TWI272104B - Immunization against flavivirus - Google Patents

Description

1272104 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種誘發免疫反應對抗黃質病毒的方法。本發 明亦揭露一重組蛋白、一表現載體以及含有前述重組蛋白或表現 載體之疫苗。 【先前技術】 黃質病毒（flavivirus)係為一種節肢動物媒介病毒（Arthropod-borne viruses) 家族 ，其家 族成員 係包括 ：登革 熱病毒 （dengue virus)、黃熱病毒（yellow fever virus)、壁風性腦炎病毒（Tick-borne encephalitis virus)、西尼羅腦炎病毒（West Nile Encephalitis virus) 以及日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus ; JEV)。該病毒家 族之所有成員均能造成人類疾病。特別是日本腦炎病毒的感染， 係為熱帶及亞熱帶亞洲地區主要罹病及死亡的原因。日本腦炎病 毒的感染係可利用免疫方式加以預防。去活化以及減毒的日本腦 炎病毒已經被製成疫苗使用。然而，由於需要長期接種以及其副 作用，例如：過敏，使得預防功效不彰。因此，目前仍需要一有 效而安全的疫苗以及免疫方法來幫助預防黃質病毒，例如：日本 腦炎，的感染。 【發明内容】 本發明之一實施例係關於一種誘發受測對象產生對抗黃質 病毒免疫反應之方法，前述受測對象可為，例如：人類或非人類 之動物；前述黃質病毒可包括，例如··曰本腦炎病毒、登革熱病 毒、壁虱性腦炎病毒或西尼羅腦炎病毒等。該方法係包括對受測 對象施用一重組蛋白或者是一 DNA疫苗，其中該重組蛋白係包 含訊號胜肽（signal peptide)與一黃質病毒的部分封套蛋白（E 蛋白），該DNA疫苗則為一表現載體（expression vector )，其係 含有可編碼（encode)前述重組蛋白的核酸。該訊號胜肽係包含 1272104 SEQ ID NO: 5之序列：VVFTILLLLVAPAYS，並使得前述重組蛋 白具有水溶性以及在細胞内正確摺疊。部分封套蛋白（E蛋白） 係可為E蛋白之N端部分（amino part)或C端部分（carboxyl part)。 所誘發的免疫反應’例如：產生專一性對抗黃質病毒的抗體，係 可藉由實施例1〜4所敘述的檢測方式或其他任何相似方式來測 定。 為了誘發對抗日本腦炎病毒的免疫反應，將DNA疫苗施用 至一受測對象，該DNA疫苗為一表現載體，其攜帶有可編碼一 重組蛋白的核酸，其中該重組蛋白之序列為SEQ ID NO: 3，即： 1，VVFTILLLLVAPAYSFNCLGMGNRDFIEGASGATWVDLVLEGD SCLTIMANDKPTLDVRMINIEASQLAEVRSYCYHASVTDISTVAR CPTTGEAHNEKRADSSYVCKQGFTDRGWGNGCGLFGKGSIDTC AKFSCTSKAIGRTIQSENIKYEVGIFVHGTTTSENHGNYSAQVGA SQAAKFTVTPNAPSITLKLGDYGEVTLDCEPRSGLNTEAFYVMT VGSKSFLVHREWFHDLALPWTPPSSTAWRNRELLMEFEEAHAT KQSVVALGSQEGGLHQALAGAIVVEYSSSVKLTSGHLKCRLKM DKLALKGTT-315. 將此3 15個氨基酸之重組蛋白命名為 M15EA，其係包含日本腦炎病毒Μ蛋白之C端15個氨基酸（SEQ ID NO:5，即SEQ ID NO:3之劃線部份），以及日本腦炎病毒E 蛋白之N端之300個氨基酸片段（SEQIDNO」，即SEQIDNO:3 之未劃線部份）。另外也能夠施用可表現重組蛋白M15EB之DNA 疫苗至一受測對象，以強化免疫反應。重組蛋白M15EB之序列係 顯示如下：

