TWI332525B - Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus - Google Patents

Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus Download PDF

Info

Publication number
TWI332525B
TWI332525B TW096141238A TW96141238A TWI332525B TW I332525 B TWI332525 B TW I332525B TW 096141238 A TW096141238 A TW 096141238A TW 96141238 A TW96141238 A TW 96141238A TW I332525 B TWI332525 B TW I332525B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
probe
sequence
fluorescent
polytype
Prior art date
Application number
TW096141238A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200819542A (en
Inventor
Peijer Chen
Dingshinn Chen
Shiouhewi Yeh
Original Assignee
Gen Biolog Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gen Biolog Corp filed Critical Gen Biolog Corp
Publication of TW200819542A publication Critical patent/TW200819542A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI332525B publication Critical patent/TWI332525B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

1332525 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一新穎的引子對、探針對及以B型肝炎 病毒基因為模版所複製放大而得之核酸，及以其同時對基因 型作定型及定量B型肝炎病毒的方法。 【先前技術】
單一核酸多型（們）（single. nucleotide polymorphisms, SNPs)，亦即基因序列位置上一群變異的單一核酸，其係 分布於整個基因序列中。一單一核酸多型係可以為等位基 因。亦即，由於存在該基因多型性，因此一物種中某些個 體具有非變異序列（野生型），而另一些個體則具有變異序 列（變異型）。就動物個體而言，基因多型性可能導致隱性 遺傳疾病。上述疾病包括：牛淋巴球黏力缺失症（Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) 、 胍 胺酸症 (Citrullinemia)、楓糖尿症（Maple Syrup Urine Disease)、 尿核甘單磷酸鹽合成缺失症（Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase)、溶腌小體貯積症、醣化基因症 等。人顓之纖維囊化症（cystic fibrosis)係上述隱性遺傳疾 病之一例，該病患者群約占白種人族群中兩千分之一。就 諸如細菌或病毒之類的微生物致病源而言，單一核酸多型 性與不同的致病效應有關，並因此影響罹患該病症之病患 的治療及長期預後狀況。依據上述，迫切需要一種能夠有 效鑑別及量化内含單一核酸多型之核酸的方法。 6 1332525 【發明内容】
本發明係有關於一新穎的引子對、探針對及由以B型肝 炎病毒基因為模版所複製放大而得之核酸，及將其同時用於 基因型定型及B型肝炎病毒定量上的應用。 本發明係關於一種能夠同時鑑別一微生物標的核酸之 單一核酸多型及量化該標的核酸的方法。該鑑別及量化係 同時執行。
本發明方法需使用一種第一探針及一種第二探針。該 第一探針係與一標的核酸之第一序列相同或互補，其係包 含一與單一核酸多型相對應的鹼基；該第二探針係與一標 的核酸之第二序列相同或互補，其係不包含與單一核酸多 型相對應的鹼基。該第一探針係共價鍵結於一第一螢光標 定物，該第二探針係共價鍵結於一第二螢光標定物。該第 一螢光標定物及該第二螢光標定物中之一者為螢光施體， 另一者為螢光受體，如此一來，當該第一探針及第二探針 與該標的核酸雜合時，該螢光施體與該螢光受體係處於鄰 近位置，使得兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移 (FRET)。 本發明方法包括將一樣本中的標的核酸複製增量的 步驟，其係藉由聚合酵素連鎖反應（PCR)以一對引子 (primer)序列為之，使得樣本中該標的核酸形成一包含該 第一序列及該第二序列的雙股核酸。上述第一探針及第二 探針係於聚合酵素連鎖反應的鏈合（annealing)步驟中與該 核酸產物雜合，以分別形成一第一雙股（duplex)及第二雙 1332525 股。上述兩種探針係可以雜合於該核酸產物的同一股上。 上述兩種探針亦可以雜合於該核酸產物的不同股上，並且 使得該螢光施體與該螢光受體位於鄰近位置上。例如該兩 種探針所雜合的序列係可以位於該核酸產品兩股所形成的 叉狀結構或泡狀結構上。
樣本中標的核酸量的測定，係藉由測量該第一探針上 螢光受體所發出的螢光量為之，其係於每一聚合酵素連鎖 反應循環之鏈合期的最末階段為之。上述螢光量之測定係 將該待測螢光強度與一預定值比較得知，其中該預定值係 由含有已知濃度之該標的核酸的溶液測量而得。上述螢光 量之測定亦可將該聚合酵素連鎖反應之交叉值（cross point value, Cp value)與一預定值比較得知，其中該預定 值係由含有已知濃度之該標的核酸的溶液測量而得，其測 量方法係如 Mackay I. et al·, Nucleic Acids Res. 30:1292-1305， 2002 所述 °
聚合酵素連鎖反應完成後，加熱使得溫度高於該第一 探針及其互補序列形成之雙股核酸的分離溫度（melting point)。當該雙股核酸分離時，上述螢光施體及螢光受體 之間的FRET受到干擾。該標的核酸中單一核酸多型的鑑 別，係以一激發光照射該螢光施體，並測量該第一探針之 螢光受體所發出之螢光量的改變，該螢光量的變化係為所 升高溫度值之函數。舉例來說，鑑別一單一核酸多型時， 首先，建立該第一雙股核酸的一階導函數分離曲線，其中 該第一雙股核酸包含一螢光標記探針，且該分離曲線係基 8 1332525 於隨溫度而變的螢光量而有所變化。其二，建立一溫度曲 線，其係基於分離曲線之分離高峰而得。其三，比對該溫 度值與該雙股核酸的分離溫度，其中該雙股係由該第一探 針與一互補序列形成。當該溫度值較該分離溫度低時，該 標的核酸中存在一單一核酸多型，當該溫度值與該分離溫 度相同時，則不存有單一核酸多型。
