TWI332526B - Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus - Google Patents

Description

1332526 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一新顆的引子對、探針對及以B型肝炎 病毒基因為模版所複製放大而得之核酸，及以其同時對基因 型作定型及定量B型肝炎病毒的方法。 【先前技術】

早 核酸多型（們）（single nucle〇tide ρ〇 1 ym〇rphisms, SNPs) ’亦即基因序列位置上一群變異的單一核酸，其係 分布於整個基因序列中。一單一核酸多型係可以為等位基 因。亦即’由於存在該基因多型性，因此一物種中某些個 體具有非變異序列（野生型），而另一些個體則具有變異序 列（變異型）。就動物個體而言，基因多型性可能導致隱性 遺傳疾病。上述疾病包括：牛淋巴球黏力缺失症（Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency)、 胍 胺 酸 症 (Citrullinemia)、楓糖尿症（Maple Syrup Urine Disease)、 尿核甘單磷酸鹽合成缺失症（Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase)、溶腾小體貯積症、醣化基因症 等。人賴之纖維囊化症（cystic fibrosis)係上述隱性遺傳疾 病之一例，該病患者群約占白種人族群中兩千分之一。就 諸如細菌或病毒之類的微生物致病源而言，單一核酸多型 性與不同的致病效應有關，並因此影響罹患該病症之病患 的治療及長期預後狀況。依據上述，迫切需要一種能夠有 效鑑別及量化内含單一核酸多型之核酸的方法。 1332526

【發明内容】 本發明係有關於一新穎的引子對、探針對及由以B型 炎病毒基因為模版所複製放大而得之核酸，及將其同時用 基因型定型及B型肝炎病毒定量上的應用。 本發明係關於一種能夠同時鑑別一微生物標的核酸 單一核酸多型及量化該標的核酸的方法。該鑑別及量化 同時執行。 本發明方法需使用一種第一探針及一種第二探針。 第一探針係與一標的核酸之第一序列相同或互補，其係 含一與單一核酸多型相對應的鹼基；該第二探針係與一 的核酸之第二序列相同或互補，其係不包含與單一核酸 型相對應的鹼基。該第一探針係共價鍵結於一第一螢光 定物，該第二探針係共價鍵結於一第二螢光標定物。該 一螢光標定物及該第二螢光標定物中之一者為螢光施體 另一者為螢光受體，如此一來，當該第一探針及第二探 與該標的核酸雜合時，該螢光施體與該螢光受體係處於 近位置，使得兩者之間能夠進行螢光共振能量轉 (FRET)。 本發明方法包括將一樣本中的標的核酸複製增量 步驟，其係藉由聚合酵素連鎖反應（PCR)以一對引 (primer)序列為之，使得樣本中該標的核酸形成一包含 第一序列及該第二序列的雙股核酸。上述第一探針及第 探針係於聚合酵素連鎖反應的鏈合（annealing)步驟中與 核酸產物雜合，以分別形成一第一雙股（duplex)及第二 肝 於 之 係 該 包 標 多 標 第 針 鄰 移 的 子 該 該 雙 1332526 股。上述兩種探針係可以雜合於該核酸產物的同一股上。 上述兩種探針亦可以雜合於該核酸產物的不同股上，並且 使得該螢光施體與該螢光受體位於鄰近位置上。例如該兩 種探針所雜合的序列係可以位於該核酸產品兩股所形成的 叉狀結構或泡狀結構上。

樣本中標的核酸量的測定，係藉由測量該第一探針上 螢光受體所發出的螢光量為之，其係於每一聚合酵素連鎖 反應循環之鏈合期的最末階段為之。上述螢光量之測定係 將該待測螢光強度與一預定值比較得知，其中該預定值係 由含有已知濃度之該標的核酸的溶液測量而得。上述螢光 量之測定亦可將該聚合酵素連鎖反應之交叉值（cross point value，Cp value)與一預定值比較得知，其中該預定 值係由含有已知濃度之該標的核酸的溶液測量而得，其測 量方法係如 Mackay I. et al., Nucleic Acids Res. 30:1292-1305, 2002 所述 °

聚合酵素連鎖反應完成後，加熱使得溫度高於該第一 探針及其互補序列形成之雙股核酸的分離溫度（melting point)。當該雙股核酸分離時，上述螢光施體及螢光受體 之間的FRET受到干擾。該標的核酸中單一核酸多型的鑑 別，係以一激發光照射該螢光施體，並測量該第一探針之 螢光受體所發出之螢光量的改變，該螢光量的變化係為所 升高溫度值之函數。舉例來說，鑑別一單一核酸多型時， 首先，建立該第一雙股核酸的一階導函數分離曲線，其中 該第一雙股核酸包含一螢光標記探針，且該分離曲線係基 8 1332526 於隨溫度而變的螢光量而有所變化。其二，建立一溫度曲 線，其係基於分離曲線之分離高峰而得。其三，比對該溫 度值與該雙股核酸的分離溫度，其中該雙股係由該第一探 針與一互補序列形成。當該溫度值較該分離溫度低時，該 標的核酸中存在一單一核酸多型，當該溫度值與該分離溫 度相同時，則不存有單一核酸多型。

