TWI329675B - Method for genotyping and quantifying hepatitis b virus - Google Patents
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Description
1329675 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一新穎的引子對、探針對及以B型肝 炎病毒基因為模版所複製放大而得之核酸，及以其同時對 基因型作定型及定量B型肝炎病毒的方法。 【先前技術】 單一核酸多型（們 Ksingle nucleotide p〇lym〇rphisrns， SNPs)，亦即基因序列位置上一群變異的單一核酸，其係 分布於整個基因序列中。一單一核酸多型係可以為等位基 因。亦即，由於存在該基因多型性，因此一物種中某些個 體具有非變異序列（野生型），而另一些個趙則具有變異序 列（變異型）。就動物個體而言，基因多型性可能導致隱性 遺傳疾病。上述疾病包括：牛淋巴球黏力缺失症（B〇vine Leukocyte Adhesion Deficiency)、 胍 胺 酸 症 (Citrullinemia)、楓糖尿症（Maple Syrup Urin e Disease )、 尿核甘單磷酸鹽合成缺失症（Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase)、溶晦小體貯積症、醣化基因症 等。人顧之纖維囊化症（cystic fibrosis)係上述隱性遺傳疾 病之一例，該病患者群約占白種人族群中兩千分之一。就 諸如細菌或病毒之類的微生物致病源而言，單一核酸多型 性與不同的致病效應有關，並因此影響罹患該病症之病患 的治療及長期預後狀況。依據上述，迫切需要一種能夠有 效鑑別及量化内含單一核酸多型之核酸的方法。 6
f發明内容J 本發明係有闕於一新穎的幻子對、探釺對及由以B型 炎病毒基因為模版所複製放大而得之核酸，及將其同時 用於基因梨定型及B蜜肝炎病毒定量上的應用。 單一：發明係關於一種能夠同時鑑別一微生物標的核酸之 同時執：多型及量化該標的核酸的方法。該鑑別及量化係 發明方法需使用一種第一探針& _ ^ ^ AI- 0 該第—探針係盥 抹針及一種第二探針 包含-與單 標的核酸之第—序列相同或互補，其係 標的核酸之第：竣多型相對應的鹼基；該第二探針係與-多型相對應的鹼：到相同或互補’其係不包含與單-核酸 標定物，該第二。該第一探針係共價鍵結於一第一螢光 笛 ** 針係共價鍵結於一第-路央炉定物。該 第一螢光標定物及 乐一螢先標疋物π 體，另一者為螢第二螢光標定物中之—者為螢光施 探針與該標C’如此"'來，當該第-探針及第二 於鄰近位Ϊ，使椁’纟時’該螢光施體與該螢光受體係處 (FRETp 兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移 本發明方法包& 步驟，其係藉由聚/一樣本中的標的核酸複製增量的 (primer)序列為之，估合酵素連鎖反應（PCR)以一對引子 第-序列及該第二纟得樣本中該標的核酸形成一包含該 ^ ^ ^ ^ 列的雙股核酸。上述第一探針及第二 核酸產物雜合，以分別2的鍵合—a步驟中與該 乃J形成—第一雙股（dup丨ex)及第二雙 1329675 股。上述兩種探針係可以雜合於該核酸產物 上述兩種探針亦可以雜合於該核酸產物的不 使得該螢光施體與該螢光受體位於鄰近位置 種探針所雜合的序列係可以位於該核酸產品 叉狀結構或泡狀結構上。 樣本中標的核酸量的測定，係藉由測 上螢光受體所發出的螢光量為之，其係於每 鎖反應循環之鏈合期的最末階段為之。上述 係將該待測螢光強度與一預定值比較得知， 係由含有已知濃度之該標的核酸的溶液測量 光量之測定亦可將該聚合酵素連鎖反應之 point value，Cp value)與一預定值比較得知 值係由含有已知濃度之該標的核酸的溶液測 量方法係如 Mackay I. et al·，Nucleic Acids 1 305，2002 所述 ° 聚合酵素連鎖反應完成後，加熱使得溫 探針及其互補序列形成之雙股核酸的分離 point)。當該雙股核酸分離時，上述螢光施· 之間的FRET受到干擾。該標的核酸中單一 別，係以一激發光照射該螢光施體，並測量 螢光受體所發出之螢光量的改變，該螢光量 升高溫度值之函數。舉例來說，鑑別一單一 首先，建立該第一雙股核酸的一階導函數分 該第一雙股核酸包含一螢光標記探針，且該 的同一股上。 同股上，並且 上。例如該兩 兩股所形成的 量該第一探針 一聚合酵素連 螢光量之測定 其中該預定值 而得。上述螢 交叉值（cross ，其中該預定 量而得，其測 Res. 30:1 292- 度高於該第一 溫度（melting 趙及螢光受體 核酸多型的鑑 該第一探針之 的變化係為所 核酸多型時， 離曲線，其中 分離曲線係基 8 1329675 於隨溫度而變的螢光量而有所變化。其二，建立一溫度曲 線，其係基於分離曲線之分離高峰而得。其三，比對該溫 度值與該雙股核酸的分離溫度，其中該雙股係由該第一探 針與一互補序列形成。當該溫度值較該分離溫度低時，該 標的核酸中存在一單一核酸多型，當該溫度值與該分離溫 度相同時，則不存有單一核酸多型。 