病喜液之劁偌： 〜取確認感染虹彩病毒之龍膽石斑之脾臟，加入pBs 緩衝液中於冰上研磨，稀釋成2〇、5〇、丨〇〇、1〇〇〇倍濃度。 16 110706 1359867 於4°C下以3000xg離心20分鐘，懸浮液以〇. 45// m的過 >慮膜過濾後，於-201備置。 么早位疫苗保護力測試： 取體重約10克之龍膽石斑魚苗，於注射前，先將魚 苗以0.5%的二苯氧基乙醇（2_phen〇xyethan〇1)進行麻 醉，貫驗組施予次單元疫苗，亦即取5〇微克的虹彩病毒 -人單位疫苗與弗氏完全佐劑以丨：丨等體積混合，並取工〇〇

微升以腹腔注射投予；對照組則以i 〇〇微升pBS以腹腔 >主射投予至魚體内，每組各1〇隻。於注射後一個月，取 稀釋100倍之病毒液以腹腔注射投予至魚苗，並觀察魚體 病徵及死亡率。結果如第9圖所示。 對照組於注射病毒液後第八曰開始有部分魚隻死 且部分魚隻產生體色變黑、食慾不振等病徵，但：予 次早位疫苗之魚隻並無任何病徵發生。於注射病毒液後第 十九曰’對照組全部死亡，但施予次單元疫苗之魚隻則全 無死亡、無病徵發生且食慾良好’累積死亡率為0%，證 2發明之次單位疫苗對於虹彩病毒症具有極佳的預 PNA疫苗保譜力測封: 取體重約10克之龍膽石斑魚苗，於注射 =〇·⑽的二苯氧基乙醇進行麻醉，實 靖 方式投予_疫苗’投予濃度為 肌内：

3·卜8L/100 微升 PBS;對照 PCDNA 升PBS至备俨肉, 腹腔/主射投予100微 ^内’母組各15隻。於注射後-個月，取稀 Π0706 17 1359867 序列表 <ι丨〇>陳秀男、王俊順 <120>魚類虹彩病毒之疫苗 <160>4 <210> 1 <211> 1607

<212> DNA <213> 虹彩病毒（iridovirus)