1-VFTILLLLVAPAYSDKLALKGTTYGMCTEKFSFAKNPADTGHG

TVVIELSYSGSDGPCKIPIVSVASLNDMTPVGRLVTVNPFVATSSA

NSKVLVEMEPPFGDSYIVVGRGDKQINHHWYKAGSTLGKAFST TLKGAQRLAALGDTAWDFGSIGGVFNSIGKAVHQVFGGAFRT-1 1272104 75 (SEQ ID NO: 11)。該重組蛋白係包含前述之15個氨基酸之片 段（劃線部份）以及EB片段（SEQIDNO:2，即SEQIDNO:ll之未 劃線部份），係包含日本腦炎病毒E蛋白之C端之160個胺基酸 片段。 舉例而言，前述之DNA疫苗係用以啟動（prime )受測對象 之免疫反應。一般而言，僅靠單一疫苗啟動免疫反應並無法得到 令人滿意的效果，不過，當一個被疫苗啟動免疫反應的受測對 象，再施用另一個疫苗時便可誘發強大且長期的免疫反應。於本 發明中，在前述DNA疫苗啟動免疫反應之後，接著施用重組蛋 白Ea (前示之SEQIDNO:l)或EB (前示之SEQIDNO:2)至受 測對象，便可強化其免疫反應。或者，也可以施用第二DNA疫 苗來強化受測對象之免疫反應，該第二DNA疫苗為一表現載體， 其含有可編碼Ea* EB的核酸。於一具體實施例中，首先施用可 編碼M15EA之第一 DNA疫苗來啟動受測對象之免疫反應，再施 用重組蛋白Ea來強化受測對象之免疫反應；而於另一具體實施例 中，首先利用可編碼M15EB之第一 DNA疫苗來啟動受測對象之 免疫反應，再利用重組蛋白EB來強化受測對象之免疫反應。 以另一個例子來說，將一可編碼M15EA或M15EB之第一 DNA 疫苗用來強化受測對象的免疫反應，不過在強化免疫反應之前， 受測對象先以EA、EB或可編碼EA或EB之第二DNA疫苗來啟動 受測對象之免疫反應。於具體實施例中，係利用EA與可編碼 M15EA之第一 DNA疫苗來分別進行啟動以及強化受測對象之免 疫反應。 在又一個例子中，係利用可編碼Ml5rEA之第一 DNA疫苗與 可編碼EB之第二DNA疫苗來分別進行啟動以及強化受測對象之 免疫反應。 M15Ea或M15Eb重組蛋白本身也可以取代可編碼M15Ea* 1272104

Ml 5EB的DNA疫苗用來強化受測對象產生對抗日本腦炎病毒的 免疫反應，尚可更進一步施用Ea或Eb，或者是可編碼Ea或Eb 之DNA疫苗。 本發明之另一特色係關於一種誘發受測對象產生對抗曰本 腦炎病毒之免疫反應之方法，係將一種DNA疫苗，其為一可編 碼Eb之表現載體施用至一受測對象，其中DNA疫苗或Eb兩者可 任選一種用來啟動，而另一種用來強化受測對象之免疫反應。 於另一方面，本發明之特色在於一段分離出的、具有SEQ ID NO:3 (即 M15EA)或 SEQ ID ΝΟ:11(即 M15EB)之重組蛋白，以 及一種DNA疫苗，為可編碼前述重組蛋白之表現載體。於前述 表現載體中，可編碼前述重組蛋白的核酸係連接於一段包含啟動 子之表現調控序列之後，該表現調控序列也可選擇性的增加其他 要素（element)，例如：增強子（enhancer)。此類表現載體可用來轉 染細胞進而表現前述重組蛋白。 於再一方面，本發明之另一特色為一種可保護受測對象免於 感染日本腦炎病毒之疫苗。該疫苗包含一表現載體以及一醫藥可 接受之載劑，該表現載體係含有可編碼SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQIDNO:ll的核酸，且該核酸可與一段表現調控序列 連接，。本發明之又一特色亦為一種疫苗，其係由SEQ ID NO:3或 SEQ ID ΝΟ:11之重組蛋白以及一醫藥可接受之載劑所組成。 本發明之一種或多種實施態樣之細節係於下文發明說明中 配合圖式一併說明，本發明之發明說明、圖式以及申請專利範圍 可更進一步彰顯其特色、目的與優點。 【實施方式】 本發明係關於誘發受測對象產生對抗黃質病毒（例如：日本腦 炎病毒）之方法及疫苗。 1272104 黃質病毒之基因體係由單股正向RNA所構成。舉例而言， 曰本腦炎病毒的基因體所編瑪的聚蛋白質（polyprotein)會在其感 染的細胞中被水解成至少十個蛋白質。這些蛋白質包括三個結構 蛋白質：封套E蛋白（envelope protein)、膜蛋白質Μ或Μ前體 (PrM)與外殼蛋白（capsid protein)，以及至少七個非結構蛋白：NS丨， NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b與NS5。以下係顯示日本腦炎病毒基 因體第933-2477之核酸序列：