本發明另一特徵係關於可用以複製放大取自 HBV的標 的核酸之引子對，其分別包含下述序列編號（SEQ ID )之 基因·•前置引子為TACTGCGG (序列編號：13 )及反置引 子為 GGTGAAGCGA (序列編號：14 )、前置引子為 CGTGGAACC (序列編號：17)及反置引子為GGTGAAGCGA (序列編號：14)或前置引子為CTCAGGCCA (序列編號： 20 )及反置引子為AACGCCGCAGACACATCCA(序列編號： 6)，其中每一個引子之長度介於8到50個鹼基之間（亦 即，15到40或1 8到30個鹼基之間）。上述引子對亦可以 為如下序列：前置引子為 CCGATCCATACTGCGGAAC (序 列編號：9 )及反置引子為 GCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA (序列編號：10)、前置引子為GCATGCGTGGAACCTTTGTG (序列編號：1 )及反置引子為CAGAGGTGAAGCGAAGTGC (序列編號：2)、前置引子為 TCATCCTCAGGCCATGCA (序列編號：5 )及反置引子為AACGCCGCAGACACATCCA (序列編號：6 )。 本發明亦提供探針對，其係用於同時鑑別B型肝炎病 毒中標的核酸之單一核酸多型及定量該標的核酸。該探針 9 1329675 對分別包含下述序列編碼（SEQ ID)之基因：第一探針為 TTGTCTACG (序列編號：18 )及第二探針為CGCTGAATC (序列編號：19 )、第一探針為 TACGCGGACTC (序列編 號：15)及第二探針為 GCCTTCTCATC (序歹J編號：16) 或一感應探針為 ACACGGGTGTTTCC (序列編號：21 )及 一固定探針為 ATTGAGAGAA (序列編號：22 )，其中每一 個引子之長度介於9到50個鹼基之間（亦即，15到40或 18到30個鹼基之間）。上述探針對亦可為如下序列：一感 應探針ACGTCCTTTGTCTACGTCCCG (序列編號：3 )及固 定探針 CGGCGCTGAATCCCGCGGAC (序列編號：4)、感 應探針TCTTTACGCGGACTCCCC (序列編號：11 )及固定 探針 TCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACC (序列編號：12 )、 感應探針 AAGACACACGGGTGTTTCCCC (序列編號：7 ) 及固定探針 GAAAATTGAGAGAAGTCCACCACGAGTCTA(序 列編號：8 )。 本發明亦提供由以B型肝炎病毒基因為模版所複製放 大而得核酸產物，其包含序列編號為15、18及21之基因， 或其之互補基因序列，其中每一個核酸產物之長度介於100 到1，000個鹼基之間（亦即，200到700或300到500個鹼 基之間）。上述核酸產物係與上述引子及探針雜合，用以 鑑別及定量含有單一核酸多型之標的核酸，其中該標的核 酸係取自HBV基因。 本發明亦提供一可同時鑑別及定量含有單一核酸多型 之HBV標的核酸的試劑組。該試劑組包含1、2或3對上 10 述弓丨子對和/或探針。 定 和 圍 本發明實施例之實施細節如下所述1其並非用以限 本發明，任何熟悉此項技藝者’在不、脫離本發明之精神 範圍内，當可做呰許更動與潤飾，因此本發明之保護範 當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 【實施方式】 本發明之目的係為提供一種同時鑑別B型肝炎病毒基 因型及定量該基因的方法。 本發明方法需使用一種第一探針及一種第二探針該 第一探針之設計係依據標的核酸中習知的單一核酸多型及 其特性來設計，例如’ GC含量、鏈合溫度、内部配對等， 其可以軟體程式來決定。為使得該第一探針能夠鑑別不同 種個體核酸中的單一核酸多型，該第一探針之序列係與一 含有單一核酸多型的序列相同或互補’其係能用以鐘別該 物種中至少兩種不同的基因型。上述序列之決定係藉由比 對該物種不同個體之去氧核醣核酸之標準序列而得，其方 法係與下文中探針及引子之設計』單元中所述方法類似。 上逮不同個體之去氧核醣核酸序列係由任何恰當的資料康 中取得,例如 y/ww.nchi.nlm.gov/PMGifs/Genomes. 該第一探針係與一單一核酸多型對偶基因（例如野生 型）雜合而形成一雙股核酸’且其中不具有任何錯配的鹼 基對。該第二探針係與另一單一核酸多型對偶基因（例如： 突變型）雜合而形成另一雙股核酸’且其中具有錯配的驗 1329675 基對。由於上述雙股核酸之後者具有錯配的鹼基對，故其 分離溫度 （Tm)較前者為低。該第一探針可以設計為以 基因為基礎的方式來區分野生基因型及突變基因型。該第 一探針與野生型基因及突變型基因雜合產生雙股核酸的能 力係可以用實驗方法測定之。上述兩種雙股核酸之分離溫 度的差異亦可以用實驗方法測定之，其差異大小（例如：達 攝氏2度）需足以測量出兩者間之差異。 茲以肝炎病毒為例··肝炎病毒包含單一核酸多型之 基因 序列為 ：TACGCGGA_CTC( 序列編號 15)， TTGTCJACG(序列編號：18)，ACiCG_GGTG；LT：LCC (序列編 號：21)(前述粗體斜線之字母表示對應於單一核酸多型性 的鹼基）上述單一核酸多型係能用來區分肝炎病毒 A基因 型至G基因型。