TWI309570B - - Google Patents

Description

1309570 五、發明說明（1) 技術簌in 糖尿採用肝實質細胞增值因子(hgf)作為 發明是有關於1特以及治療法。具體的說’本 # Α Μ π /、寺徵為含有HGF基因作為有效成分的糖尿 尸忘刑缺^ Γ病冶療劑及將HGF基因投與於缺血部位的糖 尿病型缺血性疾病之治療法。 概 背景技術

、HGF被發現對於成熟肝細胞是強力的增值促進因子， 為其基因轉殖（Cl0nning)出的蛋白質（Bi〇chem Bi〇phys

Res Commun， 122， 1450(1984) 、proc_ Natl. Acad.

Sci. USA， 83， 6489(1986) 、FEBS Letter, 22， 231 ( 1 987) > Nature, 342, 440 ( 1 9 89 ) > Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 87，3200 ( 1 99 1 ))。根據之後的研究， HGF在活體内時，已知不只作為肝再生因子而具有障害肝 的修復再生能力’還具有血管新生作用，對於缺血性疾病 及動脈疾病的治療及預防具有非常大的效用（S y m p. S 〇 c.

Exp. Biol.， 47 Cell behavior, 227-234(1993)， Proc. Natl. Acad Sci.， 90， 1937-1941(1993), Circulation,

97，381-390(1998))。也就是說，有報告指出在兔子下肢 缺血模式中投與HGF ’會見到顯著的血管新生，產生血流 量的改善、血壓減少的抑制、缺血症狀的改善等。根據這 些報告，今日，發現HGF具有作為血管新生因子這一項功 能，而考慮其機能上的應用。

2125-3906-PF.ptd 第4頁 1309570 五、發明說明（2) ' ---- 因此，HGF以血官新生因子之機能為始，發現具有種 f機能，為作為醫藥品的活用角色而進行種種試驗。然而 攻裡有個問題，就是HGF在血中的半衰期。HGF的半衰期約 只有短短的10分鐘’要維持血中濃度很困冑，而且，讓有 效劑量的HGF到達患部也是個問題。 一般常識而言，席·白极制 曰> t 蛋白性製劑在靜脈内投與時需要較多 劑里，這與前述缺血性痂、忘 .,^ , 性疾病杈式中HGF的投與有關，如例 =中所，的靜脈及動脈内投與（Circulat〇n，97， 381-390(1998))。對於违揭沾^ 机你此 ^ 化樣的動物模式以靜脈或是動脈内 ΐi1 血性疾病或是動脈疾病可以明瞭H G F的有 ，最=二有效的投與方法或是投與量等= ό 敢後並不能得出έ士给。rr » « a、+· 士 > « 付®、口明特別是在投與HGF蛋白時，有 :有效:二:Z ::還有藥物移行至患部的問題，HGF蛋 曰有效的4又與法或是投與晉笙 .卡品 尺3又兴1等都還沒有得出結論。 另一方面，最近分子生物學 使細晌嬙妒五、、羊M·儿 观于日新月異’以基因導入法 使、.田肊機此再活性化也是可 法，採用HGF基因，斌給爹、邮 』以組合種種方 入法有，如冠壯叙r 領域的基因治療。基因導 位之基因導入法Ϊ 等等幾種報告，缺血部 法，具體的說，如對糖:口:：對於骨路肌的肌肉内導入 法顯示出具有效果。 r秩病而έ ，發現忒方 另外，已知併發糖尿病， 疾病會引起血管新生作/ 病1誘發的缺血性 尿病型缺血性疾病而+ ’而預後不良，對於這種糖 扃而5 ，HGF基因的投與是否有效，都還

