TWI302166B - - Google Patents

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TWI302166B TW95100014A TW95100014A TWI302166B TW I302166 B TWI302166 B TW I302166B TW 95100014 A TW95100014 A TW 95100014A TW 95100014 A TW95100014 A TW 95100014A TW I302166 B TWI302166 B TW I302166B
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  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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1302166 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種DNA疫苗,尤指可於臨床上使用發 揮效果的日本腦炎病毒DNA疫苗者。 【先前技術】 曰本腦炎係一經由蚊子傳染的病毒傳染疾病,其病原 係日本腦炎病毒(Janapese encephalitis virus, JEV)〇 曰本腦炎死亡率高,且該疾病之影響區域廣及大部分亞洲 國豕。以往所用之疫苗係將病鼠腦中萃取之病毒,以福馬 林處理而成之製劑。該疫苗雖成功的降低日本腦炎每年感 染病例至10到30例左右。但是製作該疫苗需使用大量實 驗動物,且鼠腦組織會引起過敏等副作用。隨著科技之進 步,前述取活體組織製作之疫苗,愈發有可加以改革的空 間。 & 為在體内引起類似該傳統疫苗的免疫防禦的效果,可 使用可編碼抗原蛋白之ΜΑ質體(plasmid),以作為關八 疫苗。該等質體利用驅動子(pr〇m〇ter),以啟始心題的 合成。今日大多之DNA疫苗採用來自細胞巨大病毒 (cyt⑽egalovirus,CMV)之啟動子。該等來自病毒的啟動 子=效果雖然在老鼠的動物實驗中普遍有高效率的免疫保 力仁在其他包括靈長類的物種中的免疫保護能力則 是有南有低。 造成DNA疫苗在靈長類免疫保護能力低落的可能原因 之一,在於該DNA質體表現(exPressi〇n)不佳;其他原因 1302166 則匕括有穩疋RNA之多聚腺嘌呤(p〇lyadenylati〇n)的作 用’以及作為抗原的病毒蛋白之結構是否產生正確的折 且此外純化負體時所利用的抗生素基因,亦可能引起 過敏副作用。 由上所述,目前應用於靈長類的日本腦炎DNA疫苗仍 有其不足,有待進一步改良。 【發明内容】 為解決上述各項影響DNA疫苗效果的問題,以及避免 可能的副作用,本發明的目的在於提供—日本腦炎艱疫 苗以引發高效的免疫保護反應,並降低可能因抗生素引起 的副作用。為達到該目的所採取的技術手段,係令本發明 之日本腦《DNA疫苗包括有至少—個載體,其中該至少一 個載體編碼日本腦炎病毒膜蛋白及外套蛋白序列。 其中該曰本腦炎病毒膜蛋白係由一曰本腦炎病毒膜蛋 白别驅物㈣)所生成,本發明者發現,表現曰本腦 炎病毒膜蛋白前驅物及外套蛋白,可令所得到的病毒蛋白 質進行正確的摺疊,形成適當的構形。與僅表現日本腦炎 病毒外套蛋白者相比較,可令接受該日本腦炎驗疫苗的 生物體體内產生較高效㈣抗體,提供較強的免疫保護。 前述至少-載體進而包括有至少一多聚腺嗓吟序列。 =而包括有至少-多聚腺嗓吟序列之至少一載體, ,、中遠夕聚腺嗓呤序列係為牛生長激素之多聚腺嗓吟序 RNA轉錄本,增加牛生 由於多聚腺嘌呤序列可以穩定 1302166 長激素之多聚腺嘌呤序列或其他多聚腺嘌呤序列,將有助 於蛋白質表現。 前述至少一載體進而包括有至少一插入子。 