參見表1及表2，以及下文中『同時鑑別 及測量』一節。 上述包含單一核酸多型的序列（們），其側翼之序列 最好為一物種中不同基因型個體所保留的序列（即，無變 異的序列）。如下文所述，該保留（或無變異）側翼序列對 於設計第二探針以及聚合酵素連鎖反應引子相當重要。 該第二探針之設計係基於兩個原則。其一，該第二 探針不包含單一核酸多型，且其序列與物種中不同基因型 之保留序列相同或互補。其二，該保留序列係與上述包含 單一核酸多型的序列相鄰。此種設計之目的在於，當該第 一探針及該第二探針與標的核酸雜合後，該兩種探針的位 置能夠相當靠近，例如間隔1至3個鹼基。 12 1329675 上述第一探針及第二探針係連結於螢光標定物，並 可藉由習知技術以直接或間接的方式測定之。該螢光標定 物中之一者為螢光施體，另一者為螢光受體，該螢光施體 所發出的螢光發光光错（emission spectrum)係與該螢光受 趙的激發光譜（excitation spectrum)重養。當該第一探針 及第二探針與該標的核酸雜合時，該螢光施體與該螢光受 體係處於鄰近位置，使得兩者之間能夠進行螢光共振能量 轉移（FRET)。上述螢光受體所發出的螢光係能夠藉由習 知技術鑑別及量測之。凡是發光光譜及激發光譜重疊的兩 個螢光標定物都可以用來標定上述第一探針及第二探針， 例如：LightCycler-Red 640可以為上述螢光受體，而螢光 黃（fluorescein)可以為_上述螢光施體。
欲同時鑑別和定量一標的核酸，須將上述探針與該 標的核酸混合’施以即時聚合酵素連鎖反應（PC R)。上述 PCR反應所用的引子（primer)對係以習知技術之原則設計 之。該引子序列尤其應該與單一核酸多型側翼之序列相同 或互補’其中該側翼序列係為—物種中不同基因型個體所 保留的序列。上述引子對係用以將一含有單一核酸多型的 標的核酸複製放大。上述去氧核醣核酸序列係由任何恰當 的資料庫中取得’例如：組織均質物（Ussue homogenate)、血液樣本，並且，其係可以為去氧核醣核 酸或核醣核酸’若為核醣核酸，則在進行聚合酵素連鎖反 應之前應先施以反轉錄步驟。上述聚合酵素連鎖反應係依 據一般標準程序進打，其可以參照Innis et al(199〇) pCR 13 1329675
Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich, New York。在一實施例 中，即時聚合酵素連鎖反應係採用市面上可購得之即時聚 合酵素連鎖反應系統（Roche Molecular Diagnostic承銷之
LightCycler)。 聚合酵素連鎖反應的三個步驟（即變性、鏈合、延 長三步驟）可以重複施行多次，使得能夠獲得足量之與標 的核酸相對應的產物。其重複施行的次數則與其所使用的 樣本性質及其他因素有關。若上述樣本為複雜的核酸混合 物，當吾人欲獲得足量的上述標的核酸時，則重複施行聚 合酵素連鎖反應的次數必須較多。通常上述聚合酵素連鎖 反應重複施行的次數至少20次左右，但也可能達到40次、 50次、60次甚至1〇〇次之多。上述聚合酵素連鎖反應之 產物與上述探針鏈合後’即可用以鑑別及測量上述標的核 酸。 樣本中標的核酸之量的測定，係藉由測量上述螢光 受體所發出的螢光量為之’其係於每一聚合酵素連鎖反應 循環之鏈合期的最末階段藉由照射上述螢光施體為之。上 述發出螢光之強度係為上述複製放大的核酸產物量之函 數，而上述核酸產物量係為該標的核酸原始濃度及聚合酵 素連鎖反應重複次數之函數。若聚合酵素連鎖反應重複施 行的次數夠多，則該複製放大之核酸產物的累積率及螢光 量變化率即進入—對數線性階段。將該螢光強度值對該聚 合酵素連鎖反應次數繪圖，即可獲得對應於該對數線性階 14 1329675
段起點的聚合酵素連鎖反應重複次數（亦即交叉值，Cp 值）。繼之，將上述測得之 Cp值與一預定值比較，其中 該預定值係由含有已知濃度之標準核酸溶液測量而得。利 用下文中「HBV定量」一節所述之方法，即可獲得一系 列之上述Cp預定值。因此，吾人可以藉由將一給定之Cp 值與上述一系列 Cp預定值進行比對，即可得知該標的核 酸之原始濃度。
或者，亦可將其所發出螢光強度與一預定螢光強度 值比較，而來定量一標的核酸"除了其對應之核酸原始濃 度為已知外，該預定螢光強度值係以相同方式決定之。
欲鑑別一標的核酸，可於聚合酵素連鎖反應終了後， 將其複製放大的核酸產物施以一分離曲線分析而得知。將 該聚合酵素連鎖反應後之反應溶液緩慢加熱之，其加熱梯 度約為每秒鐘升高攝氏0.5度，使得溫度高於該第一探針 及其互補序列形成之雙股核酸的分離溫度。同時在照射該 螢光施體時，監測該螢光受體所發出的螢光量。將該螢光 強度（F )對該分離溫度（Tm )做圖，即可得到一分離曲 線圖。繼之，將該螢光強度（F)對溫度（T)微分，取 其負值（-dF/dT )對溫度做圊，以獲得該分離曲線之一次 微分曲線，來決定一分離峰值。將該分離峰值所對應的溫 度與該第一探針的分離溫度比對。在一較佳實施例中，上 述分離曲線分析係以 Light Cycler分析軟體（3.5版）為 之 (Roche Diagnostics Applied Science, Manngeim Germany )。當該溫度值低於該分離溫度，則表示該標的 15 1329675 核酸中含有一單一核酸多型’當該溫度值等於該分離溫 度，則表示該標的核酸中不含有單一核酸多型。上述方法 係能夠有效地同時银另丨丨糸j定詈__各士取 IJ砰鑑別和疋置 含有單一核酸多型的核 酸。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限定本發日月，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精 神和範圍内，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 探針和引子的設計