2125-39〇6-PF.ptd 第5頁 1309570

沒有被研究出來β 發明概要 本發明的目的是提供採用HGF基因作 性疾病的治療劑以及治療法。 為糖尿病型缺血

ΗΓΡ Α本κι發明研究者為了瞭解糖尿病型缺血性疾病是否A 3 δ ’直接在缺血患部投與HGF基因 地得 有效的效果。具體的說，對於下肢缺‘疾病1而：： 引：ί!尿病併發者，或是糖屎病型引發的缺血性疾病會 =官：生困難’而預後將不I。因此與單純缺血：： 尿病餘性疾病，_基因治療有效與 月j並不月瞭，而本發明初次揭示其有效性。 這種以HGF基因來治療的非侵入性治療法，其特 可相應於病況投與該基因數次。 玉馬 也就是說，本發明的要旨如以下所述。 (1) 一種糖尿病型缺血性疾病治療劑，含有肝 胞增殖因子（HGF)基因作為有效成分， 買細 (2) 如上述（1)之治療劑，是針對缺血部位的投與， (3) 如上述（1)或是（2)之治療劑，糖尿病型缺血、’ 病是指糖尿病型下肢缺血性疾病、糖尿病型缺血性疾 害或是糖尿病型心肌梗塞， 、、'S·障 ⑷如上述（3)之治療劑，糖尿病型缺血性疾病為糖 1309570 五、發明說明（4) 尿病型下肢缺血性疾病， (5 )如上述（1)〜（4 )任何項中 部位肌肉内的投與， 、 治療劑，是針對缺血 (6) 如上述（1)〜（5)任何項中 台病毒（HVJ)_脂肪體的型態， 〜療劑’ HGF基因為仙 (7) 如上述（1)〜（6)任何項中 因應的投與數次， 療劑’必要時可以 (8) 如上述（^〜（了）任何項中 採用50 // g， 冶療劑’ HGF基因至少 (9) —種糖尿病型缺血性疾病 、 因導入人體的工程， 沔之冶療法，含有H G F基 (10) 如上述（9)之治療法，Η 與， 土因為對缺血部位投 (11) 如上述（9)或是（10)的治療 疾病是指糖尿病型下肢缺血性疾Γ、' ] ’糖尿病型缺血性 障害或是糖尿病型心肌梗塞，6、糖尿病型缺血性神經 (12) 如上述（11)的治療法，糖 α 糖尿病型缺血性疾痣Θ 4曰糖尿病型下肢缺血性疾病， 、疋 (13) 如上述（9)〜（12)任何項中 、Λ 針對缺血部位肌肉内的投與， 〜’ F基因是 (14) 如上述（9)〜（13)任何項中之治療法，HGF基 仙台病毒（HVJ)-脂肪體的型態， 馬 (15) 如上述（9)〜（14)任何項中之治療法，必要時扣 基因可以因應的投與數次， Η 2125-3906-PF.ptd 1309570 ---- 五、發明說明（5) ___ (16) 如上述（9)〜（Η)任何 >、採用50 # g投與， T之治療法，HGF基因至 (17) 種為製造糖尿病型缺 因的使用， 、性疾病治療劑之HGF基 (M)如上述（17)的使用，糖 糖尿病型下肢缺血性疾病、糖尿^里缺血性疾病是指 糖尿病型心肌梗塞， 良缺血性神經障害或是 (19) 如上述（18)的使用’糖 糖尿病型下肢缺血性疾病， 病里缺血性疾病是指 (20) 如上述（17)〜（19)任何項 仙台病毒（HVJ)-脂肪體的型態， 之使用，HGF基因為 (21) 如上述（17)〜（2〇)任何 少採用50 //g投與。 、中之使用，HGF基因至 圖面的簡單親.明 圖1表示參考例1之糖尿病下肽 缺血的對照组中，其血液灌流组及引起正常族群 經時變化示意圖。 匕丰（PerfUSlon rati0)的 缺二表示參考例1之糖尿病下肢缺血組及引起正常族群 缺血的對照組中’缺血肌肉内的内源性HGF濃度示意圖。 圖3表不對實施例1之糖尿病下肢缺血族群投與hgf基 =及未投與組，肖引起正常族群缺血的對照組中，血液 灌流比率測定結果示意圖。 圖4表不對實施例2之糖尿病下肢缺血族群投與HGF基