本發明另一特徵係關於可用以複製放大取自 HBV的標 的核酸之引子對，其分別包含下述序列編號（SEQ ID )之基 因：前置引子為TACTGCGG (序列編號：13 )及反置引子為 GGTGAAGCGA (序列編號：14 )、前置引子為CGTGGAACC (序列編號：1 7 )及反置引子為GGTGAAGCGA (序列編號： 14 )或前置引子為CTCAGGCCA (序列編號：20 )及反置引 子為AACGCCGCAGACACATCCA (序列編號：6)，其中每 一個引子之長度介於8到5 0個鹼基之間（亦即，1 5到40或 1 8到3 0個鹼基之間）。上述引子對亦可以為如下序列：前 置弓丨子為CCGATCCATACTGCGGAAC (序列編號：9)及反 置引子為0〇八0八00丁0八八00〇八八0丁0匚八（序列編號：10)、 前置引子為GCATGCGTGGAACCTTTGTG (序列編號：1 )及 反置引子為CAGAGGTGAAGCGAAGTGC (序列編號：2 ) ' 前置引子為TCATCCTCAGGCCATGCA (序列編號：5 )及反 置弓I 子為 AACGCCGCAGACACATCCA (序列編號：6 )。 本發明亦提供探針對，其係用於同時鑑別B型肝炎病毒 中標的核酸之單一核酸多型及定量該標的核酸。該探針對分 別包含下述序列編碼（SEQ ID )之基因：第一探針為 9 1332525
TTGTCTACG (序列編號：18 )及第二探針為 CGCTGAATC (序列編號：19 )、第一探針為TACGCGGACTC(序列編號： 15 )及第二探針為GCCTTCTCATC (序列編號：16 )或一感 應探針為ACACGGGTGTTTCC (序列編號：21 )及一固定探 針為 ATTGAGAGAA (序列編號：22 )，其中每一個引子之 長度介於9到50個鹼基之間（亦即，1 5到40或1 8到30個 鹼基之間）。上述探針對亦可為如下序列：一感應探針 ACGTCCTTTGTCTACGTCCCG (序列，編號：3 )及固定探針 CGGCGCTGAATCCCGCGGAC (序列編號：4 )、感應探針 TCTTTACGCGGACTCCCC (序列編號：11 )及固定探針 TCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACC (序列編號：12)、感 應探針AAGACACACGGGTGTTTCCCC (序列編號：7 )及固 定探針 GAAAATTGAGAGAAGTCCACCACGAGTCTA (序列 編號：8 )。
本發明亦提供由以B型肝炎病毒基因為模版所複製放 大而得核酸產物，其包含序列編號為15、18及21之基因， 或其之互補基因序列，其中每一個核酸產物之長度介於100 到1，000個鹼基之間（亦即，200到700或300到500個鹼 基之間）。上述核酸產物係與上述引子及探針雜合，用以鑑 別及定量含有單一核酸多型之標的核酸，其中該標的核酸係 取自HBV基因。
本發明亦提供一可同時鑑別及定量含有單一核酸多型 之HBV 10 1332525 本發明實施例之實施細節如下所述，然其並非用以限定 本發明，任何熟悉此項技藝者’在不脫離本發明之精神和範 圍内，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視 後附之申請專利範圍所界定者為準。 【實施方式】 本發明之目的係為提供一種同時鐵別B型肝炎病毒基 因型及定量該基因的方法。 本發明方法需使用一種第一探針及一種第二探針 第—探針之設計係依據標的核酸中習知的單一核酸多 該 其特性來設計，例如，GC含量、鏈合溫度、内部配 _甘ί等， 其可以敕禮程式來決定。為使得該第一探針能夠幾 種個體核酸中的單一核酸多型，該第一探針之序列 别不同 係與〜
含有單~核酸多型的序列相同或互補，其係能用以细 物插1 —別該 搜中至少兩種不同的基因型。上述序列之決定係益 ，、鳍由比 其方 _似。 對該物種不同個體之去氧核醣核酸之標準序列而得， 法係與下文中r探針及引子之設計』單元中所述方法 返不同個體之去氧核雜核酸序列係由任何恰當的寄^ 中&〜 貝科庠 得’例如 www.ncbi.nlm. gov/PMGifs/Genomes. 該第一探針係與一單一核酸多型對偶基因（例如 )雜合而形成一雙股核酸，且其中不具有任何錯配 野生 對 的輪基 該第二探針係與另一單一核酸多型對偶基因（例如 型）雜合而形成另一雙股核酸，且其中具有錯配 突 對 由於上述雙股核酸之後者具有錯配的鹼基對， 的蛉基 故其分 11 1332525
離溫度（Tm)較前者為低。該第一探針可 為基礎的方式來區分野生基因型及突變基 針與野生型基因及突變型基因雜合產生雙 可以用實驗方法測定之。上述兩種雙股核 差異亦可以用實驗方法測定之，其差異大 度）需足以測量出兩者間之差異。 茲以肝炎病毒為例：肝炎病毒包含單 因序列為：TACGCGG4CTC(序列編號15), 列編號：1 8)，AC!CG_GGTG：LT：LCC (序歹編 體斜線之字母表示對應於單一核酸多型β 一核酸多型係能用來區分肝炎病毒Α基因 參見表1及表2，以及下文中『同時鑑別2 上述包含單一核酸多型的序列（們）， 好為一物種中不同基因型個體所保留的序 序列）。如下文所述，該保留（或無變異）側 第二探針以及聚合酵素連鎖反應引子相當 該第二探針之設計係基於兩個原則。 針不包含單一核酸多型，且其序列與物種 保留序列相同或互補。其二，該保留序列 一核酸多型的序列相鄰。此種設計之目的 探針及該第二探針與標的核酸雜合後，該 能夠相當靠近，例如間隔1至3個鹼基。 上述第一探針及第二探針係連結於| 藉由習知技術以直接或間接的方式測定之 以設計為以基因 因型。該第一探 股核酸的能力係 酸之分離溫度的 、（例如：達攝氏2 一核酸多型之基 TTGT[TACG(序 號：2 1)(前述粗 :的鹼基）上述單 型至G基因型。 L測量』一節。 其側翼之序列最 列（即，無變異的 翼序列對於設計 重要。 其一，該第二探 中不同基因型之 係與上述包含單 在於，當該第一 兩種探針的位置 ^光標定物，並可 。該螢光標定物 12 1332525
中之一者為螢光施體，另一者為螢光受體，該螢光施體所 發出的螢光發光光譜（emission spectrum)係與該螢光受體 的激發光譜（excitation spectrum)重疊。當該第一探針及第 二探針與該標的核酸雜合時，該螢光施體與該螢光受體係 處於鄰近位置，使得兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移 (FRET)。上述螢光受體所發出的勞光係能夠藉由習知技術 鑑別及量測之。凡是發光光譜及激發光譜重疊的兩個營光 標定物都可以用來標定上述第一探針及第二探針，例 如：LightCycler-Red 640可以為上述螢光受體，而螢光黃 (fluorescein)可以為上述螢光施體。
欲同時鑑別和定量一標的核酸，須將上述探針與該標 的核酸混合，施以即時聚合酵素連鎖反應（PCR)。上述pcr 反應所用的引子（primer)對係以習知技術之原則設計之。 該引子序列尤其應該與單一核酸多型側翼之序列相同或互 補，其中該側翼序列係為一物種中不同基因型個體所保留 的序列。上述引子對係用以將一含有單一核酸多型的標的 核酸複製放大。上述去氧核醣核酸序列係由任何恰當的資 料庫中取得，例如：組織均質物 （tissue homogenate)、血 液樣本，並且，其係可以為去氧核醣核酸或核醣核酸，若 為核醣核酸，則在進行聚合酵素連鎖反應之前應先施以反 轉錄步驟。上述聚合酵素連鎖反應係依據一般標準程序進 行，其可以參照 Innis et al.(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich, New York。在一實施例中，即時聚合酵 13 1332525 素連鎖反應係採用市面上可購得之即時聚合酵素連鎖反應 系統（Roche Molecular Diagnostic 承銷之 LightCycler)。
聚合酵素連鎖反應的三個步驟（即變性、鏈合、延長 三步驟）可以重複施行多次，使得能夠獲得足量之與標的 核酸相對應的產物。其重複施行的次數則與其所使用的樣 本性質及其他因素有關。若上述樣本為複雜的核酸混合 物’當吾人欲獲得足量的上述標的核酸時，則重複施行聚 合酵素連鎖反應的次數必須較多。通常上述聚合酵素連鎖 反應重複施行的次數至少20次左右，但也可能達到40次、 50次、60次甚至1〇〇次之多。上述聚合酵素連鎖反應之產 物與上述探針鍵合後，即可用以鑑別及測量上述標的核酸。