由 WWW,ngbi,nlm.nih.gQV/f31Gifs/Gennp,es/vjriises html 所示資料庫中取得216段完整的肝炎病毒DNA序列。其 中有17 5段序列經鑑別為屬於A到G基因型之病毒，該 鑑別操作係以Biology WorkBench所提供之CLUSTRLW Multiple Sequence Alignment，DRAWTREE 及 DEAWGRAM 軟想為之（workbench.sdsc.edu/)。 在上述175段基因序列中，有47段屬於B基因型， 有49段屬於C基因型。將上述兩種基因型之基因序列比 對並排，以鑑別出另一含有單一核酸多型且兩翼序列為上 述兩種基因型共有基因的基因序列片段，其係藉由 CLUSTRLW 多序列比對程式（CLUSTRLW Multiple Sequence Alignment program)為之。上述步驟比對出三 段基因序列，並據以設計出三對引子及探針，其係依據TIB M0LBI0L ( Gerlin，Germany )所提出的原則為之。上述 16 1329675 引子對可藉由 PCR反應由其個別標的核酸來產生複製放 大產物。茲將上述複製放大產物、引子對及探針對的基因 位置總結如表1所示。 表1 :用於鑑別及定量HBV中單一核酸多型的複製放大 產物、引子對及探針對 複製物 序列號碼 序列（5’~3’） 位置（nt) 產物大小 (bp) ™ 值（t) 第一群 前置引子 1 5’"GCATGCGTGGAACCnTGTG-3， 1232-1251 基因型B 57.7 反置引子 2 5,-CAGAGGTGAAGCGAAGTGC-3, 1599-1581 368 基因型C 66.3 固定餅 4 FLU-5,<XjGCGCTGMTCCCGCGGAC-3,-P 1436-1455 ΔΤΜ=8.6 感應探針 3 S'-ACGTCCTTTGTCTACGTCCCG^JC-Red 640-3, 1414-1434 ± 30%Δ TM=± 1.8 SNP位置 C/T>ntl425 第淨 前置引子 9 5,-CCGATCCATACTGCGGAAC-3, 1261-1279 基因型B 60.9 反置引子 10 5,-GCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3, 1600-1580 340 基因型C 54.8 固定探針 12 FLUy-TCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACC^ 1552-1576 ΔΤΜ=6.1 感麟針 11 5’-TCnTACG0GGACTCCCC-LC-Red 6403， 1533-1550 + 30% Δ TM=+ 1.8 SNP位置 A/T»ntl544 第消 前置引子 5 5,-TCATCCTCAGGCCATGCA-3, 3192-3209 基因型B 64.3 反置引子 6 5，-AACGCCGCAGACACArCCA-3, 392-374 416 基因型C 46.8 固定探針 8 FU^AAAATOAGAGMGTCCACCACGAGTCD^ 278-249 ΔΤΜ=16.3 感應斜 7 5’-MGACACACSGCTGTITCCCC -LC-Red 64WS 301-281 土 30%Δ TM=+ 4.9 SNP位置 A/G，nt285 ; A/G，Π287 ; G/A，nt292 ; T/C，nt294 1 :核酸位ΐ (nt)係以B型肝炎α；7·亞型基因庫之位置表示（GenBankaccession no. NC_003977)。 2 : P表3’端經磷酸化處理以避免探針於PCR時延伸。 3 : FLU 表螢光（flourescien); LC-Red640表LightcyclerRedM) 4 :所示TM值為平均數，TM值土 1°C係為基因型定型所容許。 5 : SNP位置以粗體、底線標示之。複製放大產物1在核酸位置1425處含有一 C/T單一 核酸多型。複製放大產物2在核酸位置1544處含有一 A/T 單一核酸多型。上述兩種單一核酸多型係位於 HBx基因 17 1329675 上。複製放大產物3含有4個單一核酸多型，其分別為： HBV之核酸位置285處（A/G單一核酸多型）；HBV之核 酸位置287處（G/A單一核酸多型）；HBV之核酸位置292 處（G/A單一核酸多型）；hbv之核酸位置294處（T/C單 一核酸多型）》上述4種單一核酸多型均係位於HBs基因 上述引子及探針係由TIB MOLBIOL所合成。