TWI335938B - Rna replication and amplification - Google Patents

Description

1335938 A7 B7 五、發明說明（1) 【本發明之背景】 基因訊息可在許多應用方面用已分析，包括醫學診斷、檢 定基因型以及法庭鑑定等。而藉由核酸倍增（nucleic acid amplification)有助於核酸樣品之高產量分析。 許多技術可用來做到核酸倍增。聚合酶連鎖反應（PCR, polymerase chain reaction; Saiki, et al. (1985) Science 230, 1350-1354)以及接合酶連鎖反應（LCR，ligase chain reaction. 鱗 Wu. et al. (1989) Genomics 4, 560-5691 Barringer et al. (1990), Gene 1989, 1 17-122; F. Barany. 1991, Proc. Natl. 5W. tASW 1988, 189-193)利用不同溫度之反應循環而驅 動許多次合成反應。以基因轉錄（transcription)為基礎之方 法，利用核畴核酸聚合酶（RNA polymerase)以完成RNA合成反 應，來倍增核酸的數量（U.S. Pat. No 6,066,457; U.S. Pat. No 6,132,997; U.S. Pat. No 5.716785; Sarkar et al., Science{\9Z9) 244:331-34; Stofler et al., 5^enc^(1988)239:491)，其係利用基因轉錄、反轉錄、以及以 ® 去氧核醣核酸水解酶H(DNaseH)為基礎來分解DNA等步驟，以 達成倍增DNA樣品數的目的。其他的倍增方法包括 RCA(rolling cycle amplification; U.S Patent Nos. 5S854,033 及 6,143,495)以及 SDA(strand displacement amplification; U.S. Patent Nos. 5,455，1166及5,624,825) ° 【本發明之概述】 _______4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐) ---------------裝---------訂---------線 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 A7 B7 五、發明說明（2) 本發明部分係基於以轉錄為基礎之倍增核酸方法之發现。 該方法特別適用於多種核酸分析的情況。該方法一般稱為「序 列特定轉錄倍增」（sequence specific amplification by transcription)，以下簡稱為SSAT。在本方法中，被選定的核 酸連接到一寡核苷酸，該寡核苷酸包括一啟動子序列以供轉錄 該選定的核酸。 在某些具體例中，例如轉錄連鎖反應（TCR，transcripti〇n A chain reaction)，該轉錄過程係用以驅動一連鎖反應。欲執行 TCR，可使用一啟動子核酸之固相支托’例如在稱為「單〆及 雙重啟動子 SP-TCR方法（Solid Phase Transcription Chain

Reaction )之中所述。本發明之不同態樣可見於以下之概述以 及專利說明書之其他部位。 在本發明之一觀點中，本發明之特徵在一方法’其包栝： 將樣品核酸切斷（cleaving) ’以產生斷裂之核酸片段；使用核 酸水解酶處理該斷裂核酸片段’該核酸水解酶優先切割雙股核 酸而非單股核酸，而產生處理後樣品核酸；黏合（anneal)—寡 核苷酸至該處理後樣品核酸中’該募核苷酸（亦稱為SSP募核酸) 具有一啟動子區域以及一標的結合區域，該標的結合區域會結 合至一第一標的位置；以及利用一RNA聚合酶轉錄該黏合處理 核酸樣品’以產生該核酸樣品2RNA複本’其中該^^八聚合酶 能辨認該啟動子區域。本方法在倍增樣品核酸時非常有用。 在一具體例中，該方法更包括，在轉錄之前或轉錄的同 時，利用一DNA聚合酶以延長該黏合寡核苷酸及/或該黏合樣品 核酸。該DNA聚合酶可缺乏3端至5端外切能力。舉例而言’該 5 _ _ 本紙張尺度麵中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公备) " ' --------------^---------IT---------@ 請先讀背®產意囊再填寫本寅各欄 1335938 A7 B7 五、發明說明（3) DNA聚合酶可為五.co//之DNA聚合酶I之Klenow片段，或者 一經修改或未修改之嚨菌體DNA聚合酶如SEQUENASETM。在 一具體例中，該方法包括在轉錄之前從該黏合及/或未延長之樣 品核酸股中，分離出該已延長之核酸股。在另一具體例中，只 有該黏合樣品核酸被延長，亦即使該啟動子區域為雙股並具有 機能。該SSP寡核苷酸可具有一 3端修飾，以避免其從3端開始 延長 該SSP寡核苷酸之啟動子區域以及該標的結合區域如下所 述 在一具體例中，該SSP寡核苷酸包括一連接至接受劑之厘 基。該接受劑可被連接至一固體支托，例如一有孔小珠或一斗 面。在一具體例中’該團基以及接受劑係為一特定結合配對， 例如biotin及avidin(或者streptavidin)、糖及iectin或其餘你 子。在另一具體例中，該團基與該接受劑係對彼此有化學活 性。例如，該團基可為一氨基，而該接受劑可為一被活化之承 代基’包括一 N-取代磺氨基上之電子收回基（electr〇n withdraw)。 該方法可在溫度低於50、45或40°C之下執行。換句話說， 在某些貫施狀況下，該反應溫度從未超過上述溫度。該方法可 在等溫（isothermal)或實質上等溫之狀況下進行。在一個或多個 反應中可進一步加入並移除酵素，其係藉由流動或改變培養基 而元成’其中该培養基係接觸於該固態支把。在一具體例中， 其上固疋有SSP寡核苷酸之小針或其餘襄置，可從一個反應混 合物中移至另一反應混合物中。 本紙張尺度獅巾國國家標準（CNS) A4規格（21GX297公釐） 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 裝 線！ 1335938 A7 B7 五、發明說明（4) 該切斷方法可包括剪力、超音波或利用一如内切酶之切斷 劑而完成’其中該内切酶可舉例如一個或多個限制内切酶 (restriction endonuclease)。該些限制内切酶特別可辨識一具 有四、五或六個鹼基對的特定定位，並切斷DNA以產生凹端 (recessed ends)，例如5端突出，亦可產生平整末端（blunt ends)。該樣品核酸可為DNA或RNA。在一較佳具體例中，該 樣品核酸為DNA ’例如基因體DNA、cDNA、或重組DNA。 ► 該切斷步驟可產生平均長度為2〇〇〇、1〇〇〇、7〇〇或500個 核苷酸之片段’或者可產生位於目標區域中、長度少於2〇〇〇、 1000、700或500個核苷酸的片段。該方法可包括將該切斷劑去 活化’及/或從該切斷劑中將該被切斷之核酸分離出來。 該用以處理被切斷核酸之核酸水解酶，係優先切斷雙股核 酸，而非單股核酸。在此所謂「優先切斷」係指受質2Km至少 相差五十倍。該核酸水解酶可為高度連績反應。 該核水解可為外切酶，例如iambda外切酶，或是T7外切 f 酶。 該核酸水解酶可被連接至一固態支托，例如一有孔小珠， 如一順磁性小珠。該方法可進一步包括從該以處理樣品核酸 中，分離出該核酸水解酶。該方法可包括去活化該核酸水解 酶0 該方法可進一步包括針對該尺]^八複本進行反轉錄，及/或 利用一核醣核酸水解酶處理該^^八複本，例如DNaseH。在另 一具體例中，該方法可進一步包括針對該RNA複本進行基因轉 #(translating)。在又一具體例中，該方法可進一步包括分析 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 裝 H - - i n · n I 1=口 線！

1335938 A7 B7 五、發明說明（5) 該RNA複本或DNA複本。該分析步驟可包括決定單一核苷酸或 針對一個區域的核苷酸進行定序。該分析可指出是否為對偶基 因，或是否有基因多型態。 在本發明之另一觀點中，本發明之特徵為—方法，其包 括：提供一具有複數個定位（address)之固態支托；在每一該複 數個定位中，沈積或合成一寡核苷酸，該寡核苷酸包括一5端啟 動子區域以及一 3端標的結合區域，該標的結合區域係與標的位 丨置（target site)互補；將一樣品核酸與該固態支托接觸；針對每 一複數個定位t的寡核苷酸，允許該標的結合區域與該樣品中 之標的序列黏合（在樣品中具有標的序列的情況下）；利用一 DNA 5^合5$使s玄已黏合之樣品核酸延長（例如使用該雙股寡核 苷酸中之啟動子區域）；以及利用一 RNA聚合酶以轉錄該已黏 合之樣品核酸’其中該RNA聚合酶可辨識該啟動子區域。 在一具體例中，在該些複數個定位中的寡核苷酸具有相同 之啟動子區域。在另一具體例中；，該些寡核苷酸之啟動子區域 彼此不同。 在該延長步驟或轉錄步驟之前，該方法可包括分離出未黏 合之樣品核酸，或將已黏合及未黏合之樣品核酸分離（例如在 延長該已黏合寡核苷酸之後）。 在一具體例中，係利用一DNA聚合酶以延長該募核苷酸。 在另一具體例中，該固態:支托係位於一液流槽（flow chamber)中。當轉錄產物從該液流槽中移除時’提供該RNA聚 合酶以及核醣核苷酸至該液流槽中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21〇x297公釐） n n 1^1 H n - I I I . - I I - - - HI - - . I ’ . I - - 11 -- - I I n 請先馨面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 A7 五、發明說明（6 在本發明之又一觀點中，本發明提供一方法其包括以下涉 驟·提供一具有複數個定位（address)之固態支托，其中每一」 粍包括（1)〜第—核酸片段’該核酸片段具有（a) — 5端啟動子C 域以及（b)〜可變動之3端標的結合區域，以及（2)—第二核酸j 段’該第二核酸片段係結合至該5端啟動子區域；黏合該樣^ 核魷至°玄固態支托；將該第二核酸片段之5端與該已黏合樣， =酸之3端連結；選擇性地移除未連結及/或未黏合之樣品4 酉文，以及利用_RNA聚合酶轉錄該已連結之樣品核酸，其中售 RNA聚合轉可辨識該$端啟動子區域。 單股^酸·該第—?諸以及該第二㈣片段係· 曲部分包括一☆列如一U形單股核酸。該ϋ形單股核酸可在； 固定支托之團Γ修飾之核普酸或骨幹。該修飾包括一連接扪 該連結可被〜 熱穩定黏’例如Τ4 DNA黏接酶，或- 非常有用，可^f穩絲接酶在溫度高於听之黏合環境· 曰加黏合特殊性。 在一具體例中， 態支托可在連結讀梅^法包括保存或保存該固態支托。該f 轉錄之前，或轉錄之^核^之後的任一時刻保存起來，例如^ 再本發明之又〜 步驟：提供—具有財本發明提供—方法，其包括以_ 包括一第一核酸片p位(addreSS)之固態支托，每一❹ 域以及（b) —可變重 該第核μ段具有啟動子u 態支托；黏合-第_<3端標的結合區域；黏合樣品核酸至該g 〜核酸片段’該第二核酸片段會與該5端啟秉 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 裝 線！ 1本紙張尺度適用中國國家標準 -----9 A7 B7 S'發明說明（7) • 區域結合，將該第一核酸片段之5端末端連結至一以黏合之樣 核酸之3端；選擇性移除未連結及/或未黏合樣品核酸；以及 利用一RNA聚合酶轉錄該已連結之樣品核酸，其中該RNA聚合 峰可辨識該5端啟動子區域。 在本發明之另一觀點_，本發明提供一分析基因多型態之 方去。該方法包括：對每一個基因多型態而言，確定一片段其 兩端夾置有限制酶作用序列，並包括該基因多型態之序列，以 《.使6玄二限制酶作用序列彼此相隔少於2000、1〇〇〇、700、500 個核苷酸；合成一啟動子寡核苷酸其具有（&)一5端啟動子區域 乂及（1?) 一可變動3¾¾彳示的結合區域，該可變動之3端標的結合區 域係接近或位於該片段一端之側。選擇性地連接該啟動子寡核 苦Ssc至一固癌支托，將樣品核酸黏合至該啟動子寡核苷酸；將 DNA聚合轉接觸該已黏合之樣品核酸，以延長該已黏合之樣 品核酸’並使該啟動子成為雙股核酸；以及利用一特定於該啟 動子之RNA聚合酶，以轉錄該已黏合之樣品核酸。 ψ 在本發明之另一觀點之中，本發明之特色在於一倍增一單 股核酸之方法。該方法包括：將一單股核綾黏合至一第一核苷 酸’該第一核苷酸結合至該單股核酸；延長該單股核酸之3端以 形成一第一核苷酸-單股之複合物；利用一第一RNA聚合酶轉錄 該第一核苷酸·單股之複合物，以生成一第一RNA單股；將該第 一RNA黏合至一第二核苷酸，其中該第二核苷酸係結合至該第 一RNA ;反轉錄該第一RNA以生成一第一複本單股；使該第一 複本單股形成雙股，以產生一第二核苷酸-複本單股之複合物， 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐) ---------------¾ 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 訂---------線— 1335938 A7 ------- B7 五、發明說明^17 — ~' 或者將一互補於該第二核苷酸啟動子區域之第三核苷酸黏合； 以及，轉錄該第二核苷酸_複本單股之複合物。 •该第一核苷酸包括一啟動子區域，以及一標的結合區域， 其中該啟動子區域獨特地被一第一RNA聚合酶所辨認，而該標 的結合區域係結合至該單股之3端。該第二核普酸包括一啟動子 區域，以及一標的結合區域，其中該啟動子區域獨特地被一第 二RNA聚合酶所辨認，而該標的結合區域係結合至該第一rna Φ單股之3端。該第一及第二核苦酸可結合至標的之接近〕端位 置，例如接近單股末端之位置，或者接近一單股之末端並且離 末端短於整個單股長度25%之位置。該第__及/或第二核苦酸可 包括-間隔序列，例如在該啟動子以及支托結合位置之間，具 有至少、6、12、18或24個核苷酸。 該方法可在一勻相反應混合物中進行。 在本發明之另一觀點中，本發明之特色在於一套件，其包 括：（1) 一原核（pr〇kary〇tiC)RNA 聚合酶；（2) — DNA 聚合酶， ❶其缺乏3端往5端外切酶能力；以及（3)一外切酶，該外切酶可連 續反應’並優先水解雙股核酸而非單股核酸。 該套件可更包括：-啟動子核苦酸其包括⑷一 5端啟動子 區域其可被-原核RNA聚合酶所辨識，以及（b)一可變動3端標 的結合區域。在另-具體例中’該套間包括複數個啟動子寡核 苦酸。在另-具體例中’該套件包括一固態支托，其連結至該 啟動子募核苷酸。 在另-具體例中’該套件更包括核酶核酸及/或去氧核醣 核酸。在又-具體例中，該套件更包括—容器其包括複數個限 _________η 本紙張尺度適用中Μ國家標準（CNS) Α4規格（210x297公------— 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各棚 裝---------訂---------線！ 1335938 A7 B7 五、發明說明（9) 制内切酶。該套件可更包括一個或多個反應容器，例如微量滴 定盤、strips、多孔盤、cassettes以及微流體裝置等。 ---------------装 請先讀背面之注意事項ΰ寫本頁各脚 在另一觀點中’本發明以一非自然發生RNA單股螺旋鮮體 (pool)為特色。 該RNA單股螺旋係在長度上短於1〇〇〇、7〇〇或500個彳亥# 酸。在一具體例中，至少一個或全部RNA單股螺旋具有~核峻 序列’其未見於完全加工之mRNA。例如，該些RNA單股螺旋 由基因體DNA之片段轉錄而來，該基因體DNA包括介入子 (introns)及/或調控區域，例如轉錄調控區域。該rnA單股螺旋 可包括一常見之5端’例如對應於一 SSP募核苷酸中之鍊結序 列。該常見之5端可具有2至50個核苷酸之長度。該5端可包括 一内部核醣體（ribosome)入口定位，一起始曱琉胺酸 (methionine)等。該RNA可為去帽蓋之RNA。 線！ 在本發明之又一觀點中，本發明之特色為一反應混合物其 包括：（1)一原核RNA聚合酶；以及（2)複數個寡核苷酸，每一 寡核苷酸包括：（a) — 5端啟動子區域’其可被該原核rna聚合 酶所辨識；以及（b)—可變動之3端標的結合區域。該混合物可 更包括：（3)核醣核苷酸。在另一具體例中，該混合物更包括： (4)一DNA聚合酶其缺乏3端至5端外切酶能力；以及去氧核 醣核苷酸。在一實施例中’該混合物可用以完成一勻相反應， DNA及RNA在其中合成。 該反應混合物可更包括一第二RNA聚合酶以及複數個第二 寡核苷酸，每一該寡核苷酸包括（a)5端啟動子區域其可被該第 二RNA聚合酶所辨識’以及（b) —可變動3端標的結合區域。

