TWI285649B

TWI285649B - VGA polypeptides and methods of treating VGF-related disorders

Info

Publication number: TWI285649B
Application number: TW089114523A
Authority: TW
Inventors: Hai Yan; Thomas C Boone
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1999-07-21
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2007-08-21
Also published as: US20050049180A1; US7008924B1; US20070010662A1; TW200640944A; TW200640505A; TW200427472A; TWI283588B

Description

1285649 A7 五、發明說明（發明範圍本發明係關於新穎的VGF多肽和選擇性結合劑。本發明亦關於產製V G F多肽的宿主細胞和方法。本發明更有關於診斷、治療、改善及/或預防與VGF多肽有關之疾病、病況和障礙的VGF醫藥組合物和方法。丙發明背景 V G F爲在神經元和内分泌細胞中找到的分泌性多肽。 Canu 等人，1997，Gen〇mics，45:443 46。在下視丘中發現VGF，並在腦中由電活性、傷害和生理時鐘調節。已經顯示下視丘在攝食和能量輸出的調節上扮演重要的角色，並已經顯示對下視丘的傷害將影響食慾和體重兩者。

Schwartz等人，1995, Am，J. Physiol” 269:949-57。亦已經發現VGF在代謝上扮演某種角色。已知人類和大鼠VGF的核替酸和胺基酸序列，並顯示彼此有高度的同種性。Canu等人，在前。VGF基因，最初 # 確認爲2.7kb cDNA片段，在活體外藉著神經營養素 (neurotrophins)，在神經元和内分泌細胞的子群中轉錄。肥胖和食慾不振爲能量體内平衡的瓦解，起因於在能量攝入和支出之間的不平衡。對於有效處理這類病況有需 f。、對於有效處理惡病質、不孕、代謝亢進之病況、機能、進活動性不足、胰島素產生過多和相關的病況和障礙亦有所需求。發明本發明係關於經過分離之多肽，包括在序列識別丨號、 _4 本、我張尺度適用中國國家標準（cns)A4規格⑵G χ 297公爱） 1285649 A7

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（2 ) 序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5 號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 〇號任一個中陳述的胺基酸序列。較佳的經過分離之多肽，包括在序列識別2號中陳述的胺基酸序列。本發明亦提供經過分離之多肽，包括在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5 號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 〇號任一個中陳述之胺基酸序列的片段’其中該片段具有如同在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6 號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 〇號任一個中陳述之多肽的活性。較佳的經過分離之多肽包括在序列識別2號中陳述之胺基酸序列的片段，其中該片段具有在序列識別2號中陳述之多肽的活性。本發明更提供經過分離之多肽，包括選自包括下列的胺基酸序列： (a)在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任一個中陳述之胺基酸序列，具有至少一個保留性的胺基酸置換，且其中該多肽具有在序列識別1號、序列識別2號、序列識別 3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨-丨丨丨I!丨·丨—丨— _丨丨訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（3 ) 一個中陳述之多肽的活性； (b) 在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任一個中陳述之胺基酸序列，具有至少一個胺基酸插入，且其中該多肽具有在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任一個中陳述之多肽的活性； (c) 在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任一個中陳述之胺基酸序列，具有至少一個胺基酸刪除，且其中該多肽具有在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7 號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任一個中陳述之多肽的活性； (d) 在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任一個中陳述之胺基酸序列，具有C·及/或N -終端的截短，且其中該多肽具有在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7 號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任一個 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） """" ~裳--------訂--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 導· 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（4) 中陳述之多肽的活性；以及 (e)在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 〇號任一個中陳述之胺基酸序列，具有至少一個選自包括胺基酸取代、胺基酸插入、胺基酸刪除、羧基·終端截短和胺基-終端截短的修改，且其中該多肽具有在序列識別1號、序列識別2 號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號任一個中陳述之多肽的活性。亦提供融合多肽，包括至少一個上述之多肽，與異種胺基酸序列融合。本發明亦提供選擇性結合劑，像是抗體，能夠專一地與至少一個多肽結合，該多肽包括在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 〇號任一個中陳述之胺基酸序列。本發明更提供能夠專一地與至少一個多肽之片段結合的選擇性結合劑，該多肽包括在序列識別1號、序列識別2 號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序】識别1 0戒任一個中陳述之胺基酸序列，或其天然存在的變體。本發明之選擇性結合劑可以是抗體或其片段，包括但不本紐尺度涵??§^準（CNS)A4規格⑵q χ撕— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5 ) 限於：老鼠的抗體、人類化的抗體、人類的抗體、多株抗體、單株抗體、嵌合型抗體、CDR-移植抗體、抗-遺傳性型的抗體和多變區片段（像是Fab或Fab，片段）。本發明的選擇性結合劑包括具有至少一個互補性-決定區，對多肽具有專一性的選擇性結合劑或其片段，該多肽包括在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8 號、序列識別9號或序列識別1 〇號任一個中陳述之胺基酸序列。本發明之選擇性結合劑可視需要與可檢測標記結合。亦提供能夠拮抗VGF生物活性的選擇性結合劑。較佳的選擇性結合劑或其片段，能夠專一地與包括在序列識別2號中陳述之胺基酸序列或其片段的多肽結合。本發明亦提供醫藥組合物，包括本發明之多肽或選擇性結合劑，以及一或多個在藥學上可接受的調配劑，亦包含在本發明内。調配劑可以是適當的載劑、佐劑、助溶劑、穩疋劑或抗-氧化劑。可利用水溶性的聚合物，像是聚乙一醇和葡聚醣以共價方式修改v G F多肽或選擇性結合劑。可使用本發明之醫藥組合物，提供在治療上有效含量的本發月之V G F多肽或選擇性結合劑。本發明亦提供製造可用來心療V G F相關性疾病、病況或障礙之醫藥的方法。、本發明更楗供治療、預防或改善V G F相關性疾病、病況或障礙的方法，包括對患者投予有效含量的本發明之V (} f 多肽或選擇性結合劑。VGF相關性疾病、病況和障礙，包 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ►裝 I ϋ I ϋ 一S^J 1 —Bi I ammmr n - -8 -

五、發明說明（6 ) 代:^不孕惡病質、飲食障礙、AIDS相關性複合症、々紅進（病況、機能尤進、活動性不足和姨島素產生過之飲食障礙包括貪食症和神經性厭食症。將二料提供本發明之方法，投予本發明之VGF多肤或選擇性結合劑的組合。、亦提供在動物中，診斷VGF相關性疾病、病況和障礙，或對VGF相關性疾病、病況和障礙之感受性的方法，包括決定VGF多肽的存在或含量，並^叩多月太表現的存在或含量爲基礎，診斷VGF相關性疾病、病況和障礙，或對 VGF相關性疾病、病況和障礙的感受性。在診斷相關性疾病、病況或障礙，或對VGF相關性疾病、病況和障礙的感受性的較佳方法中，該動物爲哺乳動物。在更佳的方法中，該動物爲人類。本發明亦提供測定受殍分子，確認該受試分子與V G F多肽結合的方法。該方法包括使V GF多肽與受試分子接觸，並決定該受試分子與該多肽結合的程度。該方法進一步包括決定這類受試分子是否爲V G F多肽的激動劑或拮抗劑。本發明更&供測試分子對V G F多肤之表現，或對v g F多肽之活性的影響的方法。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在考量整個説明書時，本發明的這些及其他目標更將變得更爲明確。圖片簡述圖1解釋以VGF-1(序列識別1號）注射之兔子的抗體力價含量。 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（8 ) VGF-2 LEGSFLGGSEAGERLLQQGLAQVEA(序列識別 4 號） VGF-3 SQEEAPGH(序列識別5號） VGF-4 HFHHALPPARHHPDLEAQA(序列識別 ό 號） VGF-5 QAEATRQAAAQEERLADLASDLLLQYLLQGGARQRDLG GRGLQETQQERENEREEEAEQE(序列識別 7 號） VGF-6 GGGEDEVGEEDEEAAEAEAEAEEAERARQNALLFAEEE DGEAGAED(序列識別8號） VGF-7 DAEGTEEGGEEDDDDEEMDPQTIDSLIELSTKLHLPADD WSIIEEVEE(序列識別9號） VGF-8 NAPPEPVPPPRAAPAPTHVRSPQPPPPAPARDELPDWNEV LPPWDREEDEVF PPGPYHPFPNYIRPRTLQPPASS(序列識別10號） "VGF多肽片段"一詞意指包括在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號中陳述之任何VGF多肽的胺基-終端處截短，及/或在羧基-終端處結截短的多肽。” V G F多肽片段π 一詞亦意指V G F多肽正類似物、變體或衍生物的胺基終端及/或羧基·終端截短。VGF多肽片段可能起因於另一種的RN Α接合，或源自在活體内的蛋白酶活性。這類V G F 多肽片段可視需要包括胺基-終端的甲硫胺酸殘基。將知道可使用這類的片段，例如，來產製V G F多肽的抗體。 -11 - -— — — — — — I— ^0 — — — — — —--· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 準標家國國中用適度尺張紙本 * 公 97 2 XI⑽ 格 I規 A4 1285649 A7 _______Β7 五、發明說明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ” VGF多肽正類似物’’一詞意指該多肽得自其他物種，並相當於在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7 號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 0號中陳述的任何VGF多肽。例如老鼠和人類的VGF多肽，視爲彼此的正類似物。 "VGF多肽變體” 一詞意指包括與在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9 號或序列識別1 0號中陳述的任何V G F多肽相比較，具有一或多個胺基酸序列的取代（保留性、非-保留性或其混合）、刪除（像是内部的刪除及/或V G F多肽片段），及/或加入（像是内部的加入及/或V G F融合多肽）之胺基酸序列的V G F多肽。變體可以是天然存在的（例如v Ct f多肽對偶基因變體或VGF多肽正類似物），或人工建構的。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ” V G F多肽衍生物”一詞意指已經以化學方式修改的在序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4 號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別1 〇號中陳述之任何v G F 多肽’或如同在本文中定義的VGF多肽片段、正類似物或變體。化學修改可以是，例如，藉著共價附接一或多個聚合物’包括但不限於水溶性聚合物、N -連接或〇 -連接的碳水化合物、糖類和磷酸酯。在與多肽附接之分子的類型或位置上，以與天然存在之VGf多肽不同的方式來修改 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） 1285649 A7 __B7____ 五、發明說明（1〇 ) VGF多肽衍生物。VGF多肽衍生物更包括了刪除一或多個天然附接於VGF多肽上之化學基團的VGF多肽。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ”成熟的VGF多肽’’ 一詞意指缺乏前導序列的vgF多肽。成熟的V G F多肽亦包括其他的修改，像是胺基_終端 (有或無前導序列）及/或瘦基-終端的蛋白水解加工，從較大的前驅物中切開較小的多肽，N -連接及/或〇 ·連接的糖基化作用及其類似者。 ·’ V G F融合多肽” 一詞意指一或多個胺基酸（像是異種的肽或多肽）融合在V G F多肽、片段、正類似物、變體或衍生物的胺基或羧基-終端上。 ••具有生物活性的V G F多肽π —詞意指具有至少一個包括在任一個序列識別1號、序列識別2號、序列識別3號、序列識別4號、序列識別5號、序列識別6號、序列識別7 號、序列識別8號、序列識別9號或序列識別丨〇號中陳述之胺基酸序列的多肽之活性特徵的V G F多肽。此外， V G F多肽可像免疫原一樣地活躍；也就是該v g F多肽含有至少一個可使抗體升鬲的抗原決定位。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 π經過分離的多肽”一詞意指本發明之多肽，其（丨）已經從至少大約5 0 %的多核甞酸、脂質、碳水化合物或其他物質中分離出來，這些物質是在從來源細胞中分離出時，與其一起自然地被發現的，（2 )該多肽的全部或一部份，並未與π經過分離之多肽’’自然連接的物質連接（經由共價或非共價之交互作用），（3 )該多肽與並非自然連接之物質以可操作之方式連接（經由共價或非共價之交互作用），或（4 ) -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)aT規格（210 χ^97公爱）------ 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（11) 並非天然存在的。幸父佳的是，經過分離的多肽實質上不含任何其他的污染多肽’或在其天然環境中找到的其他污染物，其將干擾它的治療、珍斷、預防或研究用途。所使用的’’載體一碉，意指任何用來運送密碼資訊至宿主細胞的分子（例如核酸、質體或病毒）。 ”表現載體”一詞意指適合用來轉化宿主細胞，並含有指揮及/或控制插入之異種性核酸序列表現之核酸序列的载體。表現包括但不限於諸如轉綠、轉譯，若有插入序列存在，還有RNA接合之類的過程。使用’’宿王細胞’’ 一詞時，意指已經利用核酸序列轉化，或能夠以核酸序列轉化，然後表現感興趣之選擇基因的細胞。該名詞包括親代細胞的後代，無論後代是否在形態學上或在遺傳的組成上與原始的親代相同，只要提供選=的基因即可。 "同一性"一詞，如同此項技藝中已知的，意指藉著比較序列定出在二或多個多肽分子，或二或多個核酸分子的序列之間的相關性。在此項技藝中，”同_性"亦意指在多肽或核酸分子之間序列相關性的程度，例如，可藉著在長串的一或多個核苷酸或二或多個胺基酸序列之間的相配性來決定。"同一性”利用㈤隙排列，（若有的話）藉著特定的數學模式或電腦程式（也就是”演算法，，）尋址，測量在二或多個序列中較小序列之間的相同配對之百分比。類似性’’ 一詞爲相關的概念，但是與，，同一性”顯然 I 裝—丨—訂 —丨丨！ - . C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 叫1 w心丨一疋興同一性”顯然有類似性”意指包括相同配對和保留性置換配對之相關別 -14 1285649

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（12 陡的測量。如果兩個多肽序列具有例如10/20個相同的胺基酸，而剩下的全部是非-保留性置換，此時同一性和類似性的百分比將都是5 〇 %。如果在相同的實例中，有五個、上的位置具有保留性置換，此時同一性的百分比仍然是 5 0%，但類似性的百分比將是75%(15/2〇)。因此，在有保 4性置換的案例中，在兩個多肽之間的類似性百分比將比在那兩個多肽之間的同一性百分比更高。核酸序列’’或”核酸分子”一詞意指DN A或RN A序列。孩名詞包括由任何已知的DN A和RNA之鹼基類似物形成的分子’像是但不限於4 _乙醯基胞嘧啶、8 _羥基_ N 6 -甲基腺嗓呤、氮丙淀基·胞p密淀、假異胞p密淀、5 _(幾基輕甲基）尿嘧啶、5 -氟尿嘧啶、5 -溴尿嘧啶、5 -羧甲基胺甲基一 2-硫代尿喃啶、5_羧甲基胺甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌替、N6 -異戊烯基腺嘌呤、甲基腺嘌呤、丨_甲基假尿喃呢、1 -甲基鳥嘌呤、丨_甲基肌甞、2,2•二甲基-鳥嘌吟、2 -甲基腺嘌呤、2 -甲基鳥嘌呤、3 -甲基胞嘧啶、5_ 甲基胞喃啶、N6 -甲基腺嘌呤、7_甲基鳥嘌呤、5 -甲胺基甲基尿喃淀、5 -甲氧胺基甲基-2_硫代尿嘧啶、甘露糖基快歐甞（qUeosine)、5’_甲氧羰基-甲基尿嘧啶、5_ 甲氧基尿π密啶、2-甲硫基_N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶_ 5 -氧基乙酸甲酯、尿嘧啶_5_氧基乙酸、氧基丁氧荅 (oxybutoxosine)、假尿嘧啶、快歐甞、2 _硫代胞嘧啶、5 _ 甲基_ 2 -硫代尿u密淀、2 -硫代尿p密淀、4 -硫代尿u密咬、5 _ 甲基尿嘧啶、N_尿嘧啶-5 -氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶_5_ -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）一 · ^1 ϋ ϋ n 一：口、I ϋ I ϋ ϋ I I . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（13 ) 氧基乙酸、假尿嘧啶、快歐甞、2 _硫代胞嘧啶和2，6 _二胺基嘌吟。 ’’天然存在”或，，天然的”一詞，當與諸如核酸分子、多肽、宿王細胞及其類似物之類的生物物質連接使用時，意指該物質在自然界中發現，而並非由人類製造的。同樣的，當在本文中使用”非·天然存在，，或，，非_天然的”一詞時，意指該物質並非在自然界中發現的，或是在結構上已經由人類修改或合成的。當在本文中使用，，以可操作之方式連結” 一詞時，意指側面序列的排列，其中將這樣描述的側面序列建構或裝配，而知以進行其平常的功能。因此，以可操作之方式與密碼序列連結的側面序列，能夠完成該密碼序列的複製、轉錄及/或轉譯。例如，將密碼序列以可操作之方式與啓動基因連結，此時該啓動基因能夠指揮該密碼序列的轉錄。側面序列不需要與密碼序列相鄰，只要它具有正確的功能即可。因此’例如，可在啓動基因序列和密碼序列之間出現介於其間之未轉譯但會轉錄的序列，而該啓動基因仍被視爲是”以可操作之方式連結，，密碼序列的。 ’*有效含量”和，，在治療上有效的含量”一詞，分別意指所使用之VGF多肽的含量，支持如同在本文中陳述之VGF 多肽的一或多個生物活性的可觀察程度。當在本文中使用”在藥學上可接受的載劑，，或，，在生理學上可接受的載劑” 一詞時，意指一或多個適於完成或促進醫藥組合物形式之V G F多肽或V G F選擇性結合劑之遞送 -16- 本紙張尺㈣用T國國家標準（CNS)A4規格咖χ 297公爱） — I-----訂----I---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（14) 的調配物質。 π選擇性結合劑”一詞意指對V G F多肽有專一性的分子或分子們。當在本文中使用時，”專一的”或”專一性” 一詞意指選擇性結合劑與V G F多肽結合，且不與非· ν G F多肽結合的能力。然而，將知曉該選擇性結合劑亦可能與Vgf正類似物結合。所使用的”轉導”一詞，意指從一個細菌中將基因運送至另一個，通常是藉著噬菌體。”轉導”亦意指藉著反轉綠病毒獲得並運送眞核生物細胞的序列。所使用的”轉移感染”一詞，意指由細胞攝入外來的或外源的DNA，而在已經將外源的〇ΝΑ導入細胞膜内時，該細胞便已經被，，轉移感染”了。許多轉移感染的技術是此項技藝中已熟知的，並在本文中揭示，參見例如，Graham等人，1973，Virology 52:456 ; Sambrook 等人，Molecular

Cloning， A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor

Laboratories, 1989) ; Davis 等人，Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier，1986);以及Chu 等人，1981，