m 2125-3906-PF.ptd 第8頁 1309570 五、發明說明（6) 因組及未投與組，與引起正常族群缺血的對照組中，將下 肢缺血部位的骨胳肌以ALP染色’比較單位血管數的結果 示意圖。 圖5表示對參考例2之添加葡萄糖之血管内皮細胞的 HGF添加組及未添加組，與未添加葡萄糖的對照組中，測 定培養上清之MMP-1濃度的結果示意圖。 圖6表示對參考例3之添加葡萄糖之血管内皮細胞的 HGF添加組及未添加組’與未添加葡萄糖的對照組中，血 管内皮細胞中發現之轉錄因子ETS- 1的mRNA量之測定結果

實施發明的最佳狀態

本發明中所使用的「HGF基因」是指會表現HGF(HGF蛋 白）的基因。具體的說如Nature, 342，440( 1 989)、特許 第 2 7776 78 號公報、B i ochem. B i ophy s. Res. Commun.， I 163, 967(1989) 'Biochem. Biophys. Res. Commun., I 172，32 1 ( 1 990 )等所記載的HGF cDNA，以後述適當表現載 體（非病毒載體、病毒載體）組合而應用。此處HGF編碼 cDNA的鹽基序列除了前述文獻記載之外，Genbank等資料 庫（database)也有登錄。依據於此，基於這些序列資訊採 $ 用適當的DNA部份作為PCR的引子（primer)，例如對於肝臟 或白血球由來的mRNA進行RT-PCR反應，而可以選殖得到 HGF的cDNA。這樣的選殖是根據如Molecular Cloning 2nd Edt.，Co 1d Spring Harbor Labor atory Press( 1 989 )等 -

2125-3906-PF.ptd 第9頁 1309570 五、發明說明（7) 基本書，對業者而言很容易操作。 此外，本發明的HGF基因並不限於前述 白質限定於與HGF實質上具有同樣作用之 3 為本發明的HGF基因使用。也就是說，η前述c腿心！ 條件下雜交之DNA及，2)對於以前述cDNA編碼之蛋白、 ί: U /中/1個或是數個(以數個為佳)胺基酸發生 f換、缺失及/或附加的胺基酸序列，得到蛋 中，具有作為HGF作用的蛋白質編碼者於 的11 #。此處前述1)以及2)讀a是以如部位Λ J變”法、PCR法、或常用的雜交法(―⑷如 ^以谷易得到的，具體的方法參考前述的Molecule Cloning等基本書來進行。 接，，將對本發明基因治療所採用的基因導入方 導入形態及導入量等方面說明。 万去、 :HGF基因作為有效成分之基因治療劑投與於 ν!〇；〇；)^Λ4 # ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^(virus 製法、浐食疋法'策王不同的’在實驗操作手冊等中會有其調 基礎技細的解說（別冊實驗醫學，基因治療的 平土社，1 996，別冊實驗醫學，基因導入盥 二實驗法’羊土社，1 997，曰本基因治療學會編基： ~發研究手冊’ Nts，1 999)。以下將做具體 $ 體的情月 ，用慣用作為基因表現載體之目的基因重組而得到 重組表現载體’依照下述方法可將目的基因導入細胞乂： 2125-3906-PF.ptd 第10頁 1309570 五、發明說明（8) 織中。 作為基因導入細胞的方法有’如脂肪微粒送入法 (lipofection)、磷酸-鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖（dextran) 法、採用微小玻璃管直接注入DNA法等等。 此外’作為導入組織的方法有’以如内包型脂肪體 (internal type 1 iposome)基因導入法、以靜電氣型脂肪 體（electrostatic type liposome)基因導入》去、HVj_ 月旨 肪體法、改良型HVJ-脂肪體法（HVJ-AVE脂肪體法）、受^ (receptor)媒介性基因導入法、金屬粒子（particle)載體 與DNA分子共同移入細胞法、naked-DNA直接導入法、以正 電荷聚合物（polymer)導入法等，以上述提供的任何種方 法，將重組表現載體（v e c t 〇 r)送入細胞皆可。 其中HVJ-脂肪體是於製出脂質二重膜的脂肪體中封入 DNA，再將此脂肪體與不活化之仙台病毒 (Hemagglut inat ing virus of Japan: HVJ)融合而製成。 該HVJ-脂肪體法與目前所用的脂肪體法比較，其特徵為與 細胞膜的融合活性非常高，是較佳的導入型態。有關HVJ: 脂肪體的調製法在文獻（實驗醫學別冊，基因治療的基礎 技術，羊土社，1 996，基因導入與表現解析實驗法，羊土 社，1997 ，J. Clin· Invest. 93， 1458-1464(1994)，

