TWI302166B - - Google Patents

Description

1302166 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種DNA疫苗，尤指可於臨床上使用發 揮效果的日本腦炎病毒DNA疫苗者。 【先前技術】 曰本腦炎係一經由蚊子傳染的病毒傳染疾病，其病原 係日本腦炎病毒（Janapese encephalitis virus, JEV)〇 曰本腦炎死亡率高，且該疾病之影響區域廣及大部分亞洲 國豕。以往所用之疫苗係將病鼠腦中萃取之病毒，以福馬 林處理而成之製劑。該疫苗雖成功的降低日本腦炎每年感 染病例至10到30例左右。但是製作該疫苗需使用大量實 驗動物，且鼠腦組織會引起過敏等副作用。隨著科技之進 步，前述取活體組織製作之疫苗，愈發有可加以改革的空 間。 & 為在體内引起類似該傳統疫苗的免疫防禦的效果，可 使用可編碼抗原蛋白之ΜΑ質體（plasmid)，以作為關八 疫苗。該等質體利用驅動子（pr〇m〇ter)，以啟始心題的 合成。今日大多之DNA疫苗採用來自細胞巨大病毒 (cyt⑽egalovirus，CMV)之啟動子。該等來自病毒的啟動 子=效果雖然在老鼠的動物實驗中普遍有高效率的免疫保 力仁在其他包括靈長類的物種中的免疫保護能力則 是有南有低。 造成DNA疫苗在靈長類免疫保護能力低落的可能原因 之一，在於該DNA質體表現（exPressi〇n)不佳；其他原因 1302166 則匕括有穩疋RNA之多聚腺嘌呤（p〇lyadenylati〇n)的作 用’以及作為抗原的病毒蛋白之結構是否產生正確的折 且此外純化負體時所利用的抗生素基因，亦可能引起 過敏副作用。 由上所述，目前應用於靈長類的日本腦炎DNA疫苗仍 有其不足，有待進一步改良。 【發明内容】 為解決上述各項影響DNA疫苗效果的問題，以及避免 可能的副作用，本發明的目的在於提供—日本腦炎艱疫 苗以引發高效的免疫保護反應，並降低可能因抗生素引起 的副作用。為達到該目的所採取的技術手段，係令本發明 之日本腦《DNA疫苗包括有至少—個載體，其中該至少一 個載體編碼日本腦炎病毒膜蛋白及外套蛋白序列。 其中該曰本腦炎病毒膜蛋白係由一曰本腦炎病毒膜蛋 白别驅物㈣)所生成，本發明者發現，表現曰本腦 炎病毒膜蛋白前驅物及外套蛋白，可令所得到的病毒蛋白 質進行正確的摺疊，形成適當的構形。與僅表現日本腦炎 病毒外套蛋白者相比較，可令接受該日本腦炎驗疫苗的 生物體體内產生較高效㈣抗體，提供較強的免疫保護。 前述至少-載體進而包括有至少一多聚腺嗓吟序列。 =而包括有至少-多聚腺嗓吟序列之至少一載體， ，、中遠夕聚腺嗓呤序列係為牛生長激素之多聚腺嗓吟序 RNA轉錄本，增加牛生 由於多聚腺嘌呤序列可以穩定 1302166 長激素之多聚腺嘌呤序列或其他多聚腺嘌呤序列，將有助 於蛋白質表現。 前述至少一載體進而包括有至少一插入子。 該進而包括有至少一插入子之至少—載體，該插入子 為嵌合型插入子’該插入子包含來自人類石免疫球蛋白基 因第-插人子區的5’端剪接提供者區’以及免疫球蛋白基 因重鏈多變區域的3,端剪接接受者區。 前述至少一載體進而包括有至少一抗藥基因。 該進而包括有至少一抗藥基因之至少一載體，其抗藥 基因係抗康黴素基因。 在質體中常加入抗藥基因以利建構質體時篩選之用。 其中最常用的是可抗青黴素等内醯胺（lactam)類抗生素的 抗藥基因Am〆。但因為在臨床上常使用該類藥物，故引起 過敏的疑慮較高。因此本發明中採用較不易發生該問題之 胺醣類的康黴素的抗藥基因Kanr。 該進而包括有至少一啟動子之至少一載體，該啟動子 係為細胞巨大病毒之早期啟動子。 前述至少一載體進而包括有至少一加強子。 將本發明提供之日本腦炎DNA疫苗送入日本腦炎病毒 佰主體内，可刺激免疫系統之反應，產生免疫防禦的效果。 並避免副作用’再藉由加強日本腦炎病毒的表現，可使免 疫系統生產效價更高的抗體，以及有類似傳統疫苗效果的 類病毒顆粒（virus like particle，VLP)。 【實施方式】 6 1302166 以下配合圖式說明本發明具體實施方式。其中所使用 之日本腦炎病毒係Beijing-l病毒株，以小鼠腦組織培養。 同時病毒基因之選殖（cloning)，以及日本腦炎病毒之感 染實驗平臺亦以之建立。