Gene 13:197。可使用這類技術將一或多個外源的£)1^八部份導入適當的宿主細胞中。當在本文中使用”轉化” 一詞時，意指在細胞遺傳特徵上的改變，且該細胞已經被轉化，此時已經鄉其修改成含有新的D Ν A。例如，細胞被轉化，其中從它的自然狀態中以遺傳上的方式修改之。在轉移感染或轉導之後，可將轉化的D Ν A與細胞重組，藉著以物理方式整合到細胞的染 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨丨 ί 丨 — 裝 — — 訂--— II---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 五、發明說明（15 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 色體内，可暫時以沒有複製的附加體要素之形式維持，或可以質體的形式獨立地複製。當DNA隨著細胞分裂而複製時，將該細胞視爲已經被穩定地轉化。 YGF多肽的相關性 V G F多肽之胺基酸序列的保留性修改，將產生具有類似那些VGF多肽之功能和化學特徵的多肽。相反的，在 V G F多肽之功能及/或化學特徵上的實際修改，可藉著在 VGF多肽之胺基酸序列中的選擇取代作用來完成，該胺基酸的選擇取代作用，在其維持（a)取代區中分子主鏈的結構，例如，像是片或螺旋的結構，（b )在標靶位置處分子的電荷或忌水性，或（c)巨大的側鏈的作用上，有明顯不同的影響。例如’ ”保留性的胺基酸置換”可能涉及以非天然的殘基來取代天然胺基酸殘基的作用，使得對該位置處的胺基酸殘基之極性或電荷有較少的或沒有影響。此外，亦可利用丙胺酸取代任何在多肽中的天然殘基，如同先前已經描述之π丙胺酸掃描的突變生成作用”。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製保留性的胺基酸置換亦包括非天然存在的胺基酸殘基，通常藉著化學肽合成而非藉著在生物系統中的合成作用將其併入。這些包括肽模仿物，以及胺基酸部份的其他相反或倒轉形式。可以常見的側鏈特徵爲基礎，將天然存在的殘基分類： 1 )忌水性的：去甲亮胺酸，Met，Ala，Val，Leu，lie ; 2)中性親水性的：Cys，Ser，Thr ; -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（16) 3 )酸性的：Asp, Glu ; 4 )鹼性的：Asn，Gln，His，Lys，Arg ; 5 )影響鏈方位的殘基：Gly，Pro ;以及 6 )芳香族的：Trp，Tyr5 Phe。例如，非-保留性置換可能涉及一類中的成員與得自另一類之成員的交換。可將這類取代的殘基導入VGF多肽與其他V G F多肽正類似物同系的區域中，或導入該分子的非 -同系區域中。在進行這類改變時，可考量胺基酸的疏水指數。已經以胺基酸的忌水性和電荷特徵爲基礎，指定每個胺基酸的疏水指數。疏水指數爲：異亮胺酸（+4.5);纈胺酸（ + 4.2);亮胺酸（ + 3.8);苯丙胺酸（ + 2.8);半胱胺酸/胱胺酸（+2.5);甲硫胺酸（+1_9);丙胺酸（+1.8);甘胺酸（-0.4);蘇胺酸（_ 0.7);絲胺酸（-0_8);色胺酸（-0.9);酪胺酸（-1.3);脯胺酸 (-1.6);組胺酸（_3·2);穀胺酸（-3.5);穀胺醯胺（-3.5);天冬胺酸（-3.5);天冬醯胺（·3·5);離胺酸（-3.9);和精胺酸（-4.5) 〇在此項技藝中，通常知道疏水之胺基酸指數的重要性，在於將交互作用的生物功能賦與蛋白質（Kyte等人，1982, J. Mol. Biol. 157:105-3 1)。已知可以某些胺基酸取代其他具有類似疏水指數或分數的胺基酸，而仍然維持類似的± 物活性。在以疏水指數爲基礎來進行改變時，其疏水指數在土 2内的胺基酸取代作用是較佳的，在± 1内的是特佳的，而在± 0 · 5内的是更佳的0 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649

五、發明說明（17) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在此項技藝中亦瞭解可以親水性爲基礎，有效地進行類似胺基酸的取代，特別是在企圖藉此產生具有生物功能的相等蛋白質或肽，以便在免疫學的具體實施例中使用之處，如同在本案例中。蛋白質最大的局部平均親水性，由其相鄰的胺基酸（親水性支配，與其免疫原性和抗原性有關，也就是與蛋白質的生物學特性有關。已經對這些胺基酸殘基指定了下列的親水性値：精胺酸 ( + 3.0);離胺酸（ + 3·0);天冬胺酸（ + 3 〇±1);穀胺酸 (+ 3.0士1);絲胺酸（ + 0·3);天冬醯胺（ + 〇·2);穀胺醯胺 (+0.2) ’甘胺酸（〇);蘇胺酸（·〇·4);脯胺酸（_〇·5±1);丙胺酸（-0 · 5 );組胺酸（_ 〇 _ 5 );半胱胺酸（_丨· 〇 );甲硫胺酸㈠·3);顯胺酸㈠·5);亮胺酸（-1.8);異亮胺酸（-1.8); 路胺酸（·2·3);苯丙胺酸（—2.5);和色胺酸（_3.4)。在以類似的親水性値爲基礎來進行改變時，其親水性値在± 2内的胺基酸取代作用是較佳的，在士 i内的是特佳的，而在土〇·5内的是更佳的。亦可以親水性爲基礎，從原始的胺基酸序列中確認出抗原決定位。這些區域亦稱爲，，抗原決定位的核心區丨丨。在想要這類取代時，可由熟諳此藝者決定想要的胺基酸取代（是否舄保留性或非保留性的）。例如，可使用胺基酸的取代來確認VGF多肽的重要殘基，或增加或減少在本文中描述之VGF多肽的親和力。在表π中陳述典型的胺基酸取代0 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 111 — I — I « — II — — — I— . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 五、發明說明（18 表II 胺基酸的取代作用經濟部智慧財產局員工消費合作社印製原始的殘基典型的取代作用較佳的ί Ala Val，Leu，lie Val Arg Lys，Gln，Asn Lys Asn Gin Gin Asp Glu Glu Cys Ser，Ala Ser Gin Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro，Ala Ala His Asn，Gln，Lys, Arg Arg lie Leu，Val，Met, Ala， Phe，去甲亮胺酸 Leu Leu 去甲亮胺酸，lie，Val， Met, Ala, Phe lie Lys Arg，1,4 二胺基-丁酸， Gln，Asn Arg Met Leu，Phe，lie Leu Phe Leu, Val，lie，Ala，Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr，Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr5 Phe Tyr Tyr Trp，Phe，Thr，Ser Phe Val lie，Met，Leu，Phe, Ala,去甲亮胺酸 Leu 21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -— — — — — — II — — — — — — — — — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 五、發明說明（19 ) …叫此π者將说夠使用已熟知的技術，決定適當的V G F 多肽變體。爲了確認該分子中能夠被改變但不破壞生物活性的適當區域，熟諳此藝者可瞒準不相信其對活性具有重要f生的區域。例如，當已知得自相同物種或得自不同物種勺㉟似多肽，具有類似的活性時，熟諳此藝者可將v G F多肽的胺基酸序列與這類類似的多肽做比較。利用這類比較，可確認出在類似多肽中被保留之分子的殘基和部份。將察知在VGF分子中，與這類類似多肽有關之未保留區中進行的改變，將不太可能不利地影響VGF多肽之生物活性及/或結構。熟諳此藝者亦將知道，即使在相對上較具保礤性的區域，可以在化學上類似的胺基酸來取代天然存在的殘基，同時仍保留活性（保留性的胺基酸殘基之置換）。因此’即使該區域對生物活性或對於結構可能是重要的，仍可使其接受保留性的胺基酸置換，而不破壞生物活性，或不會對該多肽結構有不利的影響。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此外，熟諳此藝者可回顧結構-功能的研究，確認在類似的多肽中，對活性或結構很重要的殘基。在這類比較的回顧中，可預期在VGF多肽中具有重要性的胺基酸殘基，與在類似多肽中對於活性或結構很重要的胺基酸殘基_ 致。熟諳此藝者可選擇在化學上類似的胺基酸，來取代在 VGF多肽中，預期它很重要的這些胺基酸殘基。熟諳此藝者亦可分析與類似多肽中之結構有關的三度空間結構和胺基酸序列。回顧這類資訊，熟諳此藝者可預期 VGF多肽的胺基酸排列與其三度空間結構有關。熟諳此藝 -22- 本紙張^度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' --- 1285649

五、發明說明（2〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製者可選擇對預期是在蛋白質表面上的胺基酸殘基不會造成土固的改’史’因舄這類基團可能涉及與其他分子的重要交互作用。然而，熟諳此藝者可創造在每個胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代的受試變體。可使用熟諳此藝者已知的活性測定來篩選變體。可使用這類變體收集關於適當變體的資訊。例如，如果發現特定胺基酸殘基的改變，導致破壞的、不想要地降低或不適當的活性，則將避免帶有這類改變的變體。換句話説，以從這類例行之實驗中收集到的資訊爲基礎’熟諳此藝者將可輕易地決定應該單獨或與其他突變一起，避免進一步取代何處的胺基酸。許多科學的出版物已經致力於二級結構的預測。參見 Moult，1996, Curr· 〇pin. Biotechn〇1 7:422-27 ; ch〇u等人， 1974， Biochemistry 13:222-45 ; Chou 等人，1974, Biochemistry 113:211-22 ; Chouφ、，1978，ΑοΙν·Εηζγηι〇1·Relat. Areas Mol. Biol· 47:45-48 ; Chou等人，1978, Ann·， Rev. Biochem· 47:251-276 ;以及 Chou等人，1979, Biophys· J· 26:367-84。此外，目前可利用電腦程式來幫助預測二級 t構。一種預測一級結構的方法是以同種性模型爲基礎。例如，兩個多肽或蛋白質具有3 〇 %以上的序列同一性，或 4 0 %以上的類似性，通常具有類似的結構拓樸學。蛋白質結構之資料庫（PDB)目前的增長，已經提供了二級結構的提高預測性，包括在多肽或蛋白質之結構内，可能的折疊數目。參見 Holm等人，1999, Nucleic Acids Res.，27:244- 47。已經暗示在特定的多肽和蛋白質中，有限的折叠數 -23- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I裝 I Μ· I I I I « — — — — — — I — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 B7 五、發明說明（21 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 目’且一旦已經解決結構的決定性數目，結構的預測將變成戲劇化地更精確（Brenner等人 ’ 1997，Curr. Opin. Struct. Biol. 7:369-76)。預測二級結構的其他方法包括，，穿線，，（J〇nes，1997, Curr

Opin. Struct· Biol. 7:377-87 ; Sippl等人，1996，Structure 4:15-19) ’’’ 特色分析”（B〇wie 等人，i991，Science， 253:164-70 ; Gribskov 等人，1990，Methods Enzymol. 183.146-59 ’ Gribskov等人 > 1987, Proc. Nat. Acad. Sci· U.S.A. 84:43 5 5-5 8)，和f’演化連鎖”（參見Holm等人，在前，和Brenner等人，在前）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製較佳的V G F多肽變體包括糖基化作用變體，其中與本發明之V G F多肽的胺基酸序列相比較，已經改變糖基化作用位置的數目及/或類型。在一個具體實施例中，V g F多肽變體包括比本發明之V G F多肽的胺基酸序列，更多或更少的N-鍵結之糖基化作用位置。以序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr定出N -鍵結之糖基化作用位置的特徵，其中以X表示之胺基酸殘基可以是脯胺酸以外的任何胺基酸殘基。產生該序列之胺基酸殘基的取代作用，提供了加入N ·键結之碳水化合物鏈可能的新位置。另外，排除該序列的取代作用將移除現存的N -键結之碳水化合物鏈。亦提供n -键結之碳水化合物鏈的重新排列，其中除去一或多個N -鍵結之糖基化作用位置（通常是天然存在的那些），並產生一或多個新的N -鍵結位置。其他較佳的v G F變體包括半胱胺酸變體，與本發明之VGF多肽的胺基酸序列相比較，其 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（22) 中刪除一或多個半胱胺酸殘基，或以其他的胺基酸（例如絲胺酸（Serine))取代。當必須將VGF多肽再折疊成具有生物活性之構型時，像是在分離不溶的包涵體之後，半胱胺酸變體是有用的。半胱胺酸變體通常具有比天然蛋白質更少的半胱胺酸殘基，且通常具有偶數，使起因於不成對半胱胺酸的交互作用減至最少。體是有用的。半胱胺酸變體通常具有比天然蛋白質更少的半胱胺酸殘基，且通常具有偶數’使起因於不成對半胱胺酸的交互作用減至最少。此外’可將VGF多肽與同種的多肽融合，形成同種二聚體’或與異種的多肽融合，形成異種二聚體。異種的肽和多肽包括但不限於：容許刪除及/或插入V G F融合多肽的抗原決定位；穿透膜受體蛋白質或其一部份，像是細胞外的功能部位或穿透膜和細胞内的功能部位；與穿透膜受體蛋白質結合的配體或其一邵份；具有催化活性的酵素或其一部份；促進低聚化作用的多肽或肽，像是亮胺酸拉鍊功能部位；增加穩定性的多肽或肽，像是免疫球蛋白恆定區；以及具有與本發明之VGF多肽不同之治療活性的多肽0 可在V G F多肽的胺基_終端或羧基-終端進行融合。可直接融合’不需交聯劑或接合體分子，或可經由交聯劑或接合體分子。交聯劑或接合體分子可以是一或多個胺基酸殘基，通常是從大約2 0至大約5 0個胺基酸殘基。亦可將交聯劑或接合體分子設計成帶有可供DN A核酸内切限制酶或蛋白酶切開的位置，以便容許分離融合的部份。將知曉 ——— 1------裝--------訂---------^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -25-

A7 1285649 B7_ 五、發明說明（23 ) 一旦已經建構，便可根據在本文中描述的方法來衍生該融合多肽。在本發明更進一步的具體實施例中，將V G F多肽與人類 IgG之Fc片段的一或多個功能部位融合。抗體包括兩個功能獨立的部份，稱爲nFab”的可變功能部位，其與抗原結合，以及稱爲nFcn的恆定功能部位，其涉及效應物功能，像是補體的活化作用，以及被巨噬細胞攻擊。F c具有長的血清半衰期，而F ab是短命的。Cap on等人，1989，Nature 337:525-31。當與治療性蛋白質一起建構時，Fc功能部位可提供較長的半衰期，或是像F c受體結合、蛋白質A結合、補體固定，或許甚至經胎盤傳遞，同上，將這類功能併入。表111概述在此項技藝中已知之某些F c融合的用途0

表III F c與治療性蛋白質融合

Fc之形式融合夥伴治療涉及參考文獻 IgGl CD30_L 的 N-終端霍奇金氏症；退美國專利第5,480,981號行性淋巴瘤；T-細胞白血病老鼠的 Fc- γ 2a IL-10 抗炎症；移植排斥 Zheng等人，1995, J. Immunol. 154:5590-600 IgGl TNF受體敗血性休克 Fisher等人，1996, N· Engl. J. Med. 334:1697-1702 ; Van Zee等人，1996, J. Immunol. 156:2221-30 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------^— I—訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 A7 B7 五、發明說明（24 )

IgG，IgA， TNF 受體 IgM 或 IgE (除了第一個功能部位之外）炎症，自體免疫障礙美國專利第5,808,029號 IgGl CD4受體 AIDS Capon 等人，1989, Nature 337:525-31 IgGl， IgG3 IL-2的N-終端抗-癌症，抗病毒 Harvill 等人，1995， Immunotech. 1:95-105 IgGl OPG的C·終端骨關節炎，骨密度 WO 97/23614 IgGl 萊普亭(leptin) 的N-終端抗-肥胖 PCT/US 97/23183，1997 年 12月11日建檔人類igC r l CTLA-4 自體免疫障礙 Linsley，1991，J· Exp· Med·，174:561-69 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在一個實例中，可使用熟諳此藝者已知的方法，將人類 I g G絞鏈、C Η 2和C Η 3區融合到V G F多肽的胺基·終端或羧基-終端。可藉著使用蛋白質Α親和力管柱，純化所得的V G F融合多肽。已經發現與F c區融合的肽和蛋白質，在活體内顯示出比未融合的副本，實質上更高的半衰期。再者，F c區的融合，容許融合多肽的二聚化作用/多聚化作用。該F c區可以是天然存在的F c區，或可以改變，以便改善某些品質，像是治療品質、循環時間或降低凝集。可藉著已知的方法，輕易地計算相關多肽的同一性和類似性。這類方法包括但不限於在Computational Molecular -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1285649 A7 B7 五、發明說明（25 )

Biology(A.M. Lesk編輯，Oxford University Press 1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects(D.W. Smith 編輯，Academic Press 1993) ; Computer Analysis of

Sequence Data(Part 1，A.M. Griffin 和 H.G· Griffin 編輯， Humana Press 1994) ; G. von Heinle，Sequence Analysis in Molecular Biology (Academic Press 1987) ; Sequence

Analysis Primer(M. Gribskov 和 J. Devereux 編輯，M· Stockton Press 1991);以及 Carillo 等人，1988，SIAM J· Applied Math·，48:1073 中描述的那些。設計決定同一性及/或類似性的較佳方法，得到在受試序列之間的最大配對。在可公開獲得的電腦程式中，描述了決定同一性和類似性的方法。決定在兩個序列之間的同一性和類似性之較佳的電腦程式方法，包括但不限於 GCG 套裝程式，包括 GAP(Devereux等人，1984，Nucleic Acids Res. 12:387 ； Genetics Computer Group, University of Wisconsin，Madison, WI)，BLASTP 和 FASTA(Altschul 等人，1990, J· Mol· Biol· 215:403-10)。BLASTX程式可公開獲自 National Center for Biotechnology Information(NCBI)和其他來源（Altschul等人，BLAST Manual(NCB NLM NIH， Bethesda，MD) ; Altschul等人，1990，在前）。亦可使用已熟知的Smith Waterman演算法來決定同一性。某些演算計劃將兩個胺基酸序列排成一直線，可能導致兩個序列中僅有一短區域的相配，而該小的直線排列區可能具有極高的序列同一性，即使在這兩個全長的序列之間 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝

ϋ ϋ ϋ -1 一so” I ϋ ϋ ϋ II ϋ —^1 ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 A7 ___B7_ 五、發明說明（26 ) 並無明顯的關連性。因此，在較佳的具體實施例中，選擇排列的方法（G A P程式）將產生跨越提出申請之多肽至少 5 0個相鄰的胺基酸。例如，使用電腦演算法GAP(Genetics Computer Group， University of Wisconsin，Madison，WI)，爲了使其個別胺基酸最適切地配對，將欲決定其序列同一性百分比的兩個序列排列成一直線（藉著演算法決定’’配對的跨越幅度”）。連同演算法一起使用間隙開口罰點（以3 X平均對角線來計算之；”平均對角線”爲所使用之比較矩陣的對角線平均値； n對角線”爲由特定的比較矩陣，對每個完美胺基配對指定的分數或數目）和間隙延伸罰點（其通常爲0 · 1 X間隙開口罰點），以及比較矩陣，像是PAM 250或BLOSUM 62。亦由演算法使用標準比較矩陣（參見Dayhoff等人，5 Altas of Protein Sequence and Structure( P付錄 3，1978)(PAM 250 比幸交矩陣）；Henikoff等人，1992，Proc. Natl· Acad. Sci. USA 89:10915-19(BLOSUM62 比較矩陣））。多肽序列比較的較佳參數，包括下列：演算法：Needleman and Wunsch，1970, J. Mol. Biol. 48:443-53 ; 比較矩陣：BLOSUM62(Henikoff等人，在前）；間隙罰點：12 間隙長度罰點：4 類似性之閾値：0 利用上述參數可使用GAP程式。上文提及之參數是使用 -29 - ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------- 裝· — 訂---- - ---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 a7 B7 五、發明說明（27 ) G A P程式之多肽比較的預設値參數（並未連同末端間隙的罰點一起）。其他典型的演算法，可使用間隙開口罰點、間隙延伸罰點、比較矩陣和類似性之閾値，包括在Pr〇gram Manua1， Wisconsin Package，第9版，1997年9月中陳述的那些。熟諳此藝者將知曉，並將依據待進行的特定比較，像是蛋白質-對-蛋白質、蛋白質·對-DNA ;以及額外地，是否在特定一對的序列之間（在該案例中，G AP或BestFit通常是較佳的），或是在一個序列與一個大的序列資料庫之間（在該案例中，FASTA或BLASTA是較佳的）進行比較，來進行特殊的選擇。核酸分子可利用各種方式，輕易地獲得編碼包括V G F多肽之胺基酸序列之多肽的核酸分子，包括但不限於化學合成、 cDNA或基因組庫篩選，表現庫篩選，及/或cDNA的P C R 擴大作用。在本文中使用的重組DN A方法通常是在Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)，以及 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，編輯，Green Publishers Inc.和Wiley and Sons 1994)中陳述的那些。可藉著表現選殖，其以表現蛋白質之特性爲基礎，使用陽性純種系的檢測，來確認編碼V G F多肽之胺基酸序列的核酸分子。通常，藉著使抗體或其他結合夥伴（例如受體 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公餐） ---丨！丨丨丨— ! — 1丨丨訂-------丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（28 ) 或配體）與在宿主細胞表面上表現和展示的選殖蛋白質結合，來篩選核酸庫。以可檢測標記修改抗體或結合夥伴，以便確認表現想要純種系的那些細胞。可依據根據下文陳述之為明來經營的重組表現技術，產生這些多核甞酸，並表現編碼的多肽。例如，藉著將編碼 V G F多肽之胺基酸序列的核酸序列插入適當的載體中，熟請此藝者可輕易地產生大量想要的核:y：酸序列。然後可使用該序列來產製檢測探針或擴大引子。另外，亦可將編碼 V G F多肽之胺基酸序列的多核甞酸，插入表現載體内。藉著將表現載體導入適當的宿主内，可大量地產製編碼的 VGF多肽。另一種獲得適當核酸序列的方法，是聚合酶連鎖反應 (PCR)。在該方法中，使用酵素反轉綠酶，從聚（a)+rna 或總RN A中製備cDNA。然後將兩個引子，通常是與編碼 V G F多肽之胺基酸序列的cDNA中兩個分開區.域互補的，連同諸如Taq聚合酶之類的聚合酶一起，加至cDNA中，而該聚合酶擴大在兩個引子之間的cDNA區域。另一種製備編碼V G F多肽之胺基酸序列的核酸分子的方法，是使用熟諳此藝者已熟知之方法的化學合成，像是由