本發明另一特徵係關於可用以複製放大取自 HBV的標 的核酸之引子對，其分別包含下述序列編號（SEQ ID )之基 因：前置引子為TACTGCGG (序列編號：13 )及反置引子為 GGTGAAGCGA (序列編號：14 )、前置引子為CGTGGAACC (序列編號：17 )及反置引子為GGTGAAGCGA (序列編號： 14 )或前置引子為CTCAGGCCA (序列編號：20 )及反置引 子為AACGCCGCAGACACATCCA (序列編號：6 )，其中每 一個引子之長度介於8到50個鹼基之間（亦即，1 5到40或 1 8到3 0個鹼基之間）。上述引子對亦可以為如下序列：前 置弓I子為CCGATCCATACTGCGGAAC (序列編號：9 )及反 置引子為 GCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA(序列編號：10)、 前置弓I子為GCATGCGTGGAACCTTTGTG (序列編號：1 )及 反置引子為CAGAGGTGAAGCGAAGTGC (序列編號：2 )、 前置引子為TCATCCTCAGGCCATGCA (序列編號：5 )及反 置引子為AACGCCGCAGACACATCCA (序列編號：6 )。 本發明亦提供探針對，其係用於同時鑑別B型肝炎病毒 中標的核酸之單一核酸多型及定量該標的核酸。該探針對分 別包含下述序列編碼（SEQ ID )之基因：第一探針為 9 1332526 TTGTCT ACG (序列編號：18)及第二探針為 CGCTGAATC (序列編號：19)、第一探針為TACGCGGACTC(序列編號：

1 5 )及第二探針為GCCTTCTCATC (序列編號：1 6 )或一感 應探針為ACACGGGTGTTTCC (序列編號：21 )及一固定探 針為 ATTGAGAGAA (序列編號：22 )，其中每一個引子之 長度介於9到50個鹼基之間（亦即，15到40或1 8到30個 鹼基之間）。上述探針對亦可為如下序列：一感應探針 ACGTCCTTTGTCTACGTCCCG (序列編號：3 )及固定探針 CGGCGCTGAATCCCGCGGAC (序列編號：4 )、感應探針 TCTTTACGCGGACTCCCC (序列編號：11)及固定探針 TCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACC (序列編號：12 )、感 應探針AAGACACACGGGTGTTTCCCC (序列編號：7 )及固 定探針 GAAAATTGAGAGAAGTCCACCACGAGTCTA (序列 編號：8 )。

本發明亦提供由以B型肝炎病毒基因為模版所複製放 大而得核酸產物，其包含序列編號為15、18及21之基因， 或其之互補基因序列，其中每一個核酸產物之長度介於100 到1 ,000個鹼基之間（亦即，200到700或300到500個鹼 基之間）。上述核酸產物係與上述引子及探針雜合，用以鑑 別及定量含有單一核酸多型之標的核酸，其中該標的核酸係 取自HBV基因。 本發明亦提供一可同時鑑別及定量含有單一核酸多型 之HBV標的核酸的試劑組。該試劑組包含1、2或3對上述 引子對和/或探針。 10 1332526

本發明實施例之實施細節如下所述，然其並非用以 本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神 圍内，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍 後附之申請專利範圍所界定者為準。 【實施方式】 本發明之目的係為提供一種同時鑑別 B型肝炎病 因型及定量該基因的方法。 本發明方法需使用一種第一探針及一種第二探針 第一探針之設計係依據標的核酸中習知的單一核酸多 其特性來設計，例如，G C含量、鏈合溫度、内部配對 其可以軟體程式來決定。為使得該第一探針能夠鑑別 種個體核酸中的單一核酸多型，該第一探針之序列係 含有單一核酸多型的序列相同或互補，其係能用以鑑 物種中至少兩種不同的基因型。上述序列之決定係藉 對該物種不同個體之去氧核醣核酸之標準序列而得， 法係與下文中F探針及引子之設計』單元中所述方法獎 上述不同個體之去氧核醣核酸序列係由任何恰當的資 中取得，例如 www.ncbi.nlm.gov/PMGifs/Genomes. 該第一探針係與一單一核酸多型對偶基因（例如 型）雜合而形成一雙股核酸，且其中不具有任何錯配的 對。該第二探針係與另一單一核酸多型對偶基因（例： 變型）雜合而形成另一雙股核酸，且其中具有錯配的 對。由於上述雙股核酸之後者具有錯配的鹼基對，故 限定 和範 當視 毒基 。該 型及 等， 不同 與一 別該 由比 其方 i似。 料庫 野生 鹼基 ρ :突 鹼基 其分 11 1332526

離溫度（Tm)較前者為低。該第一探針可 為基礎的方式來區分野生基因型及突變基 針與野生型基因及突變型基因雜合產生雙 可以用實驗方法測定之。上述兩種雙股核 差異亦可以用實驗方法測定之，其差異大Λ 度）需足以測量出兩者間之差異。 茲以肝炎病毒為例：肝炎病毒包含單 因序列為：TACGCGGiCTC(序列編號15)， 列編號：1 8)，AC4_CS_GGTG：LTXCC (序列編 體斜線之字母表示對應於單一核酸多型七 一核酸多型係能用來區分肝炎病毒A基因 參見表1及表2，以及下文中『同時鑑別2 上述包含單一核酸多型的序列（們）， 好為一物種中不同基因型個體所保留的序 序列）。如下文所述，該保留（或無變異）側 第二探針以及聚合酵素連鎖反應引子相當 該第二探針之設計係基於兩個原則。 針不包含單一核酸多型，且其序列與物種 保留序列相同或互補。其二，該保留序列 一核酸多型的序列相鄰。此種設計之目的 探針及該第二探針與標的核酸雜合後，該 能夠相當靠近，例如間隔1至3個鹼基。 上述第一探針及第二探針係連結於| 藉由習知技術以直接或間接的方式測定之 以設計為以基因 因型。該第一探 股核酸的能力係 酸之分離溫度的 丨、（例如：達攝氏2 一核酸多型之基 TTGT£_TACG(序 號：2 1)(前述粗 t的鹼基）上述單 型至G基因型。 i測量』一節。 其側翼之序列最 列（即，無變異的 翼序列對於設計 重要。 其一，該第二探 中不同基因型之 係與上述包含單 在於，當該第一 兩種探針的位置 会光標定物，並可 。該螢光標定物 12 1332526

