TWI314582B - Methods for detecting papillomavirus dna in blood plasma and serum - Google Patents

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TWI314582B
TWI314582B TW090121621A TW90121621A TWI314582B TW I314582 B TWI314582 B TW I314582B TW 090121621 A TW090121621 A TW 090121621A TW 90121621 A TW90121621 A TW 90121621A TW I314582 B TWI314582 B TW I314582B
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Description

1314582 A7
1. 發明領蟑 本發明關於檢測人類或動物之血漿或 增生性疾病產生之特殊胞外核酸的方法。 贅瘤或 檢測來自伴隨人類瘤形成之人類病毒核酸，以關於 :濃縮病毒舰的狀況下以核酸放大法 蹤= 或幻青中胞外病毒核酸的方法。特別的是本發明 檢：血衆或血清中的病毒核酸參檢測、鐘定、或追縱= 病毒感染所造成之人㈣瘤減的存在 '進行或 。本發明可以檢射羅患贅瘤或增生性疾病或從&費= 增生性疾病病史或診斷之人類或其他動物企聚或血清中的 胞外病毒核酸。本發明特別提供早期鑑定伴隨致癌 乳頭狀瘤病毒亞型感染所造成之子宮頸惡性腫瘤、原位子 宮頸惡性腫瘤、子宮頸發育不良、子宮頸上皮内瘤形成 (CIN)及陰莖鱗狀細胞惡性腫瘤的方法。 2. j§關拮藝昔景 子宮頸惡性腫瘤是-種惡性折磨女性、源、自於頸部鱗狀 上皮的腫瘤。該疾病的自然史已廣為人知。大多數或至少 部分的病歷起因於子宮頸上皮組織的乳頭狀瘤病毒感染1 特別是特定的人類乳頭狀瘤病毒（HPV)亞型—包括Hpv亞 型16、18、31、33及35-常伴趟著子宮頸惡化，這些Hpv 感染似乎會改變上皮細胞使個體容易發展出癌症。病毒感 染所導致的上皮組織改變會先形成子宮頸惡性前期階段， 特別是子宮頸發育不良或子宮頸上皮内瘤形成（CIN)。子 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1314582 五 、發明説明（2 A7 B7
宮頸發育不良/CIN是辨識 '診 險之橋各一疋” ^斷及治療具發展子宮頸癌危 :婦女的.重要依據’因為外科摘除發育不良的上 可降低甚至去除子宮頸癌發展的危險。 ， ^過去數十年間，錢境内子宮頸惡性腫瘤的發生率已 私者的降低。—般而言’此現象歸功於例行的婦科醫學檢 驗及以子宮頸細胞學為基礎建立的巴氏子宮癌檢驗法檢查 :取得―點子宮頸上皮組織的碎片，然後塗抹在玻片上進 灯染色及顯微鏡檢查。這些步@可有效檢測出早期惡性前 期階段㈣瘤’通常是在醫學診所中由熟練的人員來進行 ，然後父由實驗室以技術人員或特殊的機器來檢測。然後 可由婦科學豕以外科摘除或破壞的方式移除受影響的子宮 頸，有效的降低惡性腫瘤發展的危險（雖然可能伴隨生育 困難或無法生育的問題）。不幸的是’巴氏子宮癌檢驗法 並無法偵測出所有的子宮頸發育不良或惡性前期疾病。常 見的可接受偽正反應（即根據一病理學家研究小組經過組 織活體檢測而非抹片樣品檢測出婦女確實具有發育不良的 症狀，但在例行抹片篩檢中並未診斷出病徵）比例約為 5-10% ’但最近的研究則認為實際比例可能更高些。再者 ’在約7-8%的案例中’巴氏子宮癌檢驗法可表示出無法 顯示重要性的非常型鱗狀細胞（ASCUS)。而在其他20-30% 的案例中，巴氏子宮癌檢驗法並不足以說明發炎細胞的存 在。 人類乳頭狀瘤病毒（HP V)是一種經常感染多種人類組織 的乳頭狀瘤病毒，包括子宮頸組織，子宮頸組織的感染常 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂 1314582 A7 B7 五、發明説明（3 ) 伴隨子宮頸惡性腫瘤的發展。因病毒感染造成的子宮頸組 織的改變並.無法以肉眼看見’但在顯微鏡下，病毒感染的 證據可藉由巴氏子宮癌檢驗法檢測上皮細胞核及細胞質的 改變而得知。然而，HPV的感染並無法在所有的子宮頸發 育不良/惡性前期疾病或即使子宮頸惡性腫瘤的病歷中檢 測出來。如上所述’至少在部分以巴氏子宮癌檢驗法檢測 惡性前期疾病的例子中是失敗的，其無法在子宮頸組織樣 品中檢測出HPV的感染。 _ HPV具有許多的亞型，可以藪種方法來區分這些亞型。 一種常用來評估人類暴露於特殊HP V亞型（包括伴隨子宮 頸癌者）的方法是以抗病毒亞型抗體來測試血清。不幸的 是’本方法可鑑定出曾經HPV暴露但無永久性感染以及具 永久性感染的個體，但其無法辨別感染中、永久性感染及 慢性感染的HPV感染。加以區別是很重要的，因為Hpv的 永久性感染常伴隨著最嚴重的子宮頸瘤形成發展危險性。 因為在10年内的感染暴露中’僅有少部分的婦女將發展出 子宮頸癌’而對大多數經暴露的婦女來說，主動Hp v感染 對子宮頸惡性前期疾病#屐的影響可予以去除（Chua et al·，1996, Int. J. Cancer έΐ: 54-59) » HPV抗體的血清學檢 測與子宮頸發育不良存在間的關聯性並不很好，因為他無 法區分出前HPV暴露與永久性HPV感染（Olsen et al.，1996,
