TWI319980B - Laminin-modified conduit for nerve regeneration and methods of manufacturing the conduit and regenerating nerves using the conduit - Google Patents

Description

1319980 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明屬於哺乳動物神經再生之領域。更特定而言，本 發明揭示一種用於促進跨越神經斷裂兩端間之間隙之神經再 生之中空導管。本發明亦揭示製造及使用該導管之方法。 【先前技術】 神經再生是一種複雜的生物現象。成熟的神經不再複 製，也就是不再進行細胞分裂。神經系統一旦受損即十分難 1 以復元，且身體其他部分可能衰竭。在週邊神經系統（pNs) 中，若損傷較小，神經可自行再生。雖然成人1>1^8在受傷後 可再生，其並非均能造成功能復元。這主要是由於再生軸突 . 誤導向不當之標的。當神經被大於1公分長度之間隙分隔時， ' 缺乏特定導引之軸突可能會向後生長至近端之神經殘根，進 入不當之神經内衣或形成神經瘤。在所有上述情況下，受損 軸突之再生可能費時數月。為了增加軸突再生及功能復元之 丨月b性’曾使用諸多策略。這些策略包括植入自體移植物、 同種異體移植物、異種移植物、及填充有許旺細胞（sc)之 管狀物。自體移植可能產生一些問題，包括：供應處發病、 供應處遠端之除神經、神經瘤形成、以及適合收取神經之處 有限的事實。該等缺點導致了人工神經移植物的開發。 研究集中於創造管狀物，或神經導引物，以在CNS (中 樞神經系統）及PNS中橋接截斷神經間之間隙。在發表至今 之諸多管接再生術（entubulation)研究中，已在PNS中達到 某些最佳結果（S. E· Mackinnon and A. L. Dellon，P/似价 HC0008Tff 5 1319980

Reconstructive Surg, 85: 419-24 (1990); M. F. Meek et al., Microsurgery,\9: 247-53 (1999); S. T. Li et al., Clin Mater, 9: ·- 195-200 (1992))。除了生物可降解性及生物可相容性的問題 ' 外，亦確立了導管的各種物理特性，如導管之直徑及長度、 管腔表面之微幾何學、及管壁之多孔性及可通透性之影響性。 將培養之SC導入合成神經移植物之管腔中促進了週邊 神經的再生（V. Guenard et al” J 12: 3310-20 J (1992))。為了使SC在移植物中存活，必須使其附著，因為附 • 著是SC存活及增生的先決要件。層黏蛋白（iaminin)是一種 細胞外基質蛋白，係於神經再生中使SC附著之可用蛋白質。 層黏蛋白可與SC表面之整合素（integrin)交互作用而支援 • SC附著及增生。Madison等人揭示使用一種生物可吸收性神 v 經導引物以加速小鼠中之軸突再生，該導引物係以含層黏蛋 白之凝膠充填（Madison et al.，五;pm•騰汾a/ 88: 767-772 (1985))。然而，製造以該等促進劑充填之管狀物係相 φ 當昂貴且冗長之過程。Rangappa等人揭示使用一種以平行排 . 列之層黏蛋白包覆聚(1-乳酸)纖維絲充填之神經導引物，以誘 發健全的神經突生長並提供方位導向（N_ Rangappa et ai，j 历州〜施你及烈，51: 625-34 (2000))。然而，該等纖維絲在導 • 引通道内的排列不規則且難以複製。美國第4,963,140及 5,019,087號專利揭示一種用於在活體内促進斷裂之哺乳動物 神經再生之中空導管，其管壁包括〗型膠原蛋白及含層黏蛋白 之材料，以及製備該等導管之方法。該等方法包括下列步驟： 形成一包含I型膠原蛋白及含層黏蛋白材料之分散液；添加沉 HC0008TW 6 1319980 旋轉軸接觸沉殿物以形成管狀之夥 殿劑至該分散液；及以一 原蛋白薄骐。 1不生物％境與人卫材料間之交互作用最可能取決 :==性」。因此’對已有的生物材料作表面改質 j材抖之生物可相容性，近年來已成為生物材料研究的 點。不同實驗室已嚐試_合成方法，例如接枝長烧 二鏈或生物雜分子。該等合成方法時常導致縣材料物理 、!·生的改變。反之，已知氣體表面改質方法可以改質生物材 料之表面特性而不影響其主_理特性。此外，可使用廣泛 麵之化學物質（包括無法藉由傳統合成方法料高分子化 者）以將特定官能基併入基材中。 氣體電漿處理廣泛用於聚(乳酸）（PLA)或聚(乳酸·共-甘 醇酸）（PLGA)德學改質。非高分子域體電討在聚合物 表面創造反應位點，如過氧化物及磺酸基。電漿法曾被用於 增加PLA之親水性及增進其細胞附著性（j·办哗拉户的洲

7^如〇/,13: 220_6 (2002))。另一個方法係結合電漿處理及 膠原蛋白固定，亦可顯著增進PLA之細胞親和性（j. Yang以， 所23: 2607-14 (2002))。該等結果指出經電漿處理5 後聚合物之表面組成及表面上的官能基對該聚合物之細胞親 和性有很大的影響。 雖然已經由使用包含細胞附著性分子（如層黏蛋白）之 神經導引物/導管獲得改善之結果，仍有進一步大幅改善的空 間。此外，仍希望能提供一種手段，藉此再生更多有髓鞘的 軸突、達到更快速的神經生長、並跨越更長的神經間隙。仍 HC0008TW 7 1319980 需要滿狀等需求並降低韻除先前技藝朗修復神經曾遭 遇的問題，例如血管再生、過度纖維生成、神經纖維重新導 向及最終之末梢器官功能復元不佳。 【發明内容】 藉由本發明’已發現—種_之神經再生用導管，其消 除或實質上減少許多先前技藝試圖再生神經之相關缺點或問 題。 在第方面’本發明提供—種用於促進斷裂乳 動物神經之活體内再生以便橋接其_兩端間之_之中空 導管二包：由生物可降解性高分子材料所構成之管壁，該管 壁以腔表面共驗財層轉自，其 係經由氣體電裝處理而達成。 《黏蛋白之鍵、、.. 方法 在兮導:：田本發明提供—種製造層黏蛋白改質導管之 便产接於促進斷裂哺乳動物神經之活體内再生以 便橋接其_兩端間之間隙，該方法包含下列 (a)以適當功率密度及適當壓力之 可降解性高分子材料所構成之中電漿，將一由生物 化高分子表面俾與層黏蛋白鍵結；及&充分時間，以活 ⑼以層黏蛋白接觸該導管之管腔表 黏蛋白與高分子表面間形成共價鍵。充刀時間，俾使層 斷裂神經之兩端分別接觸—中空導 ^方法，包含使該 生物可降解性高分子材料所構成之管壁， HCOOOSTff 8 1319980 其中該層黏蛋白 共價鍵結有層黏蛋白， 漿處理而達成。 【實施方式】 之鐽結係經由氣體電