樣本中標的核酸之量的測定，係藉由測量上述螢光受 體所發出的螢光量為之，其係於每一聚合酵素連鎖反應循 環之鏈合期的最末階段藉由照射上述螢光施體為之。上述 發出螢光之強度係為上述複製放大的核酸產物量之函數， 而上述核酸產物量係為該標的核酸原始濃度及聚合酵素連 鎖反應重複次數之函數。若聚合酵素連鎖反應重複施行的 次數夠多’則該複製放大之核酸產物的累積率及螢光量變 化率即進入一對數線性階段^將該螢光強度值對該聚合酵 素連鎖反應次數繪圖，即可獲得對應於該對數線性階段起 點的聚合酵素連鎖反應重複次數（亦即交又值，Cp值）。 繼之’將上述測得之Cp值與一預定值比較，其中該預定 值係由含有已知濃度之標準核酸溶液測量而得。利用下文 中「HBV定量j —節所述之方法，即可獲得—系列之上述 14 1332525
Cp預定值。因此，吾人可以藉由將一給定之Cp值與上述 一系列 Cp預定值進行比對，即可得知該標的核酸之原始 濃度。
或者，亦可將其所發出螢光強度與一預定螢光強度值 比較，而來定量一標的核酸。除了其對應之核酸原始濃度 為已知外，該預定螢光強度值係以相同方式決定之。
欲鑑別一標的核酸，可於聚合酵素連鎖反應終了後， 將其複製放大的核酸產物施以一分離曲線分析而得知。將 該聚合酵素連鎖反應後之反應溶液緩慢加熱之，其加熱梯 度約為每秒鐘升高攝氏0.5度，使得溫度高於該第一探針 及其互補序列形成之雙股核酸的分離溫度。同時在照射該 螢光施體時，監測該螢光受體所發出的螢光量。將該螢光 強度（F )對該分離溫度（Tm )做圖，即可得到一分離曲 線圖。繼之，將該螢光強度（F)對溫度（T)微分，取其 負值（-dF/dT )對溫度做圖，以獲得該分離曲線之一次微 分曲線，來決定一分離峰值。將該分離峰值所對應的溫度 與該第一探針的分離溫度比對。在一較佳實施例中，上述 分離曲線分析係以 LightCycler分析軟體（3.5版）為之 ( Roche Diagnostics Applied Science, M anngeim Germany )。當該溫度值低於該分離溫度，則表示該標的核 酸中含有一單一核酸多型，當該溫度值等於該分離溫度， 則表示該標的核酸中不含有單一核酸多型。上述方法係能 夠有效地同時鑑別和定量一含有單一核酸多型的核酸。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以
15 1332525 限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精 神和範圍内，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 採針和引手的設計
由 www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/viruses.html 所示資料庫中取得216段完整的肝炎病毒DNA序列。其中 有1 7 5段序列經鑑別為屬於A到G基因型之病毒，該鑑別 操作係以 Biology WorkBench 所提供之 CLUSTRLW Multiple Sequence Alignment，DRAWTREE 及 DEAWGRAM 軟體為之（workbench, sdsc.edu/)。
在上述175段基因序列中，有47段屬於B基因型，有 49段屬於C基因型。將上述兩種基因型之基因序列比對並 排，以鑑別出另一含有單一核酸多型且兩翼序列為上述兩 種基因型共有基因的基因序列片段，其係藉由CLUSTRLW 多序列比對程式（C LU S TRLW Multiple Sequence Alignment program )為之。上述步驟比對出三段基因序 列’並據以設計出三對引子及探針，其係依據TIB MOLBIOL ( Gerlin，Germany)所提出的原則為之。上述引 子對可藉由PCR反應由其個別標的核酸來產生複製放大 產物。茲將上述複製放大產物、引子對及探針對的基因位 置總結如表1所示。 表1:用於鑑別及定量HBV中單一核酸多型的複製放大產 16 1332525 物、引子對及探針對 ««Αλί物 序列（5’~3’） 位置(a) _產物大小 (bp) 顶值（°〇 第-群 前置51子 1 5’^GCATGCGTGGMCCnTGTW， 1232-1251 368 基因型B 57.7 弓1子 2 y^AGAGGTCAAGOGAAGTGC-r 1599-1581 基因型C 66.3 固定撕 4 FLU-5’^CGGOGCrGAATCCCGCGGAC-3’-P 1436-1455 ΔΤΜ=8·6 mm 3 5’-ACGTCCnTGTpACGTCCCG4jC-M6«»’ 1414-1434 +30% Δ ΤΜ=+1.8 SNP位置 Cyr*ntl425 第4 前置31子 9 5’^OCGATCCAIACrGOGGMC-3， 1261-1279 340 基因型Β 60.9 反置引子 10 5’"GCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3， 1600-1580 基因型C 54.8 固定湖 12 FLU-5’-TCrGTGCCncrCArCTGCCGGAOC-3’-P 1552-1576 ΔΤΜ=6.1 11 5’-TCmACGOGGiPCCCC-LC"Red64(W， 1533-1550 +30% Δ ΤΜ=±1.8 SNP位置 Αίϊ *ntl544 第球 前置弓1子 5 y-TCArOCTCAGGOCATGCAJ 3192-3209 416 基因型Β 64.3 反置引子 6 5、MCGCOGCAGACACATCCA-3， 392-374 基因型C 46.8 固定撕 8 FLU-5’*GAAAAITGAGAGAAGT0CACCACGAGTC1A-3’J· 27^249 ΔΤΜ=16·3 ijm 7 301-281 ί30%Δ ΤΜ=+4.9 SNP位置 A« >nt285；A«-14287； G/A-14292； T/C-nt29i
1 :核酸位置（nt)係以B型肝炎吵/·亞型基因庫之位置表示（GenBank accession no. NC_0〇3977)。 2 : P表3’端經磷酸化處理以避免探針於PCR時廷伸· 3 : FLU 表螢先（flourescien); LC^ed640表Li^JtcjderRfidM) 4 :所示TM值為平均數，TM值±lt係為基因型定型所容許。 5: SNP位置以粗髋、底線標示之。 複製放大產物1在核酸位置1 425處含有一 C/T單一核 酸多型。複製放大產物2在核酸位置1544處含有一 a/t 單一核酸多型。上述兩種單一核酸多型係位於ΗΒχ基因 上。複製放大產物3含有4個單一核酸多型，其分別為： HBV之核酸位置285處（A/G單一核酸多型）；HBV之核酸 位置287處（G/A單一核酸多型）；HBV之核酸位置2S>2處 (G/A單一核酸多型）；HBV之核酸位置294處（T/C單一核 酸多型）。上述4種單一核酸多型均係位於HBs基因上。 17 1332525 上述引子及探針係由TIB MOLBIOL所合成。其中，第 二探針（固定探針）之3,端具有螢光標定，含有單一核酸 多型的第一探針（感應探針）則是在5’端具有Lc_Red 640 染劑標定。上述感應探針的3’端亦已磷酸化。
為確認上述複製放大產物中含有單一核酸多型，由4〇 位B型肝炎病患取得血清樣本，依照下文中「HBV之DNA 製備」一節中所述方法由該血清樣本中製備DNA。利用傳 統的PCR反應複製放大上述基因樣本，再將該等基因樣本 的複製放大產物以ABI PRISM Big-dye kits分析其基因序 列，並藉由 ABI 3100 Genetics Analyzer (Applied