Int. J. Cancer 68.: 415-419) 〇 第二種常用來篩桧婦女中特殊HPV亞型的方法為檢測雙 股DNA病毒基因組（如見Manos，美國專利序號5,7〇5 627 -6 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公釐) 五、發明説明（4 )
BaUer美國專利序號5,639,871 ; Bauer，美國專利序號 5,527,898 ;Ma刪，美國專利序號5,283，m ; ，美 國專利序號5，182,377; Gravitt et < ; CHn ίο· 3020-3027)。這些特別伴隨子宮頸癌發生的的亞型可 以核酸放大法來做專—性的放大與❹』，因而鑑定出具子 宮頸惡性腫瘤發展之高纽群的人目前用來檢測 dna的方法包含了直接評估子宮頸抹片樣本中的病毒dna (見SUverstein，美國專利序號」，814,448)。本方法並不方 便，因為檢測者可能錯過受感f的子宮頸部分，或感染病 變區可能不是位於表層並不易取得，這將使本檢測得到一 爲負反應結果。再者’此種檢測Hpv dna的方法需要進 行婦科檢查’這使得子宮頸抹片的爾檢測仍然是一種不 完美的篩檢一般女性族群的方法，因為這種檢驗受到許多 婦女的排斥即使醫學建議需進行檢測。 此外，HPV感染是一種性別轉移疾病，且男性可能成為 病毒之無徵狀帶原者。典型的子宮頸感染通常發生在性交 時，且促成其他性別轉移疾病的危險因子（未保護的性交 、多重性伴侶、免疫不全疾病等）亦可促成Hpv感染。男 性可能被-種或多種HPV亞型所感染，並能將一種或多種 病毒轉移予其性伴侣。雖然在多數的情況下男性僅做為病 毒感染的帶原者，但在相當少㈣料中，他們亦能發展 出陰莖的鱗狀細胞惡性腫瘤，類似於女性的子宮頸發育不 良及惡性腫瘤。在感染特定的HPV族群下，兩性皆可能發 屐出稱為尖型濕疣的且殖疣，這些病變亦可能屬於惡性前 13 ϊ 4582 五、 發明説明（5 ) 期者。直接的男十生尿道組織擦棒並不{一種有效檢測男性 族群帶原者的篩檢方法。 另-種用來檢測女性及男性中HPV DNA的方法為檢測 周圍血液中的HPV DNA。然而，在本領域中尚不清楚未 罹患癌症的個體血液中是否能夠檢測出乳頭狀瘤病毒dna 的存在。再者，在本領域中亦不清楚金漿及血清中是否能 夠檢測出乳頭狀瘤病毒，並做為永久性感染或發育不良或 惡性腫瘤危險的指標。 雖然有許多病毒可循環於血漿及血清中，但全身性循環 的胞外HPV DNA尚未在急性或慢性Hpv感染中被提及。 HP V感染通常有侷限於胞内上皮感染的趨勢，且通常不具 有全身性臨床感染的跡象。雖然在前期癌中，代謝性循環 子宮頸癌細胞及白血球内可檢出胞内Hpv的存在d al.，1999, J. Clin. 0nc〇i.以：1391_1396)，血液中胞外或游
裝 離HPV DNA的檢測卻未見報導。相反的，較早的研究認 為部分的病毒並無法在被感染的個體血液中被檢測出來。 以泡疹簡單病毒為例，其與HPV一樣屬於性別轉移病毒， 藉由黏膜接觸來傳播。在本領域中已知，雖然泡疹簡單病 毒可以在患有嬰兒性泡疹簡單病毒血症的嬰兒血清中發現 ，但在患有泡疹簡單腦炎之年齡較大的孩童血清中卻無法 偵測出該種病毒，即使病毒確實存在於這些孩童的腦脊髓 訂
液中（Kimura et al.，1991，j· Infect Dis 姐：289·293)。此 外，HPV不伴隨著全身性病毒血症，即使對病毒血症中曾 發現過的病毒來說，越接近起始感染時，檢測出病毒血2 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 1314582 A7 B7 五 發明說明（6 的機會將越大。這使得女性HPV病毒㈣檢充滿疑問及不 :實際’因未在多數的病歷中，任何的筛檢似乎在 路之初才能得到最好的效果。 * 本發月者之曾指出腫瘤-伴隨胞外核酸會循環於人類 及動物的血聚及*清中（美國序號08/81 8，G58，其全文在此 併入參考）。特別的是該專利文件指出腫瘤-伴隨DNA能夠 在：罹患癌症的人類及動物的血漿及血清中被檢出，使惡 性前期疾病可以被檢測 '診斷尽追蹤，並進一步對未罹： 癌症的個體加以分級區別或選蘀並根據血漿或血清中來： 突變致癌基因之DNA的有無來進行評估。 因此，極需要破認HPV專一性核酸是否能在血浆及血清 中被檢出，以及HPV核酸的檢測是否伴隨著子宮頸發育不 良或惡性前期疾病的存在。文中亦包含本改良的篩檢方法 優於婦科檢測及巴氏子宮癌檢驗法的說明。 發明招i潘· 本發明關於檢測人類或動物之血漿或血清中胞外乳頭狀 癌病毒核酸的方法。本發明方法包括了自血液、血讓或血 清中萃取核酸的步驟，特.別是放大萃取核酸的一部分，其 中該部分含有乳頭狀瘤病毒核酸或其片段，以及檢測乳頭 狀瘤病毒核酸或其片段放大產物的步驟。 在第一方面，本發明提供檢倒人類或動物之血液或血液 刀離物血漿或血清—中乳頭狀瘤病毒DNA的方法以檢測 、沴斷、追蹤、治療或評估瘤疾病，包括早期癌症、非侵 襲性癌症、原位惡性腫瘤、惡性前期疾病、侵襲性癌症^ -9 -