其中， 第二探針（固定探針）之3,端具有螢光標定，含有單一 核酸多型的第一探針（感應探針）則是在5,端具有LC_Red 640染劑標定。上述感應探針的3,端亦已磷酸化。 為確認上述複製放大產物中含有單一核酸多型，由4〇 位B型肝炎病患取得血清樣本’依照下文中「hbv之DNA 製備」一節中所述方法由該血清樣本中製備DNA。利用 傳統的PCR反應複製放大上述基因樣本，再將該等基因 樣本的複製放大產物以ABI PRISM Big-dye kits分析其基 因序列’並藉由 ABI 3100 Genetics Analyzer (Applied Biosystem，Foster City，CA)分析之。結果顯示，上述 20 種樣本之複製放大產物含有HBV C基因型的單一核酸多 型，而另外20種樣本之複製放大產物含有HBV B基因型 的單一核酸多型。 HBV DNA之製備 由114位慢性B型肝炎病患取得血清樣本〃所有上述 病患均由國立台灣大學附設醫院門診進行後續追蹤。為確 18 1329675 認上述血清提供者確罹患慢性B型肝炎，進一步以市售 肝炎測試劑（Ausab，Ausria II，Murex HbeAg/anti-Hbe，
Abbott Laboratories, North Chicago, IL )測試該血清樣本 含有 HbsAg、anti-HBs、anti-HBc Igs、HBeAg、anti-HbeAg。
上述血清中的 HBV DNAs亦以分枝鏈 DNA 分析法 (QUANTIPLEX tm HBV DNA Assay, Chiron Corporation, Emeryville，CA)分析之，其係依據該產品業者提供之操 作方法為之。上述操作均依照1975年赫爾辛基宣言中所 示的醫學倫理準則為之。
繼之，由上述樣本中製備HBV基因，其係以高純度 病毒基因製備試劑組（Roche Diagnosis Applied Science, Mannheim Germany)為之。取 200μ1的上述血清樣本， 將之與200μΐ的結合緩衝液混合，於攝氏72度中反應10 分鐘，其中該結合緩衝液成分包含：6Μ胍氫氣酸 (guanidine-HCl)、10mM 尿酸、10Mm Tris-HCM、20% Triton X-100(vol/vol)、200 # g 之 p〇ly(A)、0.8mg 腺蛋白 K。 繼之，將該反應混合液與100 Ml的異丙醇混合，滴入一 已預先充填了玻璃纖維之高純度過濾管中。將該過濾管以 一抑制物移除缓衝液沖洗兩次後，以1 0 0 // 1水將該病毒 核酸洗出，其中該抑制物移除緩衝液成分包含：1 00%乙 醇、20mmol/L 氮化鈉、2mmol/L Tris-HCl » 繼之，利用傳統方法確認上述HBV病毒DNA所屬之 基因型，在此所謂的傳統方法包括：PCR-PFLP、使用基 因型專屬引子之PCR、及直接定序等等。上述肝炎病患 19 1329675 的血清中’有60個樣本經鑑別為含有b基因型的HBV， 而46偏樣本經鏗別為含有c基因型的hBV。其餘8個樣 本中的HBV則無法以上述傳統方法決定出其所屬的基因 型。 HBV定量 為進行HBV的定量，必須先以質體pHBV 48為對象， 做成一複製量標準曲線。該質體之製造係將1.5mer的HBV DNA片段（核酸位置為2851至318 2/1至318 2/1至1281) 載入PGEM-3Z載體8中為之。上述質體合成後，係以質 體純化劑組（QIAGEN GMbH, Hilden Germany)純化之，並 以光譜儀定量之。其對應之HBV效價（copy/mL )係以 每一質體的質量決定之。繼之，將該質體進行一系列稀釋， 以得到 HBV 效價值介於 lxl〇2COpy/mL 至 lxlO11 copy/mL 的10個樣本。上述10個樣本係依據下述方法做成一標準 曲線。 每一上述樣本，取2/zl，將之與下列溶液混合：0.5 /z 1 的 Light Cycler fast Start DN A Master Hybridization Mixture、0.2仁1之25mM氣化鎂、以及如上文「探針及 引子設計」一節中所述之第二探針，其中該 LightCycler fastStart DNA Master Hybridization Mixture 包含成分：Tag DNA聚合酵素' PCR反應緩衝液、10 mM氣化鎂、dNTP 混合液(Roche Diagnosis Applied Science, Mannheim Germany )。混合上述液體後，將最终反應液的體積調整 20 1329675 到5#1，使得每一反應液中的引子濃度為5μΜ，而每一 反應液中的探針濃度為0.5//Μ。將上述最終反應液載入 LightCycler毛細管中並離心之，再置入 LightCycler樣 本旋轉架中（Roche Diagnosis Applied Science, Mannheim Germany ) ° 繼之，依據下述程序執行一及時PCR反應。首先以攝 氏95度加熱該反應液1〇分鐘，使得DNA變性分離。然 後重複進行如下程序55次：於攝氏95度加熱5分鐘，使 得DNA變性分離；於攝氏55度加熱10秒，使得DNA鏈 合；於攝氏72度加熱20秒，使得DN A分子延長。上述 反應中溫度轉換速度之設定為：分離/鏈合轉換為每秒鐘 20度；而鏈合/延長轉換為每秒鐘5度。在每一次鏈合步 驟完成時’測量LC-RED640發出的螢光量。決定每一樣 本的Cp值，並利用LightCycler軟體3.5版，將樣本的Cp 值對樣本濃度對數值作圊，即可得出標準曲線。上述標準 曲線在lxlO2 copy/mL至lxlO11 COpy/mL的範圍内呈現一 直線段’表示其測試限度為lxl〇2 C〇py/mL。 繼之測試該標準曲線以定量HBV DNA。該測試操作 所使用的測試樣本包括：由 HBV Genotype