Biosystem，Foster City, CA)分析之。結果顯示，上述 20 種樣本之複製放大產物含有 HBV C基因型的單一核酸多 型’而另外20種樣本之複製放大產物含有HBV B基因型 的單一核酸多型。 HBV DNA之盤備
由114位慢性B型肝炎病患取得血清樣本。所有上述 病患均由國立台灣大學附設醫院門診進行後續追蹤。為確 認上述血清提供者確罹患慢性B型肝炎，進一步以市售肝 炎測試劑（Ausab，Ausria II，Murex HbeAg/anti-Hbe， Abbott Laboratories, North Chicago, IL)測試該血清樣本 含有 HbsAg、anti-HBs、anti-HBc Igs、HBeAg、anti-HbeAg。 上述血清中的 HBV DNAs 亦以分枝鏈 DNA 分析法 (QUANTIPLEX tm HBV DNA Assay, Chiron Corporation, 18 1332525
Emeryville, CA )分析之，其係依據該產品業者提供之操 作方法為之。上述操作均依照1 975年赫爾辛基宣言中所示 的醫學倫理準則為之。
繼之’由上述樣本中製備HBV基因，其係以高純度病 毒基因製備試劑組（Roche Diagnosis Applied Science， Mannheim Germany )為之。取200μ1的上述血清樣本，將 之與200μ1的結合緩衝液混合，於攝氏72度中反應10分 鐘，其中該結合緩衝液成分包含：6Μ胍氫氣酸 (guanidine-HCl)、l〇mM 尿酸、10Mm Tris-HCM、20% Triton X-100(vol/vol)、200 仁 g 之 p〇ly(A)、0.8mg 胰蛋白 K。繼 之’將該反應混合液與100仁1的異丙醇混合，滴入一已預 先充填了玻璃纖維之高純度過濾管中。將該過濾管以一抑 制物移除緩衝液沖洗兩次後，以1 00以1水將該病毒核酸洗 出’其中該抑制物移除緩衝液成分包含：1 00〇/〇乙醇、 20mmol/L 氣化鈉、2mtn〇1/L Tris-HCl。
繼之’利用傳統方法確認上述HBV病毒DNA所屬之 基因型’在此所謂的傳統方法包括：PCR-PFLP、使用基因 型專屬引子之pCR、及直接定序等等。上述肝炎病患的血 清中’有60個樣本經鑑別為含有b基因型的HBV，而46 個樣本經鑑別為含有C基因型的HBV。其餘8個樣本中的 HBV則無法以上述傳統方法決定出其所屬的基因型。 Η B V定嗇 為進行HBV的定量，必須先以質體phbv 48為對象， 19 1332525
做成一複製量標準曲線。該質體之製造係將15mer的HBV DNA片段（核酸位置為2851至3182/1至3182/1至1281) 載入PGEM-3Z載體8中為之。上述質體合成後，係以質體 純化劑組（QIAGEN GMbH，Hilden Germany)純化之，並以 光譜儀疋量之。其對應之HBV效價（copy/mL)係以每一 質體的質量決定之。繼之，將該質體進行一系列稀釋，以 得到 HBV 效價值介於 ΐχΐ〇2 copy/mL 至 1x10" copy/mL 的10個樣本。上述10個樣本係依據下述方法做成一標準 曲線》
每一上述樣本，取2/zl’將之與下列溶液混合：0.5仁 1 的 LightCycler fastStart DNA Master Hybridization Mixture、0.2 β 1之25mM氣化鎂、以及如上文「探針及引 子設計」一節中所述之第二探針，其中該 LightCycler fastStart DNA Master Hybridization Mixture 包含成分：Tag DNA聚合酵素、PCR反應緩衝液、10 mM氣化鎂、dNTP 混合液(Roche Diagnosis Applied Science, Mannheim Germany )。混合上述液體後，將最終反應液的體積調整到 5/zl，使得每一反應液中的引子濃度為5//M，而每一反應 液中的探針濃度為 0.5yM。將上述最終反應液載入 LightCycler毛細管中並離心之，再置入LightCycler樣本 旋轉架中（Roche Diagnosis Applied Science, Mannheim Germany ) o 繼之，依據下述程序執行一及時PCR反應。首先以攝 氏95度加熱該反應液10分鐘，使得DNA變性分離。然後 (S ) 20 1332525
重複進行如下程序55次：於攝氏95度加熱5分鐘，使得 DNA變性分離；於攝氏55度加熱10秒，使得DNA鏈合； 於攝氏72度加熱20秒，使得DN A分子延長《上述反應中 溫度轉換速度之設定為：分離/鏈合轉換為每秒鐘2〇度； 而鍵合/延長轉換為每秒鐘5度。在每一次鍵合步巧完成 時，測量LC-RED640發出的螢光量。決定每一樣本的Cp 值’並利用LightCycler軟體3.5版，將樣本的Cp值對樣 本濃度對數值作圖，即可得出標準曲線。上述標準曲線在 lxlO2 copy/mL至 lxlO11 COpy/mL的範圍内呈現一直線 段’表示其測試限度為lxl〇2copy/mL。
繼之測試該標準曲線以定量HBV DNA。該測試操作所 使用的測試樣本包括：由 HBV Genotype Panel(International Enzymes, Inc., Fallbrook, CA)取得之 15個基因型為A至F的樣本、由QUANTIPLEX bDNA劑 組取得之4個樣本。上述19個樣本均包含已知其效價的 HBV。將上述樣本進行即時PCR，並以上述方法獲知其Cp 值。並利用上述標準曲線找出與Cp值相對應的效價。針 對每一樣本進行6次（3次重複實驗）上述定量作業。上 述測試結果顯示所有樣本的效價均為正確。 將上述方法所獲知的效價與依據傳統方法獲知的效價 進行比較，其中該傳統方法包含：NGI SuperQuant' Roche
Amplicor、Chiron Quantiplex bDNA assays。上述三種傳統 方法之實施係依據其製造商提供的操作方法為之。將上述 方法測得的效價對上述三種傳統方法測得的效價進行線性 21 回歸，結果顯示其 ’有相關l gamma值分別為0.9866, 0.983 0 及 〇.999 )。藉由 故爾森相關（Pearson correlation)估 算其組間差異係、數與組内差異純。其結果為P值小於 〇·001，顯示該方法具有相當的再現性。 HBV ^ μ
>試上述―組探針對及引子對以區分出在台灣、中 國大陸及日本三地流行的B型肝炎病毒及C型肝炎病毒。 述樣本中選取10個含有基因型B基因序列的樣 本’以及1〇個含有基因型c基因序列的樣本。依據上述 HBV疋量」-節中所述方法’以上述樣本及第2組引子 及探針進行PCR反應。於PCR反應終了後，先將反應液 、、攝氏95中60秒，再將其冷卻至攝氏45度（溫度下降 速度為每秒鐘下降攝氏〇.5度），將該反應液置於攝氏45
度中120秒，在將其加熱至攝氏8〇度（溫度上升速度為每 秒鐘上升攝氏0.5度）。同時，測量640nm之螢光量。訂 出所有上述樣本的分離曲線後’將該螢光強度（F)對溫 度（T)微分，取其負值（-dF/dT )對溫度做圖，以獲得該 分離曲線之一次微分曲線，來決定一分離峰值，上述分離 曲線分析係以Lightcyc丨er分析軟體（3.5版）為之。 上述分離曲線之一次微分曲線顯示，上述樣本的分離 峰值依其值之大小分為兩群。且上述兩群樣本的分離溫度 平均值分別對應HBV基因型B及基因型C的温度（其分 別為攝氏60·9度及548度）。上述10個含有基因型B基 22 1332525