中之一者為螢光施體，另一者為螢光受體’該螢光施體所 發出的螢光發光光譜（emission spectrum)係與該螢光受體 的激發光譜（excitation spectrum)重整。當該第一探針及第 二探針與該標的核酸雜合時，該螢光施體與該螢光受體係 處於鄰近位置，使得兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移 (FRET) »上述螢光受體所發出的螢光係能夠藉由習知技術 鑑別及量測之。凡是發光光譜及激發光譜重疊的兩個螢光 標定物都可以用來標定上述第一探針及第二探針，例 如：LightCycler-Red 640可以為上述螢光受體，而螢光黃 (fluorescein)可以為上述螢光施體。

欲同時鑑別和定量一標的核酸，須將上述探針與該標 的核酸混合，施以即時聚合酵素連鎖反應（PCR)。上述PCR 反應所用的引子（primer)對係以習知技術之原則設計之》 該引子序列尤其應該與單一核酸多型侧翼之序列相同或互 補，其中該側翼序列係為一物種中不同基因型個體所保留 的序列。上述引子對係用以將一含有單一核酸多型的標的 核酸複製放大。上述去氧核醣核酸序列係由任何恰當的資 料庫中取得，例如：組織均質物 （tissue homogenate)、血 液樣本，並且’其係可以為去氧核醣核酸或核醣核酸，若 為核醣核酸’則在進行聚合酵素連鎖反應之前應先施以反 轉錄步驟。上述聚合酵素連鎖反應係依據一般標準程序進 行，其可以參照 Innis et al_(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich，New York。在一實施例中，即時聚合酵 13 1332526 素連鎖反應係採用市面上可購得之即時聚合酵素連鎖反應 系統（Roche Molecular Diagnostic 承鎖之 LightCycler)。

聚合酵素連鎖反應的三個步驟（即變性、鏈合、延長 三步驟）可以重複施行多次’使得能夠獲得足量之與標的 核酸相對應的產物。其重複施行的次數則與其所使用的樣 本性質及其他因素有關。若上述樣本為複雜的核酸混合 物，當吾人欲獲得足量的上述標的核酸時，則重複施行聚 合酵素連鎖反應的次數必須較多。通常上述聚合酵素連鎖 反應重複施行的次數至少2 0次左右，但也可能達到4 0次、 5〇次、60次甚至100次之多。上述聚合酵素連鎖反應之產 物與上述探針鏈合後’即可用以鑑別及測量上述標的核酸。

樣本中標的核醆之量的測定，係藉由測量上述螢光受 韹所發出的螢光量為之’其係於每一聚合酵素連鎖反應循 環之鏈合期的最末階段藉由照射上述螢光施體為之。上述 發出螢光之強度係為上述複製放大的核酸產物量之函數， 而上述核酸產物量係為該標的核酸原始濃度及聚合酵素連 鎖反應重複次數之函數。若聚合酵素連鎖反應重複施行的 次數夠多，則該複製玫大之核酸產物的累積率及螢光量變 化率即進入一對數線性階段。將該螢光強度值對該聚合酵 素連鎖反應次數繪圓，即可獲得對應於該對數線性階段起 點的聚合酵素連鎖反應重複次數（亦即交叉值，Cp值）。 繼之，將上述測得之Cp值與一預定值比較’其中該預定 值係由含有已知浪度之標準核酸溶液測量而得。利用下文 中「HBV定量」一節所述之方法，即可獲得一系列之上述 14 1332526

Cp預定值。因此，吾人可以藉由將一給定之Cp值與上述 一系列Cp預定值進行比對’即可得知該標的核酸之原始 濃度》 或者，亦可將其所發出螢光強度與一預定螢光強度值 比較，而來定量一標的核酸。除了其對應之核酸原始濃度 為已知外，該預定螢光強度值係以相同方式決定之。

欲鑑別一標的核酸’可於聚合酵素連鎖反應終了後， 將其複製放大的核酸產物施以一分離曲線分析而得知。將 該聚合酵素連鎖反應後之反應溶液緩慢加熱之，其加熱梯 度約為每秒鐘升高攝氏〇_5度，使得溫度高於該第一探針 及其互補序列形成之雙股核酸的分離溫度。同時在照射該 螢光施體時，監測該螢光受體所發出的螢光量。將該螢光 強度（F )對該分離溫度（T m )做圖，即可得到一分離曲 線圖。繼之’將該螢光強度（F)對溫度（T)微分，取其 負值（-dF/dT )對溫度做圖，以獲得該分離曲線之一次微 分曲線’來決定一分離峰值》將該分離峰值所對應的溫度 與該第一探針的分離溫度比對。在一較佳實施例中，上述 分離曲線分析係以LightCycler分析軟體（3.5版）為之 (Roche Diagnostics Applied Science, Manngeim Germany )°當該溫度值低於該分離溫度，則表示該標的核 酸中含有一單一核酸多型’當該溫度值等於該分離溫度， 則表不該標的核酸中不含有單一核酸多型。上述方法係能 夠有效地同時鑑別和定量—含有單—核酸多型的核酸。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 15 1332526 限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精 神和範圍内，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 探針和弓丨手的設計