該進而包括有至少一插入子之至少—載體,該插入子 為嵌合型插入子’該插入子包含來自人類石免疫球蛋白基 因第-插人子區的5’端剪接提供者區’以及免疫球蛋白基 因重鏈多變區域的3,端剪接接受者區。 前述至少一載體進而包括有至少一抗藥基因。 該進而包括有至少一抗藥基因之至少一載體,其抗藥 基因係抗康黴素基因。 在質體中常加入抗藥基因以利建構質體時篩選之用。 其中最常用的是可抗青黴素等内醯胺(lactam)類抗生素的 抗藥基因Am〆。但因為在臨床上常使用該類藥物,故引起 過敏的疑慮較高。因此本發明中採用較不易發生該問題之 胺醣類的康黴素的抗藥基因Kanr。 該進而包括有至少一啟動子之至少一載體,該啟動子 係為細胞巨大病毒之早期啟動子。 前述至少一載體進而包括有至少一加強子。 將本發明提供之日本腦炎DNA疫苗送入日本腦炎病毒 佰主體内,可刺激免疫系統之反應,產生免疫防禦的效果。 並避免副作用’再藉由加強日本腦炎病毒的表現,可使免 疫系統生產效價更高的抗體,以及有類似傳統疫苗效果的 類病毒顆粒(virus like particle,VLP)。 【實施方式】 6 1302166 以下配合圖式說明本發明具體實施方式。其中所使用 之日本腦炎病毒係Beijing-l病毒株,以小鼠腦組織培養。 同時病毒基因之選殖(cloning),以及日本腦炎病毒之感 染實驗平臺亦以之建立。
實驗用小鼠係購自國家動物中心的C3H/HeN雌性小 鼠,飼養於國立臺灣海大學生命科學院之實驗動物房。 Beijing-Ι病毒株對12-14週C3H/HeN小鼠之半致死劑量 (LD^)係3.0x1 〇5 pFu。在進行日本腦炎感染致死實驗時, 對C3H/HeN小鼠進行腹膜注射,施以5〇倍於半致死劑量 之曰本腦炎病毒,再對其進行腦部假注射。 日本腦炎感染致死實驗的C3H/HeN小鼠在施予病毒之 後的三十日内,每日觀察其病毒腦炎病徵。 實施例1 :建構各表現載體 pcDNA3 (Invitrogen,San Dieg〇,CA,USA)係一真核 表現載體,包括有一細胞巨大病毒早期啟動子、一加強子、 一牛生長激素的多聚腺嘌呤序列、一安比西林抗藥基因、 以及一新黴素挑選標記基因。 臨床載體P3224包括有一細胞巨大病毒早期啟動子、 一加強子、細胞巨大病毒之插入子A、一牛生長激素的多 聚腺嘌呤序列、一康黴素抗藥基因。
pRL-CMV(Promega,Madison,WI, USA)之处/η/万⑽HI 片段,以及 P3224之/如1/5^/1片段相互接合以形成一嵌合載體 7
1302166 pCJ-1 。 將pCJ_l之螢光酵素(luci f erase)基因移除得一載體 稱 p C J - 2 pCJ-2僅包括有一 Wil切點,故另插入一含有複數切 點的序列以形成pCJ-2’。 pCJ-2’包括有一細胞巨大病毒早期啟動子、一加強子、 一嵌合插入子、一 SV40多聚腺嘌呤序列、一康黴素抗藥 基因。 將pCJ-2’之SV40多聚腺嘌呤序列替換以一牛生長激 素多聚腺嘌呤序列,即成pCJ-3。 pC J-3包括有一細胞巨大病毒早期啟動子、一加強子、 一嵌合插入子、一牛生長激素多聚腺嘌呤序列、一康黴素 抗藥基因。 各不同載體之表現量係以螢光酵素報導系統加以測 試。將一螢火蟲螢光酵素基因(取自pGL 3-basic,其係購 自 Promega,Madison,WI,USA)置入前述 pcDNA3、p3224、 pCJ_2’、及 pCJ-3等載體,分別製成 pcDNA3/Luc、 p3224/Luc、pCJ-2’ /Luc、及 pCJ-3/Luc 各載體。日本腦 炎病毒膜蛋白之互補DNA(cDNA)序列,係以反轉錄以及聚 合酵素連鎖反應(PCR)的方式,取自曰本腦炎病毒 Beijing-1病毒株基因體。其中所使用之PCR引子組係: 5’ -GATGAAGCTTGCCATGGTGGTATTCACCATCCT03’(正向) (SEQ ID NO: 1 ) 以及 8