因序列的樣本，其分離溫度與60.9度之差異均在1.8 内，亦即ΔΤιη (6.1度）之30%之内。上述10個含 因型C基因序列的樣本，其分離溫度與54.8度之差異 1.8度之内。因此1.8 °C (或ATm (6.1度）之30%) 為區分基因型B及基因型C之分界點。第1組及第3 製放大物（及其相對應之引子和探針）之基因型分界 別為2.5 °C和4.9 °C，其係依據如上述之方法所決定。 平均分離溫度和分界點係總結於表1中。 繼之，利用上述3組引子及探針，決定如前文「 DNA製備」一節中所述之60種B基因型的HBV及 C基因型的HBV之基因型。採用第1組引子及探針辑 述106種HBV中，可以正確判定其中103種HBV的 型。至於3個未被正確判定的樣本，有1個被錯誤判 另外2個則無法判定。採用第2組和第3組引子及探〗 則分別有1個和2個樣本無法正確判定。然而，若同 用上述3組引子和探針中任2組時，則可以正確判斷 上述106個樣本的基因型。 如前文「HBV DNA製備」一節中所述，取自8位 的樣本無法以傳統方法決定其含有HBV的基因型。以 3組引子及探針鑑別之，則可以正確決定出該8位患 本中所含HBV的基因型。將樣本中的基因直接定序再 認上述鑑別結果為正確的。上述結果顯示本發明所述 型鑑別方法較之傳統的 HBV基因型鑑別方法具有更 正確度。 度之 有基 均在 係作 組複 點分 上述 HBV 46種 卜上 基因 定， 叶時， 時採 所有 病患 上述 者樣 次 基因 高的 23 1332525
同時鑑定及定景HBV 藉由上述引子及探針與上述方法，針對含有B基因型 及C基因型之HBV的樣本同時進行鑑別及定量。自台灣 大學附設醫院（台北，台灣）取得含有B基因型及C基因 型之HBV的質體。將含有B基因型及C基因型之HBV的 質體依不同比例混合，其混合比例介於1 0 : 1到1 : 1 0之 間。依據上述「HBV之鑑別」一節中所述方法，鑑別該質 體混合液所含HBV之基因型，其中該質體混合液之效價為 每毫升107個質體。上述操作之結果顯示，各樣本之分離 曲線的一次微分曲線顯示對應HBVB基因型及C基因型的 分離曲線與分離峰值。同時，依據如前文「HBV定量」一 節中所述之方法，測得各樣本的 Cp值及其中所含質體的 效價。上述操作的結果顯示，上述方法可以同時鑑別及定 量一樣本中所含之主要HBV群及次要HBV群。其中，上 述次要HBV群之質體效價至少為上述主要HBV群之 1 0 %。上述方法可以僅以單管樣本，同時鑑別及定量一含有 單一核酸多型的標的核酸，該方法具有極佳的效率、正確 性及敏感度。 本發明方法除了可以用於鑑別及定量B基因型及C基 因型之外，亦可以用於其他基因型之鑑別及定量。前文「探 針及引子的設計」一節中所述之175個HBV DNA序列， 均可以依據該節所述方法並列比對。該引子及固定探針之 序列在A到G之基因型中，均保持不變。對應複製放大物
24 1332525 的單一核酸多型亦被檢驗，其序列變異及相對頻率均列示 於表2中。 表2 : HBV A基因型A至G基因型中單一核酸多型序列 之變異 第一群 第二群 第三群 綠 SNP c A A A G T A(17) T(l_ G(17) T(U)/Q3)m m B(47) T(42)Q5) A(46)3j[1) GP4)麵㈣ /mm m C(49) ¢07)202) T(45yA0 G(46yA(3) G(觸 A(47KG(2) D(24) Ap2XEQ)· m m 啊 E(2) Φ) Tp) G(2) Q2) Q2) TP) F(28) Tp5)CQ) (¢5)02) 〇22)/ΜΏ3 Gf27yA〇) j(\mM G(8) I® m G® G® W) 標底線字母及數字表較低之變異及其頻率。
如表2所示，7種基因型中除了基因型B及D之外， 在3種複製放大物中均具有獨特的單一核酸多型組合。因 此，可以依據下述方法，利用3組不同的引子及探針來鑑 別HBV的基因型：
(1 ) 使用第2組引子及探針，決定待測HBV是否 屬於第1群（基因型A、C、E、G)或是第2群（基因型 B、D、F )。 (2 ) 使用第1組引子及探針，決定待測HBV是屬 於第1群的基因型A、G、C、E中哪一種。 (3 ) 使用第3組引子及探針，決定待測HBV是屬 於第2群的基因型B'D、F中哪一種。 其他實施例 25 1332525 雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非 用以限定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之 精神和範圍内，當可作各種之更動與潤飾，凡所做之各種 更動與潤飾皆在本發明後附之申請專利範圍内》
26 1332525 NP-1628· 1·顶序列表3丁25 <Π0> <120> <140> <141> <150> <151> <160〉 <170> <210> <211> <212> <213> 序列表 普生股份有限公司 同時對B型肝炎病毒基因型定型及定量的方法 96141238 2003-11-05 10/395013 2003-03-21 22 Patentln version 3*4 1 20 DNA B型1 肝炎病毒 <400> 1 gcatgcgtgg aacctttgtg <210> 2 <211> 19 <212〉諷 <213> B型肝炎病毒 <400〉 2 cagaggtgaa gcgaagtgc 19 <210> 3 <211> 21 <212〉瞧 <213> B型肝炎病毒 <400> 3 acgtcctttg tctacgtccc g 21 <210〉 4 <211> 20 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 4 cggcgctgaa tcccgcggac <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400〉 5 tcatcctcag gccatgca 18 b> > > Q 1 2 3 <21<21<21<21 6 19 DNA B型肝炎病毒 <400〉 6 aacgccgcag acacatcca <210> <211> <212> <213> 7 21 WMA B型肝炎病毒 第丨頁 19 21 1332525 <400> 7 aagacacacg ggtgtttccc c NP· 1628-1序列表 _ST25 <210> 8 <211> 30 <212> m <213> B型肝炎病毒 <400> 8 gaaaattgag agaagtccac cacgagtcta <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400〉 9 ccgatccata ctgcggaac 19 <210> 10 <211〉 21 <212> DNA <213〉B型肝炎病毒 <400> 10 gcagaggtga agcgaagtgc a 21 <210> 11 <211> 18 <212〉 DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 11 tctttacgcg gactcccc 18 <210〉 12 <211> 25 <212> WA <213> B型肝炎病毒 <400> 12 tctgtgcctt ctcatctgcc ggacc 25 <210> 13 <211> 8 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 13 tactgcgg <210> 14 <211> 10 <212> mA <213> B型肝炎病毒 <400> 14 ggtgaagcga b > >> 1 2 3 11 «1Λ <2<2<2<2 15 11 DNA B型肝炎病毒 <400> 15 tacgcggact c 第2頁 s 11 111332525 NP-1628-1-TTV序列表 _ST25 <210> 16 <211> 11 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 16 gccttctcat c <210> 17 <211> 9 <212〉腿 <213> B型肝炎病毒 <400> 17 cgtggaacc 9 <210> 18 <211> 9 <212〉 <213> B型肝炎病毒