1314582 A7 ------------ B7 五、發明説明一·')~ --— 前f癌症。在這部分，本方法包含了自血液或血漿或血清 中萃取核酸.、放大部分DNA，其中該部分含有乳頭狀瘤病 毒DNA、以及檢測乳頭狀瘤病毒DNA放大產物的步驟。 本發明進一步提供檢測人類生殖泌尿道以外之體液中一 I^，不限制為全血、血漿、血清、滲出液、腹水、唾液 腦脊趙液、腸胃道分泌液及支氣管分泌液包括唾液—胞 外乳頭狀瘤病毒DNA的方法，以檢測、診斷、追蹤、治療 或#估瘤疾病’包括早期癌症」非侵襲性癌症、原位惡性 腫瘤、惡性前期疾病、侵襲性癌症及前期癌症。在這些具 體貫範例中’ s玄方法包含了自該體液中萃取Dna、放大部 刀DNA其中該部分含有乳頭狀瘤病毒DNA、以及檢測乳 頭狀瘤病毒DNA放大產物的步驟。 本發明進一步提供檢測人類或動物之血液或血液分離物 一包括血漿或血清—中乳頭狀瘤病毒rNA的方法以檢測、 | 0斷、追蹤、治療或評估瘤疾病，包括早期癌症、非侵襲 性癌症、原位惡性腫瘤、惡性前期疾病、侵襲性癌症及前 期癌症。在這些具體實範例中，該方法包含了自血液或血 漿或血清該中萃取RNA、利用酵素將RNA轉換成cDNA， 放大。卩分cDNA，其中該部分含有乳頭狀瘤病毒cDNA、以 及檢測其放大產物的步驟。 本發明進一步提g檢測人類生殖泌尿道以外之體液中— 包括但不限制為全血、血漿、血清、滲出液腹水 '唾液 、腦脊髓液、腸胃道分泌液及支氣管分泌液包括唾液—胞 外乳頭狀瘤病毒RNA的方法，以檢測、診斷、追蹤、治療 1______ _-ι〇- 本紙張尺度適用中圉國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公茇） ''— - 1314582 A7 __B7 五、發明説明（8 ) 或評估瘤疾病，包括早期癌症、非侵襲性癌症、原位惡性 腫瘤、惡性.則期疾病、侵襲性癌症及前期癌症。在這些具 體實範例中，肖方法包含了自血液或血聚或血清該中萃取 RNA'利用酵素將RNA轉換成(；1^八，放大部*cDna，其 中該部分含有乳頭狀瘤病毒cDNA、以及檢測其放大產 的步驟。 本發明提供一診斷套組來檢測血液或其他體液中的乳頭 狀瘤病毒核酸，其中該套組中多含了可專一性放大人類乳 頭狀瘤病毒DNA片段的引子，显進一步視需要含有試劑包 括鹽類、緩衝液、去氧核：y：三磷酸或其溶液，以及聚合酶 的製備，以具熱安定性之聚合酶最為理想，以放大人類乳 頭狀瘤病毒核酸片段。在替代具體實範例中，該套組進— 步含有鹽類、缓衝液、去氧核苷三磷酸或其溶液，以及酵 素的製備，以反轉錄酶最為理想，以將人類乳頭狀瘤病毒 RNA轉換成cDNA。 本發明進一步提供在不放大核酸的情形下，檢測血液、 血漿、血清或其他體液中的胞外乳頭狀瘤病毒核酸—包括 HPV DNA及RNA —以檢;iij、診斷、追縱、治療或評估惡 性或惡性前期疾病’包括子宮頸之惡性或惡性前期疾病。 在這些具體實範例中，該方法包含了自血液或血液分離液 '特別是血漿或血清一中萃取核酸的步驟來製備萃取出來 的核酸；特別是以探針來雜合萃取出來的核酸，其中該萃 取出來的核酸部份為乳頭狀瘤病毒核酸；及檢測經雜合的 乳頭狀瘤病毒核酸。在理想的具體實範例令，核酸的萃取 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公釐) 1314582 A7 -------- B7 五、發明説明（9 ) 可以與核酸的雜核反應同時進行。在理想的具體實範例中 該雜核反.應是在足夠嚴苛的條件下以探針專一性與乳頭 ^瘤病毒DNA進行雜合而不會非專—性的與非乳頭狀瘤病 毒DNA產生交聯雜核反應。 在本發明方法之理想具體實範例中，乳頭狀瘤病毒dna 是以選自含有下列群組之萃取方法自血漿或血清中萃取出 來的’這些方法包括了明膠萃取法；二氧切、玻璃珠或 矽，萃取法；胍鹽硫氰酸（gua屮dinium thi〇cyanate acid)_ 酚萃取法；胍鹽硫氰酸（guanid〖nium thi〇cyanate acid)萃取 法，藉由氣化铯或類似的梯度來離心；酚-氯仿萃取法； 或其他商業化核酸萃取法。 a在本發明方法之理想具體實範例中，乳頭狀瘤病毒DNA 是以選自含有下列群組之放大法來放大，包括聚合酶鏈加 長反應；接合酶鏈反應、DNA訊息放大反應；q_召複製； 轉譯放大反應；等溫核酸序列放大反應；自我維持序列複 製分析；旋鏢DNA (boomerang DNA)放大反應；股置換活 化反應；循環探針技術；及其任何結合使用或變化方法。 在本發明方法之理想具體實範例中，乳頭狀瘤病毒〇1^八 放大產物是以選自含有下列群組之檢測方法來檢測，包括 膠體電泳、EUSA檢測包括修飾、生物素或其他方式修飾 的引子；以專一性、螢光_、玫射性同位素_、或色素標定 之探針來雜合；南方點潰分析；電化冷光：逆點潰檢測； 及南效液相層析法β 在另一項理想具體實範例中，本發明提供一種用來評估 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1314582 A7 B7 五、發明説明（1〇 人類子S頸惡性疾病及惡性前期疾病的方法，其中該方法 含有兩種或多種以共同或依序進行的方式進行的測試，其 中一種測試可以評估血漿或血液中HP V DNA的存在，第 二種測試可以是巴氏子宮癌檢驗法、雙手骨盆檢測、組 活體檢視或陰道鏡檢視法。 ·、 本發明枝可以檢測具有永久性乳頭狀瘤病毒感染的人 類或$物，進而檢測出具伴隨乳頭狀瘤病毒而發展之瘤、 惡性前期或惡性疾病危險的人類或實$已發展出這些疾病 的人類。在料的具时範❹，這些Μ包含了自體液 包刮但不限制為血漿或血清—内萃取核酸（該核酸 讓或RNA)、放大萃取核酸的的部分，其中含有乳頭狀 瘤病毒、檢測放大的乳敎瘤病毒核酸趋；以及以反覆 或序列的方式進行該步驟的步驟，其令以反覆或序列的方 式檢測罹患永久性乳頭狀瘤病毒感染之人類或動物令放大 之乳頭狀瘤病毒核酸產物’該人類或動物為具有伴隨乳 狀瘤病毒發展或產生疾病的高危險群。 =方法對人類惡性疾病的預後以及評估癌症發展之 傾向極為有用。 本發明方法包含鑑定具發展或具有上皮組織惡性或亞性 病危險之人類的診斷方法，這些惡性疾病包括： 陰莖及鱗狀癌症，及這些惡性前期疾病與 原位惡性腫瘤包括但不限制為子宮頸發育不良及 皮内瘤形成》 本發明方法進-步包含鑑定或選擇具含有Ηρν之惡性或 -13 1314582 A7