而達成 表皮與基質，及圍繞神經、肌肉纖維、平滑肌細胞及脂肪細 胞之連續薄片。除其他物質外’基底膜尚包含IV型膠原蛋白、 層黏蛋白、巢蛋白（nidogen)、硫酸肝素蛋白多醣、及其他醣 蛋白及蛋白多醣。人類胎盤含有大量之層黏蛋白，是不錯的 層黏蛋白來源。 本發明提供-種用於促進斷裂哺乳動 生以便橋接其斷裂兩端間之間隙之中 #，么之活體内再 降解性高分子材料所構成之管壁，該^ ^包含由生物可 有盾黏蛋白，、中该層黏蛋白之鍵結係經由氣體_理 於製'物:降解性高分子材料係指傳統上用 於k私導g者’包括但不限於膠原蛋白 (PLA)、聚(甘醇酸）（PGA)、聚(乳酸_共_甘醇駿…遍）、 聚己内醋、聚（己_旨共·乳酸）（PCLA)、殼聚糖、藻酸鹽、 透明質酸、明膠及纖維蛋自。在本發明_較佳具體實例中， 該生物可降解性高分子材料為PLGA或殼聚糖。 層黏蛋白係所有基底膜的一種主要成分。基底膜為分隔 層黏蛋白可藉由熟習本技藝者所熟知之方法，由例如基 底膜及人類胎盤等材料萃取。該等萃取技術及有關層黏蛋白 更詳細的討論述於Rupert Timple等人之「層黏蛋白」乙文 ("Laminin," Methods of Enzymology - Structural and HC0008TW 9 1319980

Contractile Proteins, Part A. Extracellular Matrix, Vol. 82. Chap. 47, pp. 831-838, Academic Press, (1982))及 HyndaK. Kleinman 等人之「層黏蛋白之生物活性」乙文（，，Bi〇1〇gicalActivities〇f

Laminin, Journal of Cellular Biochemistry, Vol. 27, pp. 317-325 (1985));兩者之内容皆以如同全文揭載之參考方式併入本文。 一般而言，本發明導管之内直徑位於約1〇〇 μιη至約2〇〇〇 μηι之範圍内。較佳者，本發明導管之内直徑為約57〇。導 管之管壁厚度代表所需可通透性及壓縮強度間之平衡，以避 免崩陷。較佳係將導管製作為4可能地薄，但在活體内使用

時仍能禁得起鏠合及祕。導管的適#管壁厚度位於約W mm至約1.5 mm之範圍内。較佳者’本發明導管之管壁厚度 介於約1 mm至約丨.2麵之間。導管之長度依欲 = 間隙長度而有所不同。 设心砰、，丄 …本發明亦提供—種製造層黏蛋白改質導管之方法，該導 裂:==内-，其斷 化冋刀子表面俾與層黏蛋白騎；及 兩 導管:it: ’用於製造本發明層黏蛋白改質導管之中* 構成之導管H ，了降解“刀子材料所 J視而要以任何已知方法製造該中空導

HC0008TW 1319980 管’例如 Flynn 等人述於价24: 4265-4272 (2003)中 之纖維模板壓製法，以及Sundback等人述於5ζ·(^ύ^π·α/$24: 819-830 (2003)中之低壓注射模塑法；兩者之内容皆以如同全 文揭載之參考方式併入本文。 在本發明一較佳具體實例中，該中空導管係依

Huang 等 尺遂於 J. Biomed Mater Res Part B: Applied Materials Ί 659-664 (2005)(内容以如同全文揭載之參考方式併入本文） 中之凍乾及金屬絲加熱法製造。簡言之，將基質（如殼聚糖） /谷液注入包含一金屬（如Ni_Cr)絲作為軸心之模具中；將該 包含基質溶液之模具置入液態氮中；冷凍後，將該模具由液 態氮中移出，並對該金屬絲施加電壓以加熱之；一旦包圍該 金屬絲之基質略為融化，將該金屬絲抽離基質以在基質中創 ie縱向之通道，可藉由珠乾法移除溶劑，以形成具縱向通 道之導管。較佳者，用於製造本發明層黏蛋白改質導管之中 空導管係以殼聚糖或PLGA製成。 電聚可概略定義為包含帶電及中性物種之氣體，包含下 列中之某些：電子、正離子、貞離子、游離基、原子及分子。 電漿處理係改質聚合物表面之常財法。可施加該等表面改 質以達成各種目的’例如在表面產生特別的官能基，俾與其 他官能基進行特定交互作用。有術之詳盡討論提供 於C. M. Chan等人之加加ee(19 (内容以如同全文揭载之參考方式併入本文） 乙文中。 依據本發明，欲私高分子物件之電漿處理，係使該物 件與欲用於處理之氣體接觸，並施加足以將該氣體離子化至