Am_ J. Physiol. 271，R1 2 1 2- 1 22 0 C 1 996 ))等中有詳細的 敘述，可以參照其作法。此外，Η V J -脂肪體法在如 Molecular Medicine，30，1 440-1 448 ( 1 993 )，實驗醫學， 12， 1822-1826(1994)，蛋白質•核酸•酵素，42，

2125-3906-PF.ptd 第 11 頁 1309570

1 806- 1 8 1 3 ( 1 9 97)等亦有記載方法，以Circulati〇n， 92,（Suppl. I I)所載方法為佳。 ’ 而且HVJ以採用z株（可以由ATCC取得）為佳，基本上其 他HVJ株（例如ATCC VR-90 7及ATCC VR-105等）也可以採八 用。 另外，naked-DNA直接導入法為上述方法中最簡便的 方法’由此觀點來看’這也是讓人易於採用的方法。 此處所採用之表現载體為，只要是可以於活體内表現 目的基因的載體’不論何種皆可採用，例如pCAGGS(Gene

108， 193-200(1991))、及pBK-CMV 、pcDNA3.1 、 pZeoSV(Invitrogene 公司、Stratagene 公司）等的表現載 體。 B. 採用病毒性裁體的情裉 病毋載體以重組腺病毒（Adenovirus)、反轉錄病毒 (retrovirus)等病毒載體為代表。更具體的說，例如以無 毋化反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰療病毒 (herpesvirus)、牛痘病毒（vaccinia virus)、痘病毒 (poxvirus)、脊髓灰白質炎病毒（p〇li〇vi rus)、新比斯病 毒（Syndbis virus)、仙台病毒、SV40、免疫不全症候群

病毒（HIV)等的DNA病毒或是rna病毒來導入目的基因，使 細胞感染重組病毒，而能使基因導入細胞内。 剷述病毋載體中，已知腺病毒的感染效率比採用其他

病毒載體時為高，由此觀點來看，採用腺病毒載體系統 佳。 、、、、X

2125-3906-PF.ptd 第12頁 1309570 五、發明說明（10)

V 本發明之基因治療劑導入*者 直接導入體内的活體内法，及：人取：J為療劑 將基因治療劑導入該細胞、將：έ :出某種細胞到體外再 心。法“經科學，1 994年4 = ^回體内原處的ex 36⑴，23-48( 1 994)、實驗醫學增刊，i2U=; 曰本基因治療學會編基因治療 ）’ ）， 9)。本發明以採用活體内二發佳研，手冊，㈣， 製劑型態以上述各投與型離 如液劑等）而得。例如含有有效種種的製劑型態（例 該注射劑可以常法調製，例如以刀木之基因的注射劑時， (filter)等過濾滅菌，接著充填於盞菌容中，制以λ膜 該注射劑必要時可加入因應的慣用載^等；：調”成。 HVJ-脂肪體等的脂肪體中，以縣 體$ f佳。此外， 濃縮冷凍劑等的脂肪體製劑型態亦可。τ凍劑、離心分離 除本發明所採用的HGF基因外，也 新生作用的已知因子，或是單獨採了^汗用具有金管 指出VEGF及FGF等因子具有血广。例如’報告 已經可以使用T。此外，報告指出二辦：些基因也都 組織種種的細胞障害修復能力，也曰殖因子也具有 本發明所謂的糖尿病型缺企性 t ^這些基因。 缺血性疾病、糖尿病型缺血性神經障宝疋=尿病型下肢 ::梗f，，對於這些疾病都適用本糖尿病型 此外’本發明的基因治療劑不只是對 基因治療劑。 尿病型缺血性 2125-3906-PF.ptd 第13頁