實驗用小鼠係購自國家動物中心的C3H/HeN雌性小 鼠，飼養於國立臺灣海大學生命科學院之實驗動物房。 Beijing-Ι病毒株對12-14週C3H/HeN小鼠之半致死劑量 (LD^)係3.0x1 〇5 pFu。在進行日本腦炎感染致死實驗時， 對C3H/HeN小鼠進行腹膜注射，施以5〇倍於半致死劑量 之曰本腦炎病毒，再對其進行腦部假注射。 日本腦炎感染致死實驗的C3H/HeN小鼠在施予病毒之 後的三十日内，每日觀察其病毒腦炎病徵。 實施例1 :建構各表現載體 pcDNA3 (Invitrogen，San Dieg〇，CA，USA)係一真核 表現載體，包括有一細胞巨大病毒早期啟動子、一加強子、 一牛生長激素的多聚腺嘌呤序列、一安比西林抗藥基因、 以及一新黴素挑選標記基因。 臨床載體P3224包括有一細胞巨大病毒早期啟動子、 一加強子、細胞巨大病毒之插入子A、一牛生長激素的多 聚腺嘌呤序列、一康黴素抗藥基因。

pRL-CMV(Promega，Madison，WI, USA)之处/η/万⑽HI 片段，以及 P3224之/如1/5^/1片段相互接合以形成一嵌合載體 7

1302166 pCJ-1 。 將pCJ_l之螢光酵素（luci f erase)基因移除得一載體 稱 p C J - 2 pCJ-2僅包括有一 Wil切點，故另插入一含有複數切 點的序列以形成pCJ-2’。 pCJ-2’包括有一細胞巨大病毒早期啟動子、一加強子、 一嵌合插入子、一 SV40多聚腺嘌呤序列、一康黴素抗藥 基因。 將pCJ-2’之SV40多聚腺嘌呤序列替換以一牛生長激 素多聚腺嘌呤序列，即成pCJ-3。 pC J-3包括有一細胞巨大病毒早期啟動子、一加強子、 一嵌合插入子、一牛生長激素多聚腺嘌呤序列、一康黴素 抗藥基因。 各不同載體之表現量係以螢光酵素報導系統加以測 試。將一螢火蟲螢光酵素基因（取自pGL 3-basic，其係購 自 Promega，Madison，WI，USA)置入前述 pcDNA3、p3224、 pCJ_2’、及 pCJ-3等載體，分別製成 pcDNA3/Luc、 p3224/Luc、pCJ-2’ /Luc、及 pCJ-3/Luc 各載體。日本腦 炎病毒膜蛋白之互補DNA(cDNA)序列，係以反轉錄以及聚 合酵素連鎖反應（PCR)的方式，取自曰本腦炎病毒 Beijing-1病毒株基因體。其中所使用之PCR引子組係： 5’ -GATGAAGCTTGCCATGGTGGTATTCACCATCCT03’（正向） (SEQ ID NO: 1 ) 以及 8