I 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 1335938 A7 B7 S、發明說明（ίο ) 在一具體例中’該複數個第二寡核苷酸之標的結合區域可 結合至一單股螺旋’其中該單股螺旋係與結合至該複數個第一 募核苦酸4示的結合區域之序列互補。The two respective target binding regions can be within about 4,2,1,0.7,0.5,0.3, or 0.1 kb or one another. 在本發明之又一觀點中，本發明之特色在於一固態支托， 其包括複數個定位，每一定位均有一寡核苷酸連接其上，該寡 .核苷酸具有（a) — 5端啟動子區域，其可被一原核RNA聚合酶所 辨識，以及（b)—可變動之3端標的結合區域。該可變動之標的 結合區域之長度可在12-50個核苷酸之間。該標的結合區域在黏 合至其標的時，具有一溫度Tm其介於24_85<>c之間，或介於38_ 70 C之間。該固態支托可為一小珠、一基質或一平面表面例如 玻璃載玻片、膜、塑膠、或一可彎曲之薄板❶ 在本發明之又-觀點中，本發明之特色在於一固態支托盆 包括複數個第-及第二定位（address)，其中每一定位有一募核 >苷酸連接其上，該募核脊酸具有⑷一 5端啟動子區域其可被一 原核鹽聚合酶所辨識；以及⑻―可變動之3端標的結合區 域。在每-複數個第-定位中，該連接之寡核苦酸之啟動子區 域可被-第-RNA聚合酶所辨識。在該複數個第二定位上，該 連接之寡核*酸之啟動子區域可被__第二RNA聚合酶所辨識。 在-具體例中，該複數個第一募核苦酸之標的結合區域會 結合至-標的位置’該標的位置係位於一單股核酸之上，該單 股核酸係與該複數個第二募核鎌之標的結合區域所結合^ 的位置彼此互補。 D ^ 13 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規;(^7^x297·^酱） --------------装---------訂---------線丨 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938

五、發明說明（11 方法 本發明亦包括⑽固定支托的方法，例如sp·

TCR 本發明亦以一套件為特 W色’該套件包括一第一固態支托以 及一第一固L支托胃第〜固態支托係一 ssp寡核苷酸之陣 列。該第-U托係物針之陣列，每—探針會摘測一 對偶基因，該對偶基因係祜， t 被s亥SSP寡核苷酸陣列所倍增之片 段。 在本發明之另一觀點中，丄 Λ τ 本發明亦以一系統為特徵，該系 統包括卜處理器；-陣列合成器（繼y synthesizer);以及一 保存器’該保存it係_保存基因多型態之資訊。該處理器係 與該陣列合成器連接。該陣列合成器接收輸人資訊以建構-陣 列，該陣列在賴個陣以心伽ss)中之每-定位具有-以 5端鑲嵌之SSPS核料。⑦處理器可湘軟體設定以接收一系 列之多態樣（P—。咖SmUx供分析；查詢或計算—合叙 SSP寡核苷酸；以及傳送指A 5 α Α人 7至該陣列合成器，以合成—且有 該系列多態樣之SSAT倍増用 、另 丨子（primer)之陣列，或合成一 偵測用引子之陣列。 該系統可更包括一陣列掃推器，其並與該處理器連接。兮 陣列掃描器可傳送料—陣^結果至該處㈣。該結^ 被保存在一結果保存器中。 在本發明之又-觀點中，本發明以一方法為特色其包括： 提供-具有寡核普酸連結其上之固態支托；黏合一包含有⑽A 之樣品至该固悲支托上，利用一RNA導向之dn聚合酶延長該 被連接之寡核苦酸’以建構該些RNA之DNA複本；合成互補於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） ---------------裝---------訂---------線- 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 A7 B7 五、發明說明（12 ) 該些DNA複本之DNA股；以及利用一可辨識該啟動子區域之 RNA聚合酶以轉錄該些互補之DNA股而產生RNA複本。該樣品 t之RNA可包含例如從哺乳類組織樣品中所取得2RNa »該樣 品申之RNA可從少於1000、1〇〇、或1〇個細胞中取得。例如， 該樣品中之RNA可從約1、2、3或5個細胞中取得。該mRNA可 少於1 Ong。在一例子中，該組織係一正常組織。在另一例子 中，該組織係一腫瘤或變形組織。該方法可更包括在轉錄前保 0 存該固態支托至少12、24、48、100或200小時，例如在某些例 子申至少保存六個月，或至少一年。 在一具體例中，該被連結之寡核苷酸均一致。至少部分該 被連結之寡核苷酸可包括一 T7啟動子，一 homopolymeric T tract，以及一終端A、G或C。在一具體例中，舉例而言，該被 連接之寡核苷酸係藉由其5端以共價鍵結至該固態支托上。在另 一具體例中，該寡核苷酸並非以共價鍵結至該固態支托上。 該RNA複本可被標記。本方法可更包括將該被標記之 L RNA複本與一標的雜和（hybridizing)，該標的可舉例如一渡 器、一核酸陣列、或一包含有標的核酸之溶液。 該固態支托可為一多孔盤中之一孔之表面。該固態支托可 至少部分為玻璃或塑膠所構成。 在一具體例中，該分法更包括將一以標記之探針與該固態 支托雜和。 在本發明之另一觀點中，本發明以一方法為特色，其包 括：提供一具有寡核苷酸連接其上之固態支托；將一包含有 RNA之樣品黏合至該固定支托上；利用一RNA導向之DNA聚合 15 — __ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） ---------------壯农---------訂---------線| 請先馨面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 A7 B7 五、發明說明（13 ) 酶延長該被連接之寡核苷酸，以建構一該RNA之DNA複本；合 成互補於該DNA複本之DNA股；黏接一接合子（adaptor)於該 DNA複本上，並利用一可辨識該啟動子區域2RNA聚合酶轉錄 該互補單股，以產生一RNA複本。該接合子可更包括一啟動子 區域，供一第二RN A聚合酶使用。該轉接器可更包括一獨特之 限制酶辨認位置、一轉譯控制序列，或一含有一純化標籤 (purification tag)訊息之序列。 I 該方法可更包括反轉錄該RNA複本以生成第二DNA複 本，以及利用s亥第二RNA聚合酶以轉錄該第二dnA複本。