<400> 18 ttgtctacg <210> 19 <211> 9 <212> m <213> B型肝炎病毒 <400> 19 cgctgaatc 9 <210〉 20 <211> 9 <212> WA <213> B型肝炎病毒 <400> 20 ctcaggcca 9
<210〉 21 <211> 14 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 14 <400> 21 acacgggtgt ttcc <210> 22 <211> 10 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 22 attgagagaa 1〇 第3頁

Claims (1)

  1. 5252
    、申請專利範園： :種：同時…型肝炎病毒標的核酸之單一核酸多髮 又量該標的核酸之方法，其包括： 提供第-探針及第二探針，其中該第一探針係與該 释的核酸之第一序列相同或 %互補且包含一與單一核酸 號7 相對應的驗基，該第-探針之核酸序列為序列編 ；之彳列；纟巾該第二探針係肖該標的核酸之第二 :列相同或互補，且不包含與單—核酸多型相對應㈣ 基，該第二探針之核酸序列為序列編號：8之序列； 藉由聚合酵素連鎖反應（PCR)以一對引子來複製增 量該標的核酸，以形成一包含該第一序列及該第二序= 的雙股核酸，該對引子之其中一者的核酸序列為序列編 號：5之序列，以及該對引子之另一者的核酸序列為序 列編號：6之序列； 於反應液中將該核酸產物分別與該第一探針及第二 探針雜合，以分別形成第一雙股及第二雙股，其中該第 一探針係共價連結於一第一螢光標定物，該第二探針係 共價連結於一第二螢光標定物’其中該第一螢光標定物 及該第二螢光標定物中之一者為螢光施體，另一者為營 光受體，使得當該第一探針及第二探針與該標的核酸產 物雜合時，該螢光施體與該螢光受體係處於鄰近位置， 且其兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移（FRET); 加熱該反應液，使得其溫度高於該第一探針及其互 補序列所形成之雙股核酸的分離溫度： 1332525 99年6月7日修正替換頁 錄別料-核酸多$，其係、以一激發光照射該營光 施體，並測量該第一探針之螢光受體發出之螢光量的變 化，該螢光量變化係與其所升高的溫度值相關； 藉由測量該螢光受體所發出之螢光來定量該標的核 酸。 2. 如申請專利範圍第丨所述之方法，其中該定量步驟係將該 螢光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。 3. 如申4專利範圍第2項所述之方法’其中該第一探針及該 第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 4·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一探針及該 第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。
    如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該鑑別步驟係包 含： 建立該第一雙股的一階導函數分離曲線； 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值； 比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值較該分離 溫度低時，該標的核酸中存在一單一核酸多型，若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單一核酸多型。 2 99年6月7日修正替換頁 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該鑑別步驟係包 含： 建立該第一雙股的一階導函數分離曲線； 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值； 比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值較該分離 溫度低時，該標的核酸中存在一單一核酸多型若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單一核酸多型。 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該定量步驟係將 該榮光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。 如申凊專利範圍第7項所述之方法，其中該第一探針及該 第一探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 種可同時鑑別B型肝炎病毒標的核酸之單一核酸多型 及定量該標的核酸之方法，其包括： 提供第一探針及第二探針，其中該第一探針係與該 標的核酸之第一序列相同或互補且包含一與單一核酸 多型相對應的鹼基，該第一探針之核酸序列為序列编 * ο 1 • 之序列；其中該第二探針係與該標的核酸之第二 序歹〗相同或互補’且不包含與單一核酸多型相對應的鹼 基’該第二探針之核酸序列為序列編號：22之序列； 藉由聚合酵素連鎖反應（PCR)以一對引子來複製增 99年6月7日修正替換頁 量該標的核酸，以形成一包含該第一序列及該第二序列 的雙股核酸，該對引子之其中一者的核酸序列為序列編 號：2 0之序列，以及該對？丨子之另一者的核酸序列為序 列編號：6之序列； 於反應液中將該核酸產物分別與該第—探針及第二 探針雜合，以分別形成第—雙股及第二雙股，其中該第 —探針係共價連結於一第一螢光標定物，該第二探針係 共價連結於一第二螢光標定物，其中該第一螢光標定物 及該第二螢光標定物中之一者為螢光施體，另一者為螢 光爻體，使得當該第一探針及第二探針與該標的核酸產 物雜合時，該螢光施體與該螢光受體係處於鄰近位置， 且其兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移（FRET); 加熱該反應液，使得其溫度高於該第一探針及其互 補序列所形成之雙股核酸的分離溫度； 鑑別該單一核酸多型，其係以一激發光照射該螢光 施體，並測量該第一探針之螢光受體發出之螢光量的變 化，該螢光量變化係與其所升高的溫度值相關； 藉由測量該螢光受體所發出之營光來定量該標的核 酸。 10.如 含 申請專利範圍第9項所述之方法’其中該鑑別步驟係包 建立該第一雙股的一冑導函數分離曲線； 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值； 1332525 比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值較該分離 溫度低時，該標的核酸中存在一單—核酸多型，若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單一核酸多型。 11.如申請專利範圍第1〇項所述之方法，其中該定量步驟係 將該螢光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。 12·如申請專利範圍第n項所述之方法，其中該第一探針及 該第一探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 13· 一種引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製放 大，該引子之核酸序列為序列編號：5之序列。 14·-種引子’其係用來將b型肝炎病毒之標的核酸複製放 大’該引子之核酸序列為序列編號：20之序列。