由 www.ncbi.nlm.nih. sov/PMGifs/Genomes/viruses.html 所示資料庫中取得216段完整的肝炎病毒DN A序列。其中 有1 7 5段序列經鑑別為屬於A到G基因型之病毒，該鑑別 操作係以 Biology WorkBench 所提供之 CLUSTRLW Multiple Sequence Alignment，DRAWTREE 及 DEAWGRAM 軟體為之（workbench.sdsc.edu/)。

在上述175段基因序列中，有47段屬於B基因型，有 49段屬於C基因型。將上述兩種基因型之基因序列比對並 排，以鑑別出另一含有單一核酸多型且兩翼序列為上述兩 種基因型共有基因的基因序列片段，其係藉由CLUSTRLW 多序列比對程式（CLUSTRLW Multiple Sequence Alignment program )為之。上述步驟比對出三段基因序 列’並據以設計出三對引子及探針，其係依據TIB MOLBIOL ( Gerlin，Germany)所提出的原貝1為之。上述引 子對可藉由PCR反應由其個別標的核酸來產生複製放大 產物。茲將上述複製放大產物、引子對及探針對的基因位 置總結如表1所示。 表1 :用於鑑別及定量HBV中單一核酸多型的複製放大產 16 !332526 物、引子對及探針對

««Αλί物 序細 序列（5’~3’） 位置(it) 產物大小 (bp) TM 值（°C) 第-群 前置引子 1 5*<3CATGOGTGGAAOCTnurM’ Ώ32-Ώ51 基因型B 57.7 反置引子 2 5’CAGAGGTGAAGCGAAGTGC*3， 1599-1581 368 基因型C 66.3 固定栅 4 FLU-5，<X5GCGCTGAAr〇OCGOGGAC-3’丨 1436-1455 ΔΤΜ=8.6 mm 3 y-ACGT0CnTGT£IA0GTC0CG4jC«£d64(H， 1414-1434 ί30%Δ ΤΜ=±1_8 SNP位置 (7Γ*ιί1425 第4 前置引子 9 S’^CCGATCCAIACrGCGGAACO1 1261-1279 基因型Β 60.9 反置引子 10 5’*GCAGAGGTGAAGOGAAGTGCA-3， 1600-1580 340 基因型C 54.8 团定撕 12 FLU-5’-TOGTGOCnCTCAICrGOOGGAOC-3，*P 1552-1576 Δ ΤΜ=6.1 11 y-TCmAOGOGGACTOOOC-IOed· 1533-1550 ±30% △ ΤΜ=土 1.8 SNP位置 A/T*ntl544 前置引子 5 5’-TCATCCrCAGGOCATGCA-3， 3192-3209 基因型Β 64.3 妓引子 6 5,-AACGCCGCAGACACAICCA-3, 392-374 416 基因型C 46.8 固定撕 8 FLU-5’OMMTTGAGAGMGTCCACCACGAGTCIA-3’-P 脳9 ΔΤΜ=16.3 7 5’-ΜΟΑεΑ(^(ΚΠςρϊαΠ：-ΙΧ：-Μ640·3’ 301-281 土 30% Δ ΤΜ=土 4.9 SNP位置 A«'nt285；A/G-nt287；G/A-nt2®；T/C*nt2W

1 :核酸位置（nt)係以B型肝炎听亞型基因庫之位置表示（GenBank accession no. NC_003977 )- 2 : P表3’端經磷酸化處理以避免探針於pcR時廷伸。 3 : FLU 表螢光（flourescien): UC4ted640表L^ikjdaRedM) 4 :所示TM值為平均數，tm值illC係為基因型定型所容許· 5: SNP位粗j|、底線標示之。 複製放大產物1在核酸位置1425處含有一 C/T單一核 酸多型。複製放大產物2在核酸位置1 544處含有一 A/T 單一核酸多型。上述兩種單一核酸多型係位於HBx基因 上。複製放大產物3含有4個單一核酸多型，其分別為： HBV之核酸位置285處（A/G單一核酸多型）；HBV之核酸 位置28*7處（G/A單一核酸多型）；hbv之核酸位置292處 (G/A單一核酸多型）；hbv之核酸位置294處（T/C單一核 酸多型）°上述4種單一核酸多型均係位於HBs基因上。 17 1332526 上述引子及探針係由TIB M0LBI0L所合成。其中，第 二探針（固定探針）之3’端具有螢光標定，含有單一核酸 多型的第-探針（感應探針）則是在5’端具有Lc_Re“4〇 染劑標疋。上述感應探針的3,端亦已峨酸化。 為確認上述複製放大產物中含有單一核酸多型，由40 位B型肝炎病患取得血清樣本，依照下文中「hbv之dna 製備」一節中所述方法由該血清樣本中製備DNa。利用傳 統的PCR反應複製放大上述基因樣本，再將該等基因樣本 的複製放大產物以ABI PRISM Big_dye kits分析其基因序 列，並藉由 ABI 31〇〇 Genetics Analyzer (Applied Biosystem，Foster City，CA)分析之。結果顯示，上述 2〇 種樣本之複製放大產物含有HBV C基因型的單一核酸多 型’而另外20種樣本之複製放大產物含有hBV B基因型 的單一核酸多型。 HBV DNA之贺備

由1 1 4位慢性B型肝炎病患取得血清樣本。所有上述 病患均由國立台灣大學附設醫院門診進行後續追蹤。為確 認上述血清提供者確罹患慢性B型肝炎，進一步以市售肝 炎測試劑（Ausab，Ausria II, Murex HbeAg/anti-Hbe, Abbott Laboratories, North Chicago, IL)測試該 jk 清樣本 含有 HbsAg、anti-HBs、anti-HBc Igs、HBeAg、anti-HbeAg。 上述血清中的 HBV DNAs 亦以分枝鏈 DNA 分析法 (QUANTIPLEX tm HBV DNA Assay, Chiron Corporation,

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Emeryville，CA)分析之，其係依據該產品業者提供之操 作方法為之。上述操作均依照1 975年赫爾辛基宣言中所示 的醫學倫理準則為之。

繼之，由上述樣本中製備HBV基因，其係以高純度病 毒基因製備試劑組（Roche Diagnosis Applied Science， Mannheim Germany)為之。取200μ1的上述血清樣本，將 之與200μ1的結合緩衝液混合，於攝氏72度中反應1〇分 鐘’其中該結合緩衝液成分包含：6Μ胍氫氣酸 (guanidine-HCl)' 10mM 尿酸、l〇Mm Tris-HC卜 20% Triton X-100(vol/vol)、200 /z g 之 p〇ly(A)、0_8mg 胰蛋白 K。繼 之，將該反應混合液與1 0 0 y 1的異丙醇混合，滴入一已預 先充填了玻璃纖維之高純度過濾管中。將該過濾管以一抑 制物移除緩衝液沖洗兩次後，以1 00 y 1水將該病毒核酸洗 出，其中該抑制物移除緩衝液成分包含：1 〇〇%乙醇、 20mmol/L 氣化納、2mmol/L Tris-HCl。

繼之，利用傳統方法確認上述HBV病毒DNA所屬之 基因型，在此所謂的傳統方法包括：PCR-PFLP、使用基因 型專屬引子之PCR、及直接定序等等。上述肝炎病患的血 清中，有60個樣本經鑑別為含有B基因型的HBV，而46 個樣本經鑑別為含有C基因型的HBV »其餘8個樣本中的 HBV則無法以上述傳統方法決定出其所屬的基因型。 HBV定吾 為進行HBV的定量，必須先以質體pHBV 48為對象’ 19 1332526

做成一複製量標準曲線。該質體之製造係將15mer的HBV DNA片段（核酸位置為2851至3182/1至3182/1至1281) 載入PGEM-3Z載體8中為之。上述質體合成後，係以質體 純化劑組（QIAGEN GMbH，Hilden Germany)純化之，並以 光譜儀定量之。其對應之HB V效價（copy/mL )係以每一 質體的質量決定之。繼之，將該質體進行一系列稀釋，以 得到 HBV 效價值介於 lxlO2 copy/mL 至 lxlO11 copy/mL 的10個樣本。上述10個樣本係依據下述方法做成一標準 曲線。

每一上述樣本，取2/zl，將之與下列溶液混合：0.5μ 1 的 LightCycler fastStart DNA Master Hybridization Mixture、0.2 μ 1之25mM氣化鎮、以及如上文「探針及引 子設計」一節中所述之第二探針，其中該 LightCycler fastStart DNA Master Hybridization Mixture 包含成分：Tag DNA聚合酵素、PCR反應緩衝液、l〇 mM氣化鎂、dN TP 混合液(Roche Diagnosis Applied Science, Mannheim Germany )。混合上述液體後，將最終反應液的體積調整到 5//1’使得每一反應液中的引子濃度為5//M，而每一反應 液中的探針濃度為 0.5//M。將上述最終反應液載入 LightCycler毛細管中並離心之，再置入LightCycler樣本 旋轉架中（Roche Diagnosis Applied Science, Mannheim Germany ) ° 繼之，依據下述程序執行一及時PCR反應。首先以攝 氏95度加熱該反應液1〇分鐘，使得DNA變性分離。然後 20 1332526

重複進行如下程序55次：於攝氏95度加熱5分鐘，使得 DNA變性分離；於攝氏55度加熱10秒，使得DNA鏈合； 於攝氏72度加熱20秒，使得DN A分子延長。上述反應令 溫度轉換速度之設定為：分離/鏈合轉換為每秒鐘20度； 而鍵合/延長轉換為每秒鐘 5度。在每一次鏈合步驟完成 時，測量LC-RED640發出的螢光量《決定每一樣本的Cp 值’並利用LightCycler軟體3.5版，將樣本的Cp值對樣 本濃度對數值作圖，即可得出標準曲線。上述標準曲線在 lxlO2 copy/mL至 lxl〇n COpy/mL的範圍内呈現一直線 段，表示其測試限度為lxl〇2 copy/mL。

繼之測試該標準曲線以定量HBV DNA。該測試操作所 使用的測試樣本包括：由 HBV Genotype Panel(International Enzymes, Inc., Fallbrook, CA)取得之 15個基因型為A至F的樣本、由QUANTIPLEX bDNA劑 組取得之4個樣本。上述19個樣本均包含已知其效價的 HBV。將上述樣本進行即時pcr，並以上述方法獲知其Cp 值。並利用上述標準曲線找出與Cp值相對應的效價。針 對每一樣本進行6次（3次重複實驗）上述定量作業。上 述測試結果顯示所有樣本的效價均為正確。 將上述方法所獲知的效價與依據傳統方法獲知的效價 進行比較，其中該傳統方法包含：NGI SuperQuant、Roche Amplicor、Chiron Quantiplex bDNA assays。上述三種傳統 方法之實施係依據其製造商提供的操作方法為之。將上述 方法測得的效價對上述三種傳統方法測得的效價進行線性 21 1332526 回歸，結果顯示其具有顯著相關（gamma值分別為0.9866, 0.9830 及 0.999)。藉由皮爾森相關（Pearson correlation)估 算其組間差異係數與組内差異係數。其結果為P值小於 0.001，顯示該方法具有相當的再現性。 Η B V之鑑別

測試上述三組探針對及引子對，以區分出在台灣、中 國大陸及日本三地流行的Β型肝炎病毒及C型肝炎病毒。

由上述樣本中選取10個含有基因型Β基因序列的樣 本，以及10個含有基因型C基因序列的樣本。依據上述 「HBV定量」一節中所述方法，以上述樣本及第2組引子 及探針進行PCR反應。於PCR反應終了後，先將反應液 置於攝氏95中60秒，再將其冷卻至攝氏45度（溫度下降 速度為每秒鐘下降攝氏0.5度），將該反應液置於攝氏45 度中120秒，在將其加熱至攝氏80度（溫度上升速度為每 秒鐘上升攝氏0.5度）。同時，測量640nm之螢光量。訂 出所有上述樣本的分離曲線後，將該螢光強度（F )對溫 度（T )微分，取其負值（-dF/dT )對溫度做圖，以獲得該 分離曲線之一次微分曲線，來決定一分離峰值，上述分離 曲線分析係以LightCycler分析軟體（3.5版）為之。 上述分離曲線之一次微分曲線顯示，上述樣本的分離 峰值依其值之大小分為兩群。且上述兩群樣本的分離溫度 平均值分別對應HBV基因型B及基因型C的溫度（其分 別為攝氏60.9度及54.8度）。上述10個含有基因型B基 22 1332526

郎中所述，取自 因序列的樣本，其分離溫度與60.9度之差異均在1 内，亦即ΔΤιη(6.1度）之30%之内。上述1〇個 因型C基因序列的樣本，其分離溫度與54.8度之差 1.8度之内。因此1.8。(：（或ΔΤτη (6.1度）之30% 為區分基因型Β及基因型c之分界點。第1組及第 製放大物（及其相對應之引子和探針）之基因型分 別為2,5°C和4_9°C，其係依據如上述之方法所決定 平均分離溫度和分界點係總結於表1中。 繼之，利用上述3組引子及探針，決定如前文 DN A製備」一節中所述之60種B基因型的HBV万 C基因型的HBV之基因型。採用第t組引子及探針 述106種HBV中，可以正確判定其中1〇3種 型。至於3個未被正確判定的樣本，有丨個被錯誤 另外2個則無法判定。採用第2組和第3組 开紐弓丨子及老 則分別有1個和2個樣本無法正確判定。然而 — 用上述3組引子和探針中任2組時則可以正右 上述1 06個樣本的基因型。 確判 如前文「HBV DNA製備 的樣本無法以傳統方法決定其含有hbv的基因 3組引子及探針鑑狀，料以正確決定出^ ' 本中所含HBV的基因型。將樣本中的基因直接… 認上述鑑別結果為正確的。上 _ ^ 通結果顯不本發明 塑鑑別方法較之傳統的HBV臬田荆你 *因型鑑別方法

正確度。 I • 8度之 含有基 異均在 )係作 3組複 界點分 。上述 r HBV :46種 時，上 的基因 判定， 民針時， 同時採 斷所有 位病患 以上述 患者樣 再次確 述基因 更1¾的 23 1332526

同時鑑定及定量HBV

藉由上述引子及探針與上述方法，針對含有B基因型 及C基因型之HBV的樣本同時進行鑑別及定量。自台灣 大學附設醫院（台北，台灣）取得含有B基因型及C基因 型之HBV的質體。將含有B基因型及C基因型之HBV的 質體依不同比例混合，其混合比例介於1 0 : 1到1 : 1 〇之 間。依據上述「HBV之鑑別」一節中所述方法，鑑別該質 體混合液所含HBV之基因型，其中該質體混合液之效價為 每毫升107個質體。上述操作之結果顯示，各樣本之分離 曲線的一次微分曲線顯示對應HBVB基因型及C基因型的 分離曲線與分離峰值。同時，依據如前文「HBV定量」一 節中所述之方法，測得各樣本的Cp值及其中所含質體的 效價。上述操作的結果顯示，上述方法可以同時鑑別及定 量一樣本中所含之主要HBV群及次要HBV群。其中，上 述次要HBV群之質體效價至少為上述主要HBV群之10 %。上述方法可以僅以單管樣本，同時鑑別及定量一含有 單一核酸多型的標的核酸，該方法具有極佳的效率、正確 性及敏感度。 本發明方法除了可以用於鑑別及定量B基因型及C基 因型之外，亦可以用於其他基因型之鑑別及定量。前文「探 針及引子的設計」一節中所述之175個HBVDNA序列， 均可以依據該節所述方法並列比對。該引子及固定探針之 序列在A到G之基因型中，均保持不變。對應複製放大物 24 1332526 的單一核酸多型亦被檢驗，其序列變異及相對頻率均列示 於表2中。 表2: HBVA基因型A至G基因型中單一核酸多型序列 之變異 第一群 第二群 第三群 、ISNP c A A A G T ΑΠ7) T(1棚 m m T(i3)/GaaD G(17) Β(47) A(46K!iQ) A(44)/CQ) m TT45)細/Gfn C(49) Q37XI1Q2) T(4誦 Q46jim G(48yA〇) Α(47)ί〇β) C(43)/A(5)^D D(24) wrm A02XDM m 網 聊 E(2) Φ) TP) G(2) G(2) op) Tp) F(28) 11(25)03) Ap2/rp腿 opsm φ2)/施幽 (](27){Αϋ) πι_〇) G(8) T® m G® W) 標底線字母及數字表較低之變異及其頻率。

如表2所示，7種基因型中除了基因型B及D之外， 在3種複製放大物中均具有獨特的單一核酸多型組合。因 此，可以依據下述方法，利用3組不同的引子及探針來鑑 別HBV的基因型：

(1 ) 使用第2組引子及探針，決定待測HBV是否 屬於第1群（基因型A、C、E、G)或是第2群（基因型 B、D、F )。 (2 ) 使用第1組引子及探針，決定待測HBV是屬 於第1群的基因型A、G、C、E中哪一種。 (3 ) 使用第3組引子及探針，決定待測HBV是屬 於第2群的基因型B、D、F中哪一種。 其他實施例 25 1332526

雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非 用以限定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之 精神和範圍内，當可作各種之更動與濶飾，凡所做之各種 更動與潤飾皆在本發明後附之申請專利範圍内。 26 1332526 序列表 <110>普生股份有限公司 <120>同時對B型肝炎病毒基因型定型及定量的方法 <140> TW096141243 <141> 2003-11-05 <150> 10/395013 <151> 2003-03-21 <160> 22 <170> Patentln version 3.4 ΝΡ·1628·2·π 序列表 _ST25 <210> <211> <212> <213> 20 DNA B型肝炎病毒 <400> 1 gcatgcgtgg aacctttgtg 20 <210> 2 <211> 19 <212> <213> B型肝炎病毒 <400> 2 cagaggtgaa gcgaagtgc 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400〉 3 acgtcctttg tctacgtccc g 21 <210> 4 <211> 20 <212> <213> B型肝炎病毒 <400> 4 cggcgctgaa tcccgcggac 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 5 tcatcctcag gccatgca 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 6 aacgccgcag acacatcca ^ > > > Q 1 2 3 <21<21<21<21 7 21 DNA B型肝炎病毒 第1頁 19 1332526 NP-1628-2-TW序列表 _ST25 <400> 7 aagacacacg ggtgtttccc c <210> 8 <211> 30 <212> IM <213> B型肝炎病毒 <400> 8 gaaaattgag agaagtccac cacgagtcta <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 9 ccgatccata ctgcggaac

<210〉 10 <211> 21 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 10 gcagaggtga agcgaagtgc a <210〉 11 <221> 18 <212> m <213> B型肝炎病毒 <400> 11 tctttacgcg gactcccc <210> 12 <211> 25 <212〉 DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 12 tctgtgcctt ctcatctgcc ggacc <210> 13 <211> 8 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 13 tactgcgg <210> 14 <211> 10 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 14 ggtgaagcga <210> 15 <211> 11 <212> DNA <213> BS肝炎病毒 <400> 15 tacgcggact c 1332526 NP-1628-2-W序列表 _ST25 <210> 16 <211> 11 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 16 gccttctcat c 11 <210> 17 <211> 9

<212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 17 cgtggaacc 9 <210> 18 <211> 9 <212> DNA <213> B型肝炎病毒

<400> 18 ttgtctacg <210〉 19 <211> 9 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 9 <400> 19 cgctgaatc <210> 20 <211> 9 <212> E^A <213> B型肝炎病毒 <400> 20 ctcaggcca 9

<210> 21 <211> 14 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 14 <400> 21 acacgggtgt ttcc <210> 22 <211> 10 <212> mk <213> B型肝炎病毒 <400> 22 attgagagaa 10 第3頁

Claims (1)

1. 公告本 、申請專利範圍： 可同時鑑μ Β塑肝炎病毒標的核酸之單—核酸多型 及疋量該標的核酸之方法’其包括：

   提供第-探針及第二探針，其中該第一探針係與該 標的核酸之第-序列相同或互補且包含-與單-核酸 。多型相對應的鹼基，該第—探針之核酸序列為序列編 號：11之序列；其中該第二探針係與該標的核酸之第二 序列相同或互補，其不包含與單一核酸多型相對應的鹼 基，該第二探針之核酸序列為序列編號：1 2之序列； 藉由聚合酵素連鎖反應（PCR)以一對引子來複製增 量該標的核酸，以形成一包含該第一序列及該第二序列 的雙股核酸’ 1¾對引子之其中一纟的核酸序列為序列編 坑9之序列，以及該對引子之另一者的核酸序列為序 列編號：1 〇之序列；