惡性前期疾病人類的方法β本發明因此提供鑑定、成層或 選擇使用HPV-直接療法、或進_步診斷測試或治療過程 -包括但不限制為雙手骨盆檢剛、巴氏子宮癌檢驗法、陰 道鏡檢視法、活體檢視、子宮頭内到除、頸部圓錐形切除 法及抗病毒療法一可能有效的人類。 :此本發明的目的在於檢測或推斷被認為具有癌症或癌 症引之人體中，以及藉由血漿或血清或體液進行乳頭狀瘤 ，毒核酸之定量或定性檢測之予期診斷中具乳頭狀瘤病毒 陽性反應的癌化或癌化前細胞‘Γ 本發明應用的優點之一為可以檢測具上皮惡性或惡性前 期疾病的個體。本發明應用的S —項優，點為可筛選個體進 仃HPV-或疾病導向療法，包括生物療法、化學療法抗 病毒療法、放射線療法、及外科療法。本發明方法應用的 另一項優點為提供一種檢查特定療法是否具有適當療效的 標誌，或判斷額外或進一步治療的需要與否，以及評估這 些病患預後的狀況。本發明應用進一步的優點為可以在外 科程序移除惡性或惡性前期病灶後，定性或定量鑑定或分 析人體血漿或血清中乳頭狀瘤病毒核酸，並依外科手術後 殘留癌瘤的危險程度、以及進一步治療的需求對病患加以 分級。本發明應用的另一項優點為可以定性或定量鑑定或 分析已完成完全治療之人體血液或體液中的乳頭狀瘤病毒 核酸’做為癌症復發、急迫性復發或治療失敗的早期指示 。本發明應用的另一項優點為可以藉由一系列血液或體液 樣品的分析來鑑定永久性乳頭狀瘤病毒感染，以做為惡性 -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐)
裝 訂 1314582 五、發明説明（12 或…丨生則期疾病發展危險或預後的區分方法。 本發明特別的理想具體實範例將可藉由下 範例或申請專利範圍更詳細的說明得到證實。特定具體實 圖1為經染色處理之電泳膠片的照片，其 取传的血清中放大的乳頭狀瘤病毒後 最左仃為大小標籤，第二行為正控制組，第二〜片段。 〇’接下來的各行則依序為每月--次的時間：:丁ΐ:間點 負控制組。 : 取右行為 莛,想具體實範例的註細説明 本發明錢了伴隨著瘤形成的胞外病毒dna HPV DNA—可用來檢測及追縱無癌症或已知癌症之2 的惡性前期疾病。本發明因此能夠根據血漿或血 狀瘤病毒DNA的狀態來區別或選擇須進一步評估的人類。 本發明提供檢測人類和動物體液中胞外乳頭狀瘤病毒核 酸的方法。本測試特別有利於檢測血漿或灰清中乳頭狀瘤 病毒(卿)’並能夠用來檢測具有惡性前或惡性疾病的個 體，如子宮頸、陰莖、頭頸部及其他部位，其為部份造成 礼頭狀瘤病毋併發疾病的原因。連同分離與其他核酸分析 起，本發明方法可用來診斷、追縱、預知及定義該疾病 與以該病毒感染為i礎所進行的處理。 本發明提供檢測人類或動物之血漿或血清中胞外乳頭狀 瘤病毒核酸的方法，其中該方法包括了下列步驟，首先自 血漿或血清中純化核酸以製備萃取核酸，其次專一放大萃 -15胃 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1314582 A7 B7 五、發明説明（13 ) 取核酸的一部分來放大含有乳頭狀瘤病毒的核酸片段，以 及最後檢測放大之乳頭狀瘤病毒核酸片段。在理想的方法 中，核酸為去乳核膽核酸（DNA) ’雖然該方法可進一步允 許病毒RNA的檢測。本發明進一步提供鑑定具乳頭狀瘤病 毒併發瘤形成之ifj危險群的人類或動物，包括未羅串癌症 或未罹患已知癌症的人類，特別是子宮頸瘤形成高危險群 的人類，其中永久性乳頭狀瘤病毒感染是以系列診斷血漿 或血清中乳頭狀瘤病毒核酸來寧定的。在特別理想的方法 中，乳頭狀瘤病毒核酸為HPV: DNA。本發明方法可進— 步應用於許多體液，包括但不限制為血液、血聚、血清、 尿液、滲出液、腹水、唾液、腦脊髓液、腸胃道分泌液及 支氣管分泌液包括唾液。 在理想的方法中’核酸放大前是從體液如血漿或血清中 萃取出來的。萃取方法的細節敘述於美國專利申請文件序 號08/81 8,058中，全文在此列入參考。再者，亦可使用任 何已商品化、可有效用來萃取體液中DNA的方法，特別是 病毒DNA。在本發明理想的具體實範例中，乳頭狀瘤病毒 DNA是以敘述於美國專利序號〇8/8 1 8,058中的明膠萃取法 自血清中萃取出來的。在理想的具體實範例中，以靜脈穿 刺術收集血液’離心分離血清，如4°C、110〇xg下離心1〇 分鐘。可於-70 °C下冷凍保存血清或血漿待用。dna是自 解凍後的血清中萃取出來的，如使用明膠萃取法。明勝萃 取法如實例所述，但其不限制為萃取核酸的唯一方法，熟 習於本技藝的技術人員可在必要的時候選用許多本技藝中 -16- ¥紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐) 1314582 A7 B7 五、發明説明（14 ) 已知的方法來萃取核酸。 