1302166 實施例2 :不同插入子與多聚腺嘌呤對螢光酵素表現 的影響 在實施例2中，檢視了二個插入子對表現的影響。其 一由細胞巨大病毒之插入子A所組成，另一係一嵌合插入 子。該欲合插入子包括有人類石免疫球蛋白基因第一插入 子5’端剪接提供者區的序列，以及免疫球蛋白基因重鏈多 變區域3’端剪接接受者區的序列。 此外’為測試多聚腺嘌呤訊息序列對表現的影響，在 實施例2中比較了二不同的多聚腺嘌呤訊息序列。SV4〇以 及牛生長激素之多聚腺嘌呤訊息序列皆係表現載體中常用 者。該多聚腺嘌呤訊息序列插入含有細胞巨大病毒啟動 子、螢光酵素報導基因、以及插合子的載體。各載體的表 現量以螢光酵素報導系統加以測量。 2· 1 細胞轉染（transfection) 將約2xl〇5 BHK(ATCC CCL-10)細胞植入6孔培養盤， 且在轉染之前4小時更換新鮮培養基，再使用鈣離子沉積 法將DNA送入細胞： 將 5# g DNA 溶於 220 " 1 之 0. 1 倍 TE(1 mM Tris-C1 ; 0. 1 mM EDTA [pH 8· 0])緩衝液， 再加入 250 /z 1 之 2 倍 HBS(280 mM NaCl; 10 mM KC1; 1. 5 mM Na2HP〇4; 50 mM HEPES; 12 mM dextrose [pH 7.05]) 緩衝液， 接著加入31 // 1之2M CaCl2溶液，並適度搖晃之。

1302166 置該混合液於室溫25分鐘，再將該轉染溶液遂滴加 入前述培養基，並於37°C靜置5小時。 移除該培養基， 於室溫下加入1倍HBS之15%甘油溶液，靜置2分# 再移除該1倍HBS之15%甘油溶液， 並以1倍PBS加以洗滌。 最後加入新鮮培養基並培養於37°C。 2.2 螢光酵素檢驗（Luciferase assay) 在轉染之後，以1倍PBS洗條細胞，加入2 0 〇 # 1報 導分解（lysis)緩衝液（reporter lysis buffer， RLB)(Promega，Madison，WI，USA)。在離心令大量細胞 殘潰沉積之後，取其上清液，以BCA蛋白檢驗反應劑（Pi erce USA)檢驗之。又取20//1細胞殘渣（25/zg全蛋白質）與1〇〇 # 1螢光酵素檢驗反應劑（Promega, madison, WI，USA)處 理’在螢光測量儀中測量其2 5 e g全蛋白質之相對螢光酵 素活性單位(relative luci f erase activity unit, RLU) 數值。 第一圖揭露有各不同載體在BHK細胞中表現螢光酵素 活性的比較結果。各項資料皆為六項獨立重複實驗結果之 平均。pCJ-3/Luc 之表現量 1· 6xl07 RLU 為最高，p3224/Luc 之表現量3· 4xl06 RLU，而pcDNA3/Luc之表現量僅3.〇χΐ〇5 RLU。該圖以pcdnA3/Luc之表現量為一倍，對各組進行比 較，可知所觀察到pCJ-3/Luc之表現量為pcDNA3/Luc表 11

1302166 現量的53倍，而P3224/Luc之表現量為pcDNA3/Luc表現 量的11倍。 含有牛生長激素多聚腺嘌呤的PCJ-3之表現量為 1· 6xl07 RLU，含有SV40多聚腺嘌呤的PCJ-2’之表現量為 3· 6xl06 RLU。pCJ-3之表現量約為pCJ-2表現量的5倍。 2· 3 點墨分析（dot-blot analysis) 轉染細胞以冷PBS洗滌2次，並加入300 # 1之NP-40 分解緩衝液（1% NP-40，150 mM NaCl，50 mM Tris [pH 8. 0]， 系示合式蛋白酵素抑制劑（protease inhibitor cocktail)

[Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany])分解之。 在 4°C 以 l〇〇〇〇xG 離心 10 分鐘，以 SDS-PAGE(12.50/〇 polyacrylamide)分析其殘渣。再於轉印緩衝液中（〇. 1% SDS， 25 mM Tris [pH 8·4]，192 mM glycine，20% methanol)以 50mA 轉印2小時到硝化纖維膜。濾紙先以阻斷緩衝液（bl〇cking buffer) (5% skim milk，150 mM NaCl，50 mM Tris [pH 8· 0]) 處理2小時，再以抗日本腦炎病毒外套蛋白質單株抗體 E3· 3(1//g/mi)溶液於室溫浸泡1小時後，用洗滌緩衝液 (0.05% Tween 20, 1% skim milk, 150 mM Tris [pH 8.0]) 洗條5分鐘，接著在加有山羊抗小鼠IgG Fc區HRP標記 抗體（ 1:1 000; Chemicon，Temecula，CA，USA)之 PBS-牛 血清（1 %)中浸泡1小時。洗條5分鐘之後，以加強化學螢 光西方點墨偵測系統（Amersham，Little Chalfont， Ul〇 顯影，並曝光於X光底片上。 12 1302166 以點墨分析確認BHK細胞中載體表現量的結果，係揭 • 路於第二圖。請參看第二圖，可知pCJ-3/Ε：之表現量比 P3224/E多3倍，而p3224/E之表現量比pe多約1〇倍。 该結果指出插入子對表現極為重要。而該嵌合型插入子的 表現優於細胞巨大病毒之插入子A。 而與使用SV40多聚腺嘌呤序列之載體相較，使用牛 生長激素多聚腺嘌呤序列的載體表現量則多了 3倍。 Ϊ 實施例3 :不同插入子與不同多聚腺嘌呤序列對抗體 反應及免疫保護力的影響 為確認該等載體是否確可提供針對日本腦炎病毒的免 疫保護，先對雌性C3H/HeN小鼠肌肉注射編碼日本腦炎病 毒膜蛋白的載體，再進行日本腦炎感染致死實驗。由於 C3H/HeN小鼠比起其他小鼠對日本腦炎病毒的感染更加敏 感，故選為本實施例之實驗標的。 本實施例所使用之小鼠，係年齡為6到8週的小鼠。 一組五隻小鼠，分別在麻醉後接受注射，間隔3週，共注 • 射3次，每次注射5 0 // g DNA於兩側四頭肌，且在注射前 一週’以心臟毒素（cardiotoxin) (Sigma，St· Louis，M0, USA)處理將接受注射的肌肉。在不同時間點取鼠尾血分析 曰本腦炎病毒外套蛋白特異抗體。該抗體係以EL IS A方式 量測。終端效價（end-point titer)係以最高稀釋倍率決 定。且在設定截斷值（cutoff)為0·05的情況下，該最高 稀釋倍率之吸光值需至少2倍於對照組。低於偵測極限者 13 1302166 定其值為10，因起始稀釋倍率即為1:1〇。 第三圖係為抗體效果測試的結果。請參閱第三圖（A)， 第3週時’各組在產生日本腦炎病毒外套蛋白特異抗體方 面並無顯著差異。到了第六週，pCJ-3/E產生了 3倍於 pCJ-2’/E、2倍於P3224/E、以及3倍於pE的抗體。而在 第 8 週，pCJ-3/E 產生了 1· 6 倍於 pCJ-2，/E、1 倍於 p3224/E、

以及2倍於pE的抗體。請再參閱第三圖（B)，在第16週 時’曰本腦炎感染致死實驗的小鼠存活率顯示出，pCJ_3/E 對曰本腦炎的感染提供了完全的保護能力，而p3224/E與 pCJ_2’/E之小鼠存活率為8〇%，pE之小鼠存活率則為6〇0/〇。 綜上所述，該等資料明確指出一嵌合型插入子，以及 一牛生長激素多聚腺嘌呤，能有效提高以肌肉細胞為目標 之試管内基因表現與生物體内免疫。 實施例4 :結構構形對抗體反應及免疫保護力的影響 4· 1結構構形對DNA疫苗所引起免疫保護能力的影響 心臟毒素或bupivacaine之處理，可促進肌肉的壞死 以及再生。咸信該處理有助於肌肉對DNA的吸收與表現。 為了確認是否結構構形可在不使用心臟毒素的情況下，增 強日本腦炎DNA疫苗的效果，遂以1〇〇// g的pE、pME、或 pCJ-3/ME，注射有使用心臟毒素的C3H/HeN小鼠以及對照 組C3H/HeN小鼠的四頭肌。 結果如第四圖所示，未使用心臟毒素的對照組不產生 抗體也不產生免疫保護能力。請參閱第四圖（A)，在第六 14 1302166