在本發明之又一觀點中，本發明以一方法為特色其包括： 提供一具有寡核苷酸以5端連接其上之固態支托；將一包含有 DNA之樣品黏合至該固態支托；以及利用_Rna導向之DNA 聚合酶延長該被連接之寡核苷酸，以建構該樣品中RNA2DNA 複本。特別地，本發明以一固態支托為特色，該固態支托係以 本說明書中所述之方法製造，例如前述方法之一。 _ 本發明亦以-套件為特色其包括-感測探針(w pr〇be) 之陣列’以及一反感測探針（anti-sense probe)之陣列，其中對 該些感測探針陣列中之每一至少10、20、30、4〇、6〇或8〇%而 言’在反感測探針陣列中存在有一對應且互補之探針。 在另一觀點中，本發明以一方法為特色，其包括：提供一 核酸樣品；製備一第一及第二單股核酸群體，其中該第一群體 中之單股核酸係與該第二群體中之單股核酸互補；以及利用一 第一探針以評估在該第一群體中複數個種類之豐富性，與利用 一第二探針以評估在該第二群體中複數個種類之豐富性，其中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------壯衣 • I ^^1 I-I -1 - ^^1 n I I". Λ . I ^^1 ^^1 I - n i^K 請先馨面之注意事項再填寫本頁各欄 具體例中，該第一 探針係二單:―核:可為通或 可更包括決定 以及 五、發明說明（l4 該第一及第·_ _ 〜探針實質上彼此互補 而該第二探針 、第一平面陣列 ^ 。連接於一第二平面陣列。該方 一分數，其/ίΓ可更包括 ·'·、一給定序列對一相對應第一探針 該給定序列對 1 T之雜和程度 』蚵—相對應第二探針之雜和程度 更包括重複廊用， 吐 函數。該方法可 〜用該方法於一第二樣品，並將一仏 一及第二樣α击 、、°疋序列在該第 列在該第^第關聯比率，比對於—互補於該^序列之序 及第二樣品中之關聯比率。 錄產^隼另二觀點中’本發明以—方法為特色其包括：利用一轉 中之反感i ρ°°υ中之感測複本以及該轉錄產物集合 個基因=來評估一轉錄程度。該方法可更包括針對複數 基&該—複本及反感測複本所_出之轉錄程度。該 比較動作可包括評估不同基因之間所感測出之轉錄程度比率。 此說明書所描述之方法可製造相關單股核酸之—分佈狀•離 (population)。例如，該核酸皆可具有相同之單股或雙股狀態 (strandedness)。在許多具體例中，該生成物核酸為汉^^八，其 可利用酵素方法與輸入之DNA做辨別。因此，任何剩餘的輸入 DN A可以利用水解而單一地移除。此外，該方法特別適用於多 態樣分析，並因此可用於如多核酸多型態之高產量分析之類的 應用。多態樣分析的挑戰可見於如Pastinen e/ α/. ((2000) ι〇: ι〇3 1-1042)等文章中。 此外，本發明之許多具體例並不需要PCR或其他熱循環反 應’因此許多（有時候是全部）步驟可以在等溫狀態下進行， 17 本紙張尺度適用中國國家標準(石夜1 A4規格（210x297公Sf n n ^^1 ϋ n ^^1 m n ^^1 I n I— I n I— · n ^^1 - - ^^1 I J 1^1 _ --Π 竊 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各攔 1335938 A7 B7 五、發明說明（15 ) 典型地是在溫度如4、16、25、37、或42°C的狀況下。反應可 以進行不同之時間長度，例如至少、2、4、6或12小時。 本方法之另一優點在於本方法與RNA相比，更易於倍增 DNA。尤其，基因體DNA或cDNA可被用以分析，舉例而言， 基因多型態。cDNA可從單一細胞獲得，或從一小數目之細胞 (例如少於106、105或1000、100、或50個細胞）中獲得。 本發明亦提供一固態支托，其係為「啟動子引子晶片」 O (promoter primer chips)。該些晶片可被大量製造，並用以搜 尋（query) —基因組（genome)之相關次組合（subset)。另外， 如以下所提出的，一旦與一樣品核酸啟動（prime with)或黏接 於一樣品核酸之後，該晶片可被保存也因此可將該樣品保存。 之後，該保存晶片可用作額外之核酸製造。 該晶片以及其他固態支托亦優勢地從一複合樣品中濃縮出 相關標的核酸。在開始倍增之前_，從一複合樣品中移除無關之 核酸可進一步降低背景信號之可能性。在倍增循環的早期出現 φ 之一背景元件，可能比所需要之種類還要顯著。某些如T7 RNA聚合酶之類的RNA聚合酶，可以針對每一樣品在一次轉錄 反應中製造大於600個複本。因此，進行二或三次以轉錄為基 礎的倍增循環即可達到非常高的產量。如以下舉例所示，該方 法之靈敏度極高。例如，一特定核酸片段竒從人類基因體DNA 100ng中倍增，或是從一如單細胞之cDNA亦可。 更進一步之一個優勢在於，該方法使得一可再製之核酸資 料庫（library)之製造與保存，不需利用細胞也可完成。該資料 庫可被保存如一不可移動之核酸族群。因為該核酸並未引入細 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 裝 一一一一口 線！ A7 A7 _ '發明說明（16 ) SI此代表讀庫中的核酸並未受到可能受到細胞毒性以 其他不可預知因素所影響之偏差。 或〜更進步，如某些方法所述，使用該固態支托（例如一針 力D執車Η )使得僅交換反應溶液變得可能。例如，不需藉由如 ·'、'去活化、酚萃取或乙醇沈澱等複雜的步驟，便可移除酵 京。 括有關於許多具體例，亦發現以轉錄為基礎之倍增作用可包 山決定該啟動子位置，以對於每一 RNA產物製造一先定義之終 針對每一產物之探針亦在相似的情況下設計。這種組合可 ^減少標的核酸與不可移動探針之間的空間障礙所造成的問 JBg % °例如，該啟動子可距離連接至該固態支托之連接位置至少 3 ' 8、15、30或更多核苷酸。 本發明數個實施例中的細節可見於以下詳細敘述及圖式。 其他有關於本發明之特徵、適用對象以及優勢可從本說明書、 圖式以及申請專利範圍中獲知。 【圖式簡單說明】 第1圖係一實施例SSAT方法之流程圖。 第2圖係一實施例SSAT方法之示意圖。 第3圖係利用該S S A T方法完成一複合輸入樣品以及標的特定 SSP寡核苷酸之示意圖。 第4圖係利用一模組完成一具體例系統之流程圖。 第5圖係一實施例系統之示意圖。 第6圖係一雙啟動子SP-TCR方法之實施例之示意圖。 “本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210x297公釐） 壯衣---------訂---------線| 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 五、發明説明（π ) 第7圖係一單一啟動子sp_TCR方法之實施例之示意圖。 苐8圖係一 SNPj貞測方法之實施例。 第9圖係一以黏接方法連接之實施例之示意圖。 第10圖係TCR循環之實施例之示意圖。 第11圓係一實施例轉錄方法以製造aRNAA/或sRna。 第12圖係第一實施例凝膠電泳結果圖。 第13圖係第三實施例中’人類軌财於固態支托上轉錄後之產 物，冰存於-4°C七個月後之電泳結果圖。 【圖號說明】 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁各欄) 裝 10 片段製備 12 使成為單股 14 SSP寡核苷酸黏合 16 連接 18 轉錄 20 偵測或分析 20 以酵素E水解 22 Lambda夕卜切酶 24 T7 SSP黏合 26 Klenow 28 T7轉錄 30 偵測 110 選擇多型態 120 辨識限制酶 130 辨識/最佳化SSP寡核苷酸 140 合成SSP募核苷酸 150 合成偵測陣列 160 接收結果 170 分析結果 200 處理器 210 限制酶資料庫220 多型態資料庫 230 結果資料庫 240 陣列合成器 250 募核苷酸合成器 260 液體處理機器手臂 訂 線！ 【較佳具體具體例之詳細說明】 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚;） 1335938 A7 五、發明說明（18) 請參見第1圖’係示範性地實現本發明。該實 向分析基因體DNA之基因多型態。該實現包括：片係用以導 將樣品變為單股12，SSP寡核苦酸黏合14，連接16 ^製倚10， 以及彳貞測或分析2 〇。 轉錄1 8， [片段製備] 基因體DNA從細胞中分離出來，該細胞舉例 一對象如一病 而言是來自於 人。為了倍增複數個從基因體DNA由β , |fe i — 所得至ij 仅稭由下述的標準以選擇限制酶。該標的片段之 J 核苷酸。兮 、^口 土 7 J、A 〇、ZU、双ZZ1固非夕型態枯* 喵 位於接近該限制酶特定切割位置之處。該非多型態^苷酸序列 SSP寡核苦酸之黏合位置。該目標之多型態序列係仅歹】可作為 片段中央三分之二之長度。若需要複數個限制酶特」D亥標的 置’可選擇在相同反應狀況下具有相容功能之限制酶。又切割位 〇月參見第2圖中所描述之範例，酵素e將DNA切割成複數 個片段’分別標示為a、b、c及d。片段d包括一目標序列其可 包括一以封閉圓圈表之多型態基因。 [單股DNA之製造] 在將該SSP單股黏合至該樣品核酸之前，先將該已切割之 樣品核酸轉變成單股核酸。製造單股DNA可藉由熱或化學變性 (denature)。然而’利用酵素方法來製造單股核酸被發現在 SSAT方法中特別有效。 2000、1000、500、700、500、300、200或 1〇〇個長度係少 標的片段包括一至少15、18、20、或22個非多型態 之片 於 裝---------訂---------線| 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 21 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210x297^^7 1335938 A7 B7 五、發明說明（19 ) 該雙股DNA片段以一外切酶共同處理，該外切酶可為T7 外切酶或lambda外切酶。例如，該已切割之樣品核酸可以用 lambda外切酶在3 7°C處理約一小時。 該外切酶會催化DNA從5端往3端水解，因此依序從DNA 雙股中移除5端之單核苷酸（Little, 1981) Amplification and analysis 2:135-145; Shimozaki and

Okazaki. (1978) iVwc/· JczW.及〇. 5:4245-4261)。該反應可藉 由加熱至75°C三十分鐘而去活化。

Lambda外切酶係·一馬度連續反應性（processive)之酵素。 就其本身而言，其具有一傾向維持連接至一受質DNA單股，並 脫離該該DN A早股之刖將其完全水解，之後再去攻擊另一個兵 質DNA。該特色造成的結果是一較長之單股DNA產物，而非如 輸入之DNA —般長度之許多DNA片段。各種外切酶之連續反應 性可見於如 Thomas and Olivera (1978) «/ 仍〇/。心讲 253:424-9 ° [SSP寡核苷酸之設計] SSP寡核苷酸係用以供一rNA聚合黏接一啟動子至一^^^八 樣品。本方法所使用之該ssp寡核苷酸一般具有一長度為25 100個核苷酸，例如約30_50或4〇-6〇個核苷酸。 一 S SP寡核苷酸具有一 3端序列，亦稱為「標的結合區 域」’該區域會結合至一 ^的片中之標的位置。該序列可為 實質上一致的，亦即如90·100°/。完全與該標的區域相同。_完 全相同或幾乎完全相同的序列可增加在倍增反應中的專一性。 22 t紙張尺度適用中國涵&準（CNS) A4規格（2丨0x297公酱） ---------------裝---------訂---------線_ 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 A7 B7 五、發明說明（20 ) 該標的結合區域可選擇一特定長度，以使其與標的位置之間之 雙股核酸的變性溫度（Tm)至少為42°C、50°C或55°C。該標的結 合區域可被最佳化，以使其不會自體黏合，或黏合至SSP寡核 苷酸之剩餘物（如形成一髮夾彎）。 一 SSP寡核苷酸亦包含一啟動子序列5端至該標的序列。 該啟動子序列可被一RNA聚合酶所辨認。該RNA聚合酶可為原 核、真核或太古生物。例如，該RNA聚合酶可為一原核噬菌體 邇私 RNA聚合酶，如T7、T3以及SP6 RNA聚合酶。因此，舉例性 的啟動子區域包括但不限於T7、T3、Sp6 RNA聚合酶之啟動子 序列。一般而言，任一可特別導向一啟動子序列之RNA聚合酶 皆可使用。例如’ SP01啟動子可與從噬菌體 SP01中所得到之sigma factor共同作用，以將RNA聚合酶結合 至SP01啟動子。 該S S P寡核苦酸可被接合或可接合至一固態支托。例如， 該S S P募核苷酸亦可包括一修飾以利於親和力捕捉該標的或該 j SSP寡核苷酸複合物所合成之雙股。該修飾可包括如一個或多 個以生物酵素標示之去氧核醣核酸（或其他結合物）。其他有 用之修飾包括氨基、硫醇團基。一生物酵素標定團基可被結合 至一固定化的streptavidin或avidin。其他有用的非共價與共價 結合係習知的。在某些如利用一生物酵素標示ssp寡核苷酸的 反應中’每一反應大約使用0.1、1、5、1〇、2〇或1〇〇1)111〇1的 SSP寡核苷酸。該反應的尺寸大約如九十六孔盤中之一孔。 在-具體例中’该引子包括-序列，其一股具有一限制酶 特定切割位置。該引子亦可在該限制酶特定切割位置包括一經 ____ 23 本紙張尺度適用中麵家標準（CNS) A4規格（210x297公S3------ n ^^1 I J ί ϊ I - 1 -- I 1 ^1 (t I— n ί ί 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938

發明說明（21 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 修飾之鹼基，例如aS-dNTP，以使該引子單凝 聚合酶會辨認出該缺口點並開始聚合反應，其被切斷。DNA DNA單股之置換。重複缺σ點以及聚合反靡導致°亥缺口點 DNA之一單股。 線性倍增標的 選擇性地，在該SSP寡核苷酸啟動子序沔以^