<220> <221>CDS <222> (94)...(1551) <223> OSGIV-8L <400> 1

aagtgggtct cctgagattg ctggaaacct caggaccaca gtctctcggc gtcagccttc ccacacatcg caaaacatcg cacatagtac cgtgccagag cataggcttg cagcacaggt ggccagcttc cgagcccggg catgaacttg taccccacgc cagcacggcg aagcttgttc ccatcgcatc cagacatgat gcactcagca ttggtggctg gcgaacgcag ttaatacgca tagccatcga ggcttgatgt gtaccgcttt tccttggggt acaacgacgg gcgccgtccg gccaccgcct gcgacggcat aaagcatacg ttgcccaata gccagctgcc accacatcct aaacgcggag gacaatgata agaccaacag tggtgtcaca tgtctatgtt ccttgtggtt gcgccccgcc cctgcacctt cactgtgcag caggcttggt gcagttgcgc agtcagcctt ggtccagggt gcggatacac ccgccacgcc tggagccggt acaggtccac gcatgctgct atgtcgatga cttttatata tccgaccgcg cggcatgccc caaggtgccg gaggcgagag gtggccccag gcccctgcgc gtacgcgtcg gtctgtggcc gggcatgacg gtaccgctca gacgtcggtg caagggctca tatgccaccc ggccaggggc accctgggcc gctgctggcc acccactggt tgatcggcct gcgatggtgc gccaccacgg ggcacgtcct cgctcgtagt cccagcttct tgccaaccgt cccggtttca aggttcagct tatgcggtgg tagtacacca aacttttgcg gcaccctttg accaagagca atgccgatga ttggcggtgg gtggcgtcct tacgttcgca cgtttttctt ctcctgtgcc tcgtgttggg gccacgtgcc agaacatgat ttgcggcacc cctcgttcat ttgtggccgt tgtagcgtat ccttgggcag tctggccctg cgctgtccag cctgacgaca ccatgccgat gcaggcccgc ccagctgctg gcacgcactg cgacagggcc gacacgaaga tgcgcagcac agagtcctgg atgacgacgt tgcccgtcac attgtccaca gagatcacct gtttggtgtt gacctcgccg ctgcacgtca gcgtcatgtt gttgacaatg cgggacgtca cactgagaaa ttgctttatg ctgtttgtgg ccgaggcgta ctgaccaaag ttgatgccgc tcaccacgga cgccgcctgc tgtgccatgt cgttgagcac cttctgctga gtttcttggt tggccagggc cttcatggtg gcctgaaggt tcacggtgac cgtctgctcc atggtcacac ccttgataat cacatcacct ttaacatgag atatattgat gatctgcgac gagtctgcgg tcagcttggt gttgttggca atgttggatg tggcctcggc cacggccttc aggacagtgt cgaccccgtt gaatgactgg gcagcaccca tggctatgtt 1560 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1 ttttagctgg attttttgaa tcccacggat aaactacaca aaagcaa 1607 <210>2 <211> 1607 <212> DNA <213> 虹彩病毒（iridovirus) <220> <221> gene <222> (1)...(1607) <223>OSGIV-AY894343 <400>2 aagtgggtct ccatcgcatc aaacgcggag atgtcgatga acccactggt tacgttcgca 60 cctgagattg cagacatgat gacaatgata cttttatata tgatcggcct cgtttttctt 120 ctggaaacct gcactcagca agaccaacag tccgaccgcg gcgatggtgc ctcctgtgcc 180 caggaccaca ttggtggctg tggtgtcaca cggcatgccc gccaccacgg tcgtgttggg 240 gtctctcggc gtgaacgcag tgtctatgtt caaggtgccg ggcacgtcct gccacgtgcc 300 gtcagccttc ttaatacgca ccttgtggtt gaggcgagag cgctcgtagt agaacatgat 360 ccacacatcg tagccatcga gcgccccgcc gtggccccag cccagcttct ttgcggcacc 420 caaaacatcg ggcttgatgt cctgcacctt gcccctgcgc tgccaaccgt cctcgttcat 4Θ0 cacatagtac gtaccgcttt cactgtgcag gtacgcgtcg cccggtttca ttgtggccgt 540 cgtgccagag tccttggggt caggcttggt gtctgtggcc aggttcagct tgtagcgtat 600 cataggcttg acaacgacgg gcagttgcgc gggcatgacg tatgcggtgg ccttgggcag 660 cagcacaggt gcgccgtccg agtcagcctt gtaccgctca tagtacacca tctggccctg 720 ggccagcttc gccaccgcct ggtccagggt gacgtcggtg aacttttgcg cgctgtccag 780 cgagcccggg gcgacggcat gcggatacac caagggctca gcaccctttg cctgacgaca 840 catgaacttg aaagcatacg ccgccacgcc tatgccaccc accaagagca ccatgccgat 900 taccccacgc ttgcccaata tggagccggt ggccaggggc atgccgatga gcaggcccgc 960 cagcacggcg gccagctgcc acaggtccac accctgggcc ttggcggtgg ccagctgctg 1020 aagcttgttc accacatcct gcatgctgct gctgctggcc gtggcgtcct gcacgcactg 1080 cgacagggcc gacacgaaga tgcgcagcac agagtcctgg atgacgacgt tgcccgtcac 1140 attgtccaca gagatcacct gtttggtgtt gacctcgccg ctgcacgtca gcgtcatgtt 1200 gttgacaatg cgggacgtca cactgagaaa ttgctttatg ctgtttgtgg ccgaggcgta 1260 ctgaccaaag ttgatgccgc tcaccacgga cgccgcctgc tgtgccatgt cgttgagcac 1320 cttctgctga gtttcttggt tggccagggc cttcatggtg gcctgaaggt tcacggtgac 1380 cgtctgctcc atggtcacac ccttgataat cacatcacct ttaacgtgag atatattgat 1440 gatctgcgac gagtctgcgg tcagcttggt gttgttggca atgttggatg tggcctcggc 1500 cacggccttc aggacagtgt cgaccccgtt gaatgactgg gcagcaccca tggctatgtt 1560 ttttagctgg attttttgaa tcccacggat aaactacaca aaagcaa 1607 2 1359867