1302166 實施例2 :不同插入子與多聚腺嘌呤對螢光酵素表現 的影響 在實施例2中,檢視了二個插入子對表現的影響。其 一由細胞巨大病毒之插入子A所組成,另一係一嵌合插入 子。該欲合插入子包括有人類石免疫球蛋白基因第一插入 子5’端剪接提供者區的序列,以及免疫球蛋白基因重鏈多 變區域3’端剪接接受者區的序列。 此外’為測試多聚腺嘌呤訊息序列對表現的影響,在 實施例2中比較了二不同的多聚腺嘌呤訊息序列。SV4〇以 及牛生長激素之多聚腺嘌呤訊息序列皆係表現載體中常用 者。該多聚腺嘌呤訊息序列插入含有細胞巨大病毒啟動 子、螢光酵素報導基因、以及插合子的載體。各載體的表 現量以螢光酵素報導系統加以測量。 2· 1 細胞轉染(transfection) 將約2xl〇5 BHK(ATCC CCL-10)細胞植入6孔培養盤, 且在轉染之前4小時更換新鮮培養基,再使用鈣離子沉積 法將DNA送入細胞: 將 5# g DNA 溶於 220 " 1 之 0. 1 倍 TE(1 mM Tris-C1 ; 0. 1 mM EDTA [pH 8· 0])緩衝液, 再加入 250 /z 1 之 2 倍 HBS(280 mM NaCl; 10 mM KC1; 1. 5 mM Na2HP〇4; 50 mM HEPES; 12 mM dextrose [pH 7.05]) 緩衝液, 接著加入31 // 1之2M CaCl2溶液,並適度搖晃之。
1302166 置該混合液於室溫25分鐘,再將該轉染溶液遂滴加 入前述培養基,並於37°C靜置5小時。 移除該培養基, 於室溫下加入1倍HBS之15%甘油溶液,靜置2分# 再移除該1倍HBS之15%甘油溶液, 並以1倍PBS加以洗滌。 最後加入新鮮培養基並培養於37°C。 2.2 螢光酵素檢驗(Luciferase assay) 在轉染之後,以1倍PBS洗條細胞,加入2 0 〇 # 1報 導分解(lysis)緩衝液(reporter lysis buffer, RLB)(Promega,Madison,WI,USA)。在離心令大量細胞 殘潰沉積之後,取其上清液,以BCA蛋白檢驗反應劑(Pi erce USA)檢驗之。又取20//1細胞殘渣(25/zg全蛋白質)與1〇〇 # 1螢光酵素檢驗反應劑(Promega, madison, WI,USA)處 理’在螢光測量儀中測量其2 5 e g全蛋白質之相對螢光酵 素活性單位(relative luci f erase activity unit, RLU) 數值。 第一圖揭露有各不同載體在BHK細胞中表現螢光酵素 活性的比較結果。各項資料皆為六項獨立重複實驗結果之 平均。pCJ-3/Luc 之表現量 1· 6xl07 RLU 為最高,p3224/Luc 之表現量3· 4xl06 RLU,而pcDNA3/Luc之表現量僅3.〇χΐ〇5 RLU。該圖以pcdnA3/Luc之表現量為一倍,對各組進行比 較,可知所觀察到pCJ-3/Luc之表現量為pcDNA3/Luc表 11
1302166 現量的53倍,而P3224/Luc之表現量為pcDNA3/Luc表現 量的11倍。 含有牛生長激素多聚腺嘌呤的PCJ-3之表現量為 1· 6xl07 RLU,含有SV40多聚腺嘌呤的PCJ-2’之表現量為 3· 6xl06 RLU。pCJ-3之表現量約為pCJ-2表現量的5倍。 2· 3 點墨分析(dot-blot analysis) 轉染細胞以冷PBS洗滌2次,並加入300 # 1之NP-40 分解緩衝液(1% NP-40,150 mM NaCl,50 mM Tris [pH 8. 0], 系示合式蛋白酵素抑制劑(protease inhibitor cocktail)
[Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany])分解之。 在 4°C 以 l〇〇〇〇xG 離心 10 分鐘,以 SDS-PAGE(12.50/〇 polyacrylamide)分析其殘渣。再於轉印緩衝液中(〇. 1% SDS, 25 mM Tris [pH 8·4],192 mM glycine,20% methanol)以 50mA 轉印2小時到硝化纖維膜。濾紙先以阻斷緩衝液(bl〇cking buffer) (5% skim milk,150 mM NaCl,50 mM Tris [pH 8· 0]) 處理2小時,再以抗日本腦炎病毒外套蛋白質單株抗體 E3· 3(1//g/mi)溶液於室溫浸泡1小時後,用洗滌緩衝液 (0.05% Tween 20, 1% skim milk, 150 mM Tris [pH 8.0]) 洗條5分鐘,接著在加有山羊抗小鼠IgG Fc區HRP標記 抗體( 1:1 000; Chemicon,Temecula,CA,USA)之 PBS-牛 血清(1 %)中浸泡1小時。洗條5分鐘之後,以加強化學螢 光西方點墨偵測系統(Amersham,Little Chalfont, Ul〇 顯影,並曝光於X光底片上。 12 1302166 以點墨分析確認BHK細胞中載體表現量的結果,係揭 • 路於第二圖。請參看第二圖,可知pCJ-3/Ε:之表現量比 P3224/E多3倍,而p3224/E之表現量比pe多約1〇倍。 该結果指出插入子對表現極為重要。而該嵌合型插入子的 表現優於細胞巨大病毒之插入子A。 而與使用SV40多聚腺嘌呤序列之載體相較,使用牛 生長激素多聚腺嘌呤序列的載體表現量則多了 3倍。 Ϊ 實施例3 :不同插入子與不同多聚腺嘌呤序列對抗體 反應及免疫保護力的影響 為確認該等載體是否確可提供針對日本腦炎病毒的免 疫保護,先對雌性C3H/HeN小鼠肌肉注射編碼日本腦炎病 毒膜蛋白的載體,再進行日本腦炎感染致死實驗。由於 C3H/HeN小鼠比起其他小鼠對日本腦炎病毒的感染更加敏 感,故選為本實施例之實驗標的。 本實施例所使用之小鼠,係年齡為6到8週的小鼠。 一組五隻小鼠,分別在麻醉後接受注射,間隔3週,共注 • 射3次,每次注射5 0 // g DNA於兩側四頭肌,且在注射前 一週’以心臟毒素(cardiotoxin) (Sigma,St· Louis,M0, USA)處理將接受注射的肌肉。在不同時間點取鼠尾血分析 曰本腦炎病毒外套蛋白特異抗體。該抗體係以EL IS A方式 量測。終端效價(end-point titer)係以最高稀釋倍率決 定。且在設定截斷值(cutoff)為0·05的情況下,該最高 稀釋倍率之吸光值需至少2倍於對照組。低於偵測極限者 13 1302166 定其值為10,因起始稀釋倍率即為1:1〇。 第三圖係為抗體效果測試的結果。請參閱第三圖(A), 第3週時’各組在產生日本腦炎病毒外套蛋白特異抗體方 面並無顯著差異。到了第六週,pCJ-3/E產生了 3倍於 pCJ-2’/E、2倍於P3224/E、以及3倍於pE的抗體。而在 第 8 週,pCJ-3/E 產生了 1· 6 倍於 pCJ-2,/E、1 倍於 p3224/E、
以及2倍於pE的抗體。請再參閱第三圖(B),在第16週 時’曰本腦炎感染致死實驗的小鼠存活率顯示出,pCJ_3/E 對曰本腦炎的感染提供了完全的保護能力,而p3224/E與 pCJ_2’/E之小鼠存活率為8〇%,pE之小鼠存活率則為6〇0/〇。 綜上所述,該等資料明確指出一嵌合型插入子,以及 一牛生長激素多聚腺嘌呤,能有效提高以肌肉細胞為目標 之試管内基因表現與生物體内免疫。 實施例4 :結構構形對抗體反應及免疫保護力的影響 4· 1結構構形對DNA疫苗所引起免疫保護能力的影響 心臟毒素或bupivacaine之處理,可促進肌肉的壞死 以及再生。咸信該處理有助於肌肉對DNA的吸收與表現。 為了確認是否結構構形可在不使用心臟毒素的情況下,增 強日本腦炎DNA疫苗的效果,遂以1〇〇// g的pE、pME、或 pCJ-3/ME,注射有使用心臟毒素的C3H/HeN小鼠以及對照 組C3H/HeN小鼠的四頭肌。 結果如第四圖所示,未使用心臟毒素的對照組不產生 抗體也不產生免疫保護能力。請參閱第四圖(A),在第六 14 1302166