Engels等人，1989, Angew. Chem· Inti· Ed. 28:716-34描述的那些。這些方法特別包括核酸合成的磷酸三酯、嶙醯胺酸法，和Η -膦酸醋法。這類化學合成中的較佳方法，是聚合物-支撑的合成法，使用標準的嶙醯胺酸化學。通常，編碼VGF多肽之胺基酸序列的DNA，長度將是數百個核 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I — — — 裝 — — -訂--— II--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（29 ) 苷酸。可使用這些方法，以數個片段之方式合成大約1〇〇個核答酸以上的核酸。然後可連接片段，形成VgF基因的全長核芬酸序列。編碼多肽之胺基-終端的D N A片段經常具有A T G ’其編碼甲硫胺酸殘基。該甲硫胺酸可以或可以未出現在VGF多肽的成熟形式中，依據是否將在宿主細胞中產生之多肽設計成從該細胞中分泌出而定。亦可使用熟諳此藝者已知的其他方法。在某些具體實施例中’爲了在特定的宿主細胞中最適切地表現V G F多肽，已經將含有密碼子的核酸變體加以改變。特定的密碼子改變將依據選擇用來表現的VGF多肽和宿主細胞而定。可藉著各種方法完成這類，，密碼子的最佳條件’例如精著選擇在特定宿主細胞中，在高度表現之基因中最喜歡使用的密碼子。可使用合併密碼子頻率表，像是有關於高度表現之細菌基因偏好的密碼子 f’Eco一high.Cod*，的電腦演算法，並可由 university of

Wisconsin Package 第 9.0 版（Genetics Computer Group，

Madison，WI)提供之。其他有用的密碼子頻率表，包括 "Celegans 一 high.cod1 丨、 Celegans—low.cod1，、 "Drosophila—high.cod” 、 ’’Human—high.cod，，、 "Maize—high.cod’，和nYeast—high.cod，，。在一些案例中，可能想要製備編碼V G F多肽變體的核酸分子。可使用指定位置之突變生成作用、PCR擴大作用或其他適當的方法，來產製編碼變體的核酸分子，其中引子 (們）具有想要的點突變（參見Sambrook等人，在前，和 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------裝-------^訂----I---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 A7 ___B7___ 五、發明說明（3〇 )

Ausubel等人，在前，關於突變技術的説明）。亦可使用使用由Engels等人，在前，描述之方法的化學合成法來製備這類變體。亦可使用熟諳此藝者已知的其他方法。載體和宿主細胞使用標準的連接技術，將編碼V G F多肽之胺基酸序列的核酸分子插入適當的表現載體内。通常選擇在所使用的特定宿主細胞中，具有功能的載體（也就是説，該載體可與宿主細胞機制相容，而得以發生基因的擴大及/或基因的表現）。可在原核生物、酵母菌、昆蟲（桿狀病毒系統）及/ 或眞核生物宿主細胞中，擴大/表現編碼V G F多肽之胺基酸序列的核酸分子。宿主細胞的選擇一部份將依據是否將在轉譯之後修改V G F多肽（例如糖基化及/或嶙酸化）。如果是，則酵母菌、昆蟲或哺乳動物宿主細胞是較佳的。關於表現載體的回顧，參見Meth. Enz.，第1 8 5册（D.V Goeddel編輯，Academic Press 1990)。通常’在任何宿主細胞中使用的表現載體，將含有質體維持和選殖及表現外源性核誓酸序列的序列。這類序列，在某些具體實施例中集體地稱爲’’側面序列”，通常將包括一或多個下列的核苷酸序列：啓動基因、一或多個促進子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有捐贈者和接受者接合位置的完全插入序列、編碼多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位置、聚腺甞酸化作用序列，插入編碼待表現之多肽之核酸的聚交聯劑區，以及可選擇標記要素在下文中分別討論這些序列。 ------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -33-

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製載體可視需要含有編碼”標籤”的序列，也就是位在vgF 多肤备碼序列之5’或3’末端的寡核甞酸分子，該寡核苷酸序列編碼聚Η 1 s (像是六H ! s )，或其他的標籤，像是 FLAG、HA(血球凝集素流行性感冒病毒）或m y c，有對抗、匕的可講得〈抗體存在。通常在表現多肽時，將該標藏與居多肽融合，並可做爲從宿主細胞中以親和力純化V g F多肽的工具。可藉著例如管柱層析法，使用對抗該標籤的抗體做爲親和力基質，來完成親和力純化。接著可視需要， **著各種方法像疋使用某些切開用的肤酶，從經過純化的V G F多肽中移除該標籤。側面序列可以是同種的（也就是得自與宿主細胞相同的物種及/或品系）、異種的（也就是得自與宿主細胞物種或品系不同的物種）、雜種的（也就是得自一種以上來源之側面序列的混合）或合成的，或該側面序列可以是天然的序列，其正常便具有調節VGF多肽表現的功能。側面序列的來源，本身可以是任何的眞核生物或原核生物，任何脊椎動物或無脊推動物，或任何植物，其限制條件爲該側面序列在宿主細胞機制中是具有功能的，並可由其活化。可藉著此項技藝中已熟知的數種方法中任一種，獲得有用的側面序列。通常，在本文中有用的側面序列基因之侧面序列不同-先前已經藉著作圖及/或核酸内切限制酶消化作用確認，並因此可使用適當的核酸内切限制酶，從適當的組織來源中分離。在一些案例中，側面序列的完整核甞酸序列可能是已知的。在這裏，可使用在本文 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規袼（210 X 297公爱） ---------^---------^^^1 . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製中描述，有關於核酸合成或選殖之方法，來合成側面序列0 ‘在已知全部或一郅份側面序列之處，可使用p C R及/或藉著利用it田的暴核I酸及/或得自相同或不同物種之側面序列片《k，篩選基因組庫而獲得。在不知道側面序列之 f，可從較大的DNA破片中分離含有側面序列的DNa片丰又，其可能含有例如密碼序列，或甚至是其他的基因或基因們。可藉著核酸内切限制酶消化作用，產生適當的 DNA片段，接著使用瓊脂糖凝膠純化作用、以叫⑶⑧管柱層析法（Chatsworth，CA)，或熟諳此藝者已知的其他方法分離’完成分離作用。熟諳此藝者將輕易地知曉爲了完成該目標而選擇適當的酵素。複製起點通常是那些可購得之眞核生物表現載體的一部份’且該起點有助於在宿主細胞中擴大該載體。在一些案例中’將載體擴大至確定的副本數目，對於適切地表現 VGF多肽是很重要的。如果選擇的載體不含複製起點位置，可以已知的序列爲基礎，以化學方式合成一個複製起點，並連接到載體内。例如，得自質體pBR322(New England Biolabs，Beverly，ΜΑ)的複製起點，適合大多數的革蘭氏陰性細菌’且各種起點（例如S V 4 0、多瘤、腺病毒、水疱性口炎病毒（VSV)或乳頭狀瘤病毒，像是HP V或 B P V )，適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點成份（例如，通常僅使用S V40起點，因爲它含有早期啓動基因）。 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ~ i — — — — — — β I I I I! I _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -J · 1285649

五、發明說明（33 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製轉綠終止序列通常位在多… 止轉錄作用。通當，d禾嗝，並用來終富含G-C的片段，接著：：生τ物細胞中的轉綠終止序列爲序列，或甚至是以ί::Λ。很容易從庫中選殖該酸合成的方法來合成之，徐σ 士 +、』t易地使用核可選擇象疋在本又中描述的那些。了選擇軚圮基因要素編 ^ ^ . Η ^ ^ 〕很王、、、田胞在選擇性培養基中存白ΓίΓ白質。典型的可選擇標記基因编碼之蛋 /、a)賦與原核生物宿主細胞對抗生的抗藥性，例如氨芊主汽本 x^、他母常胞的營養缺陷互補：Γ 四環素或康黴素；⑻與細、、 ’或（c)供應不能獲自複雜培養基的重要養份。較佳的可選擇標記爲康黴素抗藥性基因、氨爷青黴素抗藥性基因和四環素抗藥性基因。關於原核生物和眞核生物宿主細胞的選擇，亦可使用新黴素抗藥性基因。可使用其他的選擇基因擴大將要表現的基因。擴大作用是其中使對於產製對生長具有決定性之蛋白質，需要量較大之基因，反覆地縱排在重組細胞之連續產製的染色體内的過程。哺乳動物細胞之適當可選擇標記的實例，包括二氫葉酸還原酶（DHFR)和胸腺核苷激酶。將哺乳動物細胞轉化物置於選擇壓力下，其中僅有憑藉著出現在載體中的選擇基因’而獨一無二地改編的轉化物能夠存活。藉著將轉化之細胞培養在連續改變在培養基中選擇製劑之濃度的條件下，強加上選擇壓力，藉此導致選擇基因和編碼V G F多肽之DNA的擴大。結果，從經過擴大的DNA中合成增加含量的VGF多肽。 36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7

五、發明說明（34 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製核糖體結合位置通常是mRNA開始轉譯所必需的，並藉著Shine-Dalgamo(原核生物）或Kozak序列（眞核生物）定出其特徵。該要素通常位在啓動基因的3,和待表現之VGF多肽之法、碼序列的5 ’端。Shine-Dalgarno序列是多變化的，但通常是聚嘌呤（也就是具有高A-G内含量的）。已經確認出許多Shine-Dalgarno序列，可輕易地使用在本文中陳述的方法分別合成它們，並可用於原核生物的載體中。可使用前導或信號序列來指揮VGF多肽到宿主細胞之外。通常，編碼信號序列的核甞酸序列係位在V gF核酸分子的密碼區中，或直接位在VGF多肽密碼區的5,末端。已經確認出許多信號序列，可將任何在所選擇之宿主細胞中具有功能的那些與V G F核酸分子一起使用。因此，信號序列可以是與V G F核酸分子同種的（天然存在的）或異種的。此外，亦可使用在本文中描述的方法，以化學方式合成信號序列。在大多數的案例中，從宿主細胞中，.經由信號肽的存在來分泌V G F多肽，將導致從已經分泌的v G F多肽中移除信號肽。該信號序列可以是載體的成份，或它也可以是插入載體内之VGF核酸分子的一部份。可將編碼天然V G F多肽信號序列的核甞酸序列與V G F 多肽密碼區連接，或可將編碼異種信號序列的核甞酸序列與V G F多肽密碼區連接。所選擇的異種信號序列應該是可由宿主細胞認出並加工，也就是被信號肽酶切開的信號序列。關於不認得和加工天然V G F多肽之信號序列的原核生物宿主細胞，藉著例如選自包括驗性嶙酸酶、青黴素酶或 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) -· I---I - I ^ « — — — — — I — · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7

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閱背面之注

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五、發明說明（36 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製轉綠插入序列。因此，當要轉錄VGF eDNA分子時，插入序列的較佳位置是在轉綠起始位置的3 ’，和聚-A轉綠終止序列的5，。較佳的是，該插入序列或插入序列們將位在 cDNA的一邊或另一邊（也就是5’或3，），使得它不會妨礙密碼序列。可使用得自任何來源的任何插入序列，包括病母的、原核生物和興核生物（植物或動物）的，其限制條件爲它與它將插入的宿主細胞是可相容的。在本文中亦包括合成的插入序列。在載體中，可視需要使用一個以上的插入序列。表現和選殖載體通常將含有可由宿主生物認出的啓動基因，並以可操作之方式與編碼VGF多肽的分子連接。啓動基因是位在結構基因之起始密碼子上游（也就是5，）的未轉綠序列（通常在大約1 0 〇到1 〇〇〇個鹼基對之内），其控制結構基因的轉錄。在傳統上可將啓動基因分類成兩種中的一種：可謗導之啓動基因和組成的啓動基因。可謗導的啓動基因反映在培養條件中的一些改變，像是養份的存在或缺 <，或溫度上的改變，開始增加從D N A中轉錄的程度。換句話説，組成的啓動基因發動連續的基因產物產製；也就是在整個基因表現中有較少的或沒有控制。由各種有可能之宿主細胞認得的大量啓動基因，是已爲人所熟知的。藉著經由限制酵素消化，從來源D N A中移出啓動基因，並將想要的啓動基因序列插入载體中，將適當的啓動基因以可操作之方式與編碼VGF多肽的DNa連接。可使用天然的VGF啓動基因序列，來指揮VGF核酸分子的擴大作 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公 -·1111111 ^ « — — — — — — I— · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649

_* I 五、發明說明（37 用及/或表現。然而，如容許所表現之蛋白質較然的啓動基因相比較，其與已經選擇使用之宿主細 4果匕動基因是較佳的。系、、死疋可相谷的’則異種的啓適合原核生物宿主使用乳糖啓動基因系統；驗性~，基0包括f内酸胺酶和 % m _ Μ Ή 杆鉍酶，色胺酸（trp)啓動基因系、…及雜種的啓動基因’像是tac啓動基因。並他已知 Μ、、二1 已經公告它們的序列，藉此使熟爾此藝者得以將它們與想要的DNA序列連接，按昭需要使用又聯劑或接合體，以便提供任何有用的限制位置。適合酵母菌宿主使用的啓動基因亦爲此項技藝中已孰知的。可有利地將酵母菌促進子與酵母菌啓動基因一起使用。適合哺乳動物宿主細胞使用的啓動基因亦是已孰知的，並包括但不限於獲自病毒之基因組的那些，像是多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（像是腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、雞肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉綠病毒、B型肝炎病毒，而最佳的是猿病毒40(SV 40)。其他適當的哺乳動物啓動基因包括異種的哺乳動物啓動基因，例如熱_休克啓動基因和肌動蛋白啓動基因。在控制VGF基因表現上，可能感興趣的其他啓動基因包括，但不限於：SV40早期啓動基因區（Bern〇is^Chamb〇n， 1981，Nature 290:304-10) ; CMV啓動基因；在勞氏肉瘤病毒之3’長端重複中所含有的啓動基因（Yamam〇t〇等人， -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

--------^---------^91. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 Α7 Β7 五、發明說明（38 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1980，Cell 22:787-97);疱疹胸腺核甞激酶啓動基因 (Wagner等人，1981，Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A. 78:1444-45);金屬硫肽基因的調節序列（Brinster等人，1982, Nature 296:39-42);原核生物表現載體，像是々-内Si胺酶啓動基因（Villa-Kamaroff等人，1978, Proc· Natl· Acad· Sci. U.S.A·，75:3727-31);或 tac 啓動基因（DeBoer 等人， 1983，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A·，80:21-25)。感興趣的還有下列的動物轉錄控制區，其顯示出組織專一性，並已經在基因轉殖的動物中使用：彈性蛋白酶I基因控制區，其在胰臟腺泡細胞中是有活性的（Swift等人，1984, Cell 38:639-46 ; Ornitz 等人，1986，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986) ; MacDonald, 1987, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Hepatology 7:425-515);胰島素基因控制區，其在胰臟細胞中是有活性的（Hanahan，1985, Nature 315:115_22);免疫球蛋白基因控制區，其在淋巴細胞中是有活性的 (Grosschedl等人，1984，Cell 38:647-58 ; Adames等人， 1985, Nature 318:533-38 ; Alexander等人，1987, Mol· Cell. BioL，7:1436-44);老鼠乳房腫瘤病毒控制區，其在睪丸、乳房、淋巴和肥大細胞中是有活性的（Leder等人，1986, Cell 45:485-95);白蛋白基因控制區，其在肝臟中是有活性的（Pinkert等人，1987, Genes和Devel. 1:268-76); 胎兒-蛋白質基因控制區，其在肝臟中是有活性的（Krumlauf 等人，1985，Mol. Cell· Biol.，5:1639-48 ; Hammer等人， 1987, Science 235:53-5 8);沒1-抗胰蛋白酵素基因控制區， -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 五、發明說明（39 其在肝臟中是有活性的（Kelsey等人，1987，Genes and Devel· 1:161-71) ; θ -血球蛋白基因控制區，其在髓樣細胞中是有活性的（Mogram等人，1985, Nature 3 15:338-40 ; Kollias等人，1986, Cell 46··89-94);骨髓磷脂鹼性蛋白質基因控制區，其在腦中的寡樹突膠質細胞中是有活性的 (Readhead等人，1987, Cell 48:703-12);肌球蛋白輕鏈_2 基因控制區，其在骨骼肌中是有活性的（Sani，1985, Nature 314:283-86);以及促性腺釋放荷爾蒙基因控制區，其在下視丘中是有活性的（Mason等人，1986, Science 234:1372_ 78)。可將促進子序列插入載體内，增加編碼VGF多肽之 DNA在高等眞核生物中的轉綠。促進子是dna順向-作用的要素，長度通常爲大約10_3〇〇個鹼基對，其作用在啓動基因上，增加轉綠。促進子相對上是方位和位置獨立的。已、、二在轉錄單位的5 ’和3 1發現它們。已知數個獲自哺乳動物基因的促進子序列（例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋主β月α兒蛋白貧和胰島素）。然而，通常將使用得自進rsv 40促進子、細胞巨大病毒早期啓動基多瘤促進子和腺病毒促進子，是眞核生物啓動激：作用中的代表性促進要素。可在VGF核酸分子因的將促進子接合到載體内，其通常位在啓動基載：，像是可購得的載體，來製備表現載體。 k類載體可以或可以不含有所有想要的側面序列。其中一 42- i紙張尺度適时關家鮮（CNS)A4規格⑵f 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝丨丨丨丨訂 I I I ί ! · 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（4〇 ) 或多個在本文中描述的側面序列，尚未出現在載體中時，可分別獲得它們，並將其連接到載體内。獲得每個側面序列所使用的方法是熟諳此藝者已熟知的。較佳的載體是與細菌、昆蟲和哺乳動物宿主細胞可相容的那些。這類載體特別包括p C R I I、p C R 3和 pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto, CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-邙（PCT 出版物編號 WO 90/14363)和 pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island， NY)。其他適當的載體包括，但不限於黏接質體、質體或經過修改的病毒，但將知道該載體系統必須是與選出之宿主細胞可相容的。這類載體包括，但不限於諸如Bluescript®質體衍生物（以高副本數目ColEl-爲基礎的噬菌體質體， Stratagene，Cloning Systems，La Jolla CA)之類的質體，設計用來選殖Taq-擴大P C R產物的P C R選殖質體（例如 TOPOTM ΤΑ Cloning® 工具組，PCR2.1 ® 質體衍生物， Invitrogen，Carlsbad，CA)，以及哺乳動物、酵母菌或病毒載體，像是桿狀病毒表現系統（pBacPAK質體衍生物， Clontech, Palo Alto, CA) ° 在已經建構載體，並已經將編碼VGF多肽的核酸分子插入該載體的適當位置之後，可將完成的載體插入適合擴大及/或多肽表現的宿主細胞内。可藉著已熟知的方法，包 -43 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） i ·丨 — I — I 訂·丨丨—丨丨 . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 五、發明說明（41 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 括諸如轉移感染、感染、氯化鈣、電穿透作用、微量注射、脂染體、DEAE-葡聚醣法之類的方法，或其他已知的技術’芫成將V G F多肽的表現載體轉化至選出的宿主細胞中。所選擇的方法，一部份將是所使用之宿主細胞類型的函數。這些方法和其他適當的方法是熟諳此藝者已熟知的’並在例如Sambrook等人，在前，中陳述。宿主細胞可以是原核生物的宿主細胞（像是大腸桿菌）或眞核生物的宿主細胞（像是酵母菌、昆蟲或脊椎動物細胞）。當在適當的條件下培養時，該宿主細胞合成V g F多肽’可接著從培養基中收集（如果宿主細胞將其分泌至培養基中）’或直接從產製它的宿主細胞中收集（如果未分泌該多肽）。將依據各種因素來選擇適當的宿主細胞，像是想要的表現程度、對於活性想要的或必需的多肽修改（像是糖基化作用或磷酸化作用），以及容易折疊成具有生物活性的分子。許多適當的宿主細胞是此項技藝中已知的，並可獲自

American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，VA。實例包括，但不限於哺乳動物細胞，像是中國倉鼠卵巢細經濟部智慧財產局員工消費合作社印製胞（CHO)、CHO DHFR(_)細胞（Urlaub 等人，1980，？1*〇。· Natl. Acad· Sci· U.S.A· 97:4216-20)、人類胚胎腎臟（HEK) 293或293T細胞，或3 T3細胞。選擇適當的哺乳動物宿主細胞’以及轉化、培養、擴大、篩選、產物產製和純化的方法，爲此項技藝中已知的。其他適當的哺乳動物細胞株，是猴子COS_l和COS-7細胞株，以及CV_1細胞株。更 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（42) 多代表性的哺乳動物宿主細胞，包括靈長類細胞株和嚷齒類細胞株，包括轉化的細胞株。正常的二倍體細胞，衍生自在活體外原始組織培養物的細胞品系，以及原始的移植物，亦疋適合的。候選者細胞可能在基因型上，在選擇基因中是有缺陷的，或可含有優勢作用的選擇基因。其他適合的哺乳動物細胞株包括但不限於老鼠神經胚細胞瘤N2 A 細胞、HeLa、老鼠L_929細胞、衍生自Swiss、Balb-c或nih 老鼠的3T3細胞株、BHK或HaK倉鼠細胞株。這些細胞株中的每一個都是熟諳蛋白質表現技藝者已知的，並可由其取得。像適當之宿主細胞一樣有用的是細菌的細胞。例如，在生物技術學的範圍内，已熟知各種品系的大腸桿菌（例如 HB101、DH5 a、DH10和MC1061)可做爲宿主細胞。在該方法中，亦可使用各種品系的枯草桿菌（Β· subtiHs)、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.)、其他的桿菌屬（Bacillus spp·)、鏈黴菌屬（Streptomyces spp·)，及其類似物。熟諳此藝者已知許多品系的酵母菌細胞，亦可用來做爲表現V G F多肤的宿主細胞。較佳的酵母菌細胞包括例如酒酵母菌（Saccharomyces cerivisae)和巴斯德畢赤·酵母菌 (Pichia pastoris) 〇

另外，亦可在想要之處使用昆蟲細胞系統，來表現V G F 多肽。在例如 Kitts等人，1993，Biotechniques，14:810-17 ; Lucklow，1993，Curr. Opin· Biotechnol. 4:564-72 ;以及 Lucklow等人，1993，J. Virol·，67:4566-79 中描述了這類系 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -I 丨丨丨 — I 裝·！ — ！！訂·- ------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（43) 統。較佳的昆蟲細胞爲Sf_9和Hi5(Invitrogen)。亦可使用基因轉殖的動物來表現糖基化的V G F多肽。例如，可使用基因轉殖的產乳動物（例如，牛或山羊），並在動物的乳汁中獲得該糖基化的多肽。亦可使用植物來產製 VGF多肽，然而，一般在植物中發生的糖基化作用與在哺乳動物細胞中產生的不同，並可能導致糖基化的產物不適合人類的治療用途。多肽的產劁可使用熟諳此藝者已熟知的標準培養基，來培養包括 V G F多肽表現載體的宿主細胞。培養基通常將含有所有細胞生長和存活所需的養份。適合用來培養大腸桿菌的培養基’包括例如Luria肉湯（LB)及/或Terrific肉湯（TB)。適合用來培養眞核生物細胞的培養基包括R0sweU Park

Memorial Institute 培養基 1640(RPMI 1640)、Minimal Essential培養基（MEM)，及 / 或 Dulbecco’s Modified Eagle培養基（DMEM)，它們全都要按照所培養之特殊細胞株的需要，補充血清及/或生長因子。適合昆蟲培養的培養基，疋按照需要補充酵母菌溶胞產物（yeast〇late)、乳清蛋白水解產物，及/或胎牛血清的Grace，s培養基。通常，加入可用來選擇經過轉移感染或轉化之細胞生長的抗生素或其他化合物，做爲培養基的添加物。所使用的化合物’將由出現在用來轉化該宿主細胞之質體上的可選擇標記要素指定。例如，可選擇標記要素是康黴素抗藥性，則加至培養基中的化合物將是康黴素。其他用於選擇 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -裝--------訂---------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（Μ ) 性生長的化合物包括氨苄青黴素、四環素和新黴素。可使用此項技藝中已知的標準方法，評估由宿主細胞產製之V G F多肽的含量。這類方法包括，但不限於西方墨點分析、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、非-變性之凝膠電泳、高效液體層析（HPLC)分離、免疫沉澱法及/或諸如dNA結合凝膠移轉測定之類的活性測定。如果已經將V G F多肽設計成由宿主細胞分泌，則可在細胞培養基中發現大部份的多肽。然而，如果該V g F多肽並未從宿主細胞中分泌，則它將出現在細胞質及/或核中（就眞核生物宿主細胞而言），或是在細胞溶質中（就革蘭氏陰性細菌的宿主細胞而言）。 ^ 關於位在宿主細胞之細胞質及/或核中（就眞核生物宿主細胞而言），或是在細胞溶質中（就細菌的宿主細胞而言）的V G F多肽，可使用熟諳此藝者已知的任何標準技術，從宿主細胞中萃取細胞内的物質（包括革蘭氏陰性細菌的包涵體）。例如’可藉著法式壓榨（French Press)、均質化作用及/或超聲波振盪，接著離心，使宿主細胞溶解，釋放出胞漿周圍/細胞質的内容物。如果V G F多肽已經在細胞溶質中形成包涵體，通常包涵體可與内及/或外側的細胞膜結合，並因此將在離心之後，發現主要在小球狀的物質中。然後在p Η値兩端，或在還原劑的存在下，像是在鹼性ρ Η値下爲二硫蘇糖醇，或在酸性ρ Η値下爲tris羧乙基膦，以諸如清潔劑、胍、胍衍生物、尿素或尿素衍生物之類的促溶劑處理該小球狀的 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I * ϋ ϋ ϋ .^1 ϋ ϋ I ϋ I 1 1 . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 五、發明說明（45) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 物質，以便釋放、打破分開，並使該包涵體溶解。然後可使用凝膠電泳、免疫沉澱法或其類似者，分析溶解的VGF 多肽。如果想要分離VGF多肽，可使用標準方法，像是在本文中和在 Marston等人，1990, Meth. Enz·，182:264_75 中描述的那些，來完成分離作用。在一些案例中，VGF多肽在分離時可能不具有生物活性。可使用各種，，再折疊”或將多肽轉變爲其三級結構，並產生二硫鍵的方法，使生物活性復原。這類方法包括使溶解的多肽暴露在大約7的pH値下，並在特定濃度之促溶劑的存在下。促溶劑的選擇與用來溶解包涵體之方法的選擇非常類似，但通常使用較低濃度的促溶劑，且不一定要與落解作用所使用的促溶劑一樣。在大部份的案例中，再折疊/氧化作用的溶液亦將含有還原劑，或按特定比例之還原劑加其氧化形式，產生特殊的氧化還原電位，容許在形成蛋白質的半胱胺酸橋時’發生二硫鍵的洗牌。一些常用的氧化還原對偶，包括半胱胺酸/胱胺、穀胱甘肽（gsh)/ 二硫雙GSH、氣化銅、二硫蘇糖醇（DTT)/二噻烷DTT，以及2,2-鲩基乙醇（bME)/二硫_b(ME)。在許多例子中，可以使用或可能需要共溶劑，以便增加再折疊的效率，而爲了經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此一目的，較常用的試劑包括甘油、各種分子量的聚乙二醇、精胺酸及其類似物。如果在表現VGF多肽時，未形成明顯程度的包涵體，此時將主要在離心細胞句漿之後的上清液中發現多肽。可從上m液中，使用諸如在本文中描述的那些之類的方法，進 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公董） 1285649 A7 B7 五、發明說明（46) 一步地分離多肽。可使用各種技術，完成從溶液中純化V G F多肽。如果已經合成多肽，使其在它的羧基或胺基-終端含有諸如六組胺酸（VGF多肽/六His)之類的標籤，或其他小的肽，像是 FLAG(Eastman Kodak Co.， New Haven， CT)或 myc(Invitrogen，Carlsbad，CA)，便可在一-步法中，藉著使該溶液通過其中管柱基質對該標籤具有高度親和力的親和力管柱來純化之。例如，聚組胺酸以高親和力和專一性與鎳結合。因此，可使用鎳的親和力管柱（像是Qiagen®鎳管柱）來純化VGF 多肤 / 聚 His。參見，例如 Current Protocols in Molecular Biology §10.11.8(Ausubel等人，編輯，Green Publishers Inc. 和Wiley and Sons 1993) o 此外，可經由單株抗體的使用來純化V G F多肽，該單株抗體能夠專一地認出並與V G F多肽結合。經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在較好是部份或完全純化VGF多肽，使得它部份或實質上不含污染物之處，可使用熟諳此藝者已知的標準方法。這類方法包括，但不限於藉著電泳分離，接著電洗脱、各種類型的層析（親和力、免疫親和力、分子篩和離子交換）、HPLC和製備等電焦聚（"Isoprime”機械/技術，Hoefer Scientific，San Francisco，CA)。在一些案例中。可混合二或多個純化技術，達到增加的純度。亦可藉著化學合成方法（像是固相肽合成），使用此項技藝中已知的技術，像是由Merrifield等人，1963，J. Am. -49- 尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 B7 五、發明說明（47)

Chem. Soc. 85:2149 ; Houghten等人，1985，Proc. Natl. Acad (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Sci. USA 82:5132 ，以及 Stewart 和 Young，Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Co· 1984)陳述的那些，來製備VGF多肽。可合成在其胺基-終端有或無甲硫胺酸的這類多肽。可使用在這些參考文獻中陳述的方法，將化學合成的VGF多肽氧化，形成二硫橋。預期化學合成的 VGF多肽具有與以重組方式產生，或從天然來源中純化之相對應V G F多肽可相比擬的生物活性，並因此可與重組或天然的VGF多肽交替使用。其他獲得V G F多肽的方法是經由從生物試樣中純化，像是其中天然發現V G F多肽的起源組織及/或液體。可使用如同在本文中描述之蛋白質純化的方法，來經營這類純化作用。在純化期間，可監視V G F多肽的出現，例如，使用對抗重組產製之VGF多肽或其肽片段而製備出的抗體。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製命多產製多肤的其他方法，是此項技藝中已知的，並可使用這些方法來產製對V G F多肽具有專一性的多肽。參見，例如Roberts等人，1997, Proc· Natl· Acad· Sci. U.S.A. 94:12297-303，其描述mRNA與其編碼之肽之間，融合蛋白質的產製。亦參見 Roberts，1999，Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268-73 〇美國專利第5,763，192號；第5,814,476號；第5,723,323號和第5,817,483號，描述了產製肽或多肽的方法。這藉著產製機會基因或其片段來進行，然後將這些基因導入宿主細胞中’其產生一或多個由該機會基因編碼的蛋白質。然後 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 B7 五、發明說明（48 ) 篩選宿主細胞，確認產生具有想要活性之肽或多肽的那些純種系。 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 其他產製肽或多肽的方法，描述在Athersys，Inc.提出的 PCT/US98/20094(W099/15650)中。已知爲 π 爲了基因發現的基因表現之隨機激活作用（Random Activation of Gene Expression for Gene Discovery)’’(RAGE-GD)，該方法藉著就地重組方法，涉及内源性基因表現的激活，或基因的過度-表現。例如，藉著將調節序列整合到標靶細胞中，激活或增加内源性基因的表現，該標靶細胞能夠藉著非_同種的或達法的重組作用，激活基因的表現。首先使標靶 DN A接受照射，並插入遺傳的啓動基因。啓動基因最後設於在基因前面的破損處，發動基因的轉錄。結果導致想要之肽或多肽的表現。將知曉亦可使用這些方法來產生總括性的IL_丨7類似蛋白質表現庫，隨後可在各種測定中，像是生化測定、細胞測疋和整個生物體的測定（例如植物、老鼠等等），用來進行南輸出入總量的表現型篩選。合成經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 >熟諳此藝者將知曉在本文中描述的VGF多肽分子著重組及其他方法產製。曰選擇性結合劍 "選擇性結合劑"-詞意指對-或多個VGF多肽且有專性的分子。適當的選擇性結合劑包括，但不限於抗：二：何生物、多肽和小分子。使用此項技藝中已知的方法來製 51 - 良紙張尺度適財關家標準（CNSM4規格⑽χ挪公爱丁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 A7 -------B7____ 五、發明說明（49) 備適當的選擇性結合劑。本發明代表性的V g F多肽選擇性結合劑，能夠與VGF多肽的特定部份結合，藉此抑制該多肽與V G F多肽受體結合。抗原"一詞意指能夠被選擇性結合劑結合的分子或分子的一邵份，並額外地能夠使用於動物中，產生能夠與該抗原 < 抗原決定位結合的抗體。抗原可具有一或多個抗原決定位。，抗原決定位，’一詞意指在任何分子中，能夠被選擇性結合劑認出，並在該結合劑的一或多個抗原_結合區與其結合的部份。抗原決定位通常包括分子之具有化學活性的表面基團，像是胺基酸或糖側鏈，其具有特定的三度空間結構特徵，以及特定的電荷特徵。”抑制抗原決定位，，和，，中和抗原決定位”一詞，意指當抗原決定位與選擇性結合劑結合時，導致含有抗原決定位之分子在活體内、在活體外或就地喪失其生物活性，較佳的是在活體内，包括VGF多肽與V G F多肽受體的結合。田在本文中使用”抗原-結合區” 一詞時，意指選擇性結合劑的邵份，其含有與抗原產生交互作用的胺基酸殘基，並賦與該結合劑對抗原的專一性和親和力。較佳的是，抗原-結合區將是老鼠來源的。在其他的具體實施例中，抗原-結合區可衍生自其他的動物物種，特別是諸如兔子、大鼠或倉鼠之類的噶齒類。例如，本發明之選擇性結合劑的柷原-結合區，最好是衍生自對人類vgf多肽有專一性的非•人類抗體。編碼這類非-人類抗體之dna的較佳來 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---„-------I ^--------^----I----. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5〇) 源，包括產製抗體的細胞株，像是一般稱爲雜種瘤的雜種細胞株。諸如抗體和抗體片段之類，與VGF多肽結合的選擇性結合劑，均在本發明的範圍内。抗體可以是多株的，包括單一專一性的多株的；單株的；重組的；嵌合的；人類化的’像是CDR-移植的；人類的；單鏈的；及/或雙重專一性的；以及其片段、變體或衍生物。抗體片段包括抗體與在V G F多肤上之抗原決定位結合的那些部份。這類片段的實例包括藉著酵素切開全長之抗體而產生的Fab*F(ab)，片段。其他的結合片段包括藉著重組D n A技術產生的那些’像疋表現含有編碼抗體可變區之核酸序列的重組質體。多株抗fa疋竹生自以心原兄疫之動物的血清之抗體分子的異種族群。抗原爲能夠與抗體結合的分子或分子的一部份，其另外還能夠謗使動物產生能夠與該抗原之抗原決定位結合的抗體。抗原可具有一或多個抗原決定位。上文提到的專一性反應，意圖表示抗原將以高度選擇之方式，與其相對應的抗體反應，而不與可能由其他抗原唤起之大批的其他抗體反應。針對V G F多肽的多株抗體，通常在動物（例如兔子或老鼠）中，藉著多次的皮下或腹腔内注射VGF多肽和佐劑來產製。將VGF多肽與在待免疫物種中爲免疫原性的載劑蛋白質偶聯可能疋有用的’像是鎖孔^^血藍蛋白、血清、白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或黃豆胰蛋白酶抑制劑。 —li-----丨裝--------訂--------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -53-

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 A7 B7 五、發明說明（51) 再者，亦可使用諸如明礬之類的凝集劑來促進免疫反應。在免疫之後，將動物採血，並測定血清之抗-VGF抗體力價。單株抗體含有實質上均質的，對抗原專一的抗體族群，該族群含有實質上類似的抗原決定位結合位置。這類抗體可以是任何類型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、 IgA、GILD及其亞類型。可在活體外、就地或在活體内，培養產生本發明之單株抗體的雜種瘤。在活體内或就地產製高力價，是較佳的產製方法。可使用任何方法產製針對VGF多肽的單株抗體，其提供由在培養中之連續細胞株產製的抗體分子。適當之製備單株抗體的方法，包括Kohler等人，1975, Nature 256:495-97 的雜種瘤方法，以及人類B-細胞雜種瘤方法（Kozbor，1984, J. Immunol. 133:3001 ; Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 5 l-63(Marcel Dekker，Inc.，1987)。本發明亦提供產製與VGF多肽起反應之單株抗體的雜種瘤細胞株。較佳的抗-VGF選擇性結合劑包括在活體内，以競爭方式抑制與人類VGF多肽結合的單株抗體，或實質上具有相同的專一性結合特徵之抗體，以及其片段或區域。可在 Harlow 和 Lane，Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratories, 1989) ； Current Protocols in Immunology(Colligan等人，編輯，Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, 1993);以及 Muller，1988，Meth· -54 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） f 裝--------訂—--------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（52)

Enzymol· 92:589-601中找到藉著競爭抑制作用來決定單株抗體專一性和親和力的較佳方法。爲了用來做爲治療劑，可修改本發明之單株抗體。一個具體實施例爲，，嵌合型抗體，，，其中重（H)及/或輕（L)鏈的一部份與在衍生自特定物種之抗體中的相對應序列是相同或同種的，或屬於特定的抗體類型或亞類型，而剩下的鏈 (們）則疋與在衍生自其他物種之抗體中的相對應序列是相同或同種的，或屬於其他的抗體類型或亞類型。亦包括這類抗體的片段，只要其顯示想要的生物活性即可。參見美國專利弟 4,816,567 號；Morrison 等人，1985，Proc. Natl. Acad· Sci. 81:6851-55。嵌合型抗體及其產製方法爲此項技藝中已知的。參見

Cabilly+ 人 ’ 1984，Proc. Natl. Acad. Sci· U.S.A· 81:3273-77 ; Morrison等人，1984，Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A. 81:6851-55 ; Boulianne 等人，1984，Nature 312:643-46 ; Neuberger等人 ’ 1985，Nature 314:268-70 ; Liu等人，1987, Proc. Natl· Acad. Sci· U.S.A. 84:3439-43 ;以及 Harlow 和

Lane，在前。當在本文中使用”嵌合型抗體” 一詞時，包括單價的、二價的或多價的免疫球蛋白。單價的嵌合型抗體是二聚體 (HL) ’藉著後合之Η鏈經由二硫橋與嵌合之L鏈結合而形成。二價的嵌合型抗體是四聚體（ΗΑ2)，藉著兩個hl二聚體經由至少一個二硫橋結合而形成。亦可藉著例如使用聚集C η區（例如從IgM Η鏈或"鏈），來產製多價的嵌合型抗 -55 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ,丨丨^11------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（53) 體。本發明之後合型抗體亦可包括個別的Η及/或L免疫球蛋白鏈。較佳的嵌合型Η鏈包括衍生自對ν G F多肽有專一性之非-人類抗體之Η鍵的抗原·結合區，其至少連接人類η 鏈C區（CH)的一部份，像是CHptC%。較佳的嵌合型l鏈包括衍生自對V G F多肽有專一性之非·人類抗體之l鏈的抗原-結合區，其至少連接人類L鏈C區（CL)的一部份。具有相同或不同可變區結合專一性之嵌合型Η鏈和l鏈的選擇性結合劑’亦可根據此項技藝中已知的方法，藉著適當地結合個別的多肽鏈來製備。參見，例如Current

Protocols in Molecular Bi〇l〇gy(Ausubel等人，編輯，Green Publishers Inc· and Wiley and Sons 1994)和Harlow等人，在前。使用該方法，可將表現嵌合型H鏈（或其衍生物）之宿主細胞，與表現嵌合型L鏈（或其衍生物）的宿主細胞分開培養，並分別回收免疫球蛋白鏈，然後再連結。另外，亦可共同培養宿主細胞，並同時容許鏈在培養基中結合，接著回收已經組合好的免疫球蛋白。本發明亦提供選擇性結合劑的”衍生物”，像是抗體、片段、區域或其衍生物，該名詞包括由截短或經過修改之基因編碼的那些蛋白質，產生在功能上類似免疫球蛋白片^ 的分子物種。該修改包括，但不限於加入細胞毒性蛋白^ 之遺傳序列密碼，像是植物和細菌的毒素。可從本發明二何的宿主細胞中產製片段和衍生物。另外，亦可使^ 選擇性結合劑，像是抗體、其片段或區域，在活體 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —^--------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 五、發明說明（54 ) 胞母性蛋白質或化合物結合，提供細胞毒性之抗-VGF抗體’其將選擇性地殺死具有VGF多肽受體的細胞。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 適當的片段包括，例如Fab、Fab’、F(ab’)2* F v。這些片段缺乏完整抗體的F c片段，從循環中較迅速地清除，並可具有比完整抗體更少的非專一性組織結合。參見Wahl等人’ D83, J. Nucl_ Med· 24:316-25。使用此項技藝中已熟知的方法，從完整的抗體中產製這些片段，例如藉著利用諸如木瓜蛋白酶（產生Fab片段）或胃蛋白酶（產生F(ab，)2片段）之類酵素的蛋白水解切開作用。由本發明之單株抗體認出這些抗原-結合區及/或抗原決定位的身份，提供了產製額外之單株抗體所必需的資訊，其具有類似的結合特徵和治療或診斷之用途，與本申請案之具體實施例並行。在另一個具體實施例中，本發明之單株抗體爲，，人類化，，的抗體。將非-人類化抗體人類化的方法，爲此項技藝中已熟知的。參見美國專利第5,585,089號和第5,693,762號。般而s，人類化之抗體具有一或多個從非人類之來源導入的胺基酸殘基。例如，可使用在此項技藝中描述的方法 (Jones等人，1986, Nature 321:522-25 ; Riechmann等人， 1998，Nature 332:323-27 ; Verhoeyen等人，1988，Science 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 239:1534-36)，藉著以人類抗體的相對應區域取代至少一部份噶齒類的互補性_決定區（CDR)，來進行人類化作用。創造抗體分子之抗原·結合區（也就是Fab或可變區片段）的重組D N A版本的技術，其繞過單株抗體的產製，亦包括在本發明的範圍内。在該技術中，可從得自免疫動物的 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（55) 免疫系統之細胞中，萃取抗體-專一性信使R N A分子，並轉綠成cDNA。然後將該cDNA選殖到細菌表現系統中。適合實行本發明之這類技術的一個實例，使用具有前導序列的噬菌體；I載體系統，其引起已經表現的f a b蛋白質移動至近膜間隙（在細菌細胞膜和細胞壁之間），或待分泌。可迅速地產製，並針對與抗原結合的那些來篩選大量具有功能的Fab片段。特別將這類VGF-結合分子（具有對VGF多肽之專一性的F a b片段），包括在在本文中使用的”抗體” 一詞内。藉著將得自具有適當之抗原-專一性的老氣抗體分子之基因’與得自具有適當之生物活性（像是能夠激活人類補體並調解ADCC)的人類抗體分子之基因接合在一起，發展出產製嵌合型抗體的技術，亦在本發明的範圍内。

Morrison等人，1984, Proc· Natl. Acad. Sci· U.S.A. 81:6851-55 ; Neuberger等人，1984，Nature，312:604-08。藉著該技術產製的選擇性結合劑，像是抗體，亦在本發明的範圍内0 將知曉本發明並不限於老鼠或大氣的單株抗體；事實上，可使用人類抗體。可藉著使用人類的雜種瘤獲得這類抗體。參見Cote等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，77(1985)。因此，與VGF多肽結合的完整人類抗體亦包括在本發明中。藉著以VGF抗原（可視需要與載劑結合）免疫能夠在缺乏内源的免疫球蛋白產生之下，產製人類抗體之節目的基因轉殖動物（例如老鼠），來產製這類 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -裝--------訂--------- f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（56) 抗體。參見，例如 Jakobovits等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A· 90:2551_55 ; Jakobovits 等人，1993, Nature 362:255-58 ; Bruggemann等人，1993, Year in Immuno· 7:33- 40 ^ 抗-遺傳性型（抗-1 d )的抗體是認得獨特決定位的抗體，該決定位通常與抗體之抗原_結合位置有關。可藉著以欲對其製備抗-Id的單株抗體，免疫與該單株抗體之來源相同物種和基因型（例如老鼠品系）的動物，來製備抗_Id抗體。經過免疫的動物將認得，並藉著對這些遺傳性型決定位產生抗體（抗-1 d抗體），對經過免疫之抗體的遺傳性型決定位產生反應。參見，例如美國專利第4,699,88〇號。抗 -1 d抗體亦可用來做爲”免疫原，，，在另一個動物中謗發免疫反應，產生所謂的抗_抗_ ；[ d抗體。抗_抗_〗d抗體在抗原決定位方面，可能與謗發抗_Id之原始的單株抗體相同。因此，藉著使用對抗單株抗體之遣傳性型決定位的抗體，可能確認出其他表現具有相同專一性之抗體的純種系。本發明亦包括與VGF多肽結合的人類抗體。使用能夠在缺乏内源的免疫球蛋白產生之下，產製人類抗體之節目的基因轉殖動物（例如老鼠），藉著以VGF抗原免疫（也就是具有至少六個相鄰的胺基酸），其可視需要與載劑結合，來產裝這類抗fa。參見，例如jak〇b〇vits等人，1993，Proc·

Natl· Acad· Sci· U.S.A· 90:2551-55 ; Jakobovits 等人，1993,

Nature 362:255.58 ; Bruggemann等人，1993, in immun〇’ 7.33-40。在種方法中，藉著使内源的部位不能編碼其中 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準6^4規格（210x297公釐） --------^---------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（57) 的重和輕免疫球蛋白鏈，並將編碼人類重和輕鏈蛋白質的部位插入其基因組内，來產製這類基因轉殖的動物。然後使部份修改的動物，也就是具有比完全互補之修改更少的那些動物雜交’獲得具有所有想要之免疫系統修改的動物。在投予免疫原時，這些基因轉殖的動物產生帶有人類 (而非例如老鼠的）胺基酸序列的抗體，包括可變區，其對這些抗原是免疫專一性的。參見pct申請案第 PCT/US96/05928號和PCT/US93/06926號。其他的方法描述在美國專利第5,545,807號、PCT申請案第PCT/US91/245號和PCT/GB89/01207號，以及歐洲專利出版物第546073B1號和546073A1號中。亦可藉著在宿主細胞中表現重組的 DN A，或藉著在如同本文描述之雜種瘤細胞中表現，來產製人類抗體。在另一個具體實施例中，亦可從噬菌體-展示庫中產製人類抗體（Hoogenboom 等人，1991，J. Mol. Biol. 227:381 ; Marks等人，1991，J. Mol· Biol· 222:581)。這些方法經由在絲狀噬菌體的表面上展示抗體節目，模仿免疫選擇，並藉著噬菌體與選擇之抗原的結合來完成後續的選擇。在PCT 申請案第PCT/US98/17364號中描述了一種這類的技術，其描述使用這類方法，分離MPL_和msk-受體的高親和力與功能拮抗的抗體。嵌合的、C D R移植和人類化的抗體，通常是藉著重組方法產製。將編碼該抗體的核酸導入宿主細胞中，並使用在本文中描述的’以及此項技藝中已知的材料和程序來表現 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I裝 -------訂---------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（58 ) 之。在較佳的具體實施例中，在哺乳動物宿主細胞中產製抗體，像是CHO細胞。可藉著在宿主細胞中表現重組的 DNA ’或藉著在如同本文描述之雜種瘤細胞中表現，來產製單株（例如人類）抗體。可在任何已知的測定方法中使用本發明之抗_VGF抗體，像疋競梦性結合測定、直接和間接的三明治測定，以及免疫沉殿測定（Sola，Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147· 158(CRC Press，Inc·，1987))，來檢測和定量 VGF多肽。抗體將以適合欲使用之測定方法的親和力，與 VGF多肽結合。爲了診斷的應用，在某些具體實施例中，可利用可檢測部份來標示抗-VGF抗體。可檢測部份可以是任一個能夠直接或間接產生可檢測信號的部份。例如，可檢測部份可以是放射性同位素，像是3H、14C、32P、35s、1251、99TC、 Π11η或67Ga;榮光或化學發光化合物，像是勞光素異硫代氰酸酯、若丹明（rhodamine)或蟲螢光素；或酵素，像是鹼性磷酸酶、卢-半乳糖芬酶或辣根過氧化酶（Bayer等人， 1990, Meth· Enz·，184:138-63)。競爭性結合測定依賴已標示之標準物（例如VGF多肽，或其在免疫學上具有反應性的部份）與受試試樣分析物 (VGF多肽）競爭與限制含量之抗-VGF抗體結合的能力。在受試試樣中V G F多肤的含量，與已經與抗體結合之標準物的含量成反比。欲協助決定已經結合之標準物的含量，通常抗體在競爭作用之前或之後是不溶的，使得與該抗體 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------I I --------t--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（59 ) 結合之標準物和分析物，可便利地從仍維持未結合之梗準物和分析物中分離出來。三明治測定通常涉及兩個抗體的使用，其分別能夠與待檢測及/或定量之蛋白質不同的免疫原部份或抗原決結合。在三明治測定中，受試試樣的分析物通常與固定在固體支撑物上的第一個抗體結合，隨後第二個抗體與該分析物結合，因此形成不溶的三-份複合體。參見，例如美國專利第4,376，11G號。第二個抗體本身可利用可檢測部份來標示（直接的三明治測定），或可使用以可檢測部份標的抗-免疫球蛋白抗體來測量（間接的三明治測定）T 種類型的二明治測足疋酵素_連接的免疫吸附測 (ELISA)，在這種案例中，可檢測部份爲酵素。、選擇性結合劑，包括抗_VGF抗體，亦可用於在活體内成像。可將以可檢測部份標示的抗體投予動物，較佳的進入血流中，並測定在宿主中已標示之抗體的存在和置可利用在動物中，無論是藉著核磁共振、放射線學其他此項技藝中已知的檢測方法可檢測到的任何部份來示抗體。本發明之選擇性結合劑，包括抗體，均可用來做爲治療劑。這些治療劑通常是激動劑或拮抗劑，它們分別促進或降低至少-種VGF多肽的生物活性。在_個具體實施中，本發明之拮抗劑抗體是能夠專一地與vgF 人並能夠抑制或排除VGF多肽在活體内或在活體外之^ W 性的抗體或其結合片段。在較佳的具體實施例中，選擇性示例定的是位或標例活 - — — ml— — — — — — — — . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -62· β張尺度_ fiiig準（CNS)A4規格⑽χ 297公愛τ 1285649 A7 五、發明說明（6〇) 結合劑，例如拮抗劑抗體，將抑制VGF多月太之功能活性至夕大、勺5 0 /〇’更佳的是至少大約8 〇 %。在另一個具體實施例中’選擇性結合劑可以是抗_卿多肽抗體，其能夠與 VGF多肽的結合夥伴（配體或受體）進行交互作用，藉此在活體外或在活體内抑制或排除VGF多肽的活性。可藉著此項技藝中已熟知的篩選測定，確認選擇性結合劑，包括激動劑和拮抗劑抗-VGF多肽抗體。本發明亦關於包括VGF選擇性結合劑（像是抗體）和其他用來在生物試樣中檢測VGF#肤含量之試劑的工具組。這读4劑了包括可檢測標記、阻斷血清、陽性和陰性對照組試樣’以及檢測試劑。化學衍生物 I % 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可由热淆此藝者製備以化學方式修改之V G F多肽的衍生物，仵到在本文中描述的揭示内容。以與·天然附接於該多肽上之分子的型式和位置不同的方式，修改vgf多肽衍生物。衍生物可包括藉著刪除一或多個天然-附接之化學基圈而形成的分子。可藉著共價附接一或多個聚合物，來你改V G F多肽。例如，通常選擇水溶性的聚合物，使得其所附接的蛋白質不會在含水的環境中沉澱，像是生理學的環境。聚合物的混合物亦包括在適當聚合物的範圍内。較佳的疋，爲了終產物製品的治療用途，該聚合物將是在藥學上可接受的。聚合物可以分別具有任何的分子量，並可以是分支或未分支的。聚合物通常分別具有在大約2 kDa到大約1〇〇 kDa -63- 張尺度適用中國國家標準（CNS)A^i721〇 x 297公釐） 1285649 A7 B7 五、發明說明（61) 之間的平均分子量（”大約”一詞代表在水溶性聚合物的製品中，有些分子將比所陳述的分子量更重，有些則更輕）。每個聚合物的平均分子量最好是在大到大 50kDa之間，更佳的是在大約12kDa到大約4GkDa=f 而最佳的是在大約20 kDa到大約35 kDa之間。適當的水溶性聚合物或其混合物，包括但不限於N_鍵結或〇-鍵結的碳水化合物、糖、磷酸酯、聚乙二醇（pEG)(^ 括已經用來衍生蛋白質之PEG的形式，包括單·（(^ μ)、烷氧基-，或芳氧基_聚乙二醇），單甲氧基-聚乙二醇、葡聚醣（像是低分子量的葡聚醣，例如大約6 kD)、纖維素，或其他以碳水化合物爲基礎的聚合物，聚（N_乙烯基吡咯烷酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇（例如甘油）和聚乙晞醇。本發明亦包括雙重功能的交聯分子，其可用來製備共價附接的 VGF多肽多聚體。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一般而言，可在任何用來使蛋白質與已活化之聚合物分子反應的適當條件下，進行化學衍生作用。製備多肽之化學衍生物的方法，通常將包括下列步驟：（a)使多肽與已活化之聚合物分子（像是聚合物分子的反應性酯或醛衍生物），在藉此使VGF多肽附接到一或多個聚合物分子上的條件下反應；（b )獲得反應產物。將以已知的參數和想要的結果爲基礎，決定最適切的反應條件。例如，聚合物分子對蛋白質之比例越鬲，則附接之聚合物分子的百分比就越大。在一個具體實施例中，VGF多肽衍生物可在胺基_ -64· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公璧) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649

五、發明說明（62) 終端具有單一的聚合物分子部份。參見，例如美國專利第 5,234,784 號。可使用此項技藝中已知的任何聚乙二醇化反應，專一地完成多肽的聚乙二醇化作用。例如在下列的文獻中描述了這類反應：Francis等人，1992, F〇cus 〇n Gr〇wth F⑽t^s 3:4-10 ;歐洲專利出版物第1543 16號和第4〇1384號；以及美國專利第4，179,337號。例如，可經由與反應性聚乙二醇分子（或類似的反應性水溶性聚合物）的醯化反應或烷基化反應，如同在本文中的描述，完成聚乙二醇化作用。關於醯化作用，選出的聚合物應該具有單一的反應性酯基團。關於還原性烷基化作用，選出的聚合物應該具有單一的反應性醛基團。反應性的醛，例如是聚乙二醇丙醛，其爲對水穩定的，或其單CrC1G烷氧基或芳氧基衍生物（參見美國專利第5,252,714號）。在另一個具體實施例中，可以化學方式將Vgf多肽與生物素偶聯。然後容許生物素/VGF多肽分子與抗生物素蛋白結合’導致四價的抗生物素蛋白/生物素/VGf多肽分子。 VGF多肽亦可與二硝基苯酚（DNp)或三硝基苯酚（TNp)共價結合，並使所得的共軛物與抗_DNP或抗_TNp_IgM 一起沉殿’形成1 〇價的十體共轭物。通4，可藉奢投予本發明之VGF多肽衍生物，包括在本文中描述有關於V G F多肽的那些，來減輕或調節病況。然而，在本文中揭示之VGF多肽衍生物與非-衍生的分子相比較’可能具有額外的活性，增加或減少的生物活性，或 •65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1285649 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（63 其他的特徵，像是增加或減少的半衰期。 Y__QF多肽活性」^其他抑揚氪節劑的測定在一些場合，可能想要確認爲VGf多肽活性之抑揚調節劑的分子，也就是激動劑或拮抗劑。可使用一或多種篩選測疋，像是在本文中描述的那些，確認調節v G F多肽之天然或合成的分子。可以在活體外之方式或在活體内之方式，藉著注射，或藉著口服遞送、植入裝置或其類似物，來投予這類分子。 ”受試分子”意指在評估調節（也就是增加或減少）vgF多肽活性之能力下的分子。最常見的是，受試分子將直接與 VGF多肽產生交互作用。然而，#企圖包括間接調節 VGF多肽活性的受試分子，像是藉著影響vgf基因表現，或藉著與VGF多肽結合夥伴（例如受體或配體）結合。在一個具體實施例中，受試分子將以至少大約1〇_6m之親和力#數與V G F多肽結合，較佳的是大約丄〇_8m，更佳的是大約10·9Μ，而最佳的是大約1〇-1〇]^。 VGF多肽激動劑或拮抗劑可以是蛋白質、肽、碳水化合物、脂質或小分子量的分子，其與VGF多肽產生交互作用而調節其活性。調節VGF多肽表現的分子包括與編碼 VGF多肽之核酸互補的核酸，或與指揮或控制vQF多肽表現之核酸序列互補的核酸，而其係擔任表現的反義調節者。一旦藉著與VGF多肽之交互作用確認出受試分子，便可進一步評估該分子增加或減少VGF多肽之活性的能力。可 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I裝 0 ϋ I I I I 訂-1111111 ΜΨ. -66- 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（64) 以數種格式完成受試分子與VGF多肽之交互作用的測量，包括以細胞爲基礎的結合測定、膜結合測定、溶液-相測定和免疫測定。一般而言，將受試分子與VGF多肽一起培養一 #又特足的時間’並藉著一或多種測量生物活性的測定，定出V G F多肤的活性。亦可在免疫測定中使用多株或單株抗體，直接測定受試分子與V G F多肽的交互作用。另外，亦可在溶液和免疫測定中，使用含有如同在本文中描述之抗原決定位標籤的 V G F多肽之修改形式。在VGF多肤經由與結合夥伴（例如受體或配體）之交互作用，來展現生物活性的事件中，可使用各種在活體外的測定，測量V G F多肽對相對應之結合夥伴（像是選擇性結合劑、爻體或配體）的結合作用。可使用這些測定，就其增加或減少VGF多肽與其結合夥伴結合的比例和/或程度的旎力，來篩選受試分子。在一個測定中，將v G F多肽固定在微量滴定盤的孔中。然後可依序（按任一種次序）或同時將放射性標π的VGF多肽結合夥伴（例如碘化的VGF多肽結合夥伴）和受試分子加至孔中。在培養之後，沖洗該孔並進行放射f生汁數，使用閃爍計數器，定出結合夥伴與 VGF多肽結合的程度。通常，將測試在一段濃度範圍内的分子，並爲了在結果評估中的精確性，可使用一系列缺少 -或多個受試測定中之要素的對照組孔。該方法的另一種選擇涉及倒轉蛋白質的”位置，，，也就是將vgf多肽結合夥伴固定在微量滴定盤的孔中，與受試分子和放射性標示 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

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1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（65) 之VGF多肽一起培養，並決定vgf多肽結合的程度。參見’例如 Current Protocols in Molecular Biology，第 1 8 章 (Ausubel等人’編輯，Green Publishers Inc.，and Wiley and Sons 1995) 〇除了放射性標示之外，亦可使V g F多肽或其結合夥伴與生物素結合，然後可使用連接酵素，像是辣根過氧化酶 (HRP)或驗性磷酸酶（AP)的鏈黴菌抗生物素蛋白，檢測生物素基化之蛋白質的存在，其可以比色的方式，或藉著瞄準鏈黴菌抗生物素的螢光來檢測。在將複合體與連接A p 或HRP的酵素連接之鏈黴菌抗生物素蛋白一起培養之後，爲了檢測的目的，亦可使用針對V g F多肽或V G F多肽結合夥伴的抗體’並使其與生物素結合。亦可藉著附接於瓊脂糖小珠、丙晞酸小珠，或其他類型的這類惰性固相受酶質上，來固定VGF多肽或VGF多肽結合夥伴。可將受酶質-蛋白質複合體放在含有互補蛋白質和受試化合物的溶液中。在培養之後，可藉著離心使小珠沉澱’並使用在本文中描述的方法，評估在vgf多肽及其結合夥伴之間的結合量。另外，亦可將受酶質-蛋白質複合m固疋在管柱中，並使受試分子和互補的蛋白質通過該管柱。然後可使用在本文中描述的任何技術（例如放射性標示或抗體結合），評估在VGF多肽及其結合夥伴之間形成的複合體。用來確認在V G F多肽結合蛋白質與v g F多肽結合夥伴之間，增加或減少複合體形成之受試分子的其他在活體外 -68 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------^---------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 A7 ____B7 _ 五、發明說明（66) 的測定’是表面質粒基因組共振檢測器系統，像是 BIAcore測定系統（Pharmacia，Piscataway，NJ)。按照製造者的指示使用BIAcore系統。該測定基本上涉及VGF多肽或 V G F多肽結合夥伴與位在檢測器中之塗覆葡聚醣的感應器晶片的共價結合。然後可將受試化合物與其他互補的蛋白質，同時或連續地注射到含有感應器晶片的小室内。可以在分子質量上的改變爲基礎，評估結合之互補蛋白質的含量，而該分子質量上的改變在物理學上與感應器晶片之塗覆葡聚醣的邊有關，並可藉著檢測器系統來測量分子質量上的改變。在一些案例中，可能想要一起評估二或多個受試化合物，其增加或減少在VGF多肽和VGF多肽結合夥伴之間形成複合體的能力。在這些案例中，可藉著同時或連續地將這類額外的受試化合物（們）加至第一個受試化合物中，專二易地修改在本文中陳述的測定。在該測定中剩下的步驟’仍如同在本文中的陳述。可有利地使用在活體外的測定，像是在本文中描述的那二，就對在V G F多肽和v G F多肽結合夥伴之間複合體形成的〜響，來篩選大量的化合物。該測定可自動篩選在噬菌體展示、合成肽和化學合成庫中產製的化合物。一亦可在細胞培養中，使用表現VGF多肽或VGF多肽結泛夥伴的、、、田胞和細胞株，來篩選增加或減少在V G F多肽和多肽〜&夥伴之間形成複合體的化合物。可從任何哺礼動物中獲得細胞和細胞株，但較佳的將是得自人類和其 !裝------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1T---------ΛΤ. -69-

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五、發明說明（67 ) 他靈長類、犬或嚆齒類來源的。在受試分子的存在或缺乏之下，評估VGF多肽與在表面表現VGF多肽結合夥伴之細胞的結合，並藉著例如流動血球計數法（cyt〇metry)，使用對VGF多肽結合夥伴之生物素基化的抗體，決定結合的程度。可有利地使用細胞培養測定，進一步評估在本文描述的蛋白質結合測定中，得到正分數的化合物。亦可使用細胞培養來篩選藥物候選者的影響力。例如，藥物候選者可減少或增加VGF基因的表現。在某些具體實施例中，可在使細胞培物養暴露在藥物候選者之下後，測量所產生之VGF多肽或VGF多肽片段的含量。在某些具體實施例中，可檢測藥物候選者對細胞培養物的實際影響。例如，特定基因的過度-表現，可能對細胞培養物具有特疋的影響。在這類案例中，可測試藥物候選者增加或減少基因表現的能力，或其預防或抑制對細胞培養物之特定影響的能力。在其他的實例中，特殊代謝產物的產生，像是多肤的片段，可能導致或與疾病或病理狀況有關。在這類案例中，可測試藥物候選者在細胞培養物中減少這類代謝產物之產製的能力。 A化的蛋渔質經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可使用tat蛋白質序列（得自hi ν)將蛋白質内化至細胞内。參見，例如 Falwell 等人，1994 1>1>〇(：^^1八(^(1.8(^· U.S，A· 91:664-68。例如已經描述了 HIV tat蛋白質之j i個胺基酸序列（Y_G_R_K_mQ_R_R_R ;序列識別丨丨號）（稱爲’’蛋白質轉導功能部位”，或TAT PDT)越過細胞的 -70- 本紙張尺度_ 準（CNS)A4規格（210 x 297公爱）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649

五、發明說明（68) 細胞質膜和核膜調節遞送。參見Schwarze等人，1999,

Science 285:1569-72 ;以及Nagahara等人，1998, Nat· Med. 4:1449-52。在這些程序中，製備可在腹腔内投藥之後貫穿組織的 FITC·構築體（FITC_標示之 G_G_G_G_Y-G_R_K-K_R_ R-Q-R-R-R ;序列識別丨2號），並藉著螢光-激活的細胞分類（FACS)分析，檢測這類構築體與細胞的結合。以“卜0_ gal融合蛋白質處理細胞，將證實々_gal的活性。在注射之後，可在許多組織中檢測這類構築體的表現，包括肝臟、腎臟、肺臟、心臟和腦組織。咸相信這類構築體經歷一些程度的伸展，以便進入細胞，並在進入細胞之後可能需要再折疊。因此，將知曉可使用tat蛋白質序列，内化想要的多肽至細胞内。例如，使用tat蛋白質序列，可以細胞内之方式投予V G F拮抗劑（像是抗-VGF選擇性結合劑、小分子、可溶性受體或反義寡核甞酸），而抑制v G F分子的活性。 s在本文中使用” V G F分子” 一詞時，意指如同在本文中定義之VGF核酸分子和VGF多肽兩者。在想要之處，亦可使用這類程序，將VGF多肽本身從内部投予細胞。亦參見 Straus，1999，Science 285:1466-67。治療用i佘可使用本發明之VGF多肽和選擇性結合劑來治療、診斷、改善或預防許多急性和慢性的疾病或病況，包括在本文中提及的那些。 VGF相關性疾病、病況和障礙，包括肥胖、不孕、惡病 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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五、發明說明（69 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製質飲食障礙、AIDS相關性複合症、代謝亢進之病況、機能允進、活動性不足和胰島素產生過多。由不t要之VGF多肽含量引起或調節的其他疾病，亦包括在本發明的範圍内。不想要的含量包括過量的Vgf多肽和在正常含量之下的VGF多肽。 YG F多肽組合物釦崧苹治療性組合物亦在本發明的範圍内。這類VgF多肽的醫藥組合物可包括在治療上有效含量的V G F多肽，與針對適當之投藥形式而選擇的在藥學上或在生理學上可接受之調配劑混合。醫藥組合物可包括在治療上有效含量的一或多個VGF多肽選擇性結合劑，與針對適當之投藥形式而選擇的在藥學上或在生理學上可接受之調配劑混合。可接受的調配物質最好是在其所使用的劑量和濃度上，對接雙者是無毒性的。醫藥組合物可含有修改、維持或保存例如該組合物之p Η 値、滲透性、黏性、澄清度、顏色、等張性、味道、無菌性、穩定性、解離或釋放速率、吸收或貫穿的調配物質。適當的調配物質包括，但不限於胺基酸（像是甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸）、抗微生物製劑、抗氧化劑（像是抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉）、緩衝落液（像是硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、擰檬酸鹽、磷酸鹽或其他的有機酸）、填充劑（像是甘露糖醇或甘胺酸）、螯合劑（像是乙二胺四乙酸（EDTA))、錯合劑（像是咖啡驗、聚乙晞吡咯烷酮、0 -環糊精或羥丙基-卢-環糊精）、 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝 tr---------ΜΨ. 1285649 A7 B7 五、發明說明（70) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 填料、單醣類、雙醣類和其他的碳水化合物（像是葡萄糖、甘露糖或糊精）、蛋白質（像是血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）、著色劑、調味劑和稀釋劑、乳化劑、親水性聚ά物（像疋聚乙錦Γ Ϊ7比P各燒酮）、低分子量的多肤、形成鹽的抗衡離子（像是鈉）、防腐劑（像是苄二甲輕銨、苯甲酸、水楊酸、乙基汞硫代水楊酸鈉、苯乙醇、對幾苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、氣己定（chl〇rhexidine)、山梨酸或過氧化氫）、溶劑（像是甘油、丙二醇或聚乙二醇）、糖醇類（像是甘露糖醇或山梨糖醇）、懸浮劑、表面活性劑或濕潤劑（像是普魯卡因（pluronics ; PEG ;脱水山梨糖醇醋；多乙氧基醚，像是多乙氧基醚20或多乙氧基醚80 ;三通；三甲醇氨基甲烷(tromethamine);卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊（tyloxapal)、穩定性促進劑（像是蔗糖或山梨糖醇）、張力促進劑（像是鹼金屬化物-較佳的是氣化鋼或抑-或甘露糖醇或山梨糖醇）、遞送媒劑、稀釋劑、賦形劑及 / 或藥學佐劑。參見 Remington’s Pharmaceutical

Sciences(第 18 版，A.R· Gennaro 編輯，Mack Publishing

Company 1990 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製將由熟諳此藝者依據，例如打算使用的投藥途徑、遞送格式和想要的劑量，來決定最適切的醫藥組合物。參見，例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences，在前。這類組合物可能影響VGF分子的物理狀態、穩定性、在活體内釋放的速率，以及在活體内清除的速率。在醫藥組合物中，主要媒劑或載劑的性質，可以是含水 •73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（71) 的或不-含水的。例如，適合注射的媒劑或載劑可以是水、生理鹽水溶液或人造的腦脊髓液，可能補充在非經腸投藥之組合物中常見的其他物質。中性的緩衝生理鹽水或與血清白蛋白混合的生理鹽水，是較具代表性的媒劑。其他代表性的醫藥組合物包括大約pH 7.0-8.5的Tris緩衝溶液’或大約pH 4.0-5.5的醋酸緩衝溶液，其更可包括山梨糖醇或適當的取代。在本發明的一個具體實施例中，可藉著將具有想要純度的選出之組合物與任意的調配劑 (Remington’s Pharmaceutical Sciences，在前）混合成冷凍乾燥餅的形式，或含水的溶液，來製備可儲存的VGF多肽組合物。此外’亦可使用諸如蔗糖之類的適當賦形劑，以冷凍乾燥物的形式調配V G F多肽產物。爲了非經腸遞送，可選擇VGF多肽醫藥組合物。另外，亦可爲了吸入或爲了經由消化遒遞送，像是口服，來選擇組合物。這類在藥學上可接受之組合物的製備，在此項技藝的範圍内。調配成份出現的濃度，爲投藥處可接受的。例如，用來將組合物維持在生理學的pH値下，或在稍低之pH値下，通常在從大約5到大約8之間pH値範圍内的緩衝溶液。當企圖非經腸投藥時，在本發明中使用之治療性組合物可以是不含熱原的、非經腸可接受的含水溶液形式，其包括在菜予上可接受之載劑中想要的V g ρ分子。特別適合非經腸注射的媒劑爲無菌的蒸餾水，在其中將VGF分子調配成無菌、等張的溶液，並適當地防腐。其他的製備可能涉 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） <裝丨------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（72) 及將想要的分子與諸如可注射之中心體、生物可腐蝕的顆粒、聚合的化合物（像是聚乳酸或聚甘醇酸）、小珠或微脂粒之類的製劑一起調配，提供經控制或持續釋放的產物，然後經由儲存處注射來遞送。亦可使用透明質酸，且其可能具有在循環中增進持續期間的作用。其他導入想要分子的適當方法，包括可植入的藥物遞送裝置。在一個具體實施例中，可調配吸入用的醫藥組合物。例如，可將VGF多肽調配成吸入用的乾粉。亦可爲了以氣溶膠遞送，將V G F多肽或核酸分子吸入溶液與推進劑一起調配。在另一個具體實施例中，可將溶液霧化。在p C τ出版物第W0 94/20069號中進一步描述了肺臟投藥，其描述以化學方式修改之蛋白質的肺臟遞送。亦企圖口服投予特定的調配物。在本發明的一個具體實施例中，可將以此形式投藥的VGF多肽與或不與在傳統上用來調和諸如錠劑和膠囊之類固體劑量形式的那些載劑一起調配。例如，可將膠囊設計成在胃腸道中的某處釋放該調配物之活性部份，此時發揮最大的生物利用性，並將前 -全身性降解減至最少。可包含其他的製劑，以促進V 〇 ρ 多肽的吸收。亦可使用稀釋劑、調味劑、低熔點的蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑和黏合劑。其他的醫藥組合物可能涉及在帶有適合製造錠劑之無毒性賦形劑的混合物中，VGF多肽的有效量。藉著將錠劑= 解於無菌的水中，或其他適當的媒劑中，可製備單位劑量形式的溶液。適當的賦形劑包括，但不限於惰性稀釋 f裝--------訂--------- 9,. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -75-

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 五、發明說明（73) 劑，像是碳酸舞、碳酸鈉或碳酸氯納，乳糖或蹲_，或黏合劑，像是澱粉、明膠或阿拉伯樹膠；或潤滑劑，像是硬脂酸鍰、硬脂酸或滑石。其他的VGF多肽醫藥組合物’對熟諳此藝者將是明顯的，包括涉及在持續·或經控制-遞送之調配物中之VGF多肽的調配物。調配各種其他的持續_或經控制_之遞送方法的技術，像是微脂粒載劑、生物可腐蝕的微顆粒，或多孔隙的小珠和儲存處注射，亦爲熟諳此藝者已知的。參見，例如PCT/US93/00829，其描述用來遞送醫藥組合物之經控制釋放的多孔隙聚合微顆粒。持續釋放之製品的額外實例包括以成形物品之形式的半透性聚合物材料，例如薄膜或微膠囊。持續釋放的材料可包括聚酯類、水膠體、聚交酯（美國專利第3,773,919號和歐洲專利出版物第058481號）、L -穀胺酸和厂乙基_ L _穀胺酸酉日的共聚物（Sidman等人 ’ 1983，Biopolymers 22:547. 56)、聚（2-羥乙基異丁烯酸酯）（Langer等人，1981，J. Biomed. Mater. Res· 15:167_277和Langer，1982, Chem· Tech· 12:98·1〇5)、乙烯乙酸乙烯酯（Langer等人，在前}，或聚_ D(-)-3-羥基丁酸（歐洲專利出版物第133988號）。持續釋放的組合物亦可包括微脂粒，其可藉著此項技藝中已知之數種方法中的任一種來製備。參見，例如Eppstein等人， 1985, Proc· Natl· Acad· Sci. USA 82:3688-92 ;以及歐洲專利出版物第036676號、第088046號和第143949號。在活體内投藥所使用的V G F醫藥組合物，通常必須是無 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — 裝------！訂· —-------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 五、發明說明（74 ) 菌的。這可藉著通過無菌過濾膜過濾冷凍乾燥物之處，可在冷凍乾燥和^建之在組合物馬使用該方法的滅菌作用。可以冷來乾燥二：：二經營中，儲存非經腸投藥的組合物。此外，通常㈣合物放在具有滅菌通氣孔的容器中，例如且 ^細々、、且射針頭刺穿之塞子的靜脈内溶液袋或小瓶。°被皮下，王一旦已經調配好醫藥組合物，便可以溶液、懸浮液、凝訂固體或脱水或冷涑乾燥散劑的形式，將其儲存在雒菌的小瓶中。這類調配物可以現成可用之形式，或以在投藥之前需要重建（例如冷凍乾燥）的形式儲存。/ 卜在特定的具體實施例中，本發明針對產生單〜劑量投藥單2的工*組。玉具組可分別含有具有脱水蛋白質的^ :個容器，和具有含水調配物的第二個容器。在本發明的範圍内，亦包括含有隔成一和多個隔間之預先_填裝的注射筒（例如液體注射筒和溶解注射筒（ly〇syringes))的工具組。八經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在治療上使用之VGF醫藥組合物的有效含量，將依據治療的前後關係和目標而定。熟諳此藝者將知曉治療的適當劑量含量，並因此一部份將依據所衍生之分子，代表將使用何種V G F分子，投藥的途徑，以及患者的大小（體重、 fa表面積或器备的大小）和狀況（年齡和一般健康狀況）。因此’臨床醫師將滴定劑量，並修改投藥途徑，以便獲得最佳的治療效果。典型的劑量範圍可以從大約〇 . 1微克/公斤到最高大約1 〇〇毫克/公斤或更多，係依據上文提及的因 -77- A7 B7 1285649 五、發明說明（75) 素。在其他的具體實施例中，劑量範圍可從0 . 1微克/公斤到最高大約1 0 0毫克/公斤；或1微克/公斤到高達大約1 0 0 亳克/公斤；或5微克/公斤到高達大約1 0 0毫克/公斤。投藥的頻率將依據在待使用之調配物中V G F分子的藥物動力學參數。通常，臨床醫師將投予組合物，直到達到獲件想要之效果的劑量爲止。因此’可在一段時間内，以單一劑量、二或多個劑量投予組合物（可以或可以不含相同含量的想要分子），或經由植入之裝置或套管連續輸液。由熟諳此藝者例行地進行更精細地區別適當的劑量，並在例行由他們完成之職務的範圍内。可經由使用適當的劑量 •反應數據，確定適當的劑量。投予醫藥組合物的途徑，係根據已知的方法，例如口月良；經由靜脈内、腹腔内、大腦内（實質内）、腦室内、肌肉内、眼内、動脈内、門脈内（intraportal)或病灶内的路徑注射；藉著持續釋放的系統；或藉著植入裝置。在想要之處’可藉著團塊注射，或藉著輸液或植入裝置連續投予該組合物。另外或額外地，亦可經由膜、海綿，或其他已經在其中吸附或包封想要分子之適當物質的植入，局部投予該組合物。在使用植入裝置之處，可將該裝置植入任何適當的組織或器官中，並可經由擴散、按時·釋放之團塊或連續投藥來遞送想要的分子。在一些案例中，可能想要以在活體外之方式來使用VGF 多肽醫藥組合物。在這類例子中，使已經從患者中移出之 LI.—______ 酵」 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tr---------11^· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -78 -

1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（76) 細胞、組織或器官，在後續將該細胞、組織或器官移植回該患者内之前，先暴露在VGF多肽醫藥組合物之下。在其他的案例中，可藉著移植某些已經使用像是在本文中描述的那些方法，以遺傳方式設計，表現和分泌V g ρ多肽的細胞，來遞送VGF多肽。這類細胞可以是動物或人類的細胞，並可以是自體的、異種的或異種的。該細胞可視需要爲永存不死的。爲了降低免疫學反應的改變，可將細胞包膠，以避免周圍組織的浸潤。包膠的材料通常是生物可相容的、半·通透的聚合封入物或膜，其容許蛋白質產物（們）的釋放，但防止該細胞被患者的免疫系統，或被其他來自周圍組織的有害因素破壞。如同在本文中討論的，可能想要以一或多種V 〇 ρ多肽處理已經分離的細胞族群（像是幹細胞、淋巴球、紅血球、軟骨細胞、神經元及其類似物）。這可藉著使經過分離的細胞直接暴露在多肽之下來完成，在該處其係以可通過細胞膜的形式。本發明的其他具體實施例，係關於在活體外產製治療性多肽’並藉著基因治療或細胞治療來產製和遞送治療性多肤的細胞和方法（例如同種重組作用及/或其他的重組產製方法）兩者。可使用同種或其他的重組方法來修改含有正常播聲轉綠的V G F基因，或表現-低下之基因的細胞，並藉此產生表現出在治療上有效含量之V g F多肽的細胞。同種重組作用最初是爲了在具有轉錄活性的基因中瞄準基因’以便着發或修正突變而發展出的技術。Kucheriapati， 79- 本紙張尺S適用中關家標準（CNS)A4規格⑽χ挪公髮） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（77) 1989, Prog· in Nucl· Acid Res· & Mol. Biol· 36:301。發展基本的技術，成爲將特定突變導入哺乳動物基因組之特定區内（Thomas等人，1986, Cell 44:419-28 ; Thomas和 Capecchi， 1987, Cell 51:503-12 ; Doetschman等人，1988，卩1*〇。.化11·

Acad· Sci. U.S.A. 85:85 83-87)，或在有缺陷的基因内修正特定突變的方法（Doetschman等人，1987，Nature 330:576-78)。在美國專利第5,272,071號·，歐洲專利出版物第 9193051 號和 505500 號；PCT/US90/07642 和 PCT 出版物第 WO 91/09955號中描述了代表性的同種重組技術。經由同種重組作用，可藉著將其與瞄D N A附接，指揮待插入基因組内的DN A序列至感興趣基因的特定區域。瞄準DNA是與基因組DNA之該區互補的（同種的）核笔：酸序列。在D N A進行複製的期間内，使與基因組特定區互補的小片瞄準D N A與親代股接觸。已經插入細胞内的DNA 雜交是一般的特性，並因此經由共享的同種區，與其他片的内源D N A重組。如果該互補股與含有突變或不同序列，或額外核菩酸的寡核苷酸附接，則由於重組的結果，也將它併入新合成的股中。由於校對的功能，可能以 D N A的新序列做爲模板。因此，將轉移的d N A併入基因組中。與那些瞄準DN A片附接的是可與VGF多肽之表現產生交互作用或控制它的D N A區域，例如側面序列。例如，在足以影響編碼想要之VGF多肽的DNA轉錄的附近和方位，將啓動基因/促進子要素、抑制者基因，或外源的轉 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨|*|-1丨___丁 Lf (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（78) 錄調節要素插入想要宿主細胞的基因組中。控制要素控制了在宿主細胞基因組中出現的DNA部份。因此，可不藉編碼VGF基因本身之DNA的轉錄，而寧可藉著與1：)]^八調節斷片偶聯之瞄準DN A (含有與感興趣之内源基因具有同種性的區域）的使用，來完成想要之VGF多肽的表現，其提供内源的基因序列，具有可認出v G F基因轉綠的信號。在典型的方法中，經由在細胞基因組内，藉著導入包栝至少一個調節序列、表現序列和接合捐贈者位置的 D N A，在預先選擇位置處的同種重組作用，改變了想要 (標靶基因在細胞中的表現（也就是想要的内源細胞基因）。事實上以這類方式將這些成份導入染色體（基因組的）DNA内，結果產生了新的轉綠單位（其中出現在該 D N A構築體中的碉節序列、表現序列和接合捐贈者位置，以可操作之方式與内源的基因連接）。由於將這些成伤導入染色體之D N A内的結果，改變了想要.之内源基因的表現。改變的基因表現，如同在本文中的描述，包括活化（或謗發表現）正常在獲得它的細胞中是無聲（未表現）的基因，以及增加在獲得它的細胞中並未以生理學上顯著程度表現之基因的表現。具體實施例進一步包括改變調節或謗導的模式，使其與在獲得它的細胞中發生之調節或謗導的模式不同，並降低（包括排除）在獲得它的細胞中表現之基因的表現。一種可藉著使用同種重組作用，來增加或引起從細胞的 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----I--訂----I----· (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁〕

1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（79) 内源VGF基因中產製VGF多肽的方法，涉首先使用同種重組作用’將得自位置-專一的重組系統之重組序列（例如 Cre/loxP，FLP/FRT)(Sauer，1994，Curr. Opin. Bi〇teehn〇1， 5:521-27 ; Sauer，1993，Methods Enzymol·，225:89〇-9〇〇)，放在細胞的内源基因組VGF多肽密碼區的上游（也就是 5 J。將含有與剛好放在基因組VGF多肽密碼區上游之位置同種的重組位置的質體，連同適當的重組酶 (recombinase)酵素一起導入經過修改的細胞株中。該重組酶引起質體經由質體的重組位置，整合到在該細胞株中，剛好位在基因組V G F多肽密碼區之上游的重組位置内 (Baubonis 和 Sauer，1993, Nucleic Acids Res. 21:2025-29 ; O’Gorman等人，1991，Science 251:1351-55)。已知可增加轉錄的任何侧面序列（例如促進子/啓動基因、插入序列、轉譯促進子），如果在該質體中位在適當之處，將以這類方式整合，產生新的或經過修改的轉錄單位，·導致從細胞的内源VGF基因中，重新或增加VGF多肽的產製。更多的方法使用其中已經將位置專一的重組序列，正好放在細胞的内源基因組VGF多肽密碼區之上游的細胞株，使用同種重組作用在細胞株之基因組的別處，導入第二個重組位置。然後將適當的重組酶酵素導入兩個-重組-位置的細胞株内，謗發重組的事件（刪除、倒位和移位）（Sauer， 1994，Curr· Opin· Biotechnol· 5:521_27 ; Sauer 1993 Methods Enzymol·，225:890-900)，其將產生新的或經過修改的轉錄單位，導致從細胞的内源VGF基因中，重新或增 •82· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝 n ϋ H ϋ / 丨、_ aw MV I I I AM μ i 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 A7 B7 五、發明說明（80) 加VGF多肽的產製。從細胞的内源V G F基因中，增加或謗發v G F多肽表現的其他方法，涉及增加或謗發基因或基因們（例如轉綠因子）的表現，及/或降低基因或基因們（例如轉錄阻遏物）的表現，其多少導致從細胞的内源V G F基因中，重新或增加 V G F多肽的產製。該方法包括將非-天然存在的多肽（例如包括與轉錄因子功能邵位融合之位置專一的DNA結合功能部位的多肽）導入細胞内，得到從細胞的内源V G F基因中，重新或增加VGF多肽產製的結果。亦企圖包括V G F多肽的細胞治療，例如植入產生v G F 多肽的細胞。該具體實施例涉及植入能夠合成並分泌V g F 多肽之生物活性形式的細胞。這類產製V G F多肽的細胞，可以疋屬於V G F多肤之天然生產者的細胞，或可以是重組的細胞，已經藉著以編碼想要之V G F多肽的基因，或以增加VGF多肽表現之基因轉化，增加其產生VGF多肽的能力。可精著適合用來遞送基因’並促進其表現和分泌的載體，來完成這類修改。爲了使在待投予V G F多肽之患者中可能的免疫學反應減至最少，像是可能在投予外來物種之多肽時發生的，最好產製VGF多肽的天然細胞，是屬於人類來源的，並產生人類的V G F多肽。同樣的，產製V G F 多肽的重組細胞，最好是利用含有編碼人類V G F多肽之基因的表現載體轉化的。可將被植入的細胞包膠，以避免周圍組織的浸潤。可植入患者中的人類或非-人類的動物細胞，在生物可相容、 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨 II 丨丨丨丨丨-— · 11 — 11 — 1 — — . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 五、發明說明（81 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 半·通透的聚合封入物或膜中，其容許V(JF多肽的釋放，但防止該細胞被患者的免疫系統，或被其他來自周圍組織的有害因素破壞。另外，亦可將患者自己的細胞，在活體外轉化成可產製V G F多肽，直接植入患者中，而不需這類的包膠作用。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製活細胞的包膠技術，爲此項技藝中已知的，並可例行地完成包膠細胞的製備，和將其植入患者。例如，Baetge等人（？€丁出版物第1〇 95/05452號和？(：171；894/09299)描述了含有遺傳工程設計之細胞的膜膠囊，以便有效地遞送生物活性的分子。該膠囊爲生物可相容的，並容易取回。該膠囊包膠以重組D N A分子轉移感染的細胞，該重組d N A 分子包括以可操作之方式與啓動基因連接之具有生物活性之分子的DN A序列密碼，其在植入哺乳動物宿主中時，並未經歷在活體内的向下調節。該裝置提供了將得自活細胞的分子遞送至接受者内的特定位置。此外，參見美國專利第4,892,538號；5,011，472號和5，106,627號。包膠活細胞的系統描述在PCT出版物第W0 91/10425號（Aebischer等人）。亦參見？<：丁出版物第\^0 91/10470號（八61^。1^1*等人）；Winn 等人，1991，Exper. Neurol· 1 13:322-29 ; Aebischer 等人，1991，Exper. Neurol. 1 11:269-75 ;以及 Tresco等人，1992, ASAIO 38:17-23。亦想像VGF多肽之在活體内和在活體外的基因治療遞送。基因治療技術的一個實例，是使用編碼V G F多肽的核酸（基因組DNA、cDNA及/或合成的DNA)，其以可操作之 -84- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 B7 五、發明說明（82 ) 方式與組成的或可謗導的啓動基因連接，形成，，基因治療 (DNA構築體”。啓動基因可以是與内源的vgf基因同種或異種的，其限制條件爲它在將插入該構築體的細胞或組織類型中，是具有活性的。基因治療之DN A構築體的其他成份，可視需要包括爲了位置-專一的整合作用而設計的DN A分子（例如可用於同種重組作用的内源序列）、組織-專一的啓動基因、促進子或無聲序列（silencers)、能夠提供勝過親代細胞之選擇性優勢的DN A分子、可用來做爲標記以便確認轉化細胞的DN A分子、陰性選擇系統、細胞專一性結合劑（像是例如爲了瞄準細胞）、細胞·專一的内化因子、促進從載體中表現的轉錄因子，以及使載體能夠產製的因子。然後可使用病毒或非-病毒的載體，將基因治療之DN A 構築體導入細胞内（在活體外或在活體内）。一種導入基因治療之DNA構築體的方法，是藉著如同在本文中描述之病母載體。某些載體，像是反轉錄病毒載體，會將dna 構築體遞送至細胞的染色體DNA内，並將基因整合到染色體的DN A内。其他的載體將具有附加體之功能，並將基因治療之D N A構築體維持在細胞質内。在另外的具體實施例中，爲了在標靶細胞中控制V G F基因的表現，可包含調節要素。這類要素可反映適當的效應物而打開。以此方式便可在想要之時表現治療性的多肽。一種傳統的控制方法涉及使用小分子的二聚體或雷帕洛體 (rapalogs)，二聚含有小分子-結合功能部位的嵌合型蛋白 -85- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) IIII 訂111111 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

--------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 五、發明說明（83) =和能夠發動生物加工的功能部位，像是dna_結合蛋白負或轉錄激活蛋白質（參見pCT出版物第w〇 96以1865、 wo 97/31898和wo 97/31899號）。可使用蛋白質的二聚作用來發動轉殖基因的轉綠。另一種調節技術，使用將從感興趣之基因中製備的蛋白貝，以凝集物或集群之形式保存在細胞内的方法。以融合蛋白質之形式來表現感興趣的基因，其包括有條件的凝集功能部位，導致凝集的蛋白質保留在内質網中。被儲存的蛋白質在細胞中是穩定和無活性的。然而，可藉著投予藥物（例如小分子的配體）釋放該蛋白質，其移除有條件的凝集功能部位，並藉此專一地打破分開凝集物或集群，而得以從細胞中分泌該蛋白質。參見Aridor等人，2000,

Science 287:816-17 和 Rivera 等人，2000，Science 287:826- 30 〇其他適當的控制方法或基因開關包括，但不限於在本文中描述的系統。使用米非司g同（Mifepristone)(RU486)做爲黃體酮的拮抗劑。經過修改之黃體酮受體配體-結合功能部位與黃體酮拮抗劑的結合，.藉著形成兩個轉錄因子的二聚體，然後越過進入細胞核與DNA結合，而激活轉錄作用。修改該配體-結合功能部位，排除了受體與天然配體結合的能力。經過修改的類固醇荷爾蒙受體系統，進一步描述在美國專利第5,364,791號和PCT出版物第w〇 96/40911 號和 WO 97/10337號中。另一種控制系統使用蜕皮激素（果蠅類固醇荷爾蒙），其 -86- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（84 ) 結合並激活蜕皮激素受體（細胞質之受體）。然後該受體移位至核’與專一的D N A反應要素（得自蜆皮激素-反應性基因的啓動基因）結合。蜕皮激素受體包括轉活化功能部位、DNA-結合功能部位和發動轉錄的配體_結合功能部位。在美國專利第5,514,578號和PCT出版物第w〇 97/381 17、WO 96/37609和WO 93/03 162號中進一步描述了蜕皮激素系統。其他的控制方法使用正的四環素-可控制轉活化劑 (transactivator)。該系統涉及與激活轉錄作用之多肽連接的突變t e t阻遏物蛋白質DNA-結合功能部位（突變的tet r_4 胺基酸改變，其導致相反的四環素-調節之轉活化劑蛋白質，也就是説，其在四環素的存在下與tet操縱基因結合）。在美國專利第5,464,758號、5,650,298號和5,654，168 號中描述了這類系統。在 Innovir Laboratories Inc·的美國專利第 5,741，679 號和 5,834,186號中描述了其他的表現控制系統和核酸構築體。可經由局部注射或藉著其他適當之病毒或非-病毒的遞送載體，藉著將編碼VGF多肽的核酸分子導入細胞内，完成在活體外的基因治療。Hefti，1994，Neurobiology 25:1418-35。例如，爲了遞送至標靶細胞，可使編碼VGF 多肽的核酸分子包含在與腺有關的病毒（AAV)載體内（參見，例如Johnson，PCT出版物第WO 95/34670號；PCT申請案第PCT/US95/07178號）。重組的AAV基因組通常含有位在編碼V G F多肽之D N A序列側面的逆向終端重覆段，以 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） f 裝--------訂---------A^_wi. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可操作之方式與具有功能的啓動基因和聚腺苷酸化列連接。 j序、、另一種適當的病毒載體包括，但不限於反轉錄病毒、腺病毒、單純疱療病4、慢病毒、肝炎病毒、微小病毒、乳頭狀^多瘤空泡化病毒、痘病毒、π病毒、冠狀病毒^旱形病毒、副黏液病毒和乳頭狀瘤病毒載體。美國專利^ 5,672,344號描述了在活體内病毒-調節之基因運送系統，其涉及重組的趨神經之HSV-1載體。美國專利第5,399 3牝號提供了加工處理，藉著遞送在活體外處理，插^編碼治療性蛋白質之DNA斷片的人類細胞，提供患者治療性蛋白質的實例。其他實行基因治療技術的方法和材料，描述在美國專利第5,631，236號（涉及腺病毒載體）、5,672,51〇號 (涉及反轉綠病毒載體）、5,635,399號（涉及表現細胞分裂素之反轉綠病毒載體）。非病毒的遞送方法包括，但不限於微脂粒-調節之運送、裸露的DNA遞送（直接注射）、受體-調節的運送（配體 -DNA複合體）、電穿透作用、磷酸鈣沉澱法和微顆粒撞擊 (例如基因槍）。基因治療之材料和方法，亦可包括可謗導的啓動基因、組織-專一的促進子-啓動基因、爲了位置-專一之整合作用而設計的DN A序列、能夠提供勝過親代細胞之選擇性優勢的DN A序列、確認轉化細胞之標記、陰性的選擇系統，以及表現控制系統（安全性測量）、細胞 •專一的結合劑（爲了瞄準細胞）、細胞-專一的内化因子，和由載體促進表現的轉錄因子，以及載體製造的方法。這 -88- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --I · 11--I--訂---I--11 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（86 ) 類實行基因治療技術的額外方法和材料，描述在美國專利第4,970，154號（涉及電穿透技術）、5,679,559號（描述基因遞送之含有脂蛋白的系統）、5,676,954號（涉及微脂粒載劑）、5,593,875號（描述嶙酸每轉移感染的方法）和 4,945,050號（描述在細胞中以藉此使顆粒貫穿細胞表面並併入細胞内部之速度，來推動生物活性之顆粒的方法），以及PC T出版物第W0 96/40958號（涉及核配體）。亦企圖使VGF基因治療或細胞治療，更包括在相同或不同的細胞（們）中，遞送一或多個額外的多肽（們）。可將這類細胞分別導入患者中，或可在單一的可植入裝置中含有這些細胞，像是上述的包膠膜，或可藉著病毒載體分別修改這些細胞。在細胞中經由基因治療來增加内源的V G F多肽表現的方法，是將一或多個促進子要素插入VGF多肽的啓動基因中，促進子要素可在那裏擔任增加V G F基因之轉錄活性的職務。將以想要在其中激活基因的組織爲基礎，來選擇所使用的促進子要素-已知促進子要素在將選擇的組織中赋與啓動基因活化。例如，若要在T細胞中，，打開，，編碼v G F 多肽的基因，則可使用1 c k啓動基因促進子要素。在此，可使用標準選殖技術，將欲加入之轉錄要素有功能的部份插入含有VGF多肽啓動基因的DNA片段中（並可視需要插入載體及/或侧面序列的5 1及/或3 1内）。然後可在活體外或在活體内’將該構築體’稱爲’’同種重組作用的構築體，I導入想要的細胞内。 -89 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） f裝--------訂-------- 蜂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（87) 亦可使用基因治療，藉著修改内源啓動基因的核芸酸序列來降低VGF多肽的表現。通常經由同種的重組方法來完成這類修改。例如，可設計含有全部或一部份就失活作用選出之VGF基因之啓動基因的〇ΝΑ分子，以便移除並/或置換調節轉錄之啓動基因的碎片。例如，可使用標準的分子生物學技術，删除啓動基因之轉錄活化劑的Tata盒子及/或結合位置；這類刪除可抑制啓動基因的活性，藉此抑制相對應之V G F基因的轉綠。在啓動基因中刪除tata 盒子或轉錄活化劑結合位置，可藉著產生包括全部或相關部份之VGF多肽啓動基因（得自與待調節之VGF基因相同或相關的物種）的DN A構築體來完成，其中經由一或多個核荅酸的取代、刪除及/或插入，使一或多個TATA盒子及 /或轉錄活化劑結合位置之核苷酸突變。結果，TATA盒子及/或活化劑結合位置具有降低之活性，或變成完全失活的。該構築體，通常亦將含有至少大約5 〇〇個鹼基的 DNA，相當於與已經修改之啓動基因斷片相鄰，天然的 (内源的）5 ’和3’ DNA序列，可直接或按照在本文中的描述，經由病毒載體將其導入適當的細胞内（在活體外或在活體内）。通常，構築體整合到細胞的基因組〇1^八内，將經由同種的重組作用，其中在啓動基因構築體中的5，和 3* DNA序列，可經由與内源的染色體DNA雜交，來協助整合經過修改的啓動基因區。 V G F多肽的用i佘可在適合待治療之病況處，將VGF多肽與一或多種細胞 -90 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1 I I n I I I I I an n ϋ ϋ 一-口V I I ϋ ϋ I . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)， 1285649 A7 B7 五、發明說明（88) 分裂素、生長因子、抗生素、消炎劑及/或化學治療劑混合使用（同時或連續）。亦可在想要抑制一或多個VGF多肽的活性之處，使用其他的方法。可藉著與表現控制序列（形成三股螺旋）或VGF mRN A互補並與其雜交的核酸分子，來完成這類抑制作用。例如，可將反義的DNA或RNA分子導入細胞内，其具有與V GF基因中至少一部份互補的序列。在本文中揭示使用VGF基因之序列，藉著可利用的技術，來設計的反義探針。通常，每個這類的反義分子，將與每個選出之VGf 基因的起始位置（5，末端）互補。當反義的分子與相對應的 VGF mRNA雜交時，便阻礙或減少了該mRNA的轉譯。反義的抑制劑提供了在細胞或器官中，與降低或缺乏V g f多肽有關的資訊。另外’可使用基因治療來創造一或多個V G F多肽的負面優勢之抑制劑。在該場合中，可製備編碼每個選出之V g F 多肽的突變多肽的DNA，並使用如同在本文中描述之病毒或非·病毒的方法，將其導入患者的細胞中。通常將這類突變體分別設計成在其生物學角色中，與内源的多肽競爭。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此外’亦可使用V G F多肽作爲免疫原，無論其是否具有生物活性’也就是説該多肽含有至少一個可使抗體升高的抗原決定位。爲了在活體内或在活體外的診斷目的，可使用與V G F多肽結合的選擇性結合劑（如同在本文中的描述），包括但不限於使用已標示之形式，來檢測在體液或 -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1285649 A7 B7___ 五、發明說明（89 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 細胞試樣中V G F多肽的存在。亦可使用抗體來預防、治療或診斷許多疾病和障礙，包括在本文中提及的那些。抗體可與V G F多肽結合，而得以減少或阻斷v G F多肽的至少一個活性特徵，或可與多肽結合，以便增加VGF多肽的至少一個活性特徵（包括藉著增加VGF多肽的藥物動力學）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製利用表現選殖策略，可使用本發明之VGF多肽來選殖 VGF多肽受體。可在結合測定中使用以放射性標示（125_ 蛾）的V G F多肽，或附上親和力/活性-標籤的v G F多肽 (像是F c融合或鹼性磷酸酶融合），來確認表現v 〇 ρ多肽受體的細胞類型或細胞株或組織。可將從這類細胞或組織中分離出的RN A轉變爲cdNA，選殖到哺乳動物表現載體中’並轉移感染到哺乳動物細胞内（像是C 0 S或2 9 3細胞）’而產生表現庫。然後可使用以放射性標示或附加標籤的V G F多肽做爲親和力配體，從該庫中確認並分離在其表面上表現V G F多肽受體的細胞亞組。然後可從這些細胞中分離DNA，並轉移感染到哺乳動物細胞内，產生第二個表現庫’其中表現v G F多肽受體之細胞的溶離份，比在原始庫中的更高許多倍。可反覆地重覆該增強作用的過程，直到分離出含有VGF多肽受體的單一重組純種系爲止。VGF多肽受體的分離，可用來確認或發展vgF多肽發送信號之路徑的新穎激動劑和拮抗劑。這類激動劑和拮抗劑包括可溶的VGF多肽受體、抗·vgf多肽受體抗體、小一分子或反義的寡核嘗酸，然後可使用它們來治療、預防或诊斷-或多種在本文中描述的疾病或障礙。 -92- ^紙張尺度適^甲國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐）--- 1285649 A7 B7 五、發明說明（9〇 ) 下列的實例僅企圖做爲解釋之用，不應解釋爲以任何方式限制本發明之範圍。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例1 :抗-VGF多肽抗體的產製藉著利用由 Amgen Boulder Peptide Technology 團體，使用標準肽合成草案合成的VGF多肽注射兔子，來產製對抗 V G F多肽的抗體。在肽合成之後，集合得自不同批的 VGF多肽，並冷凍乾燥之。藉著利用HC1的水解作用，定出每個V G F多肽的肽内含量。欲從^乏半胱胺酸琴基的VGF多肢(VGF-1 ;序列識別工號或VGF-2 ;序列識別4號；表I)來製^多株的抗_VGF多肽抗體^ '將5毫克VGF多肽和0.5毫升Imject® EDC共幸厄緩衝溶液（Pierce, Rockford, IL)轉移感染到2毫升的小瓶中，並旋轉該混合物。以2毫升無菌的水稀釋2 0毫克小瓶的 Imjecf鎖孔戈戚血藍蛋白（Pierce)，並將0 · 5毫升的該溶液加至V G F多肽溶液中。在加入鎖孔：?戚血藍蛋白之後，將 0.1毫升的EDC(10毫克EDC(Pierce)在1亳升無菌的水中）加至V G F多肽中，並在室溫下培養該溶液至少2小時。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在培養之後’將共扼的VGF多肤移至Spectra/Pro 6透析管（Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA)中，具有 1000之分子量截止値，並在4°C下以2公升PBS透析過夜，以便從試樣中移除EDTA，已知其爲抗-凝固劑。將經過透析、共軛的V GF多肽溶液移至1 5毫升的錐形管中，並加入P B S，使該溶液之體積達到4毫升。將各1毫升的等份移至2毫升有螺旋蓋的試管中，將每個等份吸至2亳升玻璃注 -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 B7 五、發明說明（91 ) 射同中，然後再吸1耄升Titermax®研究佐劑（CytRx， Norcross，Georgia) 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將注射筒與18號混合針頭連接，並將該溶液混合成乳劑狀。然後將該混合物移至兩個丨毫升的注射筒中，以肌肉内 >王射到兔子體内。以〇 ·丨毫升v G F多肽/佐劑溶液，在兩個注射位置注射兔子，並在之後4週和6週補強。在第二次補強之後，對兔子進行試驗採血（移出大約5毫升），然後在兩週之後再度進行試驗採血。如果認爲採血的結果是可接受的’便再度補強兔子，然後在這次補強之後兩週，每週採血一次持續六週（移出大約4 〇毫升）。憑1和2解釋了以 VGF^XGF二2色益含 f 〇一欲從(是有半胱胺酸殘基的VGF多j來製備多株的抗-VGF多肽抗體，將5毫克VGF多肽和0_5毫升Imject®順丁烯二酿亞胺共軛緩衝溶液（Pierce)轉移感染到2毫升的小瓶中，並旋轉該混合物。以2毫升無菌的水稀釋2 〇毫克小瓶的Imject®鎖孔戚血藍蛋白（pierce)，並將〇 5毫升的該溶液加至V G F多肽溶液中。在加入鎖孔戚血藍蛋白之後，在室溫下培養VGF多肽溶液至少2小時。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在培養之後，將共軛的V G F多肽移至Spectra/Pro 6透析管中，並在4 °C下以2公升P B S透析過夜，以便從試樣中移除EDTA。將經過透析、共軛的VGF多肽溶液移至1 5毫升的錐形管中，並加入p B S，使該溶液之體積達到4毫升。將各1毫升的等份移至2毫升有螺旋蓋的試管中，將每個等份吸至2毫升玻璃注射筒中，然後再吸1毫升Titermax®研 -94- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（94 ) 從luxPR啓動基因中謗發基因產物的表現。在3 7下培養孩培養物額外的3小時。在該次培養之後，藉著顯微鏡檢查細菌培養物中包涵體的存在，然後藉著離心收集。藉著再懸洋於含有1〇〇/0卢-親基乙醇的Laernrnli試樣緩衝溶液中’直接溶解細胞小球，並藉著8〇|§_?八〇£分析之。