週，使用心臟毒素之pCJ-3/ME較未使用心臟毒素者多產 生了 3倍的抗體。而在第八週時，無論使用心臟毒素與否， pC J-3/ME所產生的日本腦炎病毒外套蛋白特異抗體則相去 不遠。在第六週，使用心臟毒素之pCJ-3/ME所產生的抗 體分別為pE之25倍、pME之1· 3倍；在第8週時，pCJ-3/ME所產生的抗體則分別為pE之9倍、ρΜΕ之1倍。請 參閱第四圖（Β)，在第一次引起免疫反應的8週之後，其 小鼠存活率顯示出，使用或不使用心臟毒素的PC J-3/ME、 以及使用心臟毒素的pME，均提供了完全的保護能力，而 使用心臟毒素的pE僅有60%的存活率。 以上結果指出：肌肉注射編碼日本腦炎病毒膜蛋白前 驅物以及日本腦炎病毒外套蛋白之日本腦炎DNA疫苗，無 設在有無使用心臟毒素的情況下，均可產生較高效價之抗 體及產生保護能力，以對抗致命劑量的日本腦炎病毒。 4. 2血清之西方點墨分析 為確認未經心臟毒素處理之小鼠血清中，是否含有曰 本腦炎病毒外套蛋白特異抗體，肌肉注射pE或pC j — 3/ME 於未經心臟毒素處理的C3H/HeN小鼠，其間隔3週，共注 射3次’並在不同時間點以西方點墨法分析量測其血清。 請參閱第五圖，注射pCJ —3/ME小鼠之血清可清楚偵 測到日本腦炎病毒外套蛋白之52kD片段，而在注射pCJ — 3/ME小鼠之血清中則無法偵測到。且該曰本腦炎病毒外套 蛋白特異抗體隨時間增加。 15 1302166 , 4.3電子顯微 請參閱第六圖，為確認結構構形是否有所改變，進而 產生免疫反應及免疫保護能力，使用穿透式電子顯微鏡觀 察pC J-3/ME轉染之BHK-21細胞之形態。 在轉染後48小時，收集上述細胞沉渣，以含有〇. jM 一甲基胂酸鹽緩衝液（〇3〇〇(171&七6 131^161')(0117.4)之2.5% - 戊二醛（glutaraldehyde)溶液固定60分鐘，再以同液洗 • 滌一個晚上。該細胞沉渣接著以醋酸鈾醯（uranyl acetate) 染色並阻斷，再以餓酸固定，精製乙醇去水，包埋於 Eponate-12樹脂。其切片以醋酸鈾醯及檸檬酸鉛（Uad citrate)進行雙染色，以Zeiss 900電子顯微鏡（Carl Zeiss， Germany)觀察。 睛參閱第六圖。第六圖（B)所示者係pcj —3/me轉染之 BHK-21細胞，相較於第六圖（A)，其形態正常且類似轉染 前之BHK-21細胞。pCJ-3/ME轉染之BHK-21細胞，於其内 質網皺摺處及高基氏體，可見類似小粒子之結構以及電子 ；密集之結構。在正常的BHK-21細胞中無此等結構，由於 而pCJ-3/ME轉染之BHK-21細胞及日本腦炎病毒感染之ΒΗκ ^細胞皆有該等結構，指出日本腦炎DNA疫苗藉由同時表現 曰本知炎病毒膜蛋白前驅物及外套蛋白，可以在沒有使用 心臟毒素處理的情況下產生類病毒顆粒，於鼠類模式中發 揮DNA疫苗的效用。 1302166 實施例5 . w dna《苗進行一次免疫在抗體反應及免 疫保護力方面的效果 5 · 1單訓里DNA疫苗免疫之免疫保護力 為確認採行一次免疫之本實施例與採行三次免疫之實 施例3及實施例4,是否有類似的效果。將pE肌肉注射於 以心臟毒素處理過之C3H/HeN小鼠一次，而接受單一劑量 之PCJ-3注射者則為對照組。所有的小鼠皆在免疫反應後 8週時施予50倍於半致死劑量的日本腦炎病毒㈣加㈠ 病毒株，其結果如第七圖所示。請參閱第七圖（人），於第3 週及第6週，未經心臟毒素處理之pME與pCJ_3/ME所產 生之日本腦炎病毒外套蛋白特異抗體並無顯著差異。在第 8週，PCJ-3/ME比pME增加1· 3倍抗體。然而，在第3 週、第6週、及第8週，分別產生了高於經心臟毒素處理 之PE 44倍、10.6倍、及9· 4倍的日本腦炎病毒外套蛋白 特異抗體。一如預料，pCJ-3組之小鼠無一產生免疫保護 能力，在日本腦炎病毒感染下亦無一存活。如第七圖（b) 所示，經心臟毒素處理之pE有60%之存活率；相較之下， 接受pME與pCJ-3/ME肌肉注射一次以引起免疫反應且未 經心臟毒素處理者，則有較強的免疫保護力，以及1〇〇%存 活率（施予病毒之後超過30天）。 5. 2小鼠體内產生之中和抗體 表1·藉日本腦炎DNA疫苗引發免疫作用而在小鼠體内 17 1302166 ' 產生之中和抗體