週,使用心臟毒素之pCJ-3/ME較未使用心臟毒素者多產 生了 3倍的抗體。而在第八週時,無論使用心臟毒素與否, pC J-3/ME所產生的日本腦炎病毒外套蛋白特異抗體則相去 不遠。在第六週,使用心臟毒素之pCJ-3/ME所產生的抗 體分別為pE之25倍、pME之1· 3倍;在第8週時,pCJ-3/ME所產生的抗體則分別為pE之9倍、ρΜΕ之1倍。請 參閱第四圖(Β),在第一次引起免疫反應的8週之後,其 小鼠存活率顯示出,使用或不使用心臟毒素的PC J-3/ME、 以及使用心臟毒素的pME,均提供了完全的保護能力,而 使用心臟毒素的pE僅有60%的存活率。 以上結果指出:肌肉注射編碼日本腦炎病毒膜蛋白前 驅物以及日本腦炎病毒外套蛋白之日本腦炎DNA疫苗,無 設在有無使用心臟毒素的情況下,均可產生較高效價之抗 體及產生保護能力,以對抗致命劑量的日本腦炎病毒。 4. 2血清之西方點墨分析 為確認未經心臟毒素處理之小鼠血清中,是否含有曰 本腦炎病毒外套蛋白特異抗體,肌肉注射pE或pC j — 3/ME 於未經心臟毒素處理的C3H/HeN小鼠,其間隔3週,共注 射3次’並在不同時間點以西方點墨法分析量測其血清。 請參閱第五圖,注射pCJ —3/ME小鼠之血清可清楚偵 測到日本腦炎病毒外套蛋白之52kD片段,而在注射pCJ — 3/ME小鼠之血清中則無法偵測到。且該曰本腦炎病毒外套 蛋白特異抗體隨時間增加。 15 1302166 , 4.3電子顯微 請參閱第六圖,為確認結構構形是否有所改變,進而 產生免疫反應及免疫保護能力,使用穿透式電子顯微鏡觀 察pC J-3/ME轉染之BHK-21細胞之形態。 在轉染後48小時,收集上述細胞沉渣,以含有〇. jM 一甲基胂酸鹽緩衝液(〇3〇〇(171&七6 131^161')(0117.4)之2.5% - 戊二醛(glutaraldehyde)溶液固定60分鐘,再以同液洗 • 滌一個晚上。該細胞沉渣接著以醋酸鈾醯(uranyl acetate) 染色並阻斷,再以餓酸固定,精製乙醇去水,包埋於 Eponate-12樹脂。其切片以醋酸鈾醯及檸檬酸鉛(Uad citrate)進行雙染色,以Zeiss 900電子顯微鏡(Carl Zeiss, Germany)觀察。 睛參閱第六圖。第六圖(B)所示者係pcj —3/me轉染之 BHK-21細胞,相較於第六圖(A),其形態正常且類似轉染 前之BHK-21細胞。pCJ-3/ME轉染之BHK-21細胞,於其内 質網皺摺處及高基氏體,可見類似小粒子之結構以及電子 ;密集之結構。在正常的BHK-21細胞中無此等結構,由於 而pCJ-3/ME轉染之BHK-21細胞及日本腦炎病毒感染之ΒΗκ ^細胞皆有該等結構,指出日本腦炎DNA疫苗藉由同時表現 曰本知炎病毒膜蛋白前驅物及外套蛋白,可以在沒有使用 心臟毒素處理的情況下產生類病毒顆粒,於鼠類模式中發 揮DNA疫苗的效用。 1302166 實施例5 . w dna《苗進行一次免疫在抗體反應及免 疫保護力方面的效果 5 · 1單訓里DNA疫苗免疫之免疫保護力 為確認採行一次免疫之本實施例與採行三次免疫之實 施例3及實施例4,是否有類似的效果。將pE肌肉注射於 以心臟毒素處理過之C3H/HeN小鼠一次,而接受單一劑量 之PCJ-3注射者則為對照組。所有的小鼠皆在免疫反應後 8週時施予50倍於半致死劑量的日本腦炎病毒㈣加㈠ 病毒株,其結果如第七圖所示。請參閱第七圖(人),於第3 週及第6週,未經心臟毒素處理之pME與pCJ_3/ME所產 生之日本腦炎病毒外套蛋白特異抗體並無顯著差異。