Panel(International Enzymes，Inc.，Fallbrook，CA)取得之 15個基因型為A至F的樣本、由QUANTIPLEX bDNA劑 組取得之4個樣本。上述19個樣本均包含已知其效價的 HBV ^將上述樣本進行即時pcr，並以上述方法獲知其cp 值。並利用上述標準曲線找出與Cp值相對應的效價。針 21 1329675 對每一樣本進行6次（3次重複實驗）上述定量作業。上 述測試結果顯示所有樣本的效價均為正確。 將上述方法所獲知的政價與依據傳統方法獲知的效價 進行比較，其中該傳統方法包含：NGI SuperQuant、Roche Amplicor、Chiron Quantiplex bDNA assays。上述三種傳 統方法之實施係依據其製造商提供的操作方法為之。將上 述方法測得的效價對上述三種傳統方法測得的效價進行線 性回歸’結果顯示其具有顯著相關（gamma值分別為0.9866, 0.9830 及 〇.999 )。藉由皮爾森相關（Pearson correlation) 估算其組間差異係數與組内差異係數。其結果為 P值小 於0.001，顯示該方法具有相當的再現性。 之锶别 測試上述三組探針對及引子對，以區分出在台灣、中 國大陸及日本三地流行的B型肝炎病毒及c型肝炎病毒。 由上述樣本中選取10個含有基因型B基因序列的樣 本’以及10個含有基因型C基因序列的樣本。依據上述 「HBV定量」一節中所述方法，以上述樣本及第2組引 子及探針進行PCR反應。於PCR反應終了後，先將反應 液置於攝氏95中60秒，再將其冷卻至攝氏45度（溫度 下降速度為每秒鐘下降攝氏〇5度），將該反應液置於攝 氏45度中120秒’在將其加熱至攝氏8〇度（溫度上升速 度為每％/鐘上升攝氏〇.5度）。同時，測量之螢光 量訂出所有上述樣本的分離曲線後，將該螢光強度（F) 22 對溫 獲得 述分 之。 峰值 平均 別為 因序 之内 基因 均在 係作 組複 點分 上述 i dna C基 上述 因型 另外 則分 用上 度:τ)微分，取其負值（_dF/dT)對溫度做圈以 該77離曲線之-次微分曲線’來決定-分離峰值，上 離曲線π析係α LightCyeler分析軟想（3 5版）為 依其值之太丨 —，吻’_、，工现徠不的分離 ' '、分為兩群。且上述兩群樣本的分離溫度 值分別對4 HBV基因型Β及基因型c的溫度（其分 攝氏60.9度及548度）。上述1〇個含有基因型8基 J的樣本其分離溫度與60.9度之差異均在18度 亦即△ Tm ( 度）之3〇%之内。上述1〇個含有 垔c基因序列的樣本，其分離溫度與548度之差異 u度之内》因此rrc (或ΔΤηι(6」度）之3〇%) ，區分基因型β及基因型c之分界點。第i組及第3 製放大物（及其相對應之引子 1沐針）之基因型公旯 = rrC:4.9。。’其係依據如上述之方法所決定。 平均刀離溫度和分界點係總結於表1中 截之，利用上述3組引子及探釺 ^ M 对，決定如前文「Hbv 製備」一卽中所述之60種 m , 丞因型的HBV及a锸 因型的HBV之基因型。採用第 種 , 1組引子及探斜ai 100種HBV中，可以正確判 ' 〜再中103種HBV的a 。至於3個未被正確判定的樣本， ，土 * 有1個被錯誤列定， 2個則無法判定。採用第2組和坌 „ 組引子及探斜時， 别有1個和2個樣本無法正確矣 .. 】又。然而，若同時越 述3組引子和探針中任2組時， 則可以正確判斷所有 23 1329675 上述106個樣本的基因型。 如前文「HBV DNA製備」一節中所述，取自8 患的樣本無法以傳統方法決定其含有 HBV的基因型 上述3組引子及探針鑑別之，則可以正確決定出該8 者樣本中所含HBV的基因型。將樣本中的基因直接 再次確認上述鑑別結果為正確的。上述結果顯示本發 述基因型鑑別方法較之傳統的 HBV基因型鑑別方法 更高的正確度。
同時鑑定及定量HBV 藉由上述引子及探針與上述方法，針對含有 B 型及C基因型之HBV的樣本同時進行鑑別及定量。 灣大學附設醫院（台北，台灣）取得含有 B基因型 基因型之HBV的質體。將含有B基因型及C基因型之 的質體依不同比例混合，其混合比例介於1 〇 : 1到] 之間。依據上述「HBV之鑑別」一節中所述方法， 該質體混合液所含HBV之基因型，其中該質體混合 效價為每毫升1〇7個質體。上述操作之結果顯示，各 之分離曲線的一次微分曲線顯示對應HBV B基因型 基因型的分離曲線與分離峰值。同時，依據如前文「 定量」一節中所述之方法，測得各樣本的Cp值及其 含質體的效價。上述操作的結果顯示，上述方法可以 鑑別及定量一樣本中所含之主要HBV群及次要HBV 其中，上述次要HBV群之質體效價至少為上述主要 位病 。以 位患 定序 明所 具有