自血漿或血清或其他體液中將DNA萃取出來後一含有乳 頭狀瘤病毒DNA，在理想的具體實範例中為HPV DNA — 接著放大乳頭狀瘤病毒DNA，該放大反應可以用來定性或 定量。在本技藝中已有許多有用的放大分析方法，並詳述 於美國專利序號08/8 1 8,058中，在此列入參考，並包括但 不限制為聚合酶鏈加長反應、接合酶鏈反應、DNA訊號放 大如支鏈DNA訊號放大、Q-/5_-複製、轉譯基礎放大反應 、旋鏢DNA (boomerang DNA)^大反應；股置換活化反應 ;循環探針技術；及其任何結合使用或變化方法、等溫核 酸序列放大反應及自我維持序列複製分析。可使用專一辨 識目標乳頭狀瘤病毒亞型之引子或探針來進行放大反應。 對人類而言，HPV的檢測可以用專一性較廣、可檢測多種 HPV型（因它們具有較不專一的位置或因為它們為基因組 中的保守區域，如引子對MY09-MY11、GP5 + -GP6+、及 PGMY09-PGMY11)的放大引子（如 GraviU et ai·，2000，J. Clin· Microbiol. Μ·· 357-361中所述）’或僅專一辨識少數 HPV型的引子對（如對6b、' } j、16、18、33型專一的引子） 。舉例來說（但非限制條件），可單獨在個別的、多重的反 應或放大晶片中使用專一辨識HP v DNA亞型1 6、1 8、3 1 、33及35型的引子對或探針。引子及探針及放大反應已為 本技藝所熟知及使用。舉例來說，可使用Man〇s等人，美 國專利序號5,705,627 ; Bauer，美國專利序號5,639,871 ;
Bauer，美國專利序號5,527 898 ; Man〇s，美國專利序號 ______-17- 本紙張尺㈣財目g家鮮--- 1314582 A7 B7 ) 五、發明説明（15 5,2 83，171 ;及Manos ’美國專利序號5，182,377中所敘述的 引子及探針在理想具體實紅例中的引子可使用於聚合酶 鏈放大反應中。此處所列出的引子對並非包括所有可用的 選擇’其他現存或另行設計的引子對亦能適用。此外，其 他如接合酶鏈反應及Q-/9-複製等放大方法特別適用於 mRNA的放大反應。或者’用來鑑定组織樣品中之病毒 DNA及 RNA (如 Hybrid Capture Assay-Π，Digene，Silver
Spring MD)的直接檢測法可用枣檢測血清或血漿中的核酸 。直接法不需要放大反應，其f所含的探針可與乳頭狀瘤 病毒DNA雜合，因此自體液中將DNA萃取出來後或在dna 萃取過程中即可進行此法，其中DNA的萃取與DNA的雜合 反應可在单一步驟中進行。 在理想具體實範例中，放大產物的檢測可以選自含有下 列群組之檢測方法來進行，包括膠體電泳、eusa檢測包 括修飾 '生物素或其他方式修飾的引子；以專一性、螢 光-、放射性同位素-、或色素標定之探針來雜合；南方點 潰分析；電化冷光；逆點潰檢測；及高效液相層析法。 在本發明其他理想具體實範例中，不需要先放大舰即 可檢測病毒DNA。在這些具體實範例中提供了藉由純化血 液或企液分離物-包括血清或血裝—中的dna來檢測血清 或血聚中胞外乳頭狀瘤病毒臟的方法，特別是以探針血 萃取dna進行雜合—萃取DNA部分為乳頭狀瘤病毒dna， 以及檢測雜合的乳頭狀瘤病毒dna。 本發明-關於自血漿、血清或其它非子宮頸體液中萃取 -18-
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乳頭狀瘤病毒DNA，以專一性 物的步—=::二及 中該套組乃用來檢測、診斷、 斷套汲其 病》該套組特別適合用來用來筛檢:和: ::ΤΓ:Γ本發明提供的套組含有用來進= *的式劑’包含但不限制為鹽類、緩衝液、 酸或其溶液，以及聚合酶的製備 人一、 , 以具熱安定性之聚合酶 ’·‘ u大人類乳頭狀璋病毒核酸片段。在其他且 體=中’該套組再含有鹽類、緩衝液、去氧核㈣ 夂或J谷液，以及-種酵素的製備’以反轉錄酶最為理想 ，以將人類孔頭狀瘤病毒RNA轉成CDNA。 本發明提供檢測血漿或血清中乳頭狀瘤病毒DNA 一包括 人類乳頭狀瘤病毒DNA__的方法，以檢測、診斷、評估、 治療或追縱伴隨人類乳頭狀瘤病毒—包括HPV—的瘤疾病 。該瘤疾病包括惡性前期疾病、發育不良、早期癌症、非 侵襲性癌症、原位惡性腫瘤、侵襲性癌症及前期癌症，包 括子呂頸癌、子宮頸發育不良、及子宮頸上皮内瘤形成、 及包括乳頭狀瘤。 - 在特別理想的具體實範例中，本發明方法可以以一系列 的方式來檢測永久性HPV感染的存在。在理想具體實範例 中’本發明方法可鑑定具永久性HPV感染的人類或動物， 因此可以用來研究具高危險發展伴隨乳頭狀瘤病毒發生之 瘤、惡性或惡性前期疾病的人類或動物。本發明方法因此 提供檢測人類或動物預後的方法，以及檢測人類或動物中 ~ 19 - 尺度適財關家標準(CNS) λ··(2Π)Χ297公董) 1314582 A7 B7 五、發明説明（17 癌症的趨勢。 =此本發.明的放大方法及血漿與血清及其他體液中乳頭 ^廇病毒DNA的檢測可用來指派及追縱治療的過程以及非 陡與# f生/α療的效果、過程、及層於Hpv感染和/ 或子宮頸惡性或惡性前期疾病的診斷測試。該治療包括但 不限制為抗病毒療法、生物療法、化學療法及放射線療法 。