<210>3 <211> 1607 <212>DNA <213> 虹彩病毒（iridovirus) <220> <221> gene <222> (1)...(1607) <223> RBIV-AY532606 <400〉3 aagtgggtct ccatcgcatc aaacgcggag atgtcgatga acccactggt tacgttcgca 60 cctgagattg cagacatgat gacaatgata cttttatata tgatcggcct cgtttttctt 120 ctggaaacct gcactcagca agaccaacag tccgaccgcg gcaatggtgc ctcctgtgcc 180 caggactaca ttggtggccg tggtgtcaca cggcatgccc gccaccacgg tcgtgttggg 240 gtctctcggc gtgaacgcag tgtctatgtt caaggtgccg ggcacgtcct gccacgtgcc 300 gtcagccttc ttaatacgca ccttgtggtt gaggcgagag cgctcgtagt agaacatgat 360 ccacacatcg tagcctccga gcgccccgcc gtggccccag cccagcttct ttgcggcacc 420 caaaacatcg ggcttgatgt cctgcacctt gcccctgcgc tgccaaccgt cctcgttcat 480 cacatagtac gtaccgcttt cactgtgcag gtacgcgtcg cccggtttca ttgtggccgt 540 cgtgccagag tccttggggt caggcttggt gtctgtggcc aggttcagct tgtagcgtat 600 cataggcttg acaacgacgg gcagttgcgc gggcatgacg tatgcggtgg ccttgggcag 660 cagcacaggt gcgccgtccg agtcagcctt gtaccgctca tagtacacca tctggccctg 720 ggccagcttc gccaccgcct ggtccagggt gacgtcggtg aacttttgcg cgctgtccag 780 tgagcccggg gcgacggcat gcggatacac caagggctca gcaccctttg cctgacgaca 840 cgtgaacttg aaagcatacg ccgccacgcc tatgccaccc accaagagca ccatgccgat 900 taccccacgc ttgcccaata tggagccggt ggccaggggc atgccgatga gcaggcccgc 960 cagcacggcg gccagctgcc acaggtccac accctgggcc ttggcggtgg ccagctgctg 1020 aagcttgttc accacatcct gcatgctgct gctgctggcc gtggcgtcct gcacgcactg 1080 cgacagcgcc gacacaaaga tacgcagcac agagtcctgg atgacgacgt tgcccgtcac 1140 attgtccaca gagatcacct gtttggtgtt gacctcgccg ctgcacgtca gcgtcatgtt 1200 gttgacaatg cgggacgtca cactgagaaa ttgctttatg ctgtttgtgg ccgaggcgta 1260 ctgaccaaag ttgatgccgc tcaccacgga cgccgcctgc tgtgccatgt cgttgagcac 1320 cttctgctga gtctcttggt tggccagggc cttcatggtg gcctgaaggt tcacggtgac 1380 cgtctgctcc atggtcacac ccttgataat cacatcacct ttaacgtgag atatattgat 1440 gatctgcgac gagtctgcgg tcagcttggt gttgttggca atgttggatg tggcctcggc 1500 cacggccttc aggacagtgt cgacaccgtt gaatgactgg gcagcaccca tggctatgtt 1560 tttnnnnnnn nntttttgaa tcccacggat aaactacaca aaagcaa 1607 <210>4 1359867