HC0008TW 1319980 :=r任之高_射。 合物鏈中之心μ 機制，減可解離聚 ag處《/、賈鍵以形成與彼此或與電漿氣體本身中之自由 土，、、之由基’藉以活化與電聚接觸之聚合物鍵。 心：:二】之氣體’例如氬、氧、氮、氟、二氧化碳及水， ΰ 〜用所需之獨特表面特性。依據本發明， ^中空導管之_«為〇2或含〇2之顏„。已知^ 漿可與範圍廣泛之聚合物反應而在表面產生各種氧官能 ί雷、CK)、。心。及c。3。相信聚合物表面上由 氧電漿所產生之氧官能基與層黏蛋白之媽基反應，造成層 黏蛋白結合於導管之管腔表面。 本發明㈣處理之效果碰料㈣於產生電漿之氣體 種類’亦取决於操作條件，例如功率密度、暴露時間、工作 塵力、、氣體流速、溫度、電極間距、氣室容積、基材偏置電 壓、，該等條件之組合^依據本發明，使用由約2至約_ W/cm範圍之功率密度（以欲處理表面每單位面積之瓦特數表 不）可獲㈣佳結果。在本發明—較佳具體實例中，所用功 率密度為約50 W/cm2。本發明中所用之電漿較佳為健電 聚，亦即氣壓範圍由數微托耳（mT〇rr)至數百托耳。依據本 發明，使用由約0 mT〇rr至約80 mTorr範圍之壓力可獲得最 佳結果。在本發明一較佳具體實例中，所用壓力為約弘 _ΓΓ。暴糾射選㈣5簡1G分鐘之間，只要電聚處 理足以活化聚合物表面而孩於顧高分子材料之顯微結構 即可。在本發明-較佳具體實财，暴露時間制5分鐘。 HC〇〇〇8Tff 12 1319980 〃他處理條件（例如溫度及氣體流素）為可變因素，對本發 明之新穎性及實用性並非關鍵。 w依據本發明’可透過任何適當方法達成經電漿處理之導 嘗ΐ腔表H黏蛋白之接觸。例如，可將含適當濃度層黏 蛋ΐ之溶液添加至導管。該層錄白溶液之量毅以浸沒該 •導官。層黏蛋白及高分子表面間形成共價鍵之反應條件（例 相及/JDL度）取決於聚合物種類’熟習本技藝中-般技術 _者鑑於本發明揭示’無須過度實驗即可決定之。在本發明一 具體實例中’係於4°C下將導管浸泡於2〇〇 μ1之1〇〇从咖 層黏蛋白溶液中3小時。 本發明進一走提供一種促進斷裂哺乳動物神經之活體内 再生崎橋接錢裂兩關之_之方法，包含使該斷裂神 經之兩端分別接觸-中空導;I；之兩端，該導f包含由生物可 降解性高分子材料所構成之管壁，該管壁之管絲面共價鍵 結有層黏蛋白，其中該層黏蛋白之鍵結係經由氣體電漿處理 _ 而達成。 . 本發明之層黏蛋白改質導管適於在PNS及CNS中橋接斷 . 裂神經並促進神經再生及功能復元。使用時，使斷裂神經之 兩端分別接觸本發明導管（其略長於欲橋接之間隙）之兩端， 但不在斷裂神經上施加任何張力。將遠端及近端之神經殘根 部分地插入導管令。由於該導管具有彈性，其不需縫合即可 維持於間隙申。然而，亦可視需要將斷裂端之神經束膜與導 管縫合。 實例1層黏蛋白改質高分子薄膜之製備與定性 HC0008TW 13 j319980 1,1高分子薄膜之製備 、 製備兩種高分子薄膜。有關PLGA (聚(乳酸-共-甘醇酸)) • 、’係以溫和攪拌將購自Sigma化學公司（Sigma Chemcial Co·’ USA)之 PLGA ( 50 : 50 ; Mw·· 40,000〜75,000)溶解於二 ‘、、、元中製成5% ( wt/vol)之溶液。然後，將250 μΐ之該溶 • 液添加於96孔培養盤中，浸泡其底部。於室溫下使溶劑蒸發 而得到乾燥PLGA薄膜。 φ 、有關殼聚糖薄膜’則使用殼聚糖/醋酸溶液（2% w/v)取 代之。去乙醯化程度>85%之殼聚糖（分子量：645，⑻〇)係由 Sigma化學公司供應。醋酸（98%)係購自和光純藥工業株式 會才其後之方法與PLGA薄膜相同。使用MilliporeMilli-R〇 lOPlus過濾系統，於18ΜΩ之電阻下將水蒸餾及去離子化。 1,2高分子薄膜之層黏蛋白改質 為使PLGA薄膜具有親水性及化學活性，首先將 薄膜以氬電漿處理1隸處理係於—勒放電石英反應器 φ (型號：SP100 Plasma System;製造商：Anatech Co. Ltd.，USA ) . 巾的兩個平行電極板間進行。將電漿電源供應器設於5’〇 W及 13.56MHz之頻率。將基材面朝上地置於接地電極上，暴露於 36微托耳氬氣麼之輝光放電下分鐘，俾供隨後之層黏蛋白 (L-2020 ; Sigma，St. Louis，MO)偶合反應。然後，將 2〇〇 μ1 之層黏蛋白溶液（100 pg/ml)添加至96孔培養盤中經電漿預 先處理過之FLGA薄膜上’置於代下3小時。偶合反應後， 以PBS緩衝液將層黏蛋白_pLGa薄膜清洗數次。使用bca 蛋白質分析套組（Pierce，RockfordIL)計算固定於plga表

HC0008TW 1319980 面上之層黏蛋白量。 首先以 1 : 1 之 0.1 M NaOH-MeOH 及 1 : 1 之 MeOH-水 清洗殼聚糖薄膜以中和酸性，然後風乾之。其後之方法與 PLGA薄膜相同。除了氬電漿外，本實驗中亦使用氧電漿。 為供比較’亦藉由下列化學方法進行層黏蛋白改質。首 先將200 μΐ之100 mM 1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二 醯亞胺氫氣酸鹽（WSC，39391，Sigma)添加至PLGA薄膜經 1小時以活化其羧基。以PBS清洗後，令該薄膜與200 μΐ之 層黏蛋白溶液（100 pg/ml)於4°C下反應3小時，隨後以PBS 缓衝液清洗數次。使用BCA蛋白質分析套組計算反應及pbs 清洗後之層黏蛋白量。 為製備化學改質之層黏蛋白-殼聚糖薄膜，首先需將羧基 導入殼聚糖中。於室溫下依序添加20 wt%NaOH (約50 μΐ) 及10 wt%單氯乙酸溶液（約200 μΐ) ’直到pH為7.4 ± 0.2。 之後以PBS將薄膜清洗數次。其後之方法與層黏蛋白-PLGA 薄膜相同。 將層黏蛋白改質聚合物薄膜分為五組：（1)薄膜於4°C下 之100 pg/ml層黏蛋白中浸泡3小時’然後以PBS清洗三次（物 理性地吸附於薄膜上之層黏蛋白：Lphys);(2)薄膜在添加WSC 活化羧基後，於4°C下之iOOpg/ml層黏蛋白中浸泡3小時， 然後以PBS清洗三次（透過物理吸附及化學鍵結而固定於薄 膜上之層黏蛋白：Ltot) ; (3)薄膜經02或Ar電漿處理後浸泡 於100 pg/ml層黏蛋白中（L02及LAr);⑷空白薄膜；及(5) 作為對照組之培養皿。固定於薄膜上之層黏蛋白百分比係使