之間，可包括一連結區段（linker)。該連結區段 心的序歹J 包括限制内切酶特定切割位置(例如6·抓鹼“：:皮轉錄並： 位置)，以利於複製該被倍增核酸、一合成辨識標: 列（universal sequence)。該連接區段可包括一序列當該連結 區段被轉錄成RNA時其可被一 RN A結合蛋白質所辨識fRNA結 合蛋白質可舉例如Tat及Nus。 在一具體例中，該結合區段包括一内部核醣體進入位置， 一起始甲硫胺酸（initiator methionine)，一抗原部位標籤 (epitope tag) ’ 一純化或偵測標欠’及/或一轉譯調控序列。 更進一步的SSP募核芽酸設計可舉例如下述之以以以⑽及 Software方法。 已經設計之SSP寡核苷酸可利用標準寡核苷酸合成化學而 合成。此外，若一複製庫（clone bank)已建立，則ssp寡核苦酸 可以酵素方法製造（例如PCR) ’或從一宿主細胞（例如五c〇/z·) 中分離。 [SSP寡核苷酸黏合] 該SSP寡核苷酸係黏合至從外切酶處理所得之單股DNA。 該黏合反應可在一低於該SSP寡核苷酸之標的結合位置變性溫 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 1335938 A7 ____B7_ 五、發明說明（22 ) 度之溫度下反應。將SSP寡核苷酸雜合至該單股標的片段之反 應可在任何容器中進行’例如一試管、微離心管、多孔盤中之 一孔，或一流式處理槽》該SSP寡核苷酸可在黏合前、黏合申 或黏合後連接至一固態支托。 可使用多種雜合反應條件。雜合反應條件可敘述如在標準 實驗至手冊中所 s己載’如（Molecular Cloning，3rd edition， Cold Spring Harbor Press，ed· Sambrook & Russell)。可選擇 ψ 溫度以及鹽濃度以達到所要求的說服力。 一方法係用以將單股標的雜合至5端往3端方向性固定之 SSP寡核苷酸，如第3圖所示。雜合反應之後，為結合之DNA可 利用緩衝液洗除。 [模板之延長] DNA聚合酶係用以在引子延長時將ssp寡核苷酸附加於標 的序列’因此而形成雙股DNA。DNA聚合酶可舉例如包括 你Klenow片段（缺乏3端往5端外切酶能力），以及 SEQUENASETM2.0(Amersham Pharmacia Biotech)。任何 DNA聚合酶皆可能滿足需要，尤其是那些缺乏3端往5端外切酵 素能力者。雙股DNA合成條件之指述可舉例如在Gubler (1987) MeAoc/i 五rtzywo/ 152:330-335 0 該DNA聚合酶可使用SSp寡核苷酸之啟動子（或其他非標 的結合區域）為模板，而將已黏合之標的核酸部分延長。該步驟 使得啟動子區域變為雙股並具功能性。該延長步驟進一步將該 啟動子「可實行地連結至」（〇peraMy links)該標的片段。如此 _______25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公麓） 壯衣---------訂---------線_ 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 A7 B7 <1 五、發明說明（23 ) 處所使用的’該指稱「可實行地連結至」指向在影響序列（典型 地為一啟動子）以及該控制序列之間的一個有作用的連結。 既然在啟動子中1位置之後的區域僅選擇性地需為雙股， 則呈少對如SP6、T7、及T3等噬菌體RNA聚合酶而言，在某此 具體例中該SSP寡核苷酸之3端可被封阻（block)。在這些實行 例子中僅該啟動子區域需要是雙股狀態。該SSP寡核苷酸並非 用來當作一引子’而是當作模板。 在其他具體例令，該SSP寡核苷酸亦被延長。當使得啟動 子以及標的區域都成為雙股時，該種實行例子是有用的。該被 延長的核酸可被以DNA雙股的形式保存。該被保存之核酸具有 構造以及化學性質穩定的優勢。 [黏接] 清參見第9圖，在另一具體例中，該標的片段係黏接至一 ssp雙股中之底下-股，其中該SSP雙股包括該ssp寡核苷酸以 及-互補之單股。這三個元件單股可以任何次序加入反應。既 然該供為轉錄所用之模板可為單股（見下述），則只要啟動子是 雙股，該三個元件單股的不平衡雜合物已足供轉錄倍增反應疋 若該SSP雙股係從-包括該SSP寡核魏序列以及該互^區&之 髮夹彎核酸所形成’則亦可使用兩個元件單股即可。 [利用轉錄之倍增反應] 該T7聚合酶多肽鏈可從該被複製的基因丁7基因丨中分離出 來，請見如美國專利第5,869,320號（Stud

以 α/ )。T7 RNA ---------------装 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各脾 rj tn 1^1 ^^1 ^^1~~N · ^^1 ^^1 ^^1 ί-α 線！ 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 1335938 A7 _B7___ 明說明（24 ) 聚合酶可從誘導細胞其具有一核酸供T7基因可實行地連結至一 可誘發之啟動子。Chamberlin ei α/.，（1970) 228, ^ 227-231描述了一舉例性之反應途徑供純化該聚合酶。 T7 RNA聚合酶對其啟動子位置有非常高的專一性 (Chamerlin et al., in The Enzymes, ed. P. Boyer (academic Press，New York)pp. 87-108(1982))。該T7 聚合酶會辨識一高 度一致之序列，該序列從相對於RNA鍊起使位置之bp -17橫跨 A 至約bp +6的位置，（Dunn and Studier，（1983) «/. Μσ/, 166:477-535 and (1984) /· Μσ/; 1 75:111-112) ° 此夕卜， 在該模板板上唯一必須要是雙股DNA的區域即在此區域。該模 板之其餘部分可為單股。 T7聚合酶在將T7RNA聚合酶缺乏有效終止信號時所造成 的多樣化核酸倍增時（請參見Rosenberg et al., (1987) 56:125-135)特別有效。該T7 RNA聚合酶可從如Pro mega Biotech，（Madison, WI)及Epicentre Technologies, (Madison， 讀· WI)處獲得。 SP6以及T3 RNA聚合酶具有相似的特性。此外，該三個 聚合酶中每一個都具有高度專一性，不會轉錄非同源之啟動 子。下表1所列的是對於該三個聚合酶所需要的最小有效啟動子 序列。該+ 1位置的核苷酸有晝底線。 表一噬菌體RNA聚合酶啟動子__ RNA聚合酶 特定啟動子序列_ _ 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4纖（210x297公釐) -I— n 1- — -- I 1 II I - I - - - ^1 - n I- - 一 ' 一 I ill I 1 I I I I . -I 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 A7 B7 五、發明說明（25 T7 NO:23) T3 NO:24) SP6 NO:25)

TAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID

AATTAACCCTCACTAAAGG (SEQ ID

ATTTAGGTGACACTATAGA

ID 為了獲得倍增的RNA，加入RNA聚合酶反應緩衝液、過 量的四種核醣核酸、以及相對應的RNA聚合酶，並在37°C培養 2-24 小時。試管培養（z'w W/ro)可見於 Melton, D. et al. (1984)#wc/. 12:7035。該轉錄反應緩衝液可包括多 種要件，例如可包括： 1 至 20mMNaCl 24,34或40 mM Mg2Cl2 10至50 mM Tris · Hcl(pH 約7.3, 7.4或7.5) 1.2.3.5.7.5.10 mM rNTP 1.3.5.10 mM DTT 2 U/μΙ Superaselnhibitor 在序列分析中為了獲得已標記示之RNA以用來當作雜合探 針，一個或更多個已標記的核醣核苷亦被加入。隨著所使用的 偵測方法不同，該標記可為但不限置於螢光染劑，如螢光黃及 青色染劑（Cy3，Cy5，Alexa 542，and Bodipy 630/650);放射 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 壯衣---------訂---------線— 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 1335938 A7 B7 五、發明說明（26 性標記物如32P，33p，35S以及3H ;比色法（colorimetric)或化學 發光劑；以及結合對元件，如biotin或digoxygenin。 [後處理，紀錄以及保存] 本方法可更包括任一數目的後處理步驟。例如，該RNA產 物可利用特定或隨意引子而反轉錄為DNA。顯然地，該RNA產 物可被用在多種用途。例如，該RNA產物（如果其具有適合的單 股或雙股狀態）可被轉譯，並且該轉譯產物被以一活性或將轉譯 產物接觸一抗體而分析。該RNA可被量化以決定不同種類RNA 的豐富程度。若該RNA已被標記，則其可被雜合至一不同種類 已知RNA之位置探針陣列。在某些狀況下.，該RNA本身即具有 功能’例如該RNA係一適合體（aptamer)或一催化劑。該RNA 可被分析其結合或催化性質。 一端被固定，並附加有啟動子之DN Α標的可同時被重複利 用及/或保存以供未來參考用。例如，若利用一 SSP募核皆酸之 晶片’該晶片可不需反應劑便洗淨。該被洗淨之晶片一則立即 被重複使用在另外的轉錄倍增反應，或可保存在一記錄程序 中。一被保存之晶片可為脫水並冰凍的，或鑛以一防床劑如甘 油溶液並被冰床。當需要的時候’一被保存的晶片可被重新使 用、洗淨、並且與新鮮的反應物重新進行轉錄反應，例如核醣 核苷以及適合的RNA聚合酶。如下所述’多樣態的固態支托（如 針、微滴定孔、離心杯（spin CUp)、陣列以及薄膜）可被使用。 29 本紙張尺度愈用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 裝 -=口 線！ 1335938 A7 B7 五、發明說明（27 ) 同樣地，在循環TCR方法中，兩種不同系列的模板（例如 T7以及T3)被製造，該二模板可被分別記錄保存，或者共同記 錄保存。 藉由將從不同循環之中所得到的模板耦合到分開的支托 上，一原版組合以及工作組合的模板可被產生。該工作組合可 被分配到不同的使用者（例如客戶）。該原版組合可被用來製造 額外的工作組合，並可能被保存為參考或品質控制。 [轉錄連鎖反應（TCR)] 請參見第6圖，係利用該RNA產物為模板進行額外的轉 錄，以增加倍增反應。該RNA產物藉由反轉錄反應而被轉變成 DNA，其形式相似於上述該SSP寡核苷酸導向合成反應之步 驟。該從SSP寡核苷酸附加之雙股DNA而來的RNA轉錄產物，' 以符號（+ )標的股表示，係被一第二寡核苷酸捕捉，該第二寡核 苷酸具有一序列在3端（舉例而言）互補於該新合成之RNA單股。 H 該第二SSP寡核苷酸之啟動子片段可與該第一SSP寡核苷酸之啟 動子片段不同。該被捕捉的（+)RNA此時可以藉由反轉錄酶以及 DNA聚合酶而被轉變為雙股DNA。 從該新合成之DNA之轉錄反應會產生相對應於該標的之（-) 股之RNA，並因此增強倍增反應。該方法可用以偵測濃度非常 低的序列，例如從一群正常細胞中偵測出一單一癌細胞。 如上所述，當該核酸啟動子-標的融合物被捕捉時，連結 到該第一及第二SSP寡核苷酸之固態支托可被保存以待未來之 轉錄反應。 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（28 ) 在一具體例中，該固態支托包括複數對第一及第二SSP寡 核苷酸，係用以如倍增複數個不同標的。 請參見第7圖，從一初始倍增階段得到之RNA產物利用一 .標的特定引子（舉例而言）而被反轉錄。該反轉錄所得之DNA可 藉由如臉性水解、熱處理、50°C之50% formamide、或如利用 DNaseH之核酸水解酶水解，而成為單股。該單股DNA複本可 接著黏合至該可致得之固定化SSP寡核苷酸。該步驟允許增強 #倍增反應。 請參見第8圖，一在一探詢位置包含有一單核苷酸多型態 之片段，被利用SSAT方法倍增。接著，RNA產物被雜合至固 定化之反轉錄引子。該反轉錄引子將其3端之末端核苷酸定位在 該探詢位置之對面。只有在該3端末端核苷酸與該探詢位置核苷 酸互補時，反轉錄反應才會進行。併入如一 Cy3標定之dNTP之 標定物，可用以監控該反應過程。 請參見第10圖，T7(左）與T3(右）倍增反應的循環如圖示。 ^ mRNA或sRNA(從一Τ3倍增循環而得）被雜合至該些連接到固態 支托之SSP寡核苷酸（例如T7-d(T)nV)。該SSP寡核苷酸可在該 啟動子以及固態支托連接位置之間包括一 spacer序列。例如， 該spacer之長度可為6、12、18或24個核苷酸。模板DNA係藉 由如cDN A合成而製造出來。一接合子分子係在一初始循環黏 接至該模板（在本例中若使用sRNA則其為選擇性步驟）。該接合 子較佳地包括一標籤序列其未存在於該樣品上。一電腦程式可 被使用來預測在一有機體中應該從樣品上缺少之序列，例如從 一綜合基因體DNA或cDNA基因庫之資料與該有機體比對。在 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 五、發明說明（29 ) A7 B7 §亥接合子的黏接之後，H W用T7聚合酶而製造出轉錄產物 (aRNA)。 該轉錄產物包括該樟絲 氣序列以及從樣品核酸中而得到的序 列。轉錄產物接著被雜八^ σ芝— T3-TCR SSP寡核苷酸，該T3-TCR SSP寡核苷酸係連接s η 同''固態支托或另一固態支托（請見 Α字圓圈所指示之流程圖）。m 1 … ）再一次地，cDNA係從該已黏合之 轉錄產物所製造出來。兮π _ β ρ 1 3聚合酶現在用來製造sRNA。該 sRNA可被循ί哀展開以製泸如 圈所指示的流程®)。°的&麵轉錄產物（請參B字圓 加入該接合子的步驟可以從許多方法來達成。例如 及1^黏接酶（Ug叫可被使用（例如黏接-先形成之雙股其 以 包括標籤序列）。請見第 圖，在一具體例中末端轉移酶 ⑽minai t娜ferase)以及dGTp被用以在該DNA單股加 2重複之G尾段。-包括該標籤序列以及一3端重複〔尾段之 寡核苦酸被黏合並用以引導該第：DNA單股之合成。 在某些實行狀況下，將-與一接合子序列互補之探針雜合 以偵測一從一模板複製之核酸複本是可行的。 入 [固態支托] 本說明書中描述許多實施例，包括製造連接於固態支托之 模板以供RNA轉錄。該固態支托可為任—不可溶解㈣。在一 例子中，該固態支托係、-堅實平面裝置如_晶片（例如—顯微鏡 載玻片）。在另一例子中，該固態支托係—反應容器如多容器樣 品載具（例如微滴定盤）、一試管 '一管柱、一離心杯' 一噂膜 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（30 ) 或上述各種儀器之部分。例如，該模板可被連接至上述一個或 多個微滴定孔中之表面（例如多種形式，包括單孔滴定盤、單排 滴定盤、96孔滴定盤、3 84孔滴定盤、機器控制單一或多孔 盤）。該微滴定盤可便利地放置在一熱控制單元中，例如熱循環 器，以精細控制反應溫度。 在一具體例中，係使用一離心杯。該離心杯具有孔隙狀薄 膜，例如一 0.4 5 μιη薄膜或任何尺寸之薄膜，其有利於如反應 # 酵素等大分子通過。為了執行一套複數個反應，該反應元件被 傳送經過該薄膜（例如藉由低速離心）。為了切換反應元件，緩 衝液或接續的反應混合物被沖洗經過該薄膜。該SSP寡核苷酸 先物理地連接到該薄膜上（例如藉由非共價或共價連結.）。因 此，該SSP寡核苷酸以及與其結合之模板在整個反應中一直位 於該離心杯的薄膜中。在模板被產生後，該薄膜可被保存，例 如可供接續的RNA轉錄。轉錄產物亦可藉由低速離心該離心杯 而收集。 ^ 在另一具體例中，一支針或一組針被利用。該SSP募核苷 酸係物理地連接到該些針上。例如，該SSP寡核苷酸被生物標 籤所標記，並且該針的表面被被覆一層streptavidin。為進行複 數個反應，複數支針可被固定於一固定單元上。該固定單元係 用以傳送該些針到不同的反應混合物中。例如，該固定元件可 為一微滴定盤之上蓋。該上蓋被放置在不同的微滴定盤上，每 一滴定盤包含有適當的反應混合物（例如用以做樣品雜合、反轉 錄、第二股合成以及轉錄）。對循環TCR來說，需要不同的針， 每一支針用以捕捉T7和T3模板。 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（31 [偵測方法] 複數個方法可用以分析倍增反應之RNA產物，或者用以分 析該RNA產物之DNA反轉錄複本。舉例性方法包括單鹼基延長 (美國專利第6,0 13,431號）、錯配積測（mismatch detection,例 如利用MutS蛋白質或其他錯配結合蛋白質）、雜核定序（美國專 利第 5,202,23 1 以及PCT 89/10977)以及RNA定序。pastinen a/.描述了一對偶基因特定偵測方法，其中兩個引子被黏 合至標的。該二引子僅在3端尾端有相異處，而該相異處在該引 子被導引至出現的基因時係互補於探詢位置。已標記之核苷孫 只有在该引子互補於該探詢位置時，才會藉由如反轉錄酶而在 延長反應中加入到引子上。 為了分析樣品核酸之資料，已標定之RNA產物可被從一模 板陣列中產生，以複製該樣品核酸。該複製產物被雜合至一包 括有複數個捕捉棟針（eapt紙prGbe)之彳貞測陣列該彳貞測陣列可 =掃瞒以決定該已標定RNA產物是否雜合到該些探針，以及雜 &紅度由於每一探針係位於一獨特定位，因此每一種類的數 量可以此推斷。雜合至仙陣列之方法係習知技術。藉由分析 »亥 <貞測陣列所得到的資訊可被保存在―可由機器得到之媒介 ^ 例士 〃有—指向一槽案的模板陣列之位置或識別資料之指 針’其可被$來製造該樣品核酸之RNA複本。 [配對探針陣列] 34 --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（32 ) 本發明之一實行態樣包括從一核酸樣品製敢正向及反向 (sense and anti-sense)核酸，例如從一mRNA樣品中製備。該 mRNA係利用一固定化S SP寡核苷酸陣列而倍增。一 T7啟動子-poly d(T) SSP寡核苷酸雜合至該mRNA之3端多腺嘌呤， dsDNA接著被轉錄以生成已標記之反向RNA。該反向RNA亦可 被雜合至一包含有一互補於TCR接合子之序列以及一 RNA聚合 酶之陣列。已標記的正向RNA係從該所述的雜合物中製造而 ，得。 例如，該已標記之反向RNA係被雜合至一正向探針陣列 (例如一「sOligo Microarray」），並且該已標記的正向RNA係 被雜合至一反向探針陣列（例如一「aOligo Microarray」）。資 料從該二雜合中取得並做比較。例如，針對一給定基因在兩個 不同組織樣品中利用該標記之反向RNA所決定之一轉錄產物比 例；針對該給定基因在兩個組織樣品中利用該標定之正向RN A 所決定之另一轉錄產物比例。該二個比例接著被比較，例如用 以決定一可靠度係數Rc(reliability coefficient)。Rc的值在0.8 至1.0之間可視為一可靠觀察的指標。 其他種類的比例亦可被決定。例如，針對一單一樣品而 言，該已標定正向RNA雜合至探針A及探針B之雜合程度之比 例，可與該已標定反向RNA雜合至探針A’及探針B’之雜合程度 之比例做比較，其中探針A及A’彼此互補，探針B及B’彼此互 補。該探針可為部分或完全不重疊於同一基因（例如轉錄產物） 之探針，或者可為不同基因之探針。在一具體例中，該些基因 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210><297公釐） 壯衣！ (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 三一口 線 1335938 A7 B7 五、發明說明（33 ) 其中之一是可為管家基因（housekeeping gene)或其他基因其表 現程度提供一有用之參考值。 [dsRNA]