<211> 1607 <212>DNA <213> 紅彩病毒（iridoviius) <220> <221> gene <222> (1)...(1607) <223> LYCIV-AY779031 <400>4 aagtgggtct ccatcgcatc aaacgcggag atgtcgatga acccactggt tacgttcgca cctgagatcg cagacatgat gacaatgata cttttatata tgatcggcct cgtttttctt ctggaaacct gcactcagca agaccaacag tccgaccgca gcgatggtgc ctcccgtgcc caggaccaca ttggtggccg tggtgtcaca cggcattcct gccaccacgg tcgtgttggg gtctctcggc gtgaacgcag tgtctatgtt caaggtgccg ggcacgtcct gccacgtgcc gtcagccttc ttaatacgca ccttgtggtt caggcgagag cgctcgtagt agaacatgat ccacacatcg tagccgtcga gcgccccgcc gtgaccccag ccgagcttct ttgcggcacc caaaacatcg ggcttgatgt cctgcacctt tcccctgcgc tgccaaccgt cctcgttcat cacatagtag gtaccgcttt cactgtgcag gtacgcgtcg cccggcttca ttgtggccgt cgtgccagag tccttggggt caggcttggt gtctgtggcc aggttcagct tgtagcgtat cataggcttg acgacgacgg gcagttgcgc gggcatgacg tacgcggtgg ctttgggcag cagcacaggt gcgccgtccg agtcagcctt gtaccgctca tagtacacca tctggccctg ggccagtttt gccaccgcct ggtccagggt gacgtcggtg aacttttgcg cgctgtccag cgagcccggg gtcacggcat gtggatacac caagggctcg gcgccctttg cctgacgaca catgaacttg aaagcatacg ccgccacgcc tatgccaccc accaagagca ccatgccgat taccccgcgc ttgcccaata tggagccggt ggccaggggc atgccgatga gcaggcccgc cagcacggcg gccagctgcc acaggtccac gccctgggcc ttggcggtgg ccagctgctg aagcttgttc accacatcct gcatgctgct gctgctggcc gtggcgtcct gcacgcactg cgacaaggcc gtcacaaaga tgcgcagcac agagtcctgg atgacgacgt tgcccgtcac attgtccaca gagatcacct gtttggtgtt gacctcgccg ctgcatgtga gcgtcatgtt gttgacaatg cgggacgtca cactgagaaa ttgctttatg ctgttggtgg ccgaggcgta ctggccaaag ttgatgccgc tcaccacgga cgccgcctgc tgtgccatgt cgttgagcac cttctgctga gtctcttggt tggccagggc cttcatggtg gcctgaaggt tcacggtgac cgtctgctcc atggtcacgc ccttgataat tacatcgccc ttaacgtgag atatattgat gatctgcgac gagtctgcgg tcagcttggt gttgttggcg atgttggatg tggcctcggc cacggccttc aggacagtgt cgaccccgtt gaatgactgg gcagcaccca tggctatgtt ttttagctgg attttttgaa tcccacggat aaactacaca aaagcaa <210>5 <211> 1607 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1607 4 1359867

<212>DNA <213> 虹彩病毒（iridovirus) <220> <221> gene <222> (1)...(1607) <223>RSIV-AB060362 <400> 5 aagtgggtct ccatcgcatc aaacgcggag atgtcgatga acccactggt tacgttcgca cctgagatcg cagacatgat gacaatgata cttttatata tgatcggcct cgtttttctt ctggaaacct gcactcagca agaccaacag tccgaccgca gcgatggtgc ctcccgtgcc caggaccaca ttggtggccg tggtgtcaca cggcattcct gccaccacgg tcgtgttggg gtctctcggc gtgaacgcag tgtctatgtt caaggtgccg ggcacgtcct gccacgtgcc gtcagccttc ttaatacgca ccttgtggtt caggcgagag cgctcgtagt agaacatgat ccacacatcg tagccgtcga gcgccccgcc gtgaccccag ccgagcttct ttgcggcacc caaaacatcg ggcttgatgt cctgcacctt tcccctgcgc tgccaaccgt cctcgttcat cacatagtag gtaccgcttt cactgtgcag gtacgcgtcg cccggcttca ttgtggccgt cgtgccagag tccttggggt caggcttggt gtctgtggcc aggttcagct tgtagcgtat cataggcttg acgacgacgg gcagttgcgc gggcatgacg tacgcggtgg ctttgggcag cagcacaggt gcgccgtccg agtcagcctt gtaccgctca tagtacacca tctggccctg ggccagtttt gccaccgcct ggtccagggt gacgtcggtg aacttttgcg cgctgtccag cgagcccggg gtcacggcat gtggatacac caagggctcg gcgccctttg cctgacgaca catgaacttg aaagcatacg ccgccacgcc tatgccaccc accaagagca ccatgccgat taccccgcgc ttgcccaata tggagccggt ggccaggggc atgccgatga gcaggcccgc cagcacggcg gccagctgcc acaggtccac gccctgggcc ttggcggtgg ccagctgctg aagcttgttc accacatcct gcatgctgct gctgctggcc gtggcgtcct gcacgcactg cgacaaggcc gtcacaaaga tgcgcagcac agagtcctgg atgacgacgt tgcccgtcac attgtccaca gagatcacct gtttggtgtt gacctcgccg ctgcatgtga gcgtcatgtt gttgacaatg cgggacgtca cactgagaaa ttgctttatg ctgttggtgg ccgaggcgta ctggccaaag ttgatgccgc tcaccacgga cgccgcctgc tgtgccatgt cgttgagcac cttctgctga gtctcttggt tggccagggc cttcatggtg gcctgaaggt tcacggtgac cgtctgctcc atggtcacgc ccttgataat tacatcgccc ttaacgtgag atatattgat gatctgcgac gagtctgcgg tcagcttggt gttgttggcg atgttggatg tggcctcggc cacggccttc aggacagtgt cgaccccgtt gaatgactgg gcagcaccca tggctatgtt ttttagctgg attttttgaa tcccacggat aaactacaca aaagcaa 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1607 5