HC0008TW 用下式計算： P% =( A 料蛋白/A。）X 100% 其中 A層黏蛋白 為固定有層黏蛋白之薄膜之吸收度，而A〇為100 Hg/ml層黏蛋白之吸收度。 為確認是否已成功地將層黏蛋白接枝於PLGA及殼聚糖 表面’採用BCA蛋白質分析計算層黏蛋白之量。依據表1， 固定於PLGA上之層黏蛋白百分比高於殼聚糖上的。此外， 該等結果亦顯示大多數層黏蛋白係藉由物理吸附固定於薄膜 上。至於電漿處理，在兩種材料上〇2電漿之效能皆顯著高於 Ar電漿。藉由化學方法固定於PLGA上之層黏蛋白百分比幾 乎等同於使用〇2電漿處理。PLGA薄膜上之層黏蛋白量為41.3 Hg/ cm2 ’但就層黏蛋白-殼聚糖薄膜而言，〇2電聚處理之效能 更咼。殼聚糖薄膜上之層黏蛋白量為30.6 pg/ cm2。由於其低 機械強度，殼聚糖薄膜在水溶液中會膨脹，這使得藉由化學 方法之層黏蛋白改質難以控制。综上所述，相較於傳統上使 用之化學方法，〇2電漿係較佳之表面改質方法。 表1 以BCA分析測定之固定於兩種薄膜上之層黏蛋白百分比

Lt〇t L〇z L/vr PLGA__45.5%_66.1%_64.4%_51.1% 殼聚糖 33.3%_37.8%_48.9%_37.8% 1.3改質表面之定性 使用傅立葉轉換紅外線光譜儀（FTIR)進一步定性所有 薄膜之表面改質。所有圖譜係於4/cm之解析度及16次掃描 下收集，並以内建之標準套裝軟體（Perkin-Elmer Spectrum One， Perkin-Elmer Co.，Norwalk，CT，USA)分析。 HC0008TW 16 1319980 圖1顯不薄膜之FTIR吸收圖譜。有關層黏蛋白·pLGA薄 膜’吸收圖譜上位於之峰由於酿胺基(_c〇_NH_R)而 -顯著增加。另一位於㈣^之峰則是由於酿胺基叫肌) 及胺基(-CH2NH2)。由於烷基的存在，在PLGA薄膜上有該等 峰之吸收值。有關殼聚糖及層黏蛋‘殼聚糖薄臈，位於1564 cm·】至1649 cm·1之峰比例顯示出顯著的增加。位於丨⑽⑽-! 之吸收峰指出醯胺基及胺基的存在，但只有醯胺基可在1564 鲁cm·1吸收。兩辦的百分比改變指出醯胺基的形成以及胺基的 破壞。換言之，層黏蛋白已成功地固定於PLGA及殼聚糖薄 膜上。 此外，藉由高解析X光光電分光鏡（XPS，V(} MICROTECH，MT-500, U.K·)織PLGA及殼聚糖薄膜之表 面化學組成。圖譜係以單色Mg-Ka輻射源（ 1253.6 eV)於400 W之功率下得自VGEscalab22〇i_xl分光鏡。使用配備有9頻 道偵測器之CLAM4MCD電子分析器。以2〇eV之穿越能記 鲁 錄 Cls 峰區（275 - 295 eV)及 Nls 峰區（390-415 eV)之高 - 解析精密掃描。由相應峰區計算各種Cls及Nls峰之濃度。 • 採用高解析XPS測量研究薄膜在層黏蛋白改質前後之表 • 面化學變化。有及沒有層黏蛋白之PLGA薄膜之Cis區顯示 出二個峰（圖2 (a))。第一個峰（284.5 eV)係歸因於脂族碳 鍵（-c-c-)或碳遗鍵（_CH)之Cls。第二個峰（287 5 eV) 係歸因於鹎鍵（-C-0-)及-C-N鍵之Cls，而第三個峰（289 6 eV)則係歸因於類羰基種類（亦即-COO-、>〇0或-COOH) 之Cls。然而，三種Cls之相對組成在層黏蛋白附著後即有所

HC0008TW 17 1319980 改變（如表2所示）。可觀察到兩種不同的特徵。第一，_c〇 及-CN鍵的比例增加至13.7%。第二，脂族破鍵或碳·氮鍵的 比例増加至80.3%。第三，謎鍵的比例減少。-COO-鍵及-COOH 鍵的減少以及-CN鍵的增加可能是筆因於酯鍵的切割以及醯 胺鍵或胺鍵的形成。Nls XPS圖譜上-N-H鍵及-N_C-鍵的增加 亦支持此推論（表2及圖2 (b))。這顯示層黏蛋白與j>lgA薄 膜間形成了共價鍵。有及沒有層黏蛋白之殼聚糖薄膜之Cls XPS圖谱不於圖2 (c)。-C-N-鍵及幾鍵顯著增加，而<·η鍵及 -C-C_鍵則減少（表2)。該等結果可能肇因於脂族碳鍵或碳_ 風鍵的破壞以及醯胺鍵的形成。如同FTIR吸收圖譜所示，XPS 圖譜顯示層黏蛋白係共價鍵結於殼聚糖薄膜上。由於殼聚糖 及層黏蛋白·殼聚糖薄膜中皆存在有鍵及鍵，Nls XPS圖譜未出示於此。 表2 樣本在層黏蛋白固定化前後之 高解析Cls XPS及Nls XPS峰之碳官能基比例 樣本 (Cls)284.5eV -C-H,-C-C-(%) (Cls)287.5eV -C-0-,-C-N(%) (Cls)289.6eV ~COO-，>C=0， -COOH(%) (Nls)399.4eV -N-H,-N-C-(%) PLGA 72.4 12.6 14.1 0.5 層黏蛋白-PLGA 80.3 13.7 3.5 1.1 殼聚糖 84.3 12.8 — 層黏蛋白-殼聚糖 68.5 26.8 2.34 — 14許旺細胞在改質表面之附著及增生 以許旺細胞（SC)培養確認層黏蛋白改質薄膜之細胞親 和性。使用J. P. Brockes等人於165: 105-118 (1979)中φζδ義之方法單離並培養來自雌性wistar大鼠之許旺 細胞。簡s之’以過量麻醉將成年雌性Wistar大鼠犧牲。切