1309570 五、發明說明（11) 疾病可採用’對於進行中的輕度患者也可以使用。 j本發明的基因治療劑是選擇對應於治療目的疾病、症 狀專適‘的投與方法•投與部位。投與方法以不經口投與 2佳。此外投與部位以缺血部位内投與為佳。此處「缺血 位J是指包含缺企患部及其週邊的部位。 缺血部位中，具體的說可以於血管内及肌肉内等投 與，特別是，缺血部位的肌肉内投與更佳。也就是說對下 肢缺血性疾病而言，以下肢缺血部位骨骼肌内投與時，可 =促，缺血患部血管新生以求改善血流量，使缺血患部機 忐回復正常化。此外，對心肌梗塞等的心疾病而言，若是 心肌内投與時’會有同樣的回復效果。 杈適當的投與方法有，如採用非侵入性的醫用電氣儀 (catheter)或是非侵入性的注射器等投與方法。更進— =1音波使用之下’以非侵入性的醫用電氣儀或是注射器 扠與方法。採用非侵入性醫用電氣儀的投與方法時， 如對心疾病而言，可以採用於心室内腔 HGF基因的方法。 門且換主入 適用於本發明的HGF基因者有，如對糖尿病型缺血 疾病患者可以進行積極的基因導入治療，例如 J下肢缺血性疾病的患者，可以進行至今所採用的二：： 邛切除手術以外的方法來治療重症患者，而可回復〜 本發明治療劑投與量依患者症狀等因素而異 月二 者"固人採用HGF基因約為選擇…〜一的範圍投與成人^ 約10 〜約5mg之投與為佳，以約5〇 〜約5mg的投與量範

2125-3906-PF.ptd 第14頁 1309570 五、發明說明（12) 圍時效果最佳。 本發明的治療劑非數日而為數週投與一次較適當，投 與次數因應於患者的症狀而選擇。本發明的治療劑具有提 供非侵入性投與，且因應病狀可投與多次的特徵。 以下將以實施例對本發明作具體的說明，但是本發明 並不限於實施例所述。 實驗材料及方法 Hill旨肪體製齊丨的製作 1 Omg的乾燥脂質（磷酸醢絲胺酸（phosphat i dy 1 serine)、峨酸醯膽驗（phosphatidyl choline)、膽固醇 (cholesterol)的1 : 4. 8 : 2的混合物）與含有HGF基因（100 # g)~HMGl(high mobility group 1 nuclear protein, 25 "g)的等張液（137#MNaCl，5.4#MKC1，10/zM Tris-HCl ; pH7. 6 ) 200 μ 1混合，以超音波強力攪拌形成脂 肪體。精製的仙台病毒（2株）於1^(11〇6^/1111112/36(：)照射3 分鐘。脂肪體懸濁液與仙台病毒（HVJ)混合於4 110分鐘， 接者於37 C加溫30分鐘。除去游離的HVJ後，即取得hvj脂 肪體製劑。 曰 實驗動物 % 投與組：糖尿病族群（D Μ -組）的下肢缺血組 對照組：正常族群的下肢缺血組 HVJ脂肪體製劑的崧彻冰 於腹腔以鏈脲黴素（streptozotocin)投與誘發Μ週齡 之糖尿病組（1組6隻），進行一側大腿動脈的外科部份切令 2125-3906-PF.ptd 第15頁 1309570 五、發明說明（13) 除’人造出下肢部的缺血狀態。 將含有HGF基因的HVJ脂肪體製劑注入下肢缺血骨路 肌。 檢討内衮 脂肪體製劑投與後，側副血行路形成及血流改善效果 之指標，以雷射散亂光解析的雷射都卜勒影像（User DOP, Image，LDI)測定下肢血流。以正常下肢的缺血 :=广柱狀圖(colore“ist〇gram)平均值作為 流比率（perf us 1 on rat i 〇)。