18 1302166 引發免疫作 用次數a jO-3(+) 中和抗體b 1 3 <1/10 <1/10 PE(-) pE㈩ pCJ-3/ME(-) PCJ-3/MEW <1/10 <1/10 1/10 1/10 1/160 1/160 >1/320 >1/λ20 到8週的 以pCJ-3、PE、或pCJ —3/ME，對年齡為 C3H/HeN小鼠分別注射i次或3次以引發免疫作用。注射 3次者每次間隔3週。且再分為經心臟毒素處理者（+ )以及 未經心臟毒素處理者（—）。

b於第一次免疫作用8週後收取的血清，其中和曰本 腦炎病毒之效價係為可減少5〇%溶菌斑數量之稀釋倍率。 各組血清中和日本腦炎病毒的能力係以溶菌斑減少中 和试驗（plaque reduction neutralization test，PRNT) 測定。以pCJ-3、PE、或pCJ-3/ME，對年齡為6到8週的 C3H/HeN小鼠分別注射j次或3次以引發免疫作用。注射 3次者每次間隔3週。且再分為經心臟毒素處理者（+ )以及 未經心臟毋素處理者（—）。於第一次免疫作用8週後收取 血清’並檢測可中和日本腦炎病毒之抗體。請參考表1， 接受經心臟毒素處理或未經心臟毒素處理之pE之肌肉注 射者’其效價無法偵測（<1 :10)。接受pCJ —3/me DNA疫苗 而引發免疫作用者，其抗體效價增加最為明顯（1:32〇)。 此結果指出以pCJ - 3/ME引發單一次免疫作用的效果，在 產生日本腦炎病毒中和抗體方面，以及在未經心臟毒素處 理小鼠之免疫保護能力方面，皆優於經心臟毒素處理，施 予pE之小鼠。 1302166 結論 有效之DNA疫苗需要強效之表現系統，以及適當之結 構構形以發揮其抗原性。本發明提供之DNA疫苗包含一編 碼日本腦炎膜蛋白前驅物與日本腦炎外套蛋白之載體，可 產生類病毒顆粒，係一無須心臟毒素配合之高效DNA疫苗。 該載體所編碼之日本腦炎膜蛋白前驅物與日本腦炎外套蛋 白加強了抗原的穩定性，且對抗原表現細胞呈現了高密度 抗原。 由上所述可瞭解本發明之具體構造以及製造方法，確 可提供一高效日本腦炎DNA疫苗。 根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術 者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明 已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被 不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發 明之已述模式方面，料熟習該項技術者而言顯而易知之 不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之内。 【圖式簡單說明】 第一圖係為試管中各不同載體表現螢光酵素活性比較 曰本腦炎病毒外套蛋白 第二圖係為不同載體所表現的 之點墨分析結果。 第三圖係為不同載體表現日本腦炎病毒外套 起的免疫保護反應之比較。⑴為抗體量，⑻為存活率, 20 1302166 的悴第四圖係為在使用或不使用心臟毒素(cardi〇t〇xin) 旦月况下蛋白質構形對DNA疫苗效果的影響。（A)為抗體 里’（B)為存活率。 第五圖係為在不先使用心臟毒素而注射邱或pcj —3/舭 之小鼠血清西方點墨實驗。 第“圖係為（A)日本腦炎病毒感染之腹細胞以及⑻ 轉木有pCJ-3/ME之BHK細胞的電子顯微攝影。 二圖係為單姻蓋日本腦炎⑽A疫苗之免疫保護能 力比車又。（A)為抗體量，（β)為存活率。 【主要元件符號說明】 益