Claims (1)

1. 第097100811號專利申請案 100年11月14日修正替換頁 、申請專利範圍·· 一種虹彩病毒之次單位疫苗（subunit vacCine)，係 用以冶療或肋虹彩病毒所引起之魚類疾病，該次 位疫苗包括： 主SEQ ID NO. 1及其突變序列之一所編碼之虹彩 f毒外套膜上之蛋白質，其中，該突變序列係與該SEQ N(M之序列相同性為_以上，且該蛋白質係為 錐體膜蛋白；及 醫藥上可接受之載劑。 2.如申請專利範圍第丨項之次單位疫苗其中，該蛋白 質之製備方法係包括下列步驟： 將對應於該蛋白質之基因片段構築於表現載體； 將該載體轉殖至宿主細胞，以表現該抗原之蛋白 質；以及 自該宿主細胞分離該抗原之蛋白質。 3.如申請專利範圍第丨項之次單位疫苗，其中，該魚類 係為淡海水魚類或海水魚類。 4·如申請專利範圍第3項之次單位疫苗，其中，該魚類 係為石斑魚類、鱸科、嘉鱲魚、黑鯛、青甘鰺、紅甘 鰺、條紋鰺、黃鰭鮪、黃錫鯛、鸚歌魚、三線雞魚、 赤鰭笛網或虎河勝。 5. 如申請專利範圍第1項之次單位疫苗，其可經由注 射、口服及/或浸泡方式而投予至該魚類。 6. —種虹彩病毒之DNA疫苗（DNA vaccine)，用以治 110706(修正版) 1 1359867 _ -* -- ' 第097100811號專利令請案 • 年η月14曰修正替換頁 , 或預防虹彩病毒所引起之魚類疾病，該ί)ΝΑ疫苗包括： ^ 編碼虹彩病毒外套臈上之錐體膜蛋白之去氧核 糖核酸（DNA)或該DNA之部分片段，其中，該DNa 之序列係SEQ ID NO. 1及其突變序列之一，且該突變 序列與該SEQ ID NO. 1之序列相同性為8〇%以上； 用以攜帶該DNA之載體；以及 醫藥上可接受之載劑。 7·如申清專利範圍第6項之DNA疫苗，其中，該突變序 列係為不改變其所編碼之錐體膜蛋白之折疊及構形 (conformation)之突變序列。 8’如申請專利範圍第6項之DNA疫苗，其中，該魚類係 為淡海水魚類或海水魚類。 9.如申請專利範圍第6項之DNA疫苗，其中，該魚類係 為石斑魚類、鱸科、嘉鱲魚、黑鯛、青甘鰺、紅甘鰺、 條紋鰺、黃鰭鮪、黃錫鯛、鸚歌魚、三線雞魚、赤鰭 笛鯛或虎河豚。 1〇·如申请專利範圍第6項之DNA疫苗，其可經由注射、 口服及/或浸泡方式而給予。 U.—種製備如申請專利範圍第6項之DNA疫苗之方法， 係包括下列步驟： 將該DNA構築於表現載體；以及 將構築有該DNA之表現載體與醫藥上可接受之載 劑混合。 2 110706(修正版) 1359867 I ' *

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