下肢缺血部位的微血管密度以鹼活性磷酸酶 (alkaline phosphatase， ALP)染色測定， 肢缺血組與對照實驗的下肢缺血 + 4糖尿病下 投與組與未投與組。 還有，比較HGF基因 參考例1 鐘尿ϋ 肢缺血部位的ΗΓτΐ7矣拐^^ 對於腹腔内投與鏈脲黴素誘發〗6週齡 6隻）及作為對照的16週齡正常組（1組6隻），' f病組（1 動脈的外科部份切除，得到下肢部的缺血=行一側太 1週後’以雷射都卜勒影像測定缺血部位〜。

比率。糖尿病下肢缺血組的缺血部位血液、液灌 對照的下肢缺血組血液灌流比率為低（夂昭a比率比竹 請後，5週後，也測^缺血部位“ 樣的糖尿病下肢缺血组缺血部位的血液 比率， 照的下肢缺血組血液灌流比率為低（參照圖1)率比作為

1309570

肌肉内的内源性HGF濃度為糖尿病缺血組缺血部位之 肉内比作為對照的下肢缺血組肌肉内顯著的低。此結果 示糖尿病中，血管新生不良之原因為肌肉内内源性 、減少。因此推測，糖尿病下肢缺血組難以進行血管新 ^ ’而側副血行路也不發達（參照圖2 )。 貫施例1 數尿病下胲缺血組之HGF某因治療祐要f π 腹腔内投與鏈脲黴素誘發16週齡的糖尿病組（丨組6隻） 及對照實驗的1 6週齡正常組（1組6隻），進行一側大腿動脈 的外科部份切除，得到下肢部的缺血狀態。大腿動脈外科 切除後，以含有HGF基因（50 //g)的HVJ -脂肪體製劑導入於 下肢缺血部位的肌肉内。 3週後’以雷射都卜勒影像測定缺企部位的血液灌流 比率。投與HGF基因的糖尿病下肢缺血組缺血部位之血液 灌流比率’與對照實驗的下肢缺血組及未投與之上述糖尿 病下肢缺血組比較，表現出顯著的增加。 以對照實驗下肢缺血組血液灌流比率當作丨〇 〇 %時，未 投與HGF基因的糖尿病下肢缺血組為67%，投與HGF基因的 糖尿病下肢缺血組為1 29%。結果示於圖3 (參照圖1 )。 實施例2 下肢缺血組之H G F某因治療效果Γ τ T、 以與上述同樣處置製作糖尿病下肢缺血組、對照實驗 之下肢缺血組，進行HGF基因治療。5週後，取出各組下肢 缺血部位的骨骼肌，以ALP染色比較單位面積的血管數

2125-3906-PF.ptd 第17頁 1309570 五、發明說明（15) 目。未投與HGF基因的糖尿病下肢缺血組，盘對昭實驗的 下肢缺血組比較起來’血管數較少，投與_基因的糖 病下肢缺血組則有明顯的血管數增加。社I< 、、’口果如圖4所示。 參考例2 座-加堑篦^及一別卩對^^血管内戌^^^^^產生的爭響 血管内皮細胞（人大動脈由來）於無血清下’以’葡萄糖 濃度分別為0、25mM、50錢之3種培養基培養，測定24小時 培養後的培養液上清之MMP-1濃度。 此外分別與葡萄糖添加30分鐘前添加HGF1〇〇ng/ml時 相比較。 上清中的MMP-1濃度具有葡萄糖濃度依存性的明顯減 少’顯示HGF的處理會使MMP-1停止減少，且進一步地增 加。結果如圖5所示。 參考例3 對.於血官内电細胞的.jj_G F效果（有關血管新生之轉錄因子 ETS-1的轡化Λ 。 與參考例1同樣的血管内皮細胞培養後，測定細胞中 表現之轉錄因子ETS-1的mRNA量。對照實驗的内皮細胞之 ETS-lmRNA量當作1〇〇%時，未添加HGF之血管内皮細胞在高 葡萄糖條件下明顯的減少。一方面，添加HGF的血管内皮 細胞與對照組表現量相比較，為高於同等的程度 (P<0. 01)。 結果如圖6所示。 又 如以上所述’在高葡萄糖條件下的血管内皮細胞顯 示，為了金管新生作用所必須的基質（matrix)分解酵素