該步驟包括但不限制為雙手骨盆檢測、外科手術、活體 I雷射療 '冷療、頸部@錐形切除法及子宮頸内刮 除。該診斷測試包括但不限制爲巴氏子宮癌檢驗法及類似 的細胞學評估及陰道鏡檢視法。本發明進一步可以區分及 選擇應該可以進行特殊治療與療程的人類，及提供追縱反 應、舊病復發及預後。本發明的價值在即使新生瘤還屬於 惡性前期、早期或潜彳# B主 ^ . 飞腎伏時或在最少的殘留疾病徵召存在 下即可利用其反應加以區分。 —本發明方法及本發明方法較理想的使时式將藉由下列 貫Ή充刀說明。這些貫例說明了上述方法特定的目的及有 效的、’、α果些實例僅做為說明而非限制本發明的内容。 貫例1 於時間點〇時以棉尾兔乳頭狀瘤病毒（CRPV)-—種專一 f生感7Κ棉尾兔鱗狀上皮的病毒_感染三隻棉尾兔。棉尾兔 廣泛被用來做為乳頭狀瘤病毒感染人類以及發育不良及惡 丨生T瘤發展的扠式動物版本。感染前與感染後約每個月抽 人血並分離血清。將血清冷；東於-801。接種約5周後每 又動物皆發展出惡性前期病灶（乳頭狀瘤），並在時間點 -20
1314582 A7 B7 五、發明説明（18 ) 約4-13個月後形成癌症。 以美國專利申請序號08/81 8,058中所敘述的方法自血清 中萃取DNA。以1/10的萃取物進行聚合酶鏈加長反應，亦 如前述，但在每一個反應中使用25 pico莫耳可辨識C RP V 基因組E8區域的引子。寡核甞酸引子序列如下： 引子 1 : 5，-CGGGATCCCGCTGGAATAGTTAATCTTCTTCCGC-3’ (序列辨識編號1) 弓| 子 2 : 5?-AGCTGGATCCATGGGACCTGCAGAG-35 r (序列辨識編號2) 熱循環參數為：變性溫度94°C下一分鐘，黏合溫度55°C 下一分鐘，延長溫度72°C下一分鐘，重複35次。正控制組 為選殖進質體的一段E8基因序列，同時與測試樣品進行反 應。水空白組做為負控制組。將一半PCR產物以4%洋菜非 變性膠進行電泳分析，並以溴化亞乙基染色。 受感染兔子的樣品測試結果列於圖1。每一隻兔子感染 前樣品的CRPV PCR結果皆為負反應。每一個後續樣品 (N=8，1 3及13)的溪化亞乙基染色結果皆得到一條约1驗 基對大小的條帶，恰如以這些引子反應所預期得到的放大 片段，以E8基因序列做為模板者亦然。這些結果顯示本發 明方法可以檢測出兔子血清中的乳頭狀瘤病毒DNA。來自 兩隻兔子的？CR產物接著以循環定序法進行定序以確認該 序列與CRPV基因組E8基因部分吻合。 實例2 一位年輕，性活潑婦女拜訪她的婦產科醫師進行例行檢 -21 - 本纸張尺度逋用中國國家襟準(CNS) A4规格(210X297公釐） 1314582 A7 B7 五、發明説明（19 ) 查。以標準程序取得巴氏子宮癌檢驗法樣品以及使用於 HPV核酸分.析的血液樣品。由細胞技術員檢查巴氏子宮癌 檢驗法樣品’未發現異常現象。血液測試則藉由自血漿或 血清組成中分離DNA及RNA等核酸成分後進行。利用PCR 法進行能夠檢測數打HPV型的廣效性分析，及以常用來檢 測組織樣品中之HPV的雜合捕捉法檢測之。得到正反應， 邛分的P C R產物以數種限制内核叙酶切割以檢測其基因 型。結果顯示該病人體内具有苎型病毒，高危險型18及低 危險型4。以該樣品來定量此兩型病毒mRNA的含量，結 果得到1 8型病毒血中含量為5〇〇基因組/微升。 回顧從前的經驗，“正常，，的巴氏子宮癌檢驗法可能由實 驗誤差、取樣誤差或抹片上缺乏發育不良細胞的事實而造 成。須提醒該病人對可疑區域進行陰道鏡檢視以及活體= 視。子宮頸發育不良可由活體檢視確認。然後須以專— 對付病毒18型的疫苗來治療病患，以活化' _ 仗糸統及防土 進一步18型病毒的感染。 ^ -111 所有精 方法則 應瞭解前述說明旨在強調本發明的特殊實範例 神或著眼相當且包含在本發明中的修飾方法及替’、 在下述申請專利範圍中提出。 ' -22-

Claims (1)

1314%@0121621 號申請案
中文申請肩 1. 一種檢測人類或動物血漿式血清中細胞外乳頭狀瘤病毒 DNA的方法，該方法包含下列步驟： a) 血漿式血清中純化細胞外DNA來製備經萃取之細胞外 DNA ； b) 專一放大經萃取之細胞外DNA的一部分來製僙乳頭 狀瘤病毒DNA的放大片段； c) 檢測乳頭狀瘤病毒DNA的放大片段。 2.根據申請專利範圍第1項的方法，其中乳頭狀瘤病毒為 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)。 3. 根據申請專利範圍第丨項的方法，其中次項（1?)中的放大 作用是以選自含有下列群組之放大法來放大的，包括聚 合酶鏈加長反應、接合酶鏈反應、旋鏢dna (boomerang DNA)放大反應、q-沒複製；轉譯放大反應 、等溫核酸序列放大反應、自我維持序列複製分析、股 置換活化反應及循環探針技術。 相層析法。 根據申請專利範圍第1項的方法 如診斷、追蹤、評估人類或飭铷, 4. 根據申請專利範圍第丨項的方法，其中次項（(〇中乳頭狀 瘤病毒DNA放大片段的檢測是以選自含有下列群組之 檢測方法來檢測的，包括膠體電泳、免疫檢測法、核酸 雜合' 南方點潰分析、電化冷光、逆點潰檢測及高效液 ’其中包含額外的步驟
1314582 成、或乳頭狀瘤。 種檢測人類或動物血漿式血清中細胞外乳頭狀 να的方法，該方法包含下列步驟： )自血漿式血清中萃取細胞外DNA ; )以專一性探針雜合經萃取之細胞外dna的一部分， 其中該經萃取之細胞外DNA的部分為乳頭狀瘤病毒 〇Na ;