在一具體例中，雙股RNA係為了一個或複數個標的序列而 製造的。該dsRNA可被傳送到細胞或一有機體。細胞或有機體 的内生（endogenous)構造可啟動RNA介面（RNAi，RNA # interface)其壓抑包括標的序列在内之基因的表現。目前已完善 確立的是許多細胞及有機體内具有一RNAi應答（例如線蟲、植 物細胞以及哺乳類動物細胞）。個別的標的序列可被黏合至在不 同固態支托（例如不同的微滴定孔或者不同支針）上之SSP寡核苷 酸，以產生aRNA以及sRNA之模板。該些模板可在分別的支托 上製造，亦可在同一支托上製造。該些模板的轉錄會製造 aRNA以及sRNA其彼此雜合以製造dsRNA。若該aRNA以及 sRNA係分別製造，則將該些RNA變性並黏合可能會對於以形 • 成該dsRNA雙股有效。在某些例子中，該些模板係在RNA池 (pool)中製造，以製造一混合數量之dsRNA。在其他例子中， 個別的dsRNA種類係被單獨製造，以使每一標的序列可被單獨 攻擊。 在一具體例中，該模板被固定在一方形陣列以使該陣列之 每一定位（address)包括一實質上相同總數的模板。細胞（例如哺 乳類培養細胞）可在該陣列上生長，以使該陣列每一定位中所製 造之dsRNA可進入該細胞。在培養之後，該些細胞可被評估以 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210><297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（34 ) 決定該dsRNA對細胞的影響。該方形陣列的形式可為如一微滴 定盤。 • 在一具體例中’ dsRNA從一轉錄體（transcriptome)之實質 部分製造而得。在本例中，該複數個標的係該轉錄體之對應部 分。5亥些dsRNA可被用來（僅舉例而言）待徵化該轉錄體不同元 件之生物功能。 再次地，該用來製造dsRNA之模板可被保存，並亦可被製 ia為主系列（master set)以及一副系列（slave set)。該副系列 可分配到不同的使用者，以使該使用者在需要時製造心111^八。 由於該模板是固定的，該些dsRNA可從固態支粍直接清洗以及 使用。 [軟體] 本發明亦提供一系統以及軟體以協助、控制並管理一個或 多個本方法之步驟。 請參見第4圖以及第5圖，軟體可包括下列之一或多個模 組_(⑽擇欲分析之基因多型態nG ; (2)辨識丨段製備所使用 之限制酶12G ’（3)辨識並選擇性地最佳化ssp寡核苦酸設計 130，（4)接。寡核苦酸合成^或者寡核普酸陣列合成器以 衣:i^SSPl核苦酸14G，（5)合成—偵測陣列15();⑷接收ι6〇以 及分析170偵測陣列所得之結果。 d軟體可I曰由-處理器2〇〇在一網路端伺服器或本地端一 台桌上型電腦上運作而執行。該處理器與資料庫2ig、咖及 0連接Μ二貝料庫可被保存在本地端記憶體、機器可讀性 1335938 A7 B7 五、發明說明（35 ) 2介或遙控伺服器上。該處理器亦可直接或間接地連接至外部 ，置，例如一陣列合成器240、一寡核苦酸合成器 處理機器260。 •該軟體可包括—圖形使用者介面（GUI，graphieal咖 mterface)其顯示已知的基因多㈣，例如SNps，以供使用者 選，。該些基因多型態可先行依照其對於不同診斷、疾病或基 因定位之相關性而分組。該使用者可選擇一個或多個所需要的 分組。 基因多型態之資訊可被保存在—基因多型態資料庫22〇 中。料一個基因型態而言，該資料庫22〇可同時指出一個或 夕個先π項目之貝讯。该貧訊可包括一個或多個限制酶的可獲 得性，其中該限制酶可被用來切個基因體核酸以製造所需要= 片段尺寸。多個局部限制酶切割位置可被保存，以允許全部限 制酶之選擇最佳化，以使得在相容緩衝溶液中的酵素可被群 聚二該資料庫220並可保存對於每一可獲得之限制酶切割位置 之最佳化SSP养核苷酸標的位置。另外，該資訊可再選擇基因 多型態之後再行決定。 例如，該辨識適合之限制酶之步驟120可包括尋找—限制 酶資訊資料庫210，以辨識那些在一多型態位置附近水解之限 制酶，以製造一適當尺寸之片段。該限制酶資料庫210包括每 一酵素之特定辨識位置之資訊，以及其與不同缓衝條件之相容 1"生。s亥資料庫可包括，例如，R〇berts et al_所建立的資料庫 (Nucl，Acids. Res. 2001，29:258-269)，以及可包括超過3〇〇〇 種酵素之資訊。 裝--------訂--------線— (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) /

1335938 A7 I_______B7_ 五、發明說明（36 ) • 在選定基因多型態之後，該系統可輸出一最佳化限制酶組 〇，以供切割該樣品核酸成碎片。該軟體在某些具體例中可同 時控制一機器人系統以製備該先前決定之限制酶庫。 °亥糸統亦針對母一基因多型態設計一個或多個s S P寡核普 酉文。6玄系統可針對T m而對引子設計最佳化，例如一族群之s s p 寡核苷酸之所有標的結合區域具有一相似的Tm、引子雙結合之 形成、迴文（palindrome)的缺乏等等。該系統可連接至—寡核 着I苷酸合成器以製造該SSP寡核苷酸，或連接至一寡核苷酸陣列 合成器以製造一固定化SS寡核苷酸陣列。 相似地’ 一相關或完全相似之系統可用以加工一配對互補 陣列所偵測至之核酸之資訊。該系統可被用以維護—資料庫， 該資料庫包括代表雜合至一正向探針之資訊、雜合至一反向探 針之貢訊，以及該正向以及反向探針之間的關係。該資料庫可 同時包括一第一及第二標的物質相對於其對應正向探針之雜合 程度比例，以及一該第一及第二標的物質相對於其相對應反向 探針之雜合程度比例。如上所述，該雜合物質係適當地針對每 一探針組合而產生。 在另一觀點中，本發明以一能提供存取至一資料庫之系 統’該資料庫包括複數個基因之轉錄程度之資訊。該資料庫可 包括複數個包含有一描述一樣品之參考值（例如組織來源、組織 種類等）、一對照於數據之參考值（該數據為一描述該複數個基 因轉錄程度之表格）、以及一定位子其指向一固態支托之辨識資 料或者位置，該固態支托包括保存之模板其可被轉錄以製造相 對於樣品之aRNA或sRNA。該資料庫可包括至少十筆記錄，例 _____39 本紙張尺麵帛巾國冑冑準（C：NS) A4繊（21()χ297公麓)" ------- ---------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7