HC0008TW 18 1319980 除左及右坐股神經，以磷酸鹽缓衝生理鹽水（PBS)清洗之， 並切成 1 mm 長之小塊。於 3 ml DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)中以0.03%膠原蛋白酶/0.25%胰蛋白酶對該等 • 片段作酵素消化處理，並置於370C下之5% C02中30分鐘。 靜置後，於2000 rpm下離心該等片段並移除上清液。以針機 械性地分離神經束膜。將初代細胞懸浮液平板培養於培養皿 中含10%熱去活化胎牛血清（FBS)及1%抗生素（盤尼西林_ 鏈黴素溶液及兩性黴素B)之DMEM中。每週兩次替換培養 • 基’且每週一次將個別神經片段轉植於新培養皿中，俾提高 細胞懸浮液之細胞濃度。然後，將懸浮後之2χ1〇4細胞/ml之 許旺細胞接種於含2 mi DMEM培養基（含10% FBS)之96 孔組織培養盤中，以測試各種pLGA及殼聚糖薄膜在許旺細 • 胞生長上的效果。 使用掃描式電子顯微鏡（SEM)及光學顯微鏡（〇lympus 1X70)進行許旺細胞之外觀形態評估。有關SEM觀察，需以 鲁 了列方法將所有樣本固定及脫水。首先，將pLGA及殼聚糖 薄膜浸泡於2%戊二藤（於PBS中）中1小時以固定之。然後， 使㈣於观之—系列濃度上升乙醇溶液將薄膜脫水。然後 以臨界陳賴（CPD)將樣本賴。财樣本以金包覆後以 SEM檢視。SEM所得結果未出示於此。 藉由前述紐純化造成了高度純化之％培養物（圖3 大多數細胞向外延伸並轉型為紡錘形狀，雖然亦有一些 細胞=出部分㈣之外型，表示該等細胞尚未完全附著。一 種後第1天時，附著至改質薄膜之大多數SC顯示出

HC0008TW 1319980 小的片狀偽足（lamellipodial)延伸物（圖3 (b)及(c)，左半部）。 在第3天時’經〇2電漿處理之層黏蛋白_殼聚糖薄膜上的大多 數細胞向外伸展或轉型為紡錘形狀（圖3 (的及卜），右半部）。 在未經電漿處理之層黏蛋白_殼聚糖薄膜上，即使經過一段長 時間後許多細胞仍未完全伸展。歷史上，sc曾被描述為紡錘 形狀。然而，之後發現雖然許多經培養之8(：具有此特徵之紡 錘形外觀形態，某些卻具有較扁平（類似纖維母細胞）之外 觀形態。 使用 MTS 分析（CellTiter 96™ Aqueous, Promega)定量 細胞活性。在各時間點，將40 μ1 MTS試劑及600 μΐ培養基 添加至各孔中。將培養盤置於37°C、5% C02下4小時。以 UV/VIS 光譜儀（Lambda 20, Perkin Elmer)測量波長 490 nm 之吸收度’並取讀值之平均值。由數據減去培養基之吸收度 指數以校正背景吸收度。 改質薄膜之附著細胞量各有不同（圖4)。在接種後第10 天時，附著於經02電漿處理之層黏蛋白-殼聚糖薄膜之細胞數 量顯著高於其他薄膜。此外，由計算改質薄膜上細胞存活度 之圖表亦獲得相同結果。 1.5 結論 本研究顯示使用氧電漿作表面改質較易控制、更為簡易 且更加有效。相較於傳統之化學方法，藉由電漿處理而併入 殼聚糖薄膜上之層黏蛋白百分比顯著較高。大多數層黏蛋白 係藉由物理吸附而吸附於薄膜上。使用FTIR及XPS，顯示層 黏蛋白係固定於兩種薄膜之表面。XPS圖譜之結果指出層黏 HC0008TW 20 1319980 蛋白與表面間形成了共價鍵。殼聚糖及/或PLGA表面上之層 黏蛋白對於許旺細胞之附著及親和性有很大效果。該等成功 的結果被認為對導引週邊神經再生十分重要。 實例2 由層黏蛋白改質神經導管媒介之外傷性脊髓損 傷（SCI)後功能復元 2·1材料 具有約645,000之平均分子量之殼聚糖係由Sigma化學公 司供應。由1H-NMR光譜決定去乙醯化程度（DDA)為82.5 士 1.15%。氧化氘（d20，L-4501 )及氣化氘（DC卜 35wt°/〇於 〇20 中）係購自 Sigma-Aldrich (USA)。醋酸（98%，和光純 藥工業株式會社）及Ni-Cr絲（570 um)係依常規使用。除非 另外記載，所有其他化學品及溶劑均購自Sigma-Aldrich (Oakville，Canada )並依常規使用。水係使用Millipore Milli-RO 10 Plus過濾系統，於18 ΜΩ之電阻下予以蒸顧及去 離子化。 2.2 去乙酿化程度（DDA)之分析 DDA為96.4 ± 0.72%之殼聚糖之合成，係將市面可購得 之82.5 ± 1.15%去乙醯化殼聚糖片浸泡於11〇。(：下之40%氩 氧化鈉水溶液中2小時。使用b-NMR光譜（Bmker AV400 MHz)’依據經修改之公開方法（見L. Vachoud et al.， 及從 1997; 302: 169—177 ;及 M. Lavertu et al., «万 2003; 32: 1149-1158)決定殼聚糖樣本之DDA。簡言之， 樣本之製備係於室溫下攪拌由1.96 ml D2〇及0.04 ml DC1組 成之溶液中之10 mg殼聚糖’等待約半小時以確保該聚合物 HC0008TW 21 1319980 7L全溶解。在所有情況下，聚合物在溶液中之濃度均為約〇5% (w/v)。DDA之計算係如前所述般，比較H1或H2-H6之訊 號組與甲基之訊號之積分面積。 圖5顯示70。C下不同DDA之殼聚糖之400MHzIHNMR 圖譜。藉由鹼水解成功地調整了殼聚糖之DDA。對於修復較 長之神經缺陷而言，支架之吸收率亦十分關鍵。控制殼聚糖 之去乙醯化程度可調節吸收率及機械強度。FrderT.等人顯示 去乙醯化程度較高之殼聚糖具有較低之降解率、較高之機械 強度及細胞存活度（Freier T. et al.，似则阶/此26: 4624-4632 (2005)，及 Freier Τ· et al.，说⑽加奶·此 26: 5872-5878 (2006))。 2.3層黏蛋白改質神經導管之製備及定性 神導g·係以;東乾及金屬絲加熱法（γ C Huang et al.， 2〇〇5，同上）製造。簡言之，使用（57〇um)作為軸 心材料。將殼聚糖/醋酸溶液（2% w/v)注入裝滿軸心之模具 中。然後將該具軸心架構之模具置入液態氮中。一旦冷珠後， 增加電源供應器（Tai Yee Shing，Taiwan )之電壓以加熱該 Ni-Cr絲。當電源被開啟時，儘速（通常少於一分鐘）將金屬 絲由冷凍之支架抽出。以鉗子直接抽取即可輕易將金屬絲個 別移除。然後，使用一溫度控制凍乾機（VirTis，NY，USA)使 醋酸昇華。凍乾後’首先以1 : 1 〇·1 MNaOH-MeOH及1 : 1 MeOH-水清洗神經導管以中和酸性，然後再次以凍乾機乾燥 之。最後，將神經導管貯藏於乾燥環境下直到使用時。使用 銳利的手術刀片將導管切割為所需長度。 為使該等神經導管具親水性及化學活性，首先以氧電黎 HC0008TW 22 1319980 處理之。電漿處理係於一輝光放電石英反應器（型號：SP1〇〇