基因 自台 及 C HBV ：10 鑑別 液之 樣本 及C HBV 中所 同時 群。 HBV 24 1329675 群之 10%。上述方法可以僅以單管樣本，同時鑑別及定 量一含有單一核酸多型的標的核酸，該方法具有極佳的效 率、正確性及敏感度。 本發明方法除了可以用於鑑別及定量B基因型及C基 因型之外，亦可以用於其他基因型之鑑別及定量。前文「探 針及引子的設計」一節中所述之1 75個HBV DNA序列， 均可以依據該節所述方法並列比對。該引子及固定探針之 序列在A到G之基因型中，均保持不變。對應複製放大 物的單一核酸多型亦被檢驗，其序列變異及相對頻率均列 示於表2中。 表2 ·· HBV A基因型A至G基因型中單一核酸多型序列 之變異 第一群 第二群 第三群 &ISNP c A A A G T A(17) T(嗎 G(17) 聊/gqwoi) m T(17) B(47) 11(42)03 A(46Xm) G(34)/m)m A(44讎 m T(A5)fmW C(49) Q37KIU2) 聊Δ0) mm mym A(4獅 mmm D(24) T(22 賺 A(22XE1)/Qa) 網 G(24) m E(2) φ) T(2) Φ) Φ) G(2) m F(28) T(25)m A(22/T(2)m GOT) φ2)麵/〇〇) (Ml) 聊賴 G(8) m m m G(8) G(8) W) 標底線字母及數字表較低之變異及其頻率。 如表2所示，7種基因型中除了基因型B及D之外， 在3種複製放大物中均具有獨特的單一核酸多型組合。因 此，可以依據下述方法，利用3組不同的引子及探針來鑑 別HBV的基因型： (1 ) 使用第2組引子及探針，決定待測HBV是 25 1329675 否屬於第1群（基因型A、C、E、G)或是第2群（基因 型 B、D、F )。 (2 ) 使用第1組引子及探針，決定待測HBV是 屬於第1群的基因型A、G、C、E中哪一種。 (3 ) 使用第3組引子及探針，決定待測HB V是 屬於第2群的基因型B、D、F中哪一種。
其他實施例 雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非 用以限定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之 精神和範圍内，當可作各種之更動與潤飾，凡所做之各種 更動與潤飾皆在本發明後附之申請專利範圍内。
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Claims (1)
- 、申請專利範圍： —種可同時鑑別B型肝炎 及定量該標的核酸之方法，：广的核…—核酸多型 再包括： 提供第一探針及第二摆 ’其中該第一探針係與該 標的核酸之第一序列相同 ^ a ^互補且包含一與單一核酸 多型相對應的鹼基，該坌_ 探針之核酸序列為序列編 说‘3之序列；其中該第_ 乐—探針係與該標的核酸之第二 序列相同或互補，其係不白八 3與單一核酸多型相對應的 鹼基，該第二探針之核醆库 斤歹丨為與序列編號：4之序列； 藉由聚合酵素連鎖反應 题（PCR)以一對引子來複製增 量該標的核酸，以形成—白么斗# 包含該第一序列及該第二序列 的雙股核酸，該對引子之装由 ^ 如产 <具中一者的核酸序列為序列编 號：2之序列，以及該對引 ..^ ^ )丨十之另一者的核酸序列為序 列編號：1之序列； 於反應液中將該核酸羞物分別與該第一探針及第二 探針雜合，以分別形成第一雙股及第二雙股，其中該第 一探針係共價連結於一第—螢光標定物，該第二探針係 共價連結於一第二螢光標定物，其中該第一螢光標定物 及該第二螢光標定物中之一者為螢光施體，另一者為螢 光受體，使得當該第一探針及第二探針與該標的核酸產 物雜合時，該螢光施體與該螢光受體係處於鄰近位置， 且其兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移（FRET); 加熱該反應液’使得其溫度高於該第一探針及其互 補序列所形成之雙股核酸的分離溫度； 1 1^29675 99年6月7日修正替換頁 鐘別該單一核酸多型’其係以一激發光照射該勞光 施體’並測量該第一探針之螢光受體發出之螢光量的變 化’該螢光量變化係與其所升高的溫度值相關； 藉由測量該螢光受體所發出之螢光來定量該標的核 醆》 2 •如申請專利範圍第1所述之方法，其中該定量步驟係將該 榮光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。 3 . •如申請專利範圍第2項所述之方法’其中該第一探針及該 第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 4. 如申請專利範圍第丨項所述之方法，其中該第一探針及該 第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該鑑別步驟係包 含： 建立該第一雙股的一階導函數分離曲線； 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值； 比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值較該分離 温度低時，該標的核酸中存在一單一核酸多型，若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單一核酸多型β 2 1329675 99年6月7日修正替換頁 6. 