如每-筆記錄指向-不同之哺乳類組織 一樣品係經顯微解剖。在某些實施例中，_固^例中’每 料庫之存取功能-起提供至—使用者（例如―:客:被與資 向該特定固態支托之記錄。資料庫存取功能):： =指 :，：如以-存取密碼之分配(例如供網路存取)或 益可頃取之媒介其包括有該些紀錄的方式分配。' Φ [陣列分析] 本發明至少以兩種陣列為特徵：（υ — ss寡核芽酸陣列· 以及⑺一偵測陣列(例如一多型態或轉錄偵測陣列卜—陣列可 為一固態支托其包括複數個定位（address)。該些定位的贫戶可 為至少每平方公分1G、5〇、謂、5⑽、1()3、1()4、1()5 個定位，以及/或不多於每平方公分10、50、200、5卯、、 104、105、或106個定位。在該些定位之外，可另外加上其他定 位。 _ 在該陣列上。該些定位在該基板上可為一維，例如線性陣 列，可為二維’例如平面陣列；或者為三維，例如一三維陣列 如膠態矩陣。 在一具體例中’該基板為一固態支托。有可能使用之固，熊 基板包括：質譜儀盤（例如MALDI之用）、玻璃（例如功能化之 玻璃、玻璃載玻片、多孔隙矽酸鹽玻璃、單晶矽、石英、uv穿 透式石英玻璃）、塑膠以及高分子（例如聚苯乙烯、聚丙稀、聚 二氟乙焊、聚四氟乙烯、聚碳酸脂、PDMS、壓克力）、鑛金屬 基板（例如金）、矽基板、乳膠、薄膜（例如硝化纖維素、尼龍）。 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)八4規格（210x297公釐） 1335938 A7 B7 五、發明說明（38 ) 該固態基板亦可為可彎折的。該基板可為不透光的半透明或 全透明的。在某些具體例中’該陣列僅製作成多孔盤之型態， 例如一 96孔或384孔微滴定盤。 該ssp寡核苷酸陣列在每一定位具有一 ssp寡核苷酸以 使忒啟動子可接近並有功能性，以及使該標的結合區域可特定 辨識該標的位置。在某些具體例中，該ssp寡核苦酸之3端係可 延伸的，例如雜合至一模板時藉*DNA聚合酶延長。該ssp寡 Φ核芽酸可以5端錯合（anchor)至該陣列基板。另外，該ssp寡核 苷酸可以一非終端核苷酸錨合至該陣列基板，只要上述前置條 件被滿足即可。在其他具體例中，該3端係不可延伸的。 ^ 一錨合該SSP寡核苷酸之方法需要合成一氨基修飾之核苷 酸。在合成phosphoramidite的過程中，在一所需要的位置包括 一氨基修飾之核苷酸。所產生的氨基修飾ssp寡核苷酸接著被 置於一基板上活化以共價偶合至一氨基。該表面以及方法可見 於一美國序號第60/293,888號，申請日為2001年5月24日暫時 專利申請案之内容所述。該表面係以共價鍵結至一在1^_取代磺 氨上包括有一電子收回基（electron_withdrawing)之活化基為特 徵。 一錨合SSP寡核苷酸之第二方法需要直接在一固態支托上 利用5端往3端合成方法合成該SSP寡核苷酸，如在美國專利申 請案第09/770,886號’申請日2001/5/24所述之方法。該方法 提供具有C-5端連接至表面以及C3端末端之核酸陣列。該陣列 可藉由將C-5端活化、3端光學不穩定基（ph〇t〇labiie)保護之核 苦酸與一連接至表面之末端烴基反應而製備。在偶合一經修掷 -_ _ 41 本麵涵適用中晒家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐)~~ --~~ --一 裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 I--- --- B7 五、發明說明（39 ) 之核苷酸至該表面後，該C-3端光學不穩定保護基可經由一光 化學反應而脫保護，以在C-3端形成一自由烴基。該烴基接著 可與一經修飾並包含有一 c_5端磷活化基之核苷酸反應，以將 该經修飾之核苷酸拴在該表面。重複地選擇性偶合該經修飾並 帶有C-5端磷活化基（例如ph〇sph〇ramidite；)，並選擇性光脫保 濩该C-3端光學不穩定保護基，會形成固定化具有c_5端連接至 。亥固態表面並在終端位置具有C - 3之寡核普酸陣列。 遥擇性的光脫保護反應可界有幾種已知的方法完成，例如 光顯影方法（photolithography methods,如在

S^ence{\99\)2S\:iei~113-Pr〇c.Natl.Acad • Sci.USA 93:13555-13560, (1996); U.S.Patent Nos. 5,424,186; 5,5 10,270;以及5,744.305,以及5,744，l〇l中所述）或一數位微鏡 技術（micromirror technique，例如在 Sussman et· al. (1999)A^iwre 幻；17:974-975 中所述）。 一形成一 SSP陣列之第三方法包括在一基板上沈積一未經 修飾之寡核苷酸。多種方法可被獲得以分配小量液體至基板 上。例如，美國專利案第6，112,6〇5號描述一裝置可分配小量液 體。美國專利案第61 10426號描述一以毛細管動作為基礎之方 法以分配已知數量之樣品至一陣列。 在該些舉例性方法之外，任何可實行之陣列合成方法均可 被使用，只要該寡核苷酸可做為一啟動子之功能並且該標的結 合區域係特定於該標的位置。 第二種類之陣列包括複數個偵測探針。該探針可被設計為 多種形式之一以偵測SNPs4mRNA。例如，一對探針可用在每 裝！ (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) I三口 線i

1335938 kl B7 五、發明說明（40 ) • 一 biallelic SNP上。每一對探針在探詢位置上具有適當的核苷 酸，以偵測該二個對偶基因之一。該探詢位置可在該偵測探針 之終端。在另一具體例中，該偵測探針係一引子，並且使用鹼基延長方法（例如在Law and Brewer(1984) Ρη Λ^/· Sci. USA 8 1:66-70; Pastinen et al. (2000) Genome Res. 10:1031-1042中所述）以確定哪一個基因有出現。在又一具體 例中’ έ玄探詢位置係位於更中間的位置，並且可使用伯測探 針’例如在美國專利按第5,968,740號中所述。 [使用] 請 先 閱 讀 背 面 之 塗 項 再 塡 Μ 本5裝 欄

此處所述之方法以及陣列，可被使用在轉錄倍增反應。一 舉例性應用係基因定型（genotyping)以調查單核苷酸多型態 (SNP’ single nucleotide p〇Iymorphism)是否在一基因中出 現。SNPs的重要性可見於weaver，“奶以- Disc〇v^y and Typing for Genome-wide Genetic ’Trends in Genetics, December 2000。該多型態之 偵測具有多種應用。非限制性的範例包括醫學診斷、法庭證 據、疾病基因定位、環境管理、農業以及蛋白質演進。另一舉 例性應用疋δ平斷一樣σ〇中的轉錄物’例如一樣品包括少於 10,000或1,000個細胞。 [mRNA資料庫] 本發明之一範例性應用係倍增、分析以及保分佈 (population)。該方法使得從小量起始物質大量倍增產出及偵 43 本紙張尺度適用中國國家標準YCNS) Μ規格--- 訂

1335938 五、發明說明 測调A成為可能，例如從少於…、刚叫、 始。例如’該方法可用以量化在一單細胞中的二 :舌：：外、亥方法可得到輸入核酸樣品之保存。該保存可 被重複轉錄，以允許該樣品的分析。-舉例性的方法如下所 述。 、第-步’-固態支托係與一反轉錄引子共同製備。該引子 可為-生物素標^(biGtinylated)2 p叫_打引子其在；端具有 biotin團基並且其具有—單―、G4C核㈣在其3端。該a、 G或C核#酸用以將該poly·d丁引子錨合在該mRNA之多腺嘌呤 之5端。雙核#酸之猫合亦可被使用’基因或家族特定引子亦可 使用。若該引子係被生物素標定，則其係連接至一被覆有 streptavdin之支托，例如一微滴定盤被覆有streptavidin之 孔。 遠固悲支托接著在1 X第—單股合成緩衝液中清洗並平衡， 例如lx第一單股合成緩衝液（5〇mM Tds_HCL，在42時 ^ pH8.3 , 50mM KCL ； 10mM MgCl2 ； 〇.5mM spermidine ； lOmM DTT)。該mRNA樣品在該第一單股合成緩衝液（例如， 包括DNase抑制劑）的存在之下，被黏合至在該固態支托上之反 轉錄引子。該黏合反應可在42°C進行至少5分鐘。 在黏合反應之後，cDNA合成藉著加入焦構酸鈉（s〇dium pyrophosphate)、AMV反轉錄酶（例如 Universal Riboclone Cdna Synthesis SystemCatalog No. C4360，Promega Corp， Madison, Wisconsin，USA)以及去氧核醣核酸（例如lmM之 44 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 1335938 A7 ______B7_ 五、發明說明（42 ) dATP、dCTP、dGTP、dTTP)而啟動。該反應可在42〇c進行至 少30分鐘（僅舉例而言）。 在第一 cDNA單股合成之後，該固態支托如今具有每一黏 合mRNA之cDNA衩本。該cDNA複本在以固定之反轉錄引子延 長而建構時被固定化。因此，該固態支托可在這一步驟被保 存’並且在未來需要倍增並分析時可被重新取用。 選擇性地’該第二cDNA單股可被製造，例如藉由在16〇c 丨·時加入DNA聚合酶I以及DNase Η。若有需要，該反應可藉由 Τ4 DNΑ聚合酶而完成。該第二CDNΑ單股在該陣列上形成同質 雙股DNA並因此對穩定度有所貢獻。典型地，該固態支托被廣 泛洗淨並在保存前先在一冰床保護劑（例如丨〇%甘油中）中培 養。 在第二cDNA之合成後，在某些具體例中一dnA接合子 (adaptor)會黏接至該固定化cDNA之非固定末端。該DNA接合 子可包括一轉錄啟動子，例如T3 DNA聚合酶之啟動子。該設 计對上述的轉錄連鎖反應是有用的。該接合子可同時包括—個 或多個獨特的限制酶切割位置（例如一 8驗基切割者如ascl)、一 包含有純化標籤密碼之序列（例如hexa-His標籤或S-標籤），以 及一轉譯控制信號（例如Kozak保守序列）。 該支托可用以產生該原有樣品之RNA複本。該支托係先在 RNA聚合酶轉錄缓衝液中洗淨，接著與RNA聚合酶轉錄反應物 接觸，例如T7 RNA聚合酶以及核醣核苷（例如 AMPLISCRIBE™ T7 High Yield Transcription Kit, Catalog No. AS2607, Epicentre, Madison, Wisconsin戶斤提供）° 反應 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐) ---------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五 '發明說明（43 ) 被適當地培養在3 7 C至少一小時（僅舉例而言）。在培養之後’ 已倍增之mRNA可被從該反應溶液中收穫。 對轉錄連鎖反應具體例而言，該已倍增可利用其 他如上所述之啟動子（例如T3 DNA聚合酶啟動子）而倍增。 該種應用之好處有許多。例如，該方法不需要許多操作手 續如沈積以及離心管柱分離等。該洗淨以及交換溶液之步驟簡 化如該cDNA保存固定於該固態支托上。洗淨步驟同時移除了 p未連接之標的’例如核醣體RNA其可提供非特定引子位置而影 響反轉錄反應。 該固態支托係可用以保存原％mRNA樣品之DNA。該保存 有樣品之固態支托可被多次反覆使用。此外，該保存有樣品之 固態支托係藉由轉錄而倍增，其回復到原始狀態為RNA狀態。 該倍增亦為線性並較少受到偏差事件之影響（相較於等比倍 增）。在某些具體例中，該方法係受到一單一反轉錄引子之支 援。該引子對所有多腺嘌呤之mRNA皆有作用。 • 在一具體例中，該方法係用來從一有限數量之細胞中保存 一 mRNA樣品，該有限數量指少於1 〇〇細胞，或如單一細胞。 該mRNA樣品（或任何核酸樣品）之DNA保存物可建構以作為一 標準化基因庫（normalized libraries)、經刪減筛選法處理的基 因庫（subtracted libraries)以及低複雜度基因庫（reduced complexity libraries)之用。 從該固態支托所產生之RNA複本可被用來如在原始mRNA 樣品中描繪出轉錄物、活體外轉譯代表原始mRNA樣品之轉錄 物以及產生dsRNA。 46 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 壯衣！ (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 訂i 線 1335938 A7 B7 五、發明說明（44 ) 在一具體例中，RNA複本（aRNA或sRNA複本，視需要）被 用在一刪減篩選法之雜合反應（subtractive hybridization)。例 如，從一第一樣品所得之aRNA複本可被從一第二樣品所得到 的sRNA複本或從一第二樣品所得到之DNA中進行刪減篩選。 刪減篩選雜合之方法已是習知（例如一組複本可被連接到一固態 支托）。在一具體例中，該方法包括二個刪減篩選雜合反應，一 是正向（例如aRNA vs. sRNA)，另一是反向（例如sRNA vs. # aRNA)。其淨結果是高鑑別度的比較結果。 所有引用的參考資料、專利以及專利申請案以其整體作為 本案之參考資料。接續的實例將解說本發明在此所述之特定具 體例。如熟悉該項技藝之人所知，其他有關於本發明之變化以 及修正均為可能，並應屬於本發明之範疇。 第一實施例 溶液模式之序列特定轉錄倍增反應（SSAT, sequence I· specific amplification by transcription)被用來倍增人類脂蛋 白原E基因之StuI片段。（第72胺基酸至第209胺基酸） 人類基因體DNA係從Sigma Chemicals(St. Louis, M0)購 買。20 μΐ中包含10/zg高分子量人體DNA之樣品，利用10單位 之StuI(New England Biolabs，Beverly, MA)在37°C 下水解三 小時。該StuI水解物在IX lambda外切酶缓衝液[67mM Glycine-KOH(pH9.4), 2.5mM MgCl2，與 50/zg/ml 的 BSA]， 以及 10 單位的 lambda 外切酶（New England Biolabs， 47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（45 )