Plasma System ;製造商：Anatech Co· Ltd., USA)中的兩個平 行電極板間進行。將電漿電源供應器設於5〇W及13.56 MHz ' 之頻率。將基材面朝上地置於接地電極上，暴露於36微托耳 氧氣壓之輝光放電下5及1〇分鐘，俾供隨後之層黏蛋白 . (L·2020 ; Sigma，St. Louis, MO)偶合反應。然後，將 2〇〇 μ1 之層黏蛋白溶液（100 pg/ml)添加至經電漿預先處理過之導 管上，置於4°C下3小時。偶合反應後，以PBS緩衝液將層 黏蛋白改質神經導管清洗數次。 以光學顯微鏡（Olympus 1X70, Japan )定性該等層黏蛋白 改質神經導管之外觀形態。使用蘇木紫/伊紅（H&E)染色法 以更清晰地描繪支架。為顯現以電漿技術製備之神經導管中 .之蛋白質分布，依據上述方法製備導管之代表性樣本，但使 用若丹明-BSA (紅色螢光）取代層黏蛋白。製備後，以pBS 緩衝液沖洗通道，並使用共軛焦顯微鏡（TCS SP2, Leica，Maj0I> φ Instruments Co.，LTD)於螢光模式下觀察之（圖6Α)。 • 如圖6Α所示，蛋白質主要局部化於神經導管内部。此 外’連續照片亦顯示蛋白質似乎分布於整個通道壁（數據未 出示）。層黏蛋白局部化於通道壁之内部應可幫助神經再生， 因為層黏蛋白可幫助許旺細胞附著並導引神經突生長。在活 體内，這可能導致軸突再生於通道中並增進再生能力。 為觀察神經導管經氧電漿處理後顯微結構的改變，螢光 及相反差影像示於圖6Β。結構被破壞得愈嚴重表示電漿處理 時間愈長。此外，以電漿處理1〇分鐘，蛋白質就穿透了整個 HC0008TW 23 1319980 支架。該#結果顯示處理時卩林纽長會導致支架失去其顯 微構造。這可能使軸突再生的導引失去方向性。 2.4外科手術程序及動物護理 下歹J研九中使用成年250 g雌性SpragUe_Dawley大鼠。 所有涉及祕之程耗㈣北榮民總醫院動物委貞會許可。 將大鼠之㈣於T8處完全切斷並移除5 mm之賴組織。將 殼聚糖導管植入該斷裂脊髓之5 mm間隙中。在指定之受傷後 時間（1或2個月）’給予大鼠過量之麻醉劑戊巴比妥納。有 關組織切片染色，收集傷處頭側丨公分長之一節脊髓樣本。 對大鼠依序灌輸生理鹽水及4 %緩衝多聚甲醛（p FA )，並使固 疋（PFA中1小時）後之脊鑛通過蔬糖梯度。將脊趙包埋於 OCT Tissue Tek封片媒介中並於冷凍切片機中切割之。製作 10 mm連續冠狀冷凍切片並貯藏於_2〇〇c下。 2.5行為分析 為確保所有實驗動物均受到相似程度之傷害及監測復元 率，依據Basso、Beattie及Bresnehan移動試驗（BBB)及合 併行為分數（CBS )測試大鼠之功能缺失（D M Bass〇技d / 12: 1-21 (1995))»BBB係測試開放空間移動時的 姿勢、重量支撐及協調性。CBS包含一套反射試驗，包括針 對伸展、壓力及疼痛所反應之腳趾張開、置放及回抽；被敌 置於熱燙表面時舔其腳掌之反射動作；以及運動功能之協 調，包括開放空間移動、游泳及在傾斜平面上維持位置之能 力。 圖7A顯示兩個實驗組之BBB及CBS開放空間行走之平 HC0008TW 24 1319980 均分數。依據紀錄代表動物之開放空間移動之影片，以層黏 蛋白改質神經導管及未改質神經導管介入之受傷後肢均具有 復元潛力。兩組之B B B分數並未顯示顯著之功能復元，但c B s •分數達到了約8〇的穩定平均值，這指出行為改善的開始。相 較於使用未改質神經導管之組別，使用層黏蛋白改質神經導 管之實驗組得到較佳的結果。 以跑步機分析進一步測試大鼠之功能復元。在本研究中 癱使用Robomedica，Inc.所售之自動機式大鼠踏走機（R〇dent 攀Robot)。該自動機可抽樣體重支撐（BWS)水平及大鼠之小 腿位置，並將該等測量值以100Hz之數位形式儲存於機器控 制電腦之儲存碟中。大鼠之小腿位置係由高度精確製造之自 動機關節角度、轉輪及光學編碣器之測量值計算，準確性小 •於1.〇 mm。在導管移植後14、28、35及7〇天時，對sa大 鼠進行大鼠踏步能力之詳細評估。紀錄時，令未裝置自動機 之大鼠在75% BWS下於跑步機上踏步3〇秒。然後令後肢裝 φ 置有自動機之大鼠在四種固定水平之BWS(75、50、25及0%) .下踏步3G秒。麵有鱗及職躺，騎記錄矢狀面之後 •肢運動。使用兩種結果測量值評估大鼠在測試日之踏步能 •力。首先，使用腳步偵測演算法計數各大鼠在各Bws水平下 所表現之腳步數。該演算法可辨識水平速率方向之改變而指 出腳趾離地及腳趾著地事件。設定最小及最大走長、踏步時 間及速率之限制。包含至少—項超出該等限制之參數的腳步 即被認為代表短暫反射或大回抽動作而不是腳步，因此由分 i除之第一種用於評估踏步能力之測量為，對測試期 HCOOOSTff 25 1319980 ==數=步品質評估。每次分析係評估sa大 1 纽運域力。評估者孙道大鼠的 訓練組別（亦㈣定之BWS、峡之麵或未訓練）。^ 汗估踏步能力外’亦調查對漸減之BWS所反應出之踏步空間 及時間特徵。以腳步偵測演算法將自動機執道戴切為個二腳 步，然後予以分析以決定步長、步高及台腳趾姿勢，以及作 為BWS函數之踏步週期、搖擺及站立時間（J A Nessieretai，