e)檢測雜合乳頭狀瘤病毒DNA。 .根據申請專利範圍第7項的方法，其中包含額外的步驟如 诊斷、追蹤、評估人類或動物中惡性或惡性前期疾病。 •根據申請專利範圍第8項的方法，其中惡性或惡性前期疾 病為子宮頸癌、子宮頸發育不良、子宮頸上皮内瘤形成 、或乳頭狀瘤。 10 * 一種檢測人類或動物之無細胞體液中細胞外乳頭狀瘤病 毒DNA的方法，該方法包含下列步驟：
a)自無細胞體液中純化細胞外DNA來製備經萃取之細 胞外DNA ; b) 專一放大經萃取之細胞外DNA的一部分來製備乳頭 狀瘤病毒DNA的放大片段； c) 檢測乳頭狀瘤病毒DNA的放大片段。 11. 根據申請專利範圍第10項的方法，其中該無細胞體液是 選自下列群組：血漿、血清、滲出液、腹水、唾液、腦 脊髓液、腸胃道分泌液、精液、支氣管分泌液及痰液。 12. 根據申請專利範圍第1〇項的方法，其中乳頭狀瘤病毒為 -2- 1314582 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)。 13.根據申請專利範圍第10項的方法，其中次項（b)中的放 大作用是以選自含有下列群組之放大法來放大的，包括 聚合酶鏈加長反應、接合酶鏈反應、旋録DNA (boomerang DNA)放大反應、Q-召複製；轉譯放大反應 、等溫核酸序列放大反應、自我維持序列複製分析、股 置換活化反應及循環探針技術。 14_根據申請專利範圍第10項的方法，其中次項（c)中乳頭 狀瘤病毒DNA放大片段的檢測是以選自含有下列群組 之檢測方法來檢測的’包括膠體電泳、免疫檢測法、核 酸雜合、南方點潰分析、電化冷光、逆點潰檢測及高效 液相層析法。 1 5 ·根據申请專利範圍第1 〇項的方法，其中包含額外的步驟 如診斷、追蹤、評估人類或動物中惡性或惡性前期疾病。 16·根據申請專利範圍第15項的方法，其中惡性或惡性前期 疾病為子宮頸癌、子宮頸發育不良、子宮頸上皮内瘤形 成、或乳頭狀瘤。 17. —種檢測人類或動物之無細胞體液中細胞外乳頭狀瘤病 毒DN A的方法，該方法包含下列步驟： a) 自無細胞體液中萃取細胞外DNA ; b) 以專一性探針雜合經萃取之細胞外DNA的一部分， 其中該萃取DNA的部分為乳頭狀瘤病毒DNA ; C)檢測雜合乳頭狀瘤病毒DNA。 18. 根據申請專利範圍第17項的方法，其中該體液是選自含 1314582 血聚、血滑 有下列群 髓液腸胃道分泌液、精液、支氣營八 19 ^ ^ 又虱^分泌液及痰液。 如吟斷5 ϋ跑範圍第U項的方法’其中包含額外的步塌 20=1= 估人類或動物中惡性或惡性前期疾病。 2=據：凊專利範圍第19項的方法，其中惡性或惡性前其 t:病：子宮頸癌、子宮頸發育不良、子宮頸上皮内瘤开 成、或乳頭狀瘤
21·根據巾料利範圍第7項的方*，其巾:欠項⑷腿的萃 取與次項（b)雜合反應在單一步驟中進行。 22_根據申明專利範圍第】7項的方法其中次項⑷d财的 萃取與次項（b)雜合反應在單一步驟中進行。 23·根據申請專利範圍第7項的方法，其中乳頭狀瘤病毒為 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)。 24.根據申請專利範圍第17項的方法，其中乳頭狀瘤病毒為 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)。
25_—種鑑定人類或動物中永久性乳頭狀瘤病毒感染的方法 ’該方法包含下列步驟： a) 自血_漿或血清中萃取細胞外核酸； b) 專一放大經萃取之細胞外核酸的一部分來製備乳頭 狀瘤病毒核酸的放大片段； c) 檢測乳頭狀瘤病毒核酸的放大片段； d) 依序在不同的時間點重複次項（a)、（b)、（c)步驟來 檢測多於一個時間點下的乳頭狀瘤病毒核酸的放大 片段來確認永久性乳頭狀瘤病毒感染。 -4- I3l4582 26 •根據申請專利範圍第25項的方法’其中乳頭狀瘤病毒為 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)。 ’”、 27·一種繼定人類或動物中永久性乳頭狀瘤病毒感染的方法 ’該方法包含下列步驟： a) 自無細胞體液中萃取細胞外核酸； b) 專一放大經萃取之細胞外核酸的一部分來製備乳頭 狀瘤病毒核酸的放大片段； e)檢測乳頭狀瘤病毒核酸的放大片段； φ d)依序在不同的時間點重複次項（a)、（b)、（c)步驟來 檢測多於一個時間點下的乳頭狀瘤病毒核酸的放大 片段來確認永久性乳頭狀瘤病毒感染。 28. 根據申請專利範圍第27項的方法，其中該體液是選自含 有下列群組：血漿、血清、滲出液、腹水、唾液、腦脊 髓液、腸胃道分泌液、精液、支氣管分泌液及痰液。 29. 根據申請專利範圍第27項的方法，其中乳頭狀瘤病毒為 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)。 30·—種鑑定人類或動物中永久性乳頭狀瘤病毒感染的方法 · ，該方法包含下列步驟： a) 自血漿或血清中萃取細胞外核酸； b) 以專一性探針雜合經萃取之細胞外核酸的一部分， 其中該經萃取之細胞外核酸的部分為乳頭狀瘤病毒 核酸； c) 檢測雜合乳頭狀瘤病毒核酸； d) 依序在不同的時間點重複次項（a)、（b)、（c)步驟來 -5- 1314582 檢測多於一個時間點下的雜合乳頭狀瘤病毒核酸來 確認永久性乳頭狀瘤病毒感染。 