Beverly，MA)的存在狀況下稀釋至50//1，並在37°C培養30分 鐘。該酵素反應之終止係於75°C中培養三十分鐘。 接著，該反應混合物在IX Klenow片段（缺乏3端往5端外 切酶能力）緩衝液[10mM Tris-HCl (pH 7_5)，5mM MgCl2, 7.5mM dithiothreitol]以及 10 pmolsSSP 寡核苷酸（SEQ ID NO:l; T7StuSE)的存在狀況下進一步稀釋至100"1，並在37°C 進行雜合反應10分鐘。該SSP寡核苷酸黏合至該人類脂原蛋白E ► 基因之StuI片段（胺基酸72至胺基酸209)之一端。該T7StuE之 序列如下： 5，-AATTAATACG ACTCACTATA GGGAAGGCCT ACAAATCGGA ACTGGAG-35 (SEQ ID ΝΟ:1) 畫底線的序列是T7聚合酶之啟動子。該apoE黏合位置係3 端至該啟動子。

在SSP寡核苷酸黏合之後，該引子以及apoE標的物藉由加 入的 1 0 單位 Klenow 片段 DNA 聚合酶（New England BiolabS， ^ Beverly, ΜΑ) ' dATP,dGTP,dTTP,dCTP^ 10mM^37〇C 一小時而延長。在75°C三十分鐘將酵素熱去活化後，將混合物 調整於2.5M醋酸銨中，並加入兩倍體積的100%乙醇，以沈澱 DNA。接著離心以獲得DNA，並將DNA溶解在pH 8.0之20 // 1 的 10mM Tris-HCl。 該apoE標的物接著以轉錄方法倍增。利用從 Epicentre(Madison WI)購得之 AMPLISCRIBEtm T7 轉錄套 件，在活體外轉錄該乙醇沈澱之DNA樣品。所產生的轉錄產物 藉由洋菜凝膠電泳分析。預期尺寸之RNA僅在以SSP寡核苷酸 48 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（46 ) 延長之基因體DNA中可觀察到，而在未提供引子之基因體DNA 控制組中並未觀察到。 以下列樣品進行凝膠電泳以證明本方法之效果’電泳結果 請見圖 12 ’ 其中：Lane 1 : 1 OObp DNA Mmarker ; Lane 2 : 取10°/。以25Ong lambda外切酶處理的人類基因體DNA ’經過 T7轉錄反應後之樣品；Lane 3 :取10%以25Ong lambda外切酶 處理，並以SSPP引子延長之人類基因體DNA，其T7轉錄反應 .樣品；Lane 4 : 1 0%與Lane3相同之DNA，其T3轉錄反應樣 品；Lane 5 :從60ng之複製apoE DNA，進行如Lane 3之處理 後，取1 0°/。之T7轉錄反應產物；Lane 6 :同Lane 5處理之 DNA，其10%之T3轉錄反應產物；Lane 7 : 10% apoE DNA進 行T7轉錄反應之產物，未做處理；Lane 8 : 1 //g人類基因體 DNA，未做處理。 為了確定該活體外所轉錄之RNA確實為apoE RNA，根據 廠商（THERMOSCRIPT™ RT PCR 系統，Life Technologies， _ Bethesda，MD)所提供之步驟，執行RT-PCR。PCR係利用P3 及P6ASE(SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3)引子對，僅能從 SSP寡核苷酸延長之基因體DNA中轉錄出之RNA所衍生出之 DNA，製造正確尺寸的產物。由於RNA轉錄混合物中並無導出 PCR產物，因此可確認PCR產物並非從未啟動（unprimed)之基 因體DNA而來。當利用引子對T7及P6ASE(SEQ ID NO:4與 SEQ ID NO:3)時，並未得到PCR產物，因此可確認PCR之模板 確實是從RNA衍生之cDNA。 49 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（47 ) 取控制組進行凝膠電泳，以確認本方法之效果。人類基因 體DNA為模板並搭配適當引子時，可利用一特定片段之倍增作 為評估依據。被放大出之RNA被PCR偵測到。此外，PCR產物 從所準備的洋菜凝膠電泳中分離出來並定序。從DNA之定序結 果可確認PCR產物確實為apoE。 該些反應以及操作方法可被聯合並效率化，以達到經濟及 效率考量上足夠的收益。 |第二實施例 本方法所使用之材料包括： mRNA :從Ambion Inc·, Austin, Τχ·所購得之人類肝臟 多腺嘌呤RNA。 錨合引子：Bt-T7d(T)I7V，其中 Bt=5’biotin; T7 = T7 RNA聚合酶；d(T)17= — 17個Τ殘基之單體聚合物；V=A，G及 C 。 該引子 具有以 下序列 ： 5’- TTAATACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3, B 固態：被覆有streptavidin之多孔盤（NoAb

Biodiscoveries, Mississauga, Ontario, Canada) 其步驟如下： 1. 使200 pmols之猫合引子貼附到每一被覆有 streptavidin之小孑L 中， 2. 以TBS清洗小孔，並以lx第一單股合成缓衝液清洗； 50 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（48 3. « 4. 5. 6. 取2#g人類肝臟mRNA(Ambion，Inc. Austin, Tx)， 在第一單股合成緩衝液以及DNase抑制劑（Universal Riboclone cDNA Synthesis System Catalog No. C4360, Promega Corp, Madison, Wisconsin, USA) 存在的狀況下，使貼附至錨合引子。康那黴素 mRNA(Promega Corp)被用作為一正控制組（每一反 應1 # g)。負控制組則是在一相同條件之小孔中不加 RNA。mRNAs在42°C下進行黏合5分鐘。 cDNA之合成藉著加入焦磷酸鈉以及AMV反轉錄酶 (所有反應物係購自Promega Catalog N〇.C4360)而 開始。所有成分之最終濃度為：lx第一單股合成緩衝 液（50mM Tris-HCL，42°C 時pH8.3 ; 50mM KCL ; lOmM MgCl2 ; 0.5mM spermidine ; lOmM DTT ; dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 ImM) ； 40 單位之 Rnasin核醣核酸水解酶；4mM的焦碗酸納以及3 0單 位的AMV反轉錄酶。第一單股cDNA合成反應之最終 體積為20/zl。 在42°C下培養1小時。 藉由加入40 // 1之2·5χ第二單股合成緩衝液（lx = 40mM Tris-HCL, pH 7.2) ; 的 lmg/ml之乙醯化 BSA ; 23單位之DNA聚合酶1 ; 0.8單位之DNase Η 以及不含核酸水解酶之水，在最終體積100//1下，於 14-16°C培養2小時合成第二單股cDNA。 51 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（49 7. 每//g之加入RNA下加入2單位之T4 聚人酶 37°C下繼續培養1〇分鐘。 在 8. 9. Φ 以50mM之Tris-HCL清洗多孔盤中之每—丨 小孔數次。 接著將多孔盤放置冰上，並加入20#1之-pi Τ7 Rma 聚合酶緩衝液^

轉錄反應依製造商（AMPLISCRIBEtm Τ7 L ’ high yield transcription kit, Cat# AS2607 ，Epicentre,

Madison, Wisconsin)所提供之實驗程序，在⑼^^的 體積中進行。反應在37t下培養1-2小時。 10.取5/zl之反應溶液在洋菜凝膠上分析。 結果：與長度大於0.4kb之RNA轉錄物之核酸片段的分佈 相比’在以人類肝臟mRNA為引子之CDNA基因庫，以及以抗 康那黴素（kanamycin resistance)基因<mRNA為引子的反應 中，可同時觀察到在0.4-l.〇kb之中間分佈的現象。在負控制組 中並未觀測到RNA轉錄物。 核酸可從固態支托上所產出之轉錄反應產物，藉由RT_ PCR而倍增出來。相當於人類血清蛋白、beta肌動蛋白以及 G3PDH之特定尺寸的片段，可從人類肝臟細胞所衍生的樣品中 偵測到’但疋在控制組抗康那黴素基因之樣品mRNA中則未偵 測到。相似地，在控制組中有偵測到抗康那徽素基因之核酸片 段，但疋在肝臟特定轉錄產物中則未見。本例證實了爪尺^^八可 從一固態支托中以上述之方法進行倍增。 ---------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄)

1335938 A7 B7 五、發明說明（50 ) 第三實施例 本實施例所使用之材料包括： mRNA :人類肝臟完整RNA，以及酵母菌RNA(Ambion Inc.，Austin TX)。抗康那黴素基因控制組mRNA(Promega Corp) 〇 錨合引子：l)Bt-T7d(T)17V(如前所述）。2)Bt-ASC 1T3 其中Bt5端biotin ; T3=T3啟動子序列；ASCl=AscI限制内切酶 ，辨識位置(GGCGCGCC”3)TCR-接合子。 固態：被覆 streptavidin 之多孔盤（NoAb Biodiscoveries, Mississauga, Ontario, Canada) 第一部份的實驗過程如下所述： 1 · 將錫合引子200 pmol貼附於每一單孔被覆有 streptavidin之多孔盤中， 2· 利用TBS清洗，並以IX之第一單股合成緩衝液沖 洗， 3· 在该第一單股合成緩衝液以及DNase抑制劑 (Universal Riboclone cDNA synthesis System Catalog No. C4360, Promega Corp, Madison WI) 存在的狀況下。將樣品黏合至已錨合之寡核苦 酸。分別進行四個獨立的反應。反應樣品為： (a)20 μ g的人類肝臟完整RNA ; (b)20 g的人類 完整RNA + lng康那黴素mRNA ; (c)20 /z g的人 類完整RNA + 1 Ong的康那徽素mRNA ;以及 ______53_ 呆运痕兵运適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x^97公釐) ' --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 Φ « 五、發明說明（51 (d)20g酵母菌RNA+ lOOng康那黴素mRNA。 mRNA在42°C下進行黏合5分鐘。 4. 藉由加入焦填酸納以及AMV反轉錄酶（Promega Catalog No. C4360中的所有反應劑），以起始 cDNA合成。所有成分的最終濃度為：lx第一單股 合成緩衝液（50mM Tris-HCL，42°C 時 pH8.3 ;