IEEE Tmns Neuml Syst Rehabi! Eng 13(4): 497-506 (2QQ5)) 〇 ’ 如圖7B所示，受傷後兩個月時之跑步機分析可指出腳底 踏步之改善。因此，吾人推測兩種導管均使動物功能有所復 元。然而，由跑步機分析證明之踏步改善可能是由於難以分 辨之肌肉或神經功能。因此，得自BBB、CBS及跑步機分析 之結果可暗指行為改善之傾向。這就是為何在以下實驗中進 行免疫組織化學及組織學分析之原因。 2.6 免疫組織化學分析 對所有脊髓進行組織學及免疫組織化學分析以幫助釐清 功能復元。對動物灌輸4%多聚曱醛（於磷酸鹽緩衝液中）。 收集脊髓，浸泡於4%多聚甲醛（於磷酸鹽緩衝液中）中隔夜， 然後轉移至30%蔗糖溶液中。將脊髓之水平或橫截冷凍切片 (20 μπι厚度）置於以聚-L-離胺酸塗覆之載玻片上俾供免疫 染色。以目標抗體處理切片，以PBS清洗之，然後以與螢光 團共軛之二級抗體、或依次與生物素及與鏈黴親和素共軛之 螢光團偶合之二級抗體（為增加敏感度）處理之。或者，在 初級抗體處理後，可以ABC混合物（Vector lab)處理切片， HC0008TW 26 1319980 隨後以DAB錢處理使過氧化賴影， 顯現；或使用Ve伽lab之套組使想要之發色團己物 圖A中所示T5至T10之脊髓影像代表受傷後 :蛋白改質組’係得自叫數接近各組平均值=?: =域中之大量微管蛋白細陽性細胞指出找料多細胞^ 陽性染色顯示巨仙胞滲透傷處並移除了抑制性 巨嗟細胞亦可產生細胞激素以增進軸突 ㈣突再生之直接證據’使用GAp_43 —種在再生軸突$ =椎内受到向上調節之蛋白質。使用抗_GAIM3作為初級抗 以西方墨點分析確認GAP-43之存在。有關西方墨點分 析’由大鼠之脊髓移除1〇個切片。於室溫下以丨mL之5〇 =C1將該等切片處理1G分鐘，然後以1X PBS清洗之並於 至溫下以1 mL之50 mMTris-HCl (PH7.4)處理10分鐘" 然後再以1XPBS清洗之。將脊髓切片浸泡於1%Np_4〇水解 緩衝液中以萃取蛋自質樣本，細Bmd触蛋自質分析偵測 之。將等量之蛋白質裝填於—3 5_12 5%梯度之舰_廳£凝 膠上。依據標準程序進行電泳並將蛋白質轉移至一 pvDF膜 上，以抗-GAP-43作為初級抗體處理該膜。然後以HRp_共軛 二級抗體處理該膜，與SuperSignal Chemiluminescent受質 (Pierce，Rockford，IL)反應’最後將訊號捕捉於軟片上。使 用imageJ (NIH)定量GAP-43陽性條帶之相關光學密度。 不於圖8B之GAP-43陽性條帶相關光學密度提示可能存 在有一再生發生輪廓之組成分。相較於未改質組，層黏蛋白

HC0008TW 27 1319980 雖然在外傷性SCI後神經導管媒介了神經再生，可藉由 I能的再生途徑予以補強。由T5至T1〇取得橫截切片沿箸 脊趙中線通過損傷中心點地_縱向切片（圖8〇。圖％⑷

« :紅色框_兩幅影像為受傷區域。遍佈於通道及支架的大 量微管蛋白陽性元素進—步提示細胞生長的可能機制。除了 導g之通道外’多孔性的殼聚糖支架亦對細胞附著具有良好 親和性。圖8D中以GAP_43作免疫染色之影像係取自與圖叱 相同之會醜域。GAP_43陽性之結果顯示受傷後6()天時大 部分GAIM3分布於通道關。吾人提議神經導管之内表面可 能是軸突再生之最佳區域。 未改質神經導管對於抗C0X_2或〉周亡酵素_3抗體皆展現 免疫陰性染色（分別為圖8E (a)及(b))。在圖8E中，免疫^ 性染色之區域餘於初次受傷之，内，表示_成之組^ 並未產生發炎反應。圖8E (b)中之橫截切面係切自脊髓之T5 至ΤΗ)，神經導管位於Τ8。以壯酵素_3作免赦織學分析 以辨識細胞壯。令人振奮的是，陰性結果顯示在神經再生 期間並未發生細胞凋亡。 2.7 結論 使用氧電吾人已成功地將層勒蛋白併入神經導管之 内表面上。不當的延長電S處理時間會摧毀多孔性殼聚糖支 架之顯微結構。就動物模式實驗而言，得自接受神經導管移 植後BBB、CBS及齡機分狀絲暗树為改善之傾向。 HC0008TW 28 1319980 ED-1、微管蛋白沒ΙΠ及GAP-43之免疫陽性染色指出神經導 管可引導受損軸突延伸通過受傷區域。C0X-2及凋亡酵素_3 之免疫陰性染色指出神經導管不會誘發多餘之術後發炎反應 及細胞凋亡。藉由西方墨點分析，層黏蛋白改質組之GAp_43 光學密度較未改質組為佳。層黏蛋白確實增加了軸突生長效 率〇 • 熟習本技藝者當瞭解可針對上述具體實例加以改變而不 鲁 ♦離其廣泛之發明概念。因此，應瞭解本發明並不限於所揭 不之特定具體實例，而是意欲涵蓋本發明（其係以後附申請 專利範圍界定）精神及範圍内之修飾。 【圖式簡單說明】 上述發明内容及實施方式與所附圖式一併閱讀將更增瞭 解。為供闡明本發明之目的，圖式中所示具體實例為目前較 佳者。然而，應瞭解本發明並不限於所示之確切配置及手段。 在圖式中： • 圖1顯示由氧電漿處理所製備之層黏蛋白改質薄膜之 • 吸收圖譜：⑻未處理之PLGA薄膜；（b)層黏蛋^PLGA 薄膜，（c)未處理之殼聚糖薄膜；及(d)層黏蛋白殼聚糖薄膜。

★ ® 2顯7F由化學方法或氧電漿處理所製備之層黏蛋白改 質薄臈之xps ®譜··⑻由化學方法所㈣之躲蛋#_pLGA 薄膜之XPS Cls核心水平圖谱，其中左半部為未處理之PLGA 薄膜而右半部為層黏蛋白_PLGA薄膜；⑼由化學方法所製備 之層黏蛋白-PLGA薄膜之XPSNls核心水平圖譜，其中左半 部為未處理之PLGA _而右半部為層黏蛋白_pLGA薄膜； HC0008Tff 29 1319980 處理所製備之層黏蛋白姻糖薄膜之XPS cls 為層黏蛋白_殼聚糖薄膜。 膜而右半部 =_許旺細胞（⑹,微鏡照片：⑻培養於 上之sc之外觀形態；及接種後1及3天時附著於改質薄棋 «