    99年6月7日修正替換頁 15·~種引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製玫 大’該引子之核酸序列為序列编號：6之序列〇 16·—種探針，其包含與多個單一核酸多型相對應的鹼基，用 以鑑別Β型肝炎病毒標的核酸中單一核酸多型，該探釺 之核酸序列為序列編號：7之序列。 5 1332525 99年6月7日修正替換頁 17.—種探針，其包含與多個單一核酸多型相對應的驗基，用 以鑑別B型肝炎病毒標的核酸中單一核酸多型，該探針 ' 之核酸序列為序列編號：2 1之序列。 - 18. —種探針，其用以鑑別b型肝炎病毒標的核酸中單一核 酸多型，該探針之核酸序列為序列編號：8之序列。 19. 一種探針’其用以鑑別B型肝炎病毒標的核酸中單一核 Φ 酸多型，該探針之核酸序列為序列編號：22之序列。 20. —種試劑組，其可同時鑑別B型肝炎標的核酸之單一核 酸多型及定量該標的核酸，該試劑組係包含： 如申請專利範圍第13項所述之引子： 如申請專利範圍第15項所述之引子； 如申請專利範圍第17項所述之探針；以及 如申請專利範圍第19項所述之探針。
TW096141238A 2003-03-21 2003-11-05 Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus TWI332525B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/395,013 US20040191776A1 (en) 2003-03-21 2003-03-21 Method for genotyping and quantifying Hepatitis B Virus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200819542A TW200819542A (en) 2008-05-01
TWI332525B true TWI332525B (en) 2010-11-01

Family

ID=32988521

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW096141238A TWI332525B (en) 2003-03-21 2003-11-05 Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus
TW096141243A TWI332526B (en) 2003-03-21 2003-11-05 Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus
TW092131000A TWI329675B (en) 2003-03-21 2003-11-05 Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW096141243A TWI332526B (en) 2003-03-21 2003-11-05 Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus
TW092131000A TWI329675B (en) 2003-03-21 2003-11-05 Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20040191776A1 (zh)
CN (3) CN101187632B (zh)
TW (3) TWI332525B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2049691A4 (en) * 2006-07-26 2010-06-16 Genizon Biosciences Inc SUSCEPTIBILITY TREASURES FOR MORBUS CROHN
US20100255482A1 (en) * 2007-11-06 2010-10-07 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Hepatitis B Virus (HBV) Specific Oligonucleotide Sequences
RS61447B1 (sr) 2011-04-21 2021-03-31 Glaxo Group Ltd Modulacija ekspresije virusa hepatitisa b (hbv)

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629153A (en) * 1990-01-10 1997-05-13 Chiron Corporation Use of DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays
WO1993022422A1 (en) * 1992-04-27 1993-11-11 Northwestern University Genetically engineered eukaryotic organism capable of detecting the expression of heterologous ion channels
US5837542A (en) * 1992-12-07 1998-11-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) ribozymes
US5728518A (en) * 1994-01-12 1998-03-17 The Immune Response Corporation Antiviral poly-and oligonucleotides
US5945283A (en) * 1995-12-18 1999-08-31 Washington University Methods and kits for nucleic acid analysis using fluorescence resonance energy transfer
CA2257109C (en) * 1996-06-04 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
US5859225A (en) * 1996-09-05 1999-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Virion protein 26 from Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, DNA encoding same and uses thereof