5 OmM KCL ; 1 OmM MgCl2 ; 0.5mM spermidine ； lOmM DTT ； dATP, dCTP, dGTP, dTTP各ImM) ; 40單位的Rnasin核畴核酸抑制 劑；4mM焦磷酸鈉以及3 0單位之AMV反轉錄 酶。第一單股cDNA合成反應之最終體積為20 y 1 ° 5. 在42°C下培養1小時。 6. 第二單股cDNA合成反應，係加入40 μ 1的2·5χ第 二單股合成緩衝液（lx = 40mM Tris-HCL，pH 7.2) 、5 μ 1 的 lmg/ml 乙醯化（acetylated) BSA、 23單位的DNA聚合酶1、0.8單位的DNase H以及 無水核酸水解酶，最終體積為100/zl。在14-16°C 下培養2小時。 7. 每/z g的輸入RNA中，加入2單位之T4 DNA聚合 酶。繼續在37°C中培養10分鐘。 8. 以50mMTris-HCl, pH8.0沖洗多孔盤數次。 9. TCR-接合子黏接：接合子的黏接反應（ligation)係 在 30 μ 1 的體積中、利用 Fast-link DNA ligation 54 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（52 ) kit(Epicentre Cat#LK0750H, Madison WI)進 行。所有成分的最終濃度為：lx黏接緩衝液 (33mM Tris-acetate pH 7.8，66mM 醋酸鉀， 10mM 醋酸鎂，5mM DTT) ; 0_5mM ATP ; 20 pmol TCR-接合子。在室溫下培養30分鐘，接著 以50mM Tris-HCL pH8.0清洗多孔盤數次，接著 以2 0 // 1之1X T7轉錄緩衝液清洗。 _ 10. 轉錄反應係在20//1的體積中，依照製造商所提供 之實驗程序.（AmpliScribe T7 high yield transcription kit, Cat#AS2607, Epicentre, Madison, Wisconsin)進行。反應在 37°C 進行 1-2 小時。 11. 取每一反應液體取4 /z 1在洋菜凝膠上進行電泳分 析。 _ 結果：觀測到如下述的RNA倍增反應產物：在所有帶有 〇，1，或10ng康那黴素mRNA之人類肝臟完整RNA的倍增反應 中，均觀測到RNA產物之長度大於〇.4kb，且其中間分佈介於 0.4-1.Okb之間，並且在4號反應（其衍生自控制組mRNA之抗康 那黴素基因）中觀測到一不連續的RNA區段。 這些發現證實，一 cDNA基因庫（cDNA library)可在一固 態基板上，以20#g之人類完整RNA(其相當於大約200-400ng 的mRNA)的使用量合成得到。該基因庫可藉由轉錄倍增。 55 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2I〇x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（53 ) 1 ng或更少的單一種類可被以本方法偵測，如上所述以抗 康那黴素基因接合（spike)之RNA偵測。更進一步，該基因庫在 冰凍狀態下可保存數天。該保存的基因庫被有效率地轉錄，因 此使得本技術可用於RNA分佈的保存。本發明亦發現該保存基 因庫在兩個月或更長的保存之後，依然可以有效率地進行轉錄 反應。請參考圖13，其中lanel-4均為500ng人類總RNA於固態 支托上轉錄後之產物，冰存於-4°C七個月後之電泳結果圖，由 Λ 圖可知經由本發明方法保存於固態支托上之RNA，在長達七個 月後仍保有其活性。 第四實施例 將第一T7轉錄（第三實施例）所得之RNA(16 a 1)以乙醇沈 澱，並再次溶解在20// 1不含核酸水解酶的水中。4# 1的RNA被 用在T3轉錄循環（TCR)中。其實驗步驟如下： 1. 200 pmol的Bt-T3ASC1寡核苷酸被連接到被覆有 streptavidin的多孔盤； 2. 多孔盤以TBS清洗，並以lx第一單股合成緩衝液 沖洗； 3. 在第一單股合成緩衝液以及DNase抑制劑存在的狀 況下，將mRNA黏合至已錨合之寡核苷酸。總共4 個反應如下述設定：

a) 4 M g從第三實施例之T7反應1得到之RNA

b) 4/zg從第三實施例之T7反應2得到之RNA

c) 4 μ g從第三實施例之T7反應3得到之RNA 56 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄) 1335938 A7 B7 五、發明說明（54 4. Φ 5. 6. 8. 9. d)4 a g從第三實施例之T7反應4得到之RNA 黏合反應在42°C進行5分鐘。 藉由加入焦構酸納以及AMV反轉錄酶以起始 cDNA合成反應。所有成分的最終濃度為：lx第一 單股合成缓衝液（50mM Tris-HCL, 42°C時pH8.3; 50mM KCL; lOmM MgCl2；〇.5mM spermidine; lOmM DTT; dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 ImM) ; 40單位的Rnasin核酷核酸抑制劑；4mM 焦磷酸鈉以及30單位之AMV反轉錄酶。第一單股 cDNA合成反應之最終體積為20 #卜 在42°C培養該反應1小時。 第二單股cDNA合成反應係藉由加入40 # 1的2·5χ 第二單股合成缓衝液（lx = 40mM Tris-HCL, pH 7.2)、5 " 1 的 1 mg/ml acetylated B SA、23 單位的 DNA聚合酶1、0.8單位的DNase H以及無水核酸 水解酶至最終體積100/zl而起始。在14-16°C培養 2小時。 接著2 // 1(6單位）的五· co//黏接酶被加到每一孔 中，並且在16°C培養30分鐘。 每/z g RNA加入2單位T4 DNA聚合酶至每一孔 中，並且在37°C培養10分鐘。 在培養之後，以50mM TrisHCL，pH 8.0清洗多孔 盤數次。 57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2l〇x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各攔) 1335938 A7 B7 五、發明說明（55 ) 10. 利用轉錄反應以倍增各孔中之RNA。轉錄反應係 在20//1 的體積内依照 AmpliScribe T3 High Yield Tranacription Kit, (Cat#AS2603, Epicentre, Madison WI)所提供之實驗程序進行。反應在37 °C培養1-2小時。 11. 該反應藉由洋菜凝膠電泳進行分析。 > 結果：四個反應均觀測到具有0.4-lkb長度之轉錄產物。 這樣的結果展示了該黏接至以T7d(T)17V為引子的cDNA(得自 第六實施例）之TCR接合子，在驅動以T3 DNA聚合酶為媒介之 倍增反應之中是有效用的。本實施例稱為「轉錄連鎖反應（TCR, Transcription Chain Reaction)」方法的成功應用。 合併使用一如AscI(每670,000個鹼基對才會切割一次人類 DNA)之稀有序列限制酶，能允許該錨合之基因庫cDNA自該固 態支托釋放，也因此提供下游應用之彈性。在本實施例中同時 >發現三個TCR倍增反應的完整循環具有108的倍增倍率，所以 lng的完整RNA可被成功地倍增。 需注意的是，上述僅為具體例，而非限制於具體例。譬如 凡此不脫離本發明基本架構者，皆應為本專利所主張之權利範 圍，而應以專利申請範圍為準。 58 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） --------------裝--------訂--------線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁各欄)

Claims (1)

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99年6月修正頁

申請專利範圍 1. 一種製造RNA複本的方法，該方法包括： 提供一第一固態支托，該支托上係已連接具有含一啟動子 序列以及一標的結合序列之寡核苷酸； 黏合（annealing) —包括有RNAs之樣品至該固態支托上； 利用一RNA-引導（RNA-directed)之DNA聚合酶，延長該 已連接於該第一固態支托之寡核苷酸，以製造該等RNAs之 DNA複本； 合成互補該DNA複本之DNA單股，以製造一包括該啟動 子序列之雙股模板； 結合一包括有一標籤序列之接合子（adaptor)至該雙股模 板；以及 利用一可辨識該啟動子區域之RNA聚合酶，轉錄該雙股模 板以製造第一股RNA複本， 其中’該固態支托係選自由一下列物質所组成之群組：_ 針頭（pin)、一陣列、一具有一多試樣載具之表面、玻璃、塑勝 薄膜與位於一離心杯（spin-cup)上之薄膜。 2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該雙股模板係 嵌合入該已連接之寡核苷酸中，並藉由該已連接之寡核苦酸固 定在該固態支托上。 3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其更包括將—第_ 股RNA複本黏合至已固定之第二寡核苷酸，其包括一第二啟動 子序列以及一互補於該標籤序列之序列。 4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其更包括： 59 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210x297公釐）

請 先 讀 背 面 之 注 意 事 項 再

1335938 A8 B8 C8 D8 六'申請專利範匱 利用一RNA-引導之DNA聚合酶，以延長該已固定之第二 寡核苦酸，建構該等RNAs之DNA複本； 合成互補於該等DNA複本之DNA單股，以製造包括該第 二啟動子序列之第二模板；以及 利用一可辨認該第二雙股啟動子區域之RNA聚合酶，以轉 錄該互補單股，製造第二股RNA複本。 5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該已固定之第 二寡核苷酸係固定於一第二固態支托。 6. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該已固定之第 二寡核苷酸係固定於該第一固態支托。 7. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其更包括回收 (recovering) —雙股DNA分子群（pool)其係得自該第一股以及 第二股RNA複本之雜合反應（hybridization)。 8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一固態支 托係一針頭（pin)。 9· 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該針頭係連 接於一包括有其他連接針頭之基座（base)，其中該基座所包含 之針頭之裝配狀態使其可被放置在分離之反應混合物中。 10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該針頭係在 使用該方法時在多個容器間轉移，每一容器包括不同的反應之 反應劑。 11. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該第二單股 RNA複本係用以製造額外之第一股^^六複本。 _ _ 60 本紙張尺麵用中標準（CNS) A4規格------ 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各攔 裝 1335938 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 ^如申請專利範圍第i項所述之方法，其中該方法係實 質上等溫或在低於40°c之溫度下進行。 13. 如申請專利範圍第i項所述之方法，其中該樣品核酸 包括基因體DNA(genomic DlSfAJ。 14. 如申請專利範圍第i項所述之方法，其中該樣品核酸 包括cDNA。 15. 如申請專利範圍第!項所述之方法，其中更包括轉譯 (translate)該轉錄後之rna。 16. —種RNA複製與倍增之方法，包括： 提供一第-固態支托，該支托上係已連接具有含一啟動子 序列以及一標的股； 黏合一樣品核酸單股至一已結合該標的股之第一募核苷 酸； 延長該標的股之3端，以形成一第一募核苷酸_單股複合物 (complex)； 利用一第一RNA聚合酶轉錄該第一寡核苷酸_單股複合 物’以產生一第一RNA單股； 黏合該第一 RNA單股至一結合至一第一 rna單股之第二 券核苦酸； 反轉錄5玄第一 RN A早股，以產生一第一複本單股（copy strand); 使該第一複本單股成為雙股，以生成一第二寡核苷酸-複 本複合物；以及 本紐張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210x297公嫠） 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 裝 1. I ϋ H I | * . I n n ϋ #口 線丨 1335938 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 轉錄該第二寡核苷酸-複本複合物，其中該第一寡核苷酸 包括一特定地被一第一RNA聚合酶所辨識之啟動子區域，與一 結合至該標的股之3端之標的結合區域，以及該第二寡核苷酸包 括一特定地被一第二RNA聚合酶所辨識之啟動子區域，與一結 合至該第一 RNA單股之3端之標的結合區域。 17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該方法係 實質上等溫或在低於40°C之溫度下進行。 18. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該樣品核 暖包括基因體DNA(genomic DNA)。 19. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該樣品核 酸包括cDNA ° 20. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中更包括在 轉錄後保存該支托至少12小時；並重複進行轉錄。 21. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中更包括轉 譯（translate)該轉錄後之RNA。 22. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其’中更包括將 轉錄所得之RNA定序。 23. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中更包括從 轉錄所得之RNA製造DNA複本；以及在一載體核酸中複製該 DNA複本。 24. 一種製造RNA複本之方法，包括： 提供一具有寡核苷酸之固態支托，其中該寡核苷酸包含一 T7啟動子區域，一多胸腺0^咬尾段（homopolymeric T tract)，以及一終端腺σ票吟、烏糞嗓吟或胞°密咬； 62 本紙張R度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210x297公釐） 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 裝 二11 口 線！ 1335938 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 黏合一含RNAs之樣品至該固態支托； 利用一RNA-引導（RNA-directed)之DNA聚合酶，延展該 固態支托上之該寡核苷酸，以建構該RNAs之DNA複本； 合成互補於該DNA複本之單股DNA ;以及 利用一可辨識該啟動子區域之RNA聚合酶轉錄該互補之單 股DNA，以製造RNA複本； 其中，該固態支托係由玻璃構成，或一多孔盤之一孔之表 面。 25. 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該RNAs包 括mRNAs。 26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該mRNAs 係取自一哺乳類動物組織。 27. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該mRNAs 之來源係少於100個細胞。 28. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該mRNAs 之來源係少於10個細胞。 29. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該mRNAs 係少於1 Ong。 30. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該組織係 正常組織。 3 1.如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該組織係 腫瘤組織（tumorous)或轉移性組織（metastatic)。 32.如申請專利範圍第24項所述之方法，其中更包括在 轉錄前保存該固態支托至少48小時。 63 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐) 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各欄 裝 n - - - - - n 11 I ，- ^1» Hi 1115 線！ 丄 /\ Αδ Β8 C8 D8 '申請專利範圍 33·如申請專利範圍第24項所述之方法 寡核苦酸係相同的。 34. 如申請專利範圍第24項所述之方法 寡核苦酸係以共價（_alenUy)鍵結方式連接。 35. 如申請專利範圍第24項所述之方法一 寡核苦酸係以非共價（n〇n_c〇valently)鍵結方式連接 36卜如中請專利範圍第24項所述之方法，其中該驅複 本係已標疋（labeled)。 3 7.如申請專利範圍第24項所奸〜 ” 視斤返之方法，其中更包括雜 s 一（4示疋）探針至該固態支托。 38.如申請專利範圍第μ項 —t备 叮建之方法，其中該連接之 券核苷酸係以其5端連接。 其中該連接之 其中該連接之 其中該連接之 _ ---------------装---------訂---------線 請先讀背面之注意事項再填寫本頁各攔 64