在第 8週,PCJ-3/ME比pME增加1· 3倍抗體。然而,在第3 週、第6週、及第8週,分別產生了高於經心臟毒素處理 之PE 44倍、10.6倍、及9· 4倍的日本腦炎病毒外套蛋白 特異抗體。一如預料,pCJ-3組之小鼠無一產生免疫保護 能力,在日本腦炎病毒感染下亦無一存活。如第七圖(b) 所示,經心臟毒素處理之pE有60%之存活率;相較之下, 接受pME與pCJ-3/ME肌肉注射一次以引起免疫反應且未 經心臟毒素處理者,則有較強的免疫保護力,以及1〇〇%存 活率(施予病毒之後超過30天)。 5. 2小鼠體内產生之中和抗體 表1·藉日本腦炎DNA疫苗引發免疫作用而在小鼠體内 17 1302166 ' 產生之中和抗體
18 1302166 引發免疫作 用次數a jO-3(+) 中和抗體b 1 3 <1/10 <1/10 PE(-) pE㈩ pCJ-3/ME(-) PCJ-3/MEW <1/10 <1/10 1/10 1/10 1/160 1/160 >1/320 >1/λ20 到8週的 以pCJ-3、PE、或pCJ —3/ME,對年齡為 C3H/HeN小鼠分別注射i次或3次以引發免疫作用。注射 3次者每次間隔3週。且再分為經心臟毒素處理者(+ )以及 未經心臟毒素處理者(—)。
b於第一次免疫作用8週後收取的血清,其中和曰本 腦炎病毒之效價係為可減少5〇%溶菌斑數量之稀釋倍率。 各組血清中和日本腦炎病毒的能力係以溶菌斑減少中 和试驗(plaque reduction neutralization test,PRNT) 測定。以pCJ-3、PE、或pCJ-3/ME,對年齡為6到8週的 C3H/HeN小鼠分別注射j次或3次以引發免疫作用。注射 3次者每次間隔3週。且再分為經心臟毒素處理者(+ )以及 未經心臟毋素處理者(—)。於第一次免疫作用8週後收取 血清’並檢測可中和日本腦炎病毒之抗體。請參考表1, 接受經心臟毒素處理或未經心臟毒素處理之pE之肌肉注 射者’其效價無法偵測(<1 :10)。接受pCJ —3/me DNA疫苗 而引發免疫作用者,其抗體效價增加最為明顯(1:32〇)。 此結果指出以pCJ - 3/ME引發單一次免疫作用的效果,在 產生日本腦炎病毒中和抗體方面,以及在未經心臟毒素處 理小鼠之免疫保護能力方面,皆優於經心臟毒素處理,施 予pE之小鼠。 1302166 結論 有效之DNA疫苗需要強效之表現系統,以及適當之結 構構形以發揮其抗原性。本發明提供之DNA疫苗包含一編 碼日本腦炎膜蛋白前驅物與日本腦炎外套蛋白之載體,可 產生類病毒顆粒,係一無須心臟毒素配合之高效DNA疫苗。 該載體所編碼之日本腦炎膜蛋白前驅物與日本腦炎外套蛋 白加強了抗原的穩定性,且對抗原表現細胞呈現了高密度 抗原。 由上所述可瞭解本發明之具體構造以及製造方法,確 可提供一高效日本腦炎DNA疫苗。 根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術 者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明 已敘述特定的較佳具體事實,必須瞭解的是本發明不應被 不當地限制於該等特定具體事實上。事實上,在實施本發 明之已述模式方面,料熟習該項技術者而言顯而易知之 不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之内。 【圖式簡單說明】 第一圖係為試管中各不同載體表現螢光酵素活性比較 曰本腦炎病毒外套蛋白 第二圖係為不同載體所表現的 之點墨分析結果。 第三圖係為不同載體表現日本腦炎病毒外套 起的免疫保護反應之比較。⑴為抗體量,⑻為存活率, 20 1302166 的悴第四圖係為在使用或不使用心臟毒素(cardi〇t〇xin) 旦月况下蛋白質構形對DNA疫苗效果的影響。(A)為抗體 里’(B)為存活率。 第五圖係為在不先使用心臟毒素而注射邱或pcj —3/舭 之小鼠血清西方點墨實驗。 第“圖係為(A)日本腦炎病毒感染之腹細胞以及⑻ 轉木有pCJ-3/ME之BHK細胞的電子顯微攝影。 二圖係為單姻蓋日本腦炎⑽A疫苗之免疫保護能 力比車又。(A)為抗體量,(β)為存活率。 【主要元件符號說明】 益