如申明專利範圍第1項所述之方法，其中該鑑別步騍係包 含： 建立該第一雙股的—階導函數分離曲線： 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值； 比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值較該分離 溫度低時，該標的核酸中存在一單一核酸多&，若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單一核酸多型。 7. 如申請專利範圍第6項戶斤述之方法，其中該定量步驟係將 該螢光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。 8·如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該第一探針及該 第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 .種可同時鑑別B型肝炎病毒標的核酸之單—核酸多型 及定量該標的核酸之方法，其包括： 提供第一探針及第二探針’其中該第一探針係與該 標的核酸之第一序列相同或互補且包含一與單—校酸 多型相對應的鹼基，該第一探針之核酸序列為序列編 號：18之序列；其中該第二探針係與該標的核酸之第二 序列相同或互補，其係不包含與單一核酸多型相對應的 驗基，該第二探針之核酸序列為與序列編號：19之序列 藉由聚合酵素連鎖反應（PCR)以一對引子來複製增 3 99年6月7日修正替換頁 量該標的核酸，以形成一包含該第一序列及該第二序列 的雙股核酸，該對引子之其中一者的核酸序列為序列编 號：14之序列，以及該對引子之另一者的核酸序列為序 列蝙號：1 7之序列； 於反應液中將該核酸產物分別與該第一探針及第二 探針雜合，以分別形成第一雙股及第二雙股，其中該第 一探針係共價連結於一第一螢光標定物，該第二探針係 共價連結於一第二螢光標定物，其中該第一螢光標定物 及該第二螢光標定物中之一者為螢光施體，另一者為螢 光受鱧，使得當該第一探針及第二探針與該標的核酸產 物雜合時’該螢光施體與該榮光受體係處於鄰近位置， 且其兩者之間能夠進行螢光共振能量轉移（FRET): 加熱該反應液’使得其溫度高於該第一探針及其互 補序列所形成之雙股核酸的分離溫度； 鑑別該單一核酸多型，其係以一激發光照射該螢光 施趙’並測量該第一探針之螢光受體發出之螢光量的變 化’該螢光量變化係與其所升高的溫度值相關； 藉由測量該螢光受體所發出之螢光來定量該標的核 酸。 10.如申請專利範圍第9項所述之方法，其十該鑑別步驟係包 含： 建立該第一雙股的一階導函數分離曲線； 決定該曲線之分離峰值所對應的溫度值： 4 1329675 99年6月7日修正替換頁 比對該溫度值與該雙股的分離溫度，其中該雙股係 由該第-探針與其互補序列形成，若該溫度值較該分離 溫度低時，該標的核酸中存在_單一核酸多型，若該溫 度值與該分離溫度相同時，則不存有單一核酸多变。 H·如申請專利範圍第1〇項所述之方法，其中該定量步驟係 將該螢光受體所發出的螢光強度值與一預定值比較。 12. 如申請專利範圍第n項所述之方法，其中該第一探針及 該第二探針係雜合於該核酸產物的同一股上。 13. —種引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製放 大’該引子之核酸序列為序列編號：2之序列。 14. 一種引子，其係用來將b型肝炎病毒之標的核酸複製放 大’該弓丨子之核酸序列為序列編號：1 4之序列》 1 5·—種引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製放 大’該弓丨子之核酸序列為序列編號：1之序列。 16. —種引子，其係用來將B型肝炎病毒之標的核酸複製放 大’該5丨子之核酸序列為序列編號：1 7之序列。 17. —種探針，其包含一與單一核酸多型相對應的鹼基，用以 1329675 99年6月7日修正替換頁 鑑別B变肝炎病毒標的核酸中一單一核酸多型，該探針 之核酸序列為序列編號：3之序列。 18. —種探針，其包含一與單一核酸多型相對應的鹼基’用从 鑑別B型肝炎病毒標的核酸中一單一核酸多型，該探針 之核酸序列為序列編號：1 8之序列。 19. 一種探針’其用以鑑別B型肝炎病毒標的核酸中一單— 核酸多型’該探針之核酸序列為序列編號：4之序列。 20· —種探針，其用以鑑別B型肝炎病毒標的核酸中一單一 核酸多型，該探針之核酸序列為序列編號：1 9之序列。 21.—種試劑组’其可同時鑑別B型肝炎標的核酸之單—核 酸多型及定量該標的核酸，該試劑組係包含： 如申請專利範圍第14項所述之引子； 如申請專利範圍第16項所述之引子： 如申請專利範圍第18項所述之探針；以及 如申請專利範圍第20項所述之探針。 6
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