   99λ°Υ®

   於反應液令將該核酸產物分別與該第一探針及第二 探針雜合，以分別形成第一雙股及第二雙股，其中該第 一探針係共價連結於一第一螢光標定物，該第二探針係 共價連結於一第二螢光標定物，其中該第一螢光標定物 及該第一榮光標定物中之一者為螢光施體，另一者為登 光又髏’使得當該第一探針及第二探針與該標的核酸產 物雜合時，該螢光施體與該螢光受體係處於鄰近位置， 且其兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移（fret); 加熱該反應液，使得其溫度高於該第一探針及其互 補序列所形成之雙股核酸的分離溫度； 99年6月7曰修正替換頁 鑑別該單-核酸多型’其係以一激發光照射該螢光 施體，並測量該第一探針之螢光受體發出之螢光量的變 化，該螢光量變化係與其所升高的溫度值相關； 測量該螢光受體所發出之螢光來定量該標的核 2.如申請專利範圍第！所述之方法’其中該定量步驟係將該 營光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。 3 , .如申請專利範圍第2項所述之方法’其中該第—探針及該 第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 4.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第—探針及該 第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。

   藉由 酸。 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該鑑別步驟係包 含： 建立該第一雙股的一階導函數分離曲線； 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值； 比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值較該分離 溫度低時，該標的核酸中存在一單一核酸多型，若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單一核酸多型。 1332526 99年6月7曰修正替換頁 ~~—------ 6.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中兮你 丹甲这鑑別步驟係包 含： 建立該第一雙股的一階導函數分離曲線； 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值；

   比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值較$分離 溫度低時，該標的核酸中存在一單一核酸多型，若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單—核酸多型。 7·如申請專利範团第6項所述之方法，其中該定量步驟係將 該螢光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。 8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該第一探針及該 第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 9. 一種可同時鑑別B型肝炎病毒標的核酸之單一核酸多型 φ 及定量該標的核酸之方法，其包括： 提供第-探針及第二探針，其中該第一探針係與該 標的核酸之第一序列相同或互補且包含一與單一核酸 。多型相對應的驗基，該第一探針之核酸序列為序列編 號.15之序列，纟中該第二探針係與該標的核酸之第二 序列相同或互補，其不包含與單-核酸多型相對應的驗 基，該第二探針之核酸序列為序列编號：16之序列； 藉由聚合酵素連鎖反應(PCR)卩一對引子來複製增 3 133.2526 99年6月7曰修正替換頁 I--—-------- 量該標的核酸，以形成一包含該第一序列及該第二序列 的雙股核酸，該對引子之其中一者的核酸序列為序列編 號：13之序列，以及該對引子之另一者的核酸序列為序 列编號：1 4之序列；

   於反應液中將該核酸產物分別與該第一探針及第二 探針雜合，以分別形成第一雙股及第二雙股，其中該第 一探針係共價連結於一第一螢光標定物，該第二探針係 共價連結於一第二螢光標定物，其中該第一螢光標定物 及該第二螢光標定物中之一者為螢光施體，另一者為螢 光受逋，使得當該第一探針及第二探針與該標的核酸產 物雜合時，該螢光施體與該螢光受體係處於鄰近位置， 且其兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移（FRET); 加熱該反應液，使得其溫度高於該第一探針及其互 補序列所形成之雙股核酸的分離溫度；

   鑑別該單一核酸多型，其係以一激發光照射該螢光 施體’並測量該第一探針之螢光受體發出之螢光量的變 化’該螢光量變化係與其所升高的溫度值相關； 藉由測量該螢光受體所發出之螢光來定量該標的核 酸。 10.如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該鑑別步驟係包 含： 建立該第一雙股的一階導函數分離曲線； 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值； 4 133.2526 99年6月7日修正替換頁 比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值較該分離 溫度低時’該標的核酸中存在一單一核酸多型，若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單一核酸多型。 11. 如申清專利範圍第1〇項所述之方法，其中該定量步驟係 將該勞光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。

   12. 如申請專利範圍第n項所述之方法，其中該第一探針及 該第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 13. —種引子’其係用來將b型肝炎病毒之標的核酸複製放 大’該引子之核酸序列為序列编號：9之序列。 14. 一種引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製放 大，該引子之核酸序列為序列編號：1 3之序列。

   15. —種引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製放 大，該引子之核酸序列為序列編號：1 0之序列。 16. —種探針，其包含一與單一核酸多型相對應的鹼基，用以 鑑別B型肝炎病毒標的核酸中單一核酸多型，該探針之 核酸序列為序列编號：1 1之序列。 5 1332526 99年6月7日修正替換頁 17. —種探針，其包含一與單一核酸多型相對應的鹼基，用以 鑑別B型肝炎病毒標的核酸中單一核酸多型，該探針之 核酸序列為序列編號：1 5之序列。 18. —種探針，其用以鑑別B型肝炎病毒標的核酸中單一核 酸多型，該探針之核酸序列為序列編號：1 2之序列。

   19. 一種探針，其用以鑑別B型肝炎病毒標的核酸中單一核 酸多型，該探針之核酸序列為序列編號·· 1 6之序列。 20.—種試劑組，其可同時鑑別B型肝炎標的核酸之單一核 酸多型及定量該標的核酸，該試劑组係包含： 一引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製 放大，該引子之核酸序列為序列編號：1 3之序列； 一引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製 放大，該引子之核酸序列為序列編號：14之序列

   —探針，其包含一與單一核酸多型相對應的鹼基， 用以鑑別B型肝炎病毒標的核酸中單一核酸多型，該探針之 核酸序列為序列編號：1 5之序列；以及 一探針，其用以鑑別B型肝炎病毒標的核酸中單一核酸 多型，該探針之核酸序列為序列编號：1 6之序列。 6