US6194149B1 (en) * 1998-03-03 2001-02-27 Third Wave Technologies, Inc. Target-dependent reactions using structure-bridging oligonucleotides
US6268146B1 (en) * 1998-03-13 2001-07-31 Promega Corporation Analytical methods and materials for nucleic acid detection
US6410231B1 (en) * 1999-02-26 2002-06-25 Incyte Genomics, Inc. SNP detection
US6303305B1 (en) * 1999-03-30 2001-10-16 Roche Diagnostics, Gmbh Method for quantification of an analyte
US6642001B1 (en) * 1999-07-13 2003-11-04 Whitehead Institute For Biomedical Research Generic SBE-FRET protocol
US6759193B2 (en) * 1999-07-28 2004-07-06 The Government Of The Republic Of Singapore Detection of human hepatitis B virus surface antigen mutants by specific amplification and its application on gene chip
US6653079B2 (en) * 2000-03-13 2003-11-25 Freshgene, Inc. Methods for detection of differences in nucleic acids
US6558929B2 (en) * 2000-09-15 2003-05-06 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forshung E.V. PCR reaction mixture for fluorescence-based gene expression and gene mutation analyses
US6583279B1 (en) * 2001-01-26 2003-06-24 Becton, Dickinson And Company Sequences and methods for detection of hepatitis B virus
ATE465272T1 (de) * 2001-01-31 2010-05-15 Mayo Foundation Nachweis von herpex-simplex-virus
US6596489B2 (en) * 2001-03-30 2003-07-22 Applied Gene Technologies Methods and compositions for analyzing nucleotide sequence mismatches using RNase H
US6803201B2 (en) * 2002-01-24 2004-10-12 Stratagene Compositions and methods for polynucleotide sequence determination

Also Published As

Publication number Publication date
TWI329675B (en) 2010-09-01
US20040191776A1 (en) 2004-09-30
TW200819543A (en) 2008-05-01
TW200819542A (en) 2008-05-01
CN1570142A (zh) 2005-01-26
CN101187632A (zh) 2008-05-28
CN1995982A (zh) 2007-07-11
CN1570142B (zh) 2011-05-25
TWI332526B (en) 2010-11-01
CN101187632B (zh) 2011-07-27
TW200418991A (en) 2004-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0915991B1 (en) Nucleic acid amplification method based on ramification-extension (ram) and in vitro transcription
WO2014082586A1 (zh) 引物中部序列干扰pcr技术
US10358675B2 (en) Oligonucleotides for controlling amplification of nucleic acids
EP2007901A1 (en) Rapid genotyping analysis and the device thereof
JP2009261406A (ja) β２アドレナリン多型検出
CN1269967C (zh) 单核苷酸多态性的鉴定
EP2450443B1 (en) Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods
JP4228041B2 (ja) 塩基多型の検出方法
EP1426448A1 (en) Method for lowering the effects of sequence variations in a diagnostic hybridization assay, probe for use in the assay and assay
EP2598653A1 (en) Generic pcr
TWI332525B (en) Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus
US20120190008A1 (en) Generic pcr
CN114085926A (zh) Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法
WO2004092385A1 (ja) β３アドレナリン受容体変異遺伝子の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット
JP2009232707A (ja) 一塩基多型の検出法及びプローブ固定担体
US7211381B1 (en) β2 andrenergic polymorphism detection
WO2004092415A1 (ja) ミトコンドリアｄｎａ３２４３変異の検出法および定量法ならびにそのためのキット
JP5584385B2 (ja) ヒトパピローマウイルスの検出法及びタイピング方法
JP5017947B2 (ja) 複数の塩基多型の同定方法
JP4267881B2 (ja) ヒトチトクロムｐ４５０２ｃ１９遺伝子の点突然変異の検出用核酸及びそれを用いたヒトチトクロムｐ４５０２ｃ１９遺伝子の点突然変異の検出方法
JP2012105645A (ja) Ｅｇｆｒエクソン２１ｌ８５８ｒ遺伝子多型検出用プライマー及びその用途
JP2007330134A (ja) 核酸の検出方法
JP2007330137A (ja) 塩基多型の同定方法
JP2007330138A (ja) 複数の塩基多型の同定方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees