TWI287999B - Gene therapy for cardiomyopathy - Google Patents

Description

1287999 五、發明說明（1) 技術範圍

本發 障害的基 說，本發 心肌障害 害心肌部 病或狹心 療法所採 因以外的 用下於障 治療法所 明是有關於將HGF基因非侵入性投與以治療心、月 因治療法及此治療法所採用的治療劑。具體的 明是有關於將HGF基因非侵入性投與於心肌内 基因治療法，特別是有關於在超音波使用下於障 位注入HGF基因，更有效率的治療心肌炎等心疾 症、心功能不全的心肌障害基因治療法以及此治 用的治療劑。更進一步，本發明是有關於HGF基 其他基因亦可能適用的基因治療法，在超音波使 害組織部位非侵入性投與基因的基因治療法及此 採用的治療劑。 的 背景技^ 近 統的範 題即如 心 疾病的 症、缺 明確基 前最先 型心肌 究，被 者的家 Μ 年來醫療 ,，此領 心肌障害 肌障害是 總稱，例 血等為基 礎疾病卻 進的、以 炎（HCM) < 認為常是 族為對象 技術有 域有許 問題。 指以心 如心肌 礎之疾 發病的 基因層 > HCM 患 染色體 進行連 I人的進步’然而卻無關於循環系 多問題還未解決，其中之一重要課 =的器質性或機能性異常為起因之 k可勿類為以高血壓、代謝異常 病而續發的二次性心肌炎，以及無 突發性心肌炎（ICM)等。lCM中，目、 次（level)研究瞭解病因者為肥大 者中有半數以上，根據家族病史研 之顯性遺傳形式造成。以這種好發 鎖分析，至今已辨認出5個與造成

1287999 五、發明說明（2) 此病相關的病因基因片段，其中有4個是特指病因基因本 身。 此外’擴張型心肌炎（DCM)的病症中多為單發例，約 有2 0%被認為有家族病史。以這種好發性家族為對象進行 連鎖分析’發現7種特定病因基因片段（然而病因基因尚不 明）與此有關。 然而’有關心肌障害進行這種病因基因之認定與發症 機轉之暸解的研究時，對於其基因治療，至今還沒有具體 可行的方法。 一方面，最近的分子生物學研究突飛猛進，以基因導 入法使細胞機能再活化已不是夢想，並有種種的組合方法 可應用。特別是，在心臟導入基因的方法中，已經有靜脈 内注射法（J· Clin· Invest. 90， 626-630(1992))、直接 注入法（Circulation, 82，22 1 7-2 22 1 ( 1 990 )、 Circulation，90，241 4-2424( 1 99 4))或是直接採用載體 於冠狀動脈内擴散注入法（J· Thorac. Cardi〇vaS(^

Surg·， 1〇9， 7 1 6-720 ( 1 995 ))等幾項報告，而沒有非侵入 性的具體治療法。 X 登明概要 本發明的目的是提供至今尚未發現有效之治療法的心 肌障害非侵入性治療法以及此治療法所採用的治療劑。: 就是說，本發明的目的是提供以HGF基因非侵入性投與°， 而進行心肌障害治療的基因治療法以及其所採用的/療

1287999 五、發明說明（3) f二具體的說’本發明的目的是提供以HGF基因於心肌内 ，入性投與的心肌障害基因治療法，特別 =下，將㈣基因注人於障害心、肌部位，更有效率用的^ 〜肌炎等心疾病或狹心症、心功能不全等的心肌障害美 因Μ療法以及其所採用的治療劑。更進一步，本發明的目 的疋提供HGF基因以外的其他基因也能適用的基因治療 法在超音波使用之下，對於障害組織部位進行非侵入性 基因投與的基因治療法及其所採用的治療劑。 本發明研究者經過深入研究檢討的結果，發現使用 HGF基因作為治療用基因，非侵入性的直接注射於患部心 肌層’可以得到有效的效果。也就是說，本發明者發現不 必2刀開患部或是進行開胸手術，於超音波的使用下以肉眼 I7 了達到在患部心肌層注入HGF基因的效果。由於該治療 法為非侵入性的治療法，可以依據病況投與該基因數次， 因此可以有效果的進行心肌障害治療。 因此’本發明研究者是首次發明，於超音波使用下， X肉眼進行直接對患部組織投與基因之有效的治療，由此 可知其他各種臟器特異之疾病的基因治療也可以本發明方 法進行。 例如，採用HGF基因時’以本發明方法，可以對各種 ，15特異的疾病，例如肺纖維症、或是肝硬化、肝纖維症 等進行治療。更進一步，HGF基因以外的其他基因治療用 基因也可以前述之本發明方法進行更有效的治療。 也就是說，本發明的要旨如下列所示。

MR 2125-3899-PF.ptd 第6頁 1287999 五、發明說明（4) (1) 分 (2) 於〇 (3) 一種心肌障害治療劑， 且為非侵人性投與，〃内3有HGF基因作為有效成 如上述（1)所記載的户淼 肌内， σ〜、蜊，/、目的為將HGF基因投與 如上述（1)或（2)所印_ μ 毒（Sendai virus)(HVj)°载台療劑，HGF基因為仙台病 (4)如上述⑺或記載m\1P〇議e)的型態， 音波使用之下，對障坌心肌邱、劑，其目的是為了於超 C 5)如上述（1)〜（4)任何頊由仏“处 又” 次，投與8次， 7員中所圮載的治療劑，至少每週i (6)如上述（1)〜（5)任何頊φ % ^ | 少採用10/zg， 、中所兄載的治療劑，HGF基因至 為心肌炎、狹心症或是心臟功能不全， 1早。 (8) —種基因治療劑，盆向人本 m…、二上其内含有對障害治療有效的基因作 非侵入性投與。 用下對卜害組織部位進行該基因 =如△述記載的治療劑，組織障害部位為心肌， 二/ 9)所記载的治療劑，基因為HGF基因，

(11) '一種心肌P早害6^]其RE1 τ±. k 土口〉口療法，包括將HGF基因非侵入 性的投與於υ έ人類之哺乳動物的心肌内， (12) 如上述所記載的治療法，HGF基 (HVJ) -脂肪體的型態， 母 (13) 如上述（11)或（12)所記載的治療法，HGF基因為於超

1287999 五、發明說明（5) ------ — 音波使用之下，對障害心肌部位進行非侵入性投與， (14)如上述（11)〜（13)任何項中所記載的治療法，郎1?基 因為至少每週1次，投與8次， (1 5、）如上述（11)〜（丨4)任何項中所記載的治療法，心肌障 害為心肌炎、狹心症或是心臟功能不全， 6 ) 一種基因治療法，其中含有於超音波使用之下，在 P早害組織部位進行非侵入性之障害治療而投與有效基因， (1 7)如上述（1 6 )所記載的治療法，障害組織為心肌， (1 8 )如上述（1 6 )或是（1 7)所記載的治療法，基因為基 ，其目的乃是為了非侵入性投與 使用，HGF為仙台病毒（HVJ) —

(19) 一種HGF基因的使用 用心肌障害治療劑的製造 (20) 如上述（19)所記載的 脂肪體的型態， (21)如上述（19)或是（2〇)所記載的使用’是為了於超音 ^使用之下，在障害心肌部位進行非侵入 的治療劑， 土口仅>、 (2 )如上述（1 9 )〜（2 1 )任何項所記載的使用，心肌障宝 才曰心肌炎、狹心症或是心臟功能不全， 。

的使用，其目的乃是為了於超音波使用之 在卩早σ、、且織部位進行非侵入性障害治療有效基因投 之基因治療劑的製造， (2 = )如上述（23)所記載的使用，障害組織為心肌， 如上述（23)或是（24)所記載的使用，基因為HGF基

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圖面的簡單說明 圖1表示於心肌炎倉鼠的心臟，採用HVJ導入作為報導 (reporter)基因的蟲熒火素酶（luciferase)，顯示出蟲癸 火素酶活性值為高值，乃是於超音波使用之下導入基因的 證明結果示意圖（graph)。 圖2表示以A L P染色測定心臟中微血管密度，η g 美因 組及對照組（c ο n t r ο 1 )的比較結果示意圖。 圖3表示將心臟血流量以雷射都卜勒影像 (LaseroDoppleroImage)(LDI)評比法（score)評估，比較 HGF基因組與對照組、及非處理組的結果示意圖。 圖4表示以Mas son染色測定心肌中纖維化的分佈密 度，比較HGF基因組與對照組的結果示意圖。 實施發明的最佳狀熊 本發明所使用的HGF基因可說是由表現之{JGF得到的基 因，該基因表現出的多胜肽（polypeptide)限於與HGF實質 上同樣效果者’其基因序列之一部份缺失或是以其他鹽基 置換、以其他鹽基序列插入一部份、5，端及/或3，端鹽基 結合等基因皆包括在内。這樣的基因有，如Nature，342, 440(1989)、特 §午苐 2777678 號公報，Biochem· Biophys· Res. Commun., 163, 967(1989) ^ Biochem, Biophys.

Res· Coramun·， 172，32 1 ( 1 990 )等記載的 HGF 基因，這樣

2125-3899-PF.ptd 第9頁 1287999 五、發明說明（7) 的基因將在本發明中使用到。 此處HGF基因（HGF編碼cDNA)的鹽基序列除了前述文獻 記載之外，Genbank等資料庫（database)也有登錄。依據 於此’基於這些序列資訊採用適當的DNA部份作為PCR的引 子（primer)，例如對於肝臟或白血球由來的.^進行 RT-PCR反應，而可以選殖得到HGF的⑼“。這樣的選殖是 根據如Molecular Cloning 2nd Edt·，Cold Spring

Hatboi: Laboratory press(i 989 )等基本書，對業者而言

很容易操作。此外，HGF基因的改變等，也是根據前述基 本書，業者亦容易操作。 、接著’將對本發明基因治療所採用的基因導入方法， 導入形態及導入量等方面進行說明。 以HGF基因作為有效成分之基因治療劑投與於患者 B、，其投與型恶為非病毒性載體與採用病毒性載體（viru vyc^or)時疋元全不同的，在實驗操作手冊等中會有其調 ί 14、投與法等詳細的解說(別冊實驗醫，，基因治療的 驗：土社，1 996 ’別冊實驗醫學，基因導入與;

么♦ mi平土社，1 997 ,日本基因治療學會編基1 ，療開發研究主手冊，NTS，1 999 )。以下將做具體的說明（ ΐΑϋ病肯彳體的情形 $用丨貝用作為基因表現載體之目的基因重組而得到白 織中：現載體’依照下述方法可將目的基因導入細胞或^ 作為基因導人細胞的方法有，如脂肪微粒送入法

1287999 五、發明說明（8) (1 ipof ect ion)、磷酸-鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖（dextran) 法、採用微小玻璃管直接注入DNA法等等。 此外，作為導入組織的方法有，以如内包型脂肪體 (internal type liposome)基因導入 >去、以靜電氣型月旨肪 體（electrostatic type liposome)基因導入〉去、jjyj 一月旨 肪體法、改良型HVJ-脂肪體法（HVJ-AVE脂肪體法）、受器 (receptor)媒介性基因導入法、金屬粒子（particle)载體 與D N A分子共同移入細胞法、n a k e d - D N A直接導入法、以正 電荷聚合物（polymer)導入法等，以上述提供的任何種方 法，將重組表現載體送入細胞皆可。

其中HV J-脂肪體是於製出脂質二重膜的脂肪體中封入 DNA，再將此脂肪體與不活化之仙台病毒 (Hemagglutinating virus of Japan: HVJ)融合而製成。 該Η V J -脂肪體法與目前所用的脂肪體法比較，其特徵為與 細胞膜的融合活性非常高，是較佳的導入型態。有關Hvf 脂肪體的調製法在文獻（實驗醫學別冊，基因治療的基礎 技術，羊土社，1996，基因導入與表現解析實驗法，羊土 社，1997, J. Clin. Invest· 93， 1458—1464(1994)，

Am· J· Physiol· 271，R1 2 1 2 - 1 22 0 ( 1 996 ))等中有詳細

敘述，可以參照其作法。此外，HV j _脂肪體法在如 、

Molecular Medicine， 30， 1440-1448(1993)，實驗醫風 12，1822-1826(1994)，蛋白質•核酸•酵素，42，予’ 1 80 6- 1 8 1 3 ( 1 997)等亦有記載方法，以circulati〇n， 92，（Suppl· II)所載方法為佳。

1287999 五、發明說明（9) 而且HVJ以採用Z株（可以*ATCC取得）為佳，基本上直 他株（例如ATCC 0-90 7及ATCC VR-105等）也可以採^ 用。 另外，naked-DNA直接導入法為上述方法中最簡便的 方法，由此觀點來看，這也是讓人易於採用的方法。 此處所採用之表現載體為，只要是可以於活體内表現 目的基因的載體，不論何種皆可採用，例如pCAGGs(Gene 108， 193-200(1991))、及pBK-CMV 、pcDNA3.1 、 pZe〇SV(Invitr〇gene 公司、Stratagene 公司）等的表現 體。 Β_· 採用病毒性載體的情飛 病毒載體以重組腺病毒（Adenovirus)、反轉錄病主 (retrovirus)等病毒載體的為代表。更具體的說了::以 無毒化反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒 (herpesvirus)、牛痘病毒（Vaccinia virus) /殖病毋主 (poxvirus)、脊髋灰白質炎病毒（p〇H〇vir ^^ t 主新比斯病 毋（Syndlns Vlrus)、仙台病毒、SV4〇、免疫不全症候届 病毒（HIV)等的DNA病毒或是RNA病毒來導入曰沾、砰 細胞感染重組病毒，而能使基因導入細胞内。 從 前述病毒載體中，已知腺病毒的感染效 病毒載體時為南’由此觀點來看，採用腺/、他 佳。 π脲病毋載體系統較 本發明之基因治療劑導入患者的方法 直接導入體内的i n v i vo法，及由人取出掌土 ’口療劑 %出杲種細胞到體外 2125-3899-PF.ptd 第12頁 1287999 五、發明說明（10) 再將基因治療劑導入該細胞、將該細胞送回體内原處的ex Vivo法（曰經科學，1 994年4月號，20-45頁，月刊藥事， 36(1)，23-48 ( 1 994 )、實驗醫學增刊，12(15)， （ 1 994 )， 曰本基因治療學會編基因治療開發研究手冊，NTS， 1 9 9 9 )。本發明以採用i n v丨v〇法為佳。 製劑型態以上述各投與型態綜合種種的製劑型態（例 如液劑等）而得。例如含有有效成分之基因的注射劑時， 该注射劑可以常法調製，例如以適當的溶劑（pBS等的緩衝 液.、生理食鹽水、滅菌水等）溶解後，必要時因應以濾膜 (filter)等過濾滅菌，接著充填於無菌容器中調製而成。 該注射劑必要時可加入相應的慣用載體等亦佳。此外，

Hy-脂肪體等的脂肪體中，以懸濁劑、冷康劑、離心分離 滚縮冷凍劑等的脂肪體製劑型態亦可。 除以本發明導入HGF基因外、,M ^ m lt ^ ^ m rTL rz 卜，也可以併用内因性心肌 暗堂卩主A * 口于。例如報告指出心肌細胞 P早害時會表現大量的TGF-沒β & η ^ Μ ^ Ρ及熱休克蛋白（HSP)等因子， 疋有關使心肌障害減輕的心軋 m , · e此且m 肌修復功能，因此也可以採用 延些基因。又及，有報告招^ ^ 钟的插德a egf等增殖因子具有修復組 織的種種細胞障害功能，也可 T Μ 乂採些基因。更進一步，除 了廷些心肌保護因子及再生因 κ β + HIT仅罐》$丄 1 于外，也可以採用有關於心 肌保邊及再生的因子。 本發明是這些HGF基因單循+ θ 入、、臨、/λ 竭或疋與其他基因組合再導 入心臟的心肌細胞，在大量表 丹守 肌細胞專必要的目的蛋白。如 ^ 此而來，可求得受損傷細胞

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五、發明說明（Π) 等再活化的能力而能修復再生心肌細胞等，估μ # ^ 從丨曰於心肌陸 害的心機能回復正常化。根據本發明的基因治療劑，口、 用於重症心肌炎患者、除心臟移殖以外無治療方法的^ = 也可以治療。 〜 此外，本發明的治療劑不只可適用於重症心肌炎串 者，對於發展中的輕度心肌炎患者也適用。而Β ^二 4 叩且，也可以 應用在狹心症及心功能不全等的心肌障害患者。

本發明的基因治療劑對於治療目的患者，相應其症狀 而選擇適當的投與方法•投與部位。投與部位以二^内 (障害心肌部位）的投與為佳。此外投與方法以非經口投與 為佳。 广 較適當的非經口投與方法可以是以如非侵入性醫用電 氣儀（c a t h e t e r)或是非侵入性注射器等投與方法。更佳的 方法可以是在超音波的使用下，以非侵入性醫用電氣儀或 是注射器等的投與方法。採用非侵入性醫用電氣儀投與方 法時，有如於心肌内直接注入HGF基因的方法。 本發明的治療劑投與量為依患者症狀等而異，以HGF 基因而言，成人患者約為〇· 〇〇〇lmg〜1()〇mg的投與量，以〇· 0(Π〜10mg程度的投與量為佳。

此外，若為HVJ —脂肪體的型態時，以HGF基因而言， 成人患者選擇約為1〜4 0 0 0 // g之範圍的投與量，以約 10〜400//g的範圍為佳。 本發明的治療劑較適用於非數日而為數週投與一次， 例如以每週一次投與為佳。

2125-3899-PF.ptd 第14頁 1287999 五 、發明說明⑽ 的可t ί ?數依患者症狀選擇適當者。依治療目的而相應 导又一數次，例如以8次投與為佳。 障宝a步，本發明疋提供含有於超音波使用之下，對 之；卩位進行非侵入性對障害治療有效之基因的投與 發明療法，以及其所採用的治療劑。也就是說，本 進杆^3、曰波使用下以肉眼直接對患部組織投與基因， 性#金 > 之治療的首次發明。該治療法具有因基因非侵入 以^ 而可以依病況投與數次期待用於治療之基因，為 不卩卩於Hrif/斤沒有的優點。如此而來，本發明的基因療法 ^ Μ ' 土因，還可以適用於基因治療用的所有基因。 療法對使用於障害心肌部位時特別有效。此時投 阳土可以是如HGF基因及TGF一冷基因、HSP基因、VEGF 土因、FGF基因、EGF基因等。 以下將以實施例對本發明作具體的說明，但是本發明 、’不限於實施例所述之情形。 實驗材料及方法 豐驗動物 症层乳（Bio 14.6)為由東方（orientai)酵母購 入。 HGF基因 #、^HGFS因是採用人之HGF cDNA(特許第2777678號）以 =法選殖’再播入表現載體 中。 實驗方法

2125-3899-PF.ptd 第15頁 1287999 五、發明說明（13) 1 ·於超音波使用下對心肌炎倉鼠的心臟採用HVJ脂肪體導 入報導（reporter)基因蟲熒火素酶，於1週後調查其活 性。對照組於超音波使用下只有導入PBS。蟲熒火素酶活 性以光度計（1111^11〇1116士61〇(1^11^1:1^95 0 7 (3£1^110[0公司）） 測定。 2·於心電儀（Echocardiogram)(MD500，YOKOKAWA-GE)操作 下，進行心肌炎倉鼠（1 2週齡）心臟腹側心肌的Η V J -脂肪體 製劑注入，以下述1)〜3 )進行研究。 1) 以ALP染色測定心肌内微血管密度，比較HGF基因組與對 照組。 2) 以雷射都卜勒影像（LDI)評比法評估HVJ-脂肪體製劑投 與之心臟的血流量，比較HGF基因組與對照組。 3) 進行心肌Mas son染色，以電腦分析測定纖維化的分佈密 度，比較HGF基因組與對照組。 參考例1 HVJ脂肪體製劑的Μ作

10mg的乾燥脂質（磷酸醯絲胺酸（phosphatidyl serine)、磷酸醯膽鹼（phosphatidyl choline)、膽固醇 (cholesterol)的1:4. 8:2的混合物）與含有HGF基因（1〇〇 # g)-HMGl(high mobility group 1 nuclear protein, 25 //g)的等張液（137//M NaCl，5.4/zM KC1，10#M Tris-HCl ; pH7. 6 ) 20 0 // 1混合，以超音波強力攪拌形成脂 肪體。精製的仙台病毒（2株）於訂（11〇61/1111112/3 6(：)照射3 分鐘。脂肪體懸濁液與仙台病毒（Η V J )混合於4 °C 1 0分鐘，

2125-3899-PF.ptd 第16頁 1287999 五、發明說明（14) 接著於37 °C加溫30分鐘。除去游離的HVJ後，即取得脂 肪體製劑。 參考例2 蟲熒火素酶活性的測定 於倉鼠（1組6隻）投與含蟲熒火素酶基因1 0 // g之脂肪 製劑，1週後測定蟲熒火素酶活性。結果如圖1所示。 如圖1所示，在心臟顯示出蟲熒火素酶之高值，證明 於超音波使用下可以導入基因。 實施例1 心ϋ倉鼠的Η Γτ F基因治療 於1 2週齡的心肌炎倉鼠（丨組6隻）心臟腹側心肌注入脂 肪體製劑1至於對照組則於同樣的丨2週齡心肌炎倉鼠（丨組 6隻）注入含有對照載體的脂肪製劑，另外未處理組為未作 任何處置的心肌炎倉鼠（1組6隻）。之後，每週注入脂肪體 製劑’共8次。8週後，以ALP染色測定20週齡心肌炎倉鼠 的心，心微血管密度，並以LD !評比評估血流量。此 外启鼠女本死後’將心臟摘出以M a s s ο η染色，再以電腦 分析測定纖維化的分布密度。 以ALP染色，發現HGF基因治療組會有顯著因血管新生 而造成之> 微血密度上昇。其結果顯示於圖2。

LD 1评比結果顯示，當對照組作為1 〇〇%時，HGF基因治 療組為163 ± 7% ’有顯著的血流量增大現象。其結果示於 圖3 〇 以Mas son 色分析的結果顯示，Η”基因治療組會有

1287999 五、發明說明（15) 顯著的纖維化分布密度減少現象。其結果示於圖4。 產業上利用的可能性 本發明以HGF基因作為有效成份的心肌障害治療劑具 有患部心肌血管新生的促進、加上患部血流量的增大、心 肌纖維化的抑制與減輕，心肌機能的回復等作用。此外本 發明的治療劑具有於超音波使用之下以肉眼直觀患部心肌 層，非侵入性且確定目標之注入的功能。依據這些效果， 本發明的治療劑對心肌障害具更有效果的治療。

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Claims (1)

1. ^號 9m〇7(UR 1287999 3T、~f請專利範圍 f 人有1肝療突發性心^(icm)之藥學組成物，其内 2.如申請專利範圍第1項' 大、& — 立乃是 用來將HGF基因投與於心肌内。斤述的藥學⑯’，、 直中L如某申Λ專利範圍主第1項或第2項所述的藥學組成物’ Γ Λ'Λ病vJ)-脂肪體的型態。 並乃θ用°來二：靶圍第2項或第3項所述的藥學組成物， 來於超音波使…，對障害心肌部位進行非侵 5·如申請專利範圍第1 ^ 學組成物，其中至少每週丨^到f4項，何項中所述的的衆 6. 如申請專利範圍第j =與::欠。 組成物，其中HGF基因至少^到苐5項任何項中所述的_學 7. 如申請專利範圍第！：用10鞔。 組成物，其中該心肌炎包括員到第6項任何項中所述的藥學 心肌炎（DCM)。 肥大型心肌炎（HCM)及擴張型 8 · 一種製備治療突發祕 括將一HGF基因導入一载體中肌炎（ICM)藥物的方法，包 9·如申請專利範圍第8 以進行非侵入性之投與。 炎（ICM)藥物的方法，苴〜斤述的製備治療突發性心肌 肪體的型態。 、 土因為仙台病毒（HVJ) —脂 1 0 ·如申請專利範圍筮 炎（ICM)藥物的方法，、斤述的製備治療突發性心肌 、目的乃是為了於超音波使用之 2125-3899-PF3.ptc 第19頁 1287999 _案號90107648_年月曰 修正_ 六、申請專利範圍 下，在障害心肌部位進行非侵入性HGF基因投與之治療 劑。 11 .如申請專利範圍第8項到第1 0項任何項中所述的製 備治療突發性心肌炎（I C Μ)藥物的方法，其中該突發性心 肌炎包括肥大型心肌炎（HCM)及擴張型心肌炎（DCM)。

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