藉著首先利用高壓均質化作用（也就是經過14,〇〇〇镑/平方英忖2次）使細胞在水中破裂，來純化v g F多肽-F c融合蛋白質。藉著在J-6B中以4200 RPM離心1小時，收獲包涵體’並以1/10之比例，將包涵體溶解於6M胍、50 mM

Tns、8 mM DTT，pH 8.7中1小時。然後在2M尿素、50 mM Tris、160 mM精胺酸、3 mM半胱胺酸，pH 8.5中，將已落解的混合物稀釋2 〇倍。在冰冷的環境中攪拌該混合物過仗’藉著超過滤濃縮成大約1 〇倍，然後以1 〇 mM Tris， 1·5 Μ尿素，pH 9稀釋成3倍。然後以醋酸將該混合物的 P Η値碉整到pH 5。藉著離心移除沉澱物，並將上清液裝入以20 mM NaAc，100 mM NaCl，pH 5平衡過的SP -瓊脂糖速流管柱中（10毫克/毫升蛋白質裝載；室溫）。使用倍管柱體積之在相同緩衝溶液中，範圍在從約i NaCl到500 mMNaCl的梯度，從管柱中洗脱出蛋白質。將得自管柱的集合物稀釋3倍，並裝入在2〇 mM NaAc，ι5〇 niMNaCl，pH 5的SP-瓊脂糖HP管柱（1〇毫克/毫升蛋白質裝載；室溫）中。使用20-倍管柱體積，在相同緩衝溶液中’範圍在從約150 mM NaCl到400 mM NaCl的梯度，洗脱出蛋白質。收集峰値並過濾之。 · I---I--訂--I------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -97-

1285649 A7 B7 五、發明說明（95 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用在本文中描述的方法，或熟諳此藝者已知的方法，評估VGF多肽-Fc融合蛋白質的活性。 t例4 :在某因棘殖的老氣中表現老鼠的Vgf多肽欲評估VGF多肽的生物活性，使用標準草案來製備在賽納普辛（synapsin)啓動基因控制之下編碼老鼠VGF多肽的構築體。預期該構築體的遞送會引起病理學上的改變，這提供了 V G F多肽功能的情報。同樣的，使用標準草案，製備含有在肌動蛋白啓動基因控制之下的全長VGF多肽的構築體。預期該構築體的遞送將導致無所不在的表現。欲產生這些構築體，使用PCR擴大編碼老鼠VGF多肽的模板D N A序列，使用相當於想要序列之5，和3 ’末端的引子，且其併入限制酵素位置，容許將經過擴大的產物插入表現載體内。在擴大作用之後，使用標準重組的DNA技術，以凝膠純化P C R產物，以適當的限制酵素消化，並連接到表現載體内。參見Graham等人，1997，Nature Genetics， 17:272-74和Ray等人，1991，Genes Dev· 5:2265-73。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在連接之後，藉著電穿透作用使用反應混合物轉化大腸桿菌宿主品系，並就藥物的抗藥性來選擇轉化物。從所選出的菌落中分離質體DNA，並使其接受DNA定序，證實適當之插入序列的存在，並沒有突變。經由兩輪的CsCl密度梯度離心來純化V GF多肽表現載體，利用適當的限制酵素切開，並藉著凝膠電泳法純化出含有老鼠V G F多肽轉殖基因之已經弄直的片段。以2微克/毫升之濃度，將已經純化的片段再懸浮於5 111]\4丁出，？^17.4和0.2 1][1]\4£〇丁八中。 -98 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（96) 按照描述（PCT出版物第W0 97/23614號），注射得自 BDFlxBDFl交配的單-細胞胚胎。在C02恆溫箱中培養該胚胎過夜，並將1 5-20個兩個細胞的胚胎移至假懷孕之c D 1 雌鼠的輸卵管中。如下藉著整合轉殖基因至基因組DNA 試樣中的P C R擴大作用，篩選獲自植入微量注射之胚胎的後代。在5 5 °C下，以2 0微升耳朵緩衝溶液（20 mM Tris， pH 8.0, 10 mM EDTA，0.5% SDS和5 00毫克/毫升蛋白酶〖）消化耳朵的碎片過夜。然後以2 0 0微升T E稀釋試樣，並在使用適當引子的P C R反應中使用2微升的耳朵試樣。確認出基因轉殖的創始動物，並用來產生F 1老藏。欲這樣進行，從F 1老鼠中移出一部份的脾臟、肝臟和全部的腦’並使用總RN A萃取工具組（Qiagen)從脾臟中分離總細胞RNA，並藉著RT-PCR定出轉殖基因的表現。使用 Superscript™前擴大系統（Gibco-BRL)，如下將從脾臟回收的RNA轉變爲cDNA。使用適當的引子，位在表現載體序列中’並在V G F多肽轉殖基因之3 ’，從轉殖基因的轉綠本中發動cDNA合成。在7 0 °C下，將1 0毫克從創始者和對照組之肝臟、腦和脾臟製備的總RNA與ImM引子一起培養 10分鐘，並放在冰上。然後以10 mM Tris_HCl，pH 8.3, 50 mM KC1，2.5 mM MgCl2, dNTP各 10 mM，0.1 mM DTT和 200 單位的Superscript II反轉錄酶補充該反應。在4 2 °C下培養 50分鐘之後，藉著加熱至72°C 15分鐘使該反應中止，並在3 7 °C下以2單位RN A酶Η消化2 0分鐘。然後使用對老鼠 VGF多肽專一的引子，藉著PCR擴大試樣。 -99 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -裝--------訂---------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（97) 使得自轉殖基因陽性之F 1老鼠的小孩雜交，產生F 2同種接合子的老鼠。按照在本文中的描述，定出VgF mRNA 在F 2老鼠中的表現程度。 : j鼠多肽在F2基因後中的生物活性在安樂死之前，先將獲自實例4的F2基因轉殖之老鼠稱重，藉著異氟烷麻醉，並藉著心臟穿刺抽血。使試樣接受血液學和血清化學分析。在最後的放血之後完成χ射線攝影。在巨觀的解剖時，使主要的内臟器官接受重量分析。在巨觀的解剖之後，移出組織（也就是肝臟、脾臟、胰臟、胃、整個胃腸道、腎臟、呼吸器官、皮膚和乳腺、骨骼、腦、心臟、肺臟、胸腺、氣管、食道、甲狀腺、腎上腺、膀胱、淋巴結和骨赂肌），並在1 〇 %經過緩衝的Z n _ 福馬林中固定’以供組織學的檢查。在固定之後，在石壤塊中加工組織，並獲得3毫米的切片。所有的切片均以蘇木素和曙紅染色，然後進行組織學分析。如下使基因轉殖和對照組老鼠的脾臟、淋巴結和派亞氏腺（Peyer、patch)接受免疫組織學分析，利用b細胞和丁細胞專一性抗體。將福馬林固定石蠟包埋的切片脱蠟，並在去離子水中水合。以3 %過氧化氫使該切片中止，以蛋白質阻斷劑（Lipshaw，Pittsburgh, PA)阻斷之，並在大鼠單株抗-老鼠 B220和CD3(Harlan，Indianapolis, IN)中培養。藉著气物素、基化的兔抗-大球爹舎和帶有D A B做邊色原 CA)的過氧化酶共軛之鏈黴菌彳龙生、物素蛋白（BioGenex，San Ramon，CA)，來檢測抗體的結 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝 -100-

1285649 五、發明說明（98) 合。以蘇木素對切片進行對比染色。在驗屍之後，移出得自基因轉殖動物和對照組孩子的脾臟和胸腺之MLN和切片。藉著以注射筒的平端對1〇〇毫米尼龍細胞濾網（Becton Dickinson，Franklin Lakes, NJ)的底部’溫和地磨碎組織，來製備單一細胞的懸浮液。將細胞冲洗兩次’計數’然後以每種組織大約1 χ 1 〇 6個細胞，以 20微升之體積，將其與0·5微克cD16/32(FcrIII/II)Fc阻斷劑一起培養10分鐘。然後在2-8X：下，在帶有〇·5微克對抗 CD90.2(Thy-1.2)、CD45R(B220)、CDllb(Mac-l)、Gr-Ι、 CD4 或 CD8 之 FITC或 PE -共轆蘇抗體(E^rMingen，San

Diego, CA)的 100 微升體積之PE^T^乏 Ca+和 Mg+)、〇·ι〇/0 牛血清白蛋白和〇·〇1%疊氮化鈉中，染色〇分鐘。在抗體結合之後，沖洗細胞，真在 FACScan(Becton Dickinson)上[心已經從較佳具體實施例的觀本發明，熟諳此藝者了解將發生改變和修改。因此，企圖使附綠的申請專利範圍涵蓋所有在本發明提出申請之範圍内的這類相等的改變0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -101 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1285649 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（99) <11Q> Y3LH, Hai Boone, Tom <120> 序列一覽表 VGF多肽及治療VGF相關性障礙的方法 <130> 00-422-A <140> <Ϊ41> <tB〇> 60/144,797 丨 <本51> 1999—07-21 | <160> 10j ： j <170> PatentIn Ver. 2,0I ； <210> 1 <211> 30 <取2>蛋白質 <2;13>挪威大鼠 <4Ό0> 1 Ala Gin Glu Glu Ala Asp Ala Glu Glu Arg Arg Leu Gin Glu Gin Glu 1 5 10 is Glu Leu Gl-u Asn Tyr lie Glu His Val Leu Leu His Arg Pro 20 25 30 <210> 2 <211> 9 蛋白質 ^213> 挪威大鼠 <400> 2 Ala Gin Glu Glu Ala Asp Ala Glu Glu 1 5 <21Q> 3 <211> 19 ί 蛋白質挪威大鼠 <4〇〇> 3 i ι^ύ Gin Glu Gin Glu Glu Leu Glu Asn Tyr 工le Glu His Val l»eu I*eii ! 1 5 10 15 His Arg Pro <210> 4 、 c211> 25 <2訌> 蛋白質 <：^3>挪威大鼠 -102 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —l·--------Aws--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1285649 A7

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱） 1285649 A7 B7 五、發明說明（1〇1) L^u Ph.e Ala Glu Glu Glu Asp Gly Glu Ala Gly Ala Glu Asp 35 40 45 <2110 > $ <2jll> 49 <硌2>蛋白質 · 丨<273>挪威大鼠 ! |<4j〇〇> 9

ASp Ala Gill Gly trhr Glu Glu Gly Gly Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 5 10 IS

Glu Met Asp Pro Gin Tiir 工le Asp Ser Leu lie Glu Leu $er Thr Lys 20 25 30

Leii His Leu Pro Ala Asp Asp Val Val Ser ϊΐβ lie Gill Glu Val Glu 35 40 45

Glu <210> 10 <2ll> 75 〜 <2^蛋白質 <2：|3>挪威大鼠 <40〇5> 10

As4 Ala Pro Pro Glu Pro Val Pro Pro Pro Arg Ala Ala Pro Ala Pro i 5 10 15

I

Thr His Vai Arg Ser pro Gin Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ala Arg Asp 20 25 30

Glii Leu Pro Asp Trp Asn Clu Val Leu Pro Pro Trp Aep Arg Glu Glu 35 40 45

Asp Glu Val Phe Pro Pro Gly Pro Tyr His Pro Phe Pro Asn Tyr II白 50 55 60

Arg Pro Arg Thr Leu Gin Pro Pro Ala Ser Ser 65 70 75 -----!«f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------#9 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -104 - 本紙張尺度_用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）

Claims

1285微: :9114523號專利申請案請專利範圍替換本(96年1月） A8 B8 C8 D8

六、申請專利範圍 1. 一種經過分離的VGF多肽，其胺基酸序列係選自由序列識別 1 號（AQEEADAEERRLQEQEELENYIEHVLLHRP)、序列識別2號（AQEEADAEE)及序列識別3號 (LQEQEELENYIEHVLLHRP)所成組群。 2. —種經過分離的多肽，其胺基酸序列係如序列識別2號中陳述者。 3. —種經過分離的多肽，其胺基酸序列係選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3號所成組群的片段，其中該片段具有胺基酸序列係選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3號所成組群之多肽的活性。 4· 一種經過分離的多肽，其胺基酸序列係如序列識別2號中陳述之胺基酸序列的片段，其中該片段具有胺基酸序列係如序列識別2號中陳述之多肽的活性。 5. —種經過分離的多肽，其胺基酸序列係選自包括下列的胺基酸序列： (a)選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3 號所成組群之胺基酸序列，帶有至少一個保留性胺基酸置換，且其中該多肽具有胺基酸序列係選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3號所成組群之多肽的活性； (b )選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3 號所成組群之胺基酸序列，帶有至少一個胺基酸插入，且其中該多肽具有胺基酸序列係選自由序列識別1 號、序列識別2號及序列識別3號所成組群之多肽的活 65409-960115.DOC -1- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公嫠) A8 B8 C8 D8 1285649 六申請專利範園性； (C)選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3 號所成組群之胺基酸序列，帶有至少一個胺基酸刪除，且其中該多肽具有胺基酸序列係選自由序列識別1 號、序列識別2號及序列識別3號所成組群之多肽的活性； (d) 選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3 號所成組群胺基酸序列，其具有C-及/或N·終端的截短，且其中該多肽具有胺基酸序列係選自由序列識別i 號、序列識別2號及序列識別3號所成組群之多肽的活性；以及 (e) 選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3 號所成組群之胺基酸序列，帶有至少一個選自包括胺基酸取代、胺基酸插入、胺基酸刪除、羧基-終端戴短和胺基-終端截短的修改，且其中該多肽具有胺基酸序列係選自由序列識別1號、序列識別2號及序列識別3號所成組群之多肽的活性。 6.——種融合多肽，其為申請專利範圍第1、2、3、4或5 項中任一項之多肽，與異種的胺基酸序列融合。 7 ·根據申請專利範圍第6項之融合蛋白質，其中該異種的胺基酸序列為I g G恆定功能部位或其片段。 8_ —種申請專利範圍第}、2、3、4或5項中任一項之多肽之用途，其係用於和在藥學上可接受的調配劑製造治療、預防或改善VGF多肽-相關性疾病、障礙或病況 65409-960115.DOC -2- 1285649 /、、申请專利範園 A8 B8 C8 D8 之藥劑。典66 =申叫專利範園第8項之用途，其中該在藥學上可接又、，周配劑為載劑、佐劑、穩定劑或抗氧化劑。 1〇=據中請專利範園第1、2、3、4或5項中任—項之多其係利用水溶性聚合物以共價方式將其修改。 11·=據中請專利範園第1G項之多肽，其中該水溶性聚合、係選自包括聚乙二醇、單甲氧基'聚乙二醇、葡聚 =纖維素、聚-(N·乙埽基吡咯烷§同）聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙燒/環氧乙燒共聚物、聚氧乙烯化的多元醇和聚乙埽醇。 12·根據中請專利範園第H)項之多肽，其中該水溶性聚合物係選自包括聚乙二醇和葡聚醣。 13· —種用來洽療、預防或改善VGF多肽·相關性疾病、障礙或病況的醫藥組合物，包括申請專利範圍第丨、2、 3、4或5項中任一項之多肽。 14·根據申請專利範圍第13項之醫藥組合物，其中該vgf 多肽相關性疾病、障礙或病況為肥胖。 15·根據申請專利範圍第13項之醫藥組合物，其中該vgf 多肽相關性疾病、障礙或病況，係選自、包括不孕、惡病質、飲食障礙、AIDS相關性複合症、代謝亢進之病況、機能亢進、活動性不足和胰島素產生過多。 16.根據申請專利範圍第丨5項之醫藥組合物，其中該飲食障礙為貪食症和神經性厭食症。 17· —種在個體中診斷v G F多肽相關性病況或v 〇 F多肽相 65409-960115.DOC -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公羞) A8 B8 C8 D8 1285649 申請專利範園關性病況之感受性的工具組，包#· (a) 決定申請鲁利範圍第1、2、3、之多肽表現的存在或含量的方法；以或5項中任一項 (b) 以該多肽表現的存在或含量肽相關性病況或VGF多肽相關性^礎’診斷多法。病沉之感受性的方 18· —種確認與多肽結合之化合物的方法， (a) 使申請專利範圍第i、2、3、 + i · 々 4或5項中任一項之多肽與該化合物接觸；並裝 (b) 定出多肽對該組合物之結合作用的程产。 19.根據申請專利範圍第丨8項之方法，更進包括在多肽與該化合物結合時，定出其活性。，訂 65409-960115.DOC -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)