Claims (1)

1302166 十、申請專利範圍·· 種日本^义DNA疫苗，其係包含至少一個載體， 其:°亥至）一個載體編碼曰本腦炎病毒膜蛋白及曰本腦炎 病毋外套蛋白序列，其中該至少一載體進而包含至少一插 子且°亥插入子為嵌合型插入子，該插入子包含來自人 類免疫球蛋白基因第—插人子區的5，端剪接提供者區， 乂及免疫球蛋白基因重鏈多變區域的3，端剪接接受者區； =該載體進而包含至少—啟動子序列以啟動日本腦炎病 毒膜蛋白及外矣 奮蛋白的表現，且該啟動子係為細胞巨大病 毒之早期啟動子。 #寻利範圍第1項 中。亥載體進而包括至少-多聚腺嗓呤序列 中上t申請專利範圍第2項之曰本腦“ΝΑ疫苗，其 '"夕认卜票吟序列係為牛生長激素多聚腺嗓呤序列。 中兮：二1請專利範圍第1項之曰本腦“ να疫苗，其 Μ載肢進而包括有至少一抗藥基因。 5 ·如申請專利範圍第4項之 中該載體進而h入 不躺夂DNA疫苗，其 進而包含至少一抗康黴素基因。 6 ·如申請專利範圍第丄項之日本 中該載體進而—人 火DNA疫苗，其 秋運而包含加強子序列。 7 ·—種作為日本腦《DNA疫苗的栽 一編碼曰本胳*广主 X私，其包括至少 甸火病t膜蛋白及日本腦炎 列，其中該至少—_、隹而勺人5人病4外套蛋白的序 夕 戟體進而包含至少—才干 子為嵌合型栖〜工 入子，且該插入 I插入子，該插入子包含來自 一 /3免疫球蛋白 1302166 基因第-一插入之 千區的5 ’端剪接提供者區，以及免疫球蛋白 基因重鏈多0 。 又&域的3端剪接接受者區；又，該載體 包含至少一 ^ , 子序列以啟動日本腦炎病毒膜蛋白及 ΛΛ xej I 子、 且咸啟動子係為細胞巨大病毒之早期啟動 其中該载體進而 其中該多聚腺嘌 ’其中該載體進 8 .如中請專利範圍第7項之載體， 包括至少一多聚腺嘌呤序列。 9.如申請專利範園第8項之載體， 呤序列為牛生長激素多聚腺嘌呤序列。 1 〇 .如申請專利範圍第7項之載體 而包含至少一抗藥基因。 0項之载體，其中該載體 、之載植，其中該載體進 丄丄·如申請專利範圍第工 進而包έ至少一抗康黴素基因。 1 2 ·如申請專利範圍第了 而包含加強子序列。 十一、圖式： 如次頁 1302166 公告本 >年么月 pcDNA3/Luc CMV Luc| BCH pA pCJ-2VLuc pCJ-3/Luc CMV Luc BCH pA CMV Cliimcric nitron Luc SV40 pA CMV Cliimcric iiilron Luc BCH pA

Fold increase

第一圖 1302166 (A)

Days post challenge 第三圖 1302166 o o o o o o 8 6 4 2 o 8 έ 111 11(—3)3—— o o o o o o o o o o o o p〇-3(+) -Θ- pE(+) pIVlE(+) |>CI-3/ME(+) pE(-) -A- pC：.l-3/ME(-)

Time after injection (weeks) (B) o o o o o 0 8 6 4 2 11 (％) lrtls

第四圖 1302166 (—3) 3-i— 0

Time after injection (weeks) g (％) ijns

Days post challenge 第七圖