3 1 ·根據申請專利範圍第3〇項的方法，其中乳頭狀瘤病毒為 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)。 32. —種鑑定人類或動物中永久性乳頭狀瘤病毒感染的方法 ’該方法包含下列步驟： a) 自無細胞體液中萃取細胞外核酸； b) 以專一性探針雜合經萃取之細胞外核酸的—部分， 馨 其中該經萃取之細胞外核酸的部分為乳頭狀瘤病毒 核酸； c) 檢測雜合乳頭狀瘤病毒核酸； d) 依序在不同的時間點重複次項（a)、（b)、（c)步驟來 檢測多於一個時間點下的雜合乳頭狀瘤病毒核酸來 確認永久性乳頭狀瘤病毒感染。 33 _根據申請專利範圍第32項的方法，其中該體液是選自含 有下列群組者，如血液、血漿、血清、滲出液、腹水、 唾液、腦脊髓液、腸胃道分泌液'精液、支氣管分泌液 # 及痰液。 34. 根據申請專利範圍第32項的方法，其中乳頭狀瘤病毒為 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)。 35. 根據申請專利範圍第27項的方法，當雜合乳頭狀瘤病毒 核酸的檢測多於一次時，包含鑑定具有惡性或惡性前期 疾病傾向之人類或動物的額外步驟。 36. 根據申請專利範圍第3〇項的方法，當雜合乳頭狀瘤病毒 -6- 1314582 核酸的檢測多於一次時，包含鑑定具有惡性或惡性前帛 疾病傾向之人類或動物的額外步驟。 37.根據巾請專㈣圍第32項时法，#乳頭狀瘤病毒放纟 · 片段的檢測多於一次時，包含鑑定具有惡性或惡性前期 疾病傾向之人類或動物的額外步驟。 38:種評估婦女子宮頸惡性或惡性前期疾病的方法，其中 該方法包含兩種或更多同時或依序進行的檢測，其中一 種檢測可評估血漿或血清中HPV DNA的存在，第二種 修 測試為巴氏子宮癌檢驗法檢查。 39_—種評估婦女子宮頸惡性或惡性前期疾病的方法，其中 該方法包含兩種或更多同時或依序進行的檢測，其中一 種檢測可評估血漿或血清中HPV DNA的存在，第二種 測試為雙手骨盆檢測。 40.—種評估婦女子宮頸惡性或惡性前期疾病的方法，其中 β玄方法包含兩種或更多同時或依序進行的檢測，其中一 種檢測可評估血漿或血清中HPV DNA的存在，第二種 測試為組織活體檢視。 鲁 4 1 · 一種評估婦女子宮頸惡性或惡性前期疾病的方法，其中 該方法包含兩種或更多同時或依序進行的檢測，其中一 種檢測可評估血漿或血清中HPV DNA的存在，第二種 測試為陰道鏡檢視法。 42. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中人類乳頭狀瘤病 毒為伴隨子宮頸瘤形成的人類乳頭狀瘤病毒亞型。 43. 根據申請專利範圍第12項的方法，其中人類乳頭狀瘤病 -7- 1314582 毒為伴隨子宮頸瘤形成的人類乳頭狀瘤病毒亞型。 44. 根據申請專利範圍第26項的方法，其中人類乳頭狀瘤病 毒為伴隨子宮頸瘤形成的人類乳頭狀瘤病毒亞型。 45. 根據申請專利範圍第29項的方法，其中人類乳頭狀瘤病 毒為伴隨子宮頸瘤形成的人類乳頭狀瘤病毒亞型。 46. 根據申請專利範圍第31項的方法，其中人類乳頭狀瘤病 毒為伴隨子宮頸瘤形成的人類乳頭狀瘤病毒亞型。 47 ·根據申請專利範圍第34項的方法，其中人類乳頭狀瘤病 毒為伴隨子宮頸瘤形成的人類乳頭狀瘤病毒亞型。 48. —種檢測人類或動物血漿式血清中細胞外乳頭狀瘤病毒 RN A的方法，該方法包含下列步驟： a) 自血漿式血清中純化細胞外RNA來製備經萃取之細 胞外RNA ; b) 將該細胞外RNA轉換成cDNA; c) 專一放大經萃取之細胞外RNA的一部分來製備乳頭 狀瘤病毒RNA的放大片段； d) 檢測乳頭狀瘤病毒RNA的放大片段。 49_ 一種檢測人類或動物血漿式血清中乳頭狀瘤病毒rna的 方法’該方法包含下列步驟： a) 自血漿式血清中萃取細胞外RNA ; b) 以專一性探針雜合經萃取之細胞外rna的一部分， 其中該經萃取之細胞外RNA的部分為乳頭狀瘤病毒 RNA ； c) 檢測雜合乳頭狀瘤病毒RNA。 1314582 50_ —種檢測人類或動物之無細胞體液中細胞外乳頭狀瘤病 毒RNA的方法，該方法包含下列步驟： a) 自無細胞體液中純化細胞外RNA以製備經萃取之細 胞外RNA ; b) 將細胞外RNA轉換成cDNA ; c) 專一放大萃取RNA的一部分來製備乳頭狀瘤病毒 RNA的放大片段； d) 檢測乳頭狀瘤病毒RNA的放大片段。 51.根據申請專利範圍第50項的方法，其中該體液是選自含 有下列群組：血聚、血清、滲出液'腹水、唾液'腦脊 髓液、腸胃道分泌液、精液、支氣管分泌液及痰液。 5 2. —種檢測人類或動物之無細胞體液中細胞外乳頭狀瘤病 毒RN A的方法，該方法包含下列步驟： a) 自無細胞體液中萃取細胞外rnA ; b) 以專一性探針雜合經萃取之細胞外rna的一部分， 其中該經萃取之細胞外RNA的部分為乳頭狀瘤病毒 RNA ； c) 檢測雜合乳頭狀瘤病毒rna。 53.根據申請專利範圍第52項的方法，其中該體液是選自含 有下列群組：血漿、血清、滲出液、腹水、唾液、腦脊 髓液、腸胃道分泌液、精液、支氣管分泌液及痰液。
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