^之％之外觀形態―⑻經及⑹未經氧電製處理之層黏蛋白、— 聚糖薄膜。 圖4包含圖4A及4B，顯示附著於改質薄膜上之sc之定 里結果。圖4A係接種後1〇天時附著於不同薄膜上之sc之 MTS試驗結果。接種細胞之數量約為lxlO5個細胞/孔。將三 種改質薄膜互相比較。圖4B顯示三種薄膜上細胞存活度之相 對比例。吸收波長為490 nm。「殼聚糖+電漿+層黏蛋白」： 經氧電漿處理之層黏蛋白-殼聚糖薄膜。「殼聚糖+電漿」：未 經氧電漿處理之層黏蛋白-殼聚糖薄膜。「殼聚糖」：只有殼聚 糖薄膜。 圖5顯示具有不同DDA之殼聚糖在7〇°C下之400 MHz hNMR圖譜：（a)經鹼水解之殼聚糖（DDA=96.4±〇.720/0); 及(b)市面可購得之殼聚糖（DDA=82.5 土 1.150/〇)。 圖6包含圖6A及6B。圖6A顯示併入若丹明-BSA之神 經導管，以螢光顯微鏡偵測（氧電漿處理：5分鐘）。圖6B顯 示併入若丹明之神經導管之橫截切片，其中(a)及(b)為螢光影 像，（c)及(d)為相反差影像。導管係經氧電漿處理5分鐘（a、 c )或 10 分鐘（b、d )。 圖7包含圖7A及7B，顯示行為分析之結果。圖7A顯示 HC0008TW 30 1319980 兩個實驗組之(a) BBB及(b) CBS分數，其中紅線代表使用層 點蛋白改質神經導管之組別，而藍線則代表使用未改質神經 導管之組別（所顯示之數據為平均值±標準差，n = 3)。圖7B 顯示接受未改質神經導管之動物之跑步機分析結果，（a)脊髓 損傷（SCI)剛發生及(b)受傷後兩個月時。 圖8包含圖8A至8E，顯示免疫組織化學分析之結果。 圖8A顯示損傷中心點處之層黏蛋白改質神經導管切片，以 (a-c)微管蛋白点m ( 一種細胞骨架標記物）及_ e叫（一 種巨嗤細胞標記物）作免錢色，其巾⑻及(d)之…位於丁5 ()及(e)之切片位於党傷區域’（c)及(f)之切片位於τιο。 圖犯顯示對GAP_43之西方墨點抗體反應性 二:=气改質組於受傷後60天時之微管蛋白染 組於受====。圖-顯示未改質 為縱向切片。@ 8E顯示未木色，:、中⑻為橫載切片及(b) 種標記物免絲色，1中質㈣受傷後6Q天時之其他兩

HC0008TW 31

Claims (1)

1319980 十、申請專利範圍： 1. 一種用於促進斷裂哺乳動物神經之活體内再生以便橋接 該神經斷裂兩端間之間隙之中空導管，該導管包含由生 物可降解性高分子材料所構成之管壁， 之管腔表面所界定之管腔，且該管壁之管腔表== 結有層黏蛋白，其中該層黏蛋白與管腔表面之共價鍵結 係藉由氣體電漿處理而達成。 u

2. 根射請專利範圍第丨項之中空導f，其中該生物可降 解性兩分子材料係選自由下顺成之群··騎蛋白、聚 (乳酸）、聚(甘醇酸）、聚(乳酸-共·甘醇酸）、聚己内醋、聚 (己内醋_共_乳酸）、殼聚糖、驗鹽、透明質酸、明 纖維蛋白。 / 3. 4.

5. 6. 根據申請專利第2項之中空導管，射該生物可降 解性高分子材料包含聚(乳酸_共_甘醇酸）。 根據：請專利範圍第2項之中空導f，其中該生物可降 解性高分子材料包含殼聚糖。 $申請專利制第〗項之中空導f，其中該氣體電聚 匕3 〇2或含〇2之氣體電漿。 一種製造雜蛋自改料管之方法，該 乳動物神經之活體内再生以便橋接該神經斷裂兩 鳊間之間隙，該方法包含下列步驟： (a)以-功率密度及—壓力之紐電漿，將—由生物 :降解性高分子材騎構紅巾㈣管處理充分時間， 化該高分子㈣之管絲面俾與輕蛋白鍵結；及 HC〇008Tff 32 7. 9. 10. 11 12. 13. 14. 15, 16. (b)以層黏蛋白接觸經活化之管腔表面充分時間， 俾使層黏蛋白與經活化之管腔表面間形成共價鍵。 根據申請專利範圍第6項之方法’其中該氣體電漿包含 〇2或含〇2之氣體電漿。 ，據:請專利範㈣6項之方法，其中步驟⑷中操作之 功率畨度係位於約2至約l〇〇 w/cm2之範圍内。 根據申請專利範㈣8項之方法’其中步驟(a)中操作之 功率密度為約50 w/cm2。 ，據申請專利範圍第6項之方法，其巾步驟(a)中操作 堅力係位於約0至約80微托耳之範圍内。 、 ^申請專利範圍第1〇項之方法，其中步驟⑷中操作之 壓力為約36微托耳。 6項^法’其中步驟(a)中之處理 f間係位於約5至10分鐘之範圍内。 睛專利範圍第12項之方法，其中步驟(a)中之處理 時間為約5分鐘。 專利範圍第6項之方法’其中步驟(b)包含將含 腔表面與層終白直接闕。 ^活化之& =申請專利細第14項之方法，其中該層黏蛋白溶液 /、有約100 gg/ml之濃度。 0 c**1 * 15項之方法，其中該導管係於約4 下在該層黏蛋白溶液中處理約3小時。 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該生物可降解性 HCOO〇8Tff 33 17. I31998〇 18. -種係選自聚(乳酸共-甘醇酸)及殼聚糖。 該神經斷裂=$哺乳動物神經之活體内再生以便橋接 19. 一種促進_^項之方法所製造。 經斷裂H ___再生以便橋接該神 裂兩端分難if社方法，财枝含㈣神經之斷 兩=刀別接觸根射請專·圍第1項之中空導管之 20. 一 種促進斷裂哺乳動物神經之活 經斷裂兩端間之間隙之方法，^生以便橋接該神 裂兩端分別接觸根據申請專利:圍第 斷 兩端。 叫乐丨8項之中空導管之 HC0008TW 34