Claims (1)

1302166 十、申請專利範圍·· 種日本^义DNA疫苗,其係包含至少一個載體, 其:°亥至)一個載體編碼曰本腦炎病毒膜蛋白及曰本腦炎 病毋外套蛋白序列,其中該至少一載體進而包含至少一插 子且°亥插入子為嵌合型插入子,該插入子包含來自人 類免疫球蛋白基因第—插人子區的5,端剪接提供者區, 乂及免疫球蛋白基因重鏈多變區域的3,端剪接接受者區; =該載體進而包含至少—啟動子序列以啟動日本腦炎病 毒膜蛋白及外矣 奮蛋白的表現,且該啟動子係為細胞巨大病 毒之早期啟動子。 #寻利範圍第1項 中。亥載體進而包括至少-多聚腺嗓呤序列 中上t申請專利範圍第2項之曰本腦“ΝΑ疫苗,其 '"夕认卜票吟序列係為牛生長激素多聚腺嗓呤序列。 中兮:二1請專利範圍第1項之曰本腦“ να疫苗,其 Μ載肢進而包括有至少一抗藥基因。 5 ·如申請專利範圍第4項之 中該載體進而h入 不躺夂DNA疫苗,其 進而包含至少一抗康黴素基因。 6 ·如申請專利範圍第丄項之日本 中該載體進而—人 火DNA疫苗,其 秋運而包含加強子序列。 7 ·—種作為日本腦《DNA疫苗的栽 一編碼曰本胳*广主 X私,其包括至少 甸火病t膜蛋白及日本腦炎 列,其中該至少—_、隹而勺人5人病4外套蛋白的序 夕 戟體進而包含至少—才干 子為嵌合型栖〜工 入子,且該插入 I插入子,該插入子包含來自 一 /3免疫球蛋白 1302166 基因第-一插入之 千區的5 ’端剪接提供者區,以及免疫球蛋白 基因重鏈多0 。 又&域的3端剪接接受者區;又,該載體 包含至少一 ^ , 子序列以啟動日本腦炎病毒膜蛋白及 ΛΛ xej I 子、 且咸啟動子係為細胞巨大病毒之早期啟動 其中該载體進而 其中該多聚腺嘌 ’其中該載體進 8 .如中請專利範圍第7項之載體, 包括至少一多聚腺嘌呤序列。 9.如申請專利範園第8項之載體, 呤序列為牛生長激素多聚腺嘌呤序列。 1 〇 .如申請專利範圍第7項之載體 而包含至少一抗藥基因。 0項之载體,其中該載體 、之載植,其中該載體進 丄丄·如申請專利範圍第工 進而包έ至少一抗康黴素基因。 1 2 ·如申請專利範圍第了 而包含加強子序列。 十一、圖式: 如次頁 1302166 公告本 >年么月 pcDNA3/Luc CMV Luc| BCH pA pCJ-2VLuc pCJ-3/Luc CMV Luc BCH pA CMV Cliimcric nitron Luc SV40 pA CMV Cliimcric iiilron Luc BCH pA
Fold increase
第一圖 1302166 (A)
Days post challenge 第三圖 1302166 o o o o o o 8 6 4 2 o 8 έ 111 11(—3)3—— o o o o o o o o o o o o p〇-3(+) -Θ- pE(+) pIVlE(+) |>CI-3/ME(+) pE(-) -A- pC:.l-3/ME(-)
Time after injection (weeks) (B) o o o o o 0 8 6 4 2 11 (%) lrtls
第四圖 1302166 (—3) 3-i— 0
Time after injection (weeks) g (%) ijns
Days post challenge 第七圖
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