2125-3906-PF.ptd

第18頁 1309570 五、發明說明（16) 產生會減少，血管新生時會表現、增加 ETS-1之mRNA表現也降低。 的轉錄因子 由上述可以明瞭，在高葡萄糖條件下血技 較為困難。一方面’在高葡萄糖條件下的血二=會變得 加HGF時，MMP — 丨的產生、與\内皮細胞添 增加，顯示HGF會使血管新生作用變容易。、現θ顯著的 產_1__上利用的可能性 以本發明的HGF基因作為有效成 疾病治療劑，V以改善HGF 線κ病型缺血性 特有的血管新生不良情形，而顯干出題糖尿病型缺血患部 用’所以可以改善缺血患部也流量；=峨生作 與，而得以達到促進進行1次以上的投 的效果，本發明的治療劑對糖^據於此，由這樣 病、糖尿病型缺血性神經，尿病型下肢血性疾 有治療作用。 °還有糖尿病型心肌梗塞具

Claims (1)

1309570 ---案號9〇1〇, ru㈠月ί日 六、申請專利範圍 ί. 種糖尿病型缺血性疾病治療劑’含有肝實質細胞 增殖因子（HGF)基因之裸DNA，其中該尿病型缺血性疾病排 除糖尿病型神經障礙。 2. 如申請專利範圍第1項所述之治療劑 血部位之肌肉的投與。 3. 如申請專利範圍第ί項所述之治療劑 g至50mg的HGF基因。 4. 如申請專利範圍第2項所述之治療劑 g至50mg的HGF基因。 5. 如申請專利範圍第ί至4項任一項所述之治療劑，其 中糖尿病型缺血性疾病是指糖尿病型下肢缺血性疾病或是 糖尿病型心肌梗塞。 6. 如申請專利範圍第5項所述之治療劑 型缺血性疾病為糖尿病型下肢缺血性疾病t 7，如申請專利範圍第6項所述之治療劑 位係下肢缺血部位之骨路肌内。 8. 如申請專利範圍第5項所述之治療劑 型缺血性疾病為糖尿病型心肌粳塞。 9. 如申請專利範圍第8項所述之治療劑 位係心肌内。 10. —種糖尿病型下肢缺血性疾病或糖尿病型心肌梗 塞之治療劑，其包括HGF基因，且該HGF基因為仙台病毒 (HVJ) -脂肪體的型態。 11. 如申請專利範圍第卜4項、第1 〇項任—項中所述之 修正 外年“月7日 修正

其是針對缺 其係採用1 // 其係採用1 # 其中糖尿病 其中投與部 其中糖尿病 其中投與部

2125-3906.PF3.ptc 第20頁 1309570 _案號90108146_年月曰 修正_ ， 六、申請專利範圍 治療劑，其係投與一次或一次以上。 1 2 .如申請專利範圍第5項任一項中所述之治療劑，其 係投與一次或一次以上。 1 3.如申請專利範圍第6項任一項中所述之治療劑，其 係投與一次或一次以上。 1 4.如申請專利範圍第7項任一項中所述之治療劑，其 · 係投與一次或一次以上。 1 5.如申請專利範圍第8項任一項中所述之治療劑，其 係投與一次或一次以上。 1 6.如申請專利範圍第9項任一項中所述之治療劑，其 φ 係投與一次或一次以上。

2125-3906-PF3.ptc 第21頁