GTGGTATTCACCATCCTCCTGCTGTTGGTCGCTCCGGCTTATAGTTTCAACTGTCTGGGA 992 ATGGGCAATCGTGACTTCATAGAAGGAGCCAGTGGAGCCACTTGGGTGGACTTGGTGCTA 1052 GAAGGAGACAGCTGCTTGACAATCATGGCAAACG ACAAACCAACATTGGACGTCCGCATG 1112 ATCAACATCGAAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCAGAAGTTACTGCTATCATGCTTCAGTC 1172 ACTGACATCTCGACGGTGGCTCGGTGCCCCACGACTGGAGAAGCCCACAACGAGAAGCGA 1232 GCTGATAGTAGCTATGTGTGCAAACAAGGCTTCACTGATCGTGGGTGGGGCAACGGATGT 1292 GGACTTTTCGGGAAGGGAAGTATTGACACATGTGCAAAATTCTCCTGCACCAGCAAAGCG 1352 ATTGGAAGAACAATCCAGTCAGAAAACATCAAATACGAAGTTGGCATTTTTGTGCATGGA 1412 ACCACCACTTCGGAAAACCATGGGAATTATTCAGCGCAAGTTGGGGCGTCCCAGGCGGCA 1472 AAGTTTAC AGTAAC ACCTAATGCTCCTTCGATAACCCTCAAACTTGGTGACTACGGAGAA 1532 GTCACACTGGACTGTGAGCCAAGGAGTGGACTAAACACTGAAGCGTTTTACGTCATGACC 1592 GTGGGGTCAAAGTCATTTTTGGTCCATAGGGAATGGTTTCATGACCTCGCTCTCCCTTGG 1652 ACGCCCCCTTCG AGC AC AGCGTGG AG A AAC AG AG A ACTCCTC ATGG A ATTTGAAG AGGCG 1712 CACGCCACAAAACAGTCCGTTGTTGCTCTTGGGTCACAGGAAGGAGGCCTCCATCAGGCG 1772 TTGGCAGGAGCCATCGTGGTGGAGTACTCAAGCTCAGTGAAGTTAACATCAGGCCACCTA 1832 AAATGCAGGCTGAAAATGG AC AAACTGGCTCTGAAAGGC AC AACCTATGGTATGTGCACA 1892 GAAAAATTCTCGTTCGCGAAAAATCCGGCGGACACTGGTCACGGAACAGTTGTCATTGAA 1952 CTTTCATACTCTGGGAGTGATGGCCCCTGCAAGATTCCGATTGTCTCCGTTGCTAGCCTC 2012 AATGACATGACCCCCGTCGGGCGGCTGGTGACGGTGAACCCCTTCGTCGCGACTTCCAGC 2072 GCCAACTCAAAGGTGCTGGTCGAGATGGAACCCCCCTTCGGAGACTCCTACATCGTAGTT 2132 GG A AGGGG AG AC AAGC AG ATTA ACC ACC ATTGGTAC A AGGCTGG AAGC ACGCTGGGC AAA 2192 GCCTTTTCAACGACTTTGAAGGGAGCTCAAAGACTGGCAGCGTTGGGCGACACAGCCTGG 2252 G ACTTTGGCTCTATTGG AGGGGTCTTC A ACTCC ATAGGG A A AGCTGTTC ACC A AGTGTTT 2312 GGTGGTGCCTTCAGAACACTCTTTGGGGGAATGTCTTGGATCACACAAGGGCTAATGGGG 2372 GCCCTACTACTTTGGATGGGCATCAACGCACGAGACCGATCAATTGCTTTGGCCTTCTTA2432 GCCACAGGAGGTGTGCTCGTGTTCTTAGCTACCAATGTGCATGCT 2477 曰本腦炎病毒基因體第978_2477之核酸序列（SEQ ID NO: 9) 係編碼全長E蛋白（SEQ ID NO: 4)，第978-1877之核酸序列（SEQ ID NO: 6)與第1851-2330之核酸序列（SEQ ID NO: 7)係分別編碼 EA與EB。之前相關研究曾利用此兩種片段於人類或大腸桿菌中 9 1272104 表現、製備，並將其施用於一受測對象上以誘發對抗日本腦炎病 毒之免疫反應，然而，Ea因為是不可溶蛋白質並且其在宿主細胞 中無法正確摺疊，因而不具有免疫性。以較Ea為較好的免疫原， 然而其仍不足以誘發令人滿意的免疫反應。 本發明係揭露一種方法，其係利用Ea或EB誘發對抗日本腦 炎病毒之免疫反應。本發明之一部分係由兩種重組蛋白其令人意 外的特點為基礎，該兩種重組蛋白為曰本腦炎病毒基因體第 933-1877之核酸序列（SEQ ID NO:8)所編碼之重組蛋白Ml5Ea (SEQ ID N0:3 )，以及另一個由日本腦炎病毒基因體第933-977 以及第1851_2330之核酸序列（SEQIDN0..12)所編碼之重組蛋 白質M15EB ( SEQ ID ΝΟ:11 )。該兩種重組蛋白質係包含曰本腦 炎病毒Μ蛋白之C端15個氨基酸片段，此15個氨基酸片段係由 日本腦炎病毒基因體第933-977 ( SEQ ID NO: 10)之核酸序列所 編碼之訊號胜肽，可使得重組蛋白質成為水溶性。並且，因為該 重組蛋白質可正確的於宿主細胞内摺疊，故其可以基因重組方式 製備。 為製備前述之重組蛋白，先將一可編碼前述蛋白質之核酸， 例如：SEQIDNO:8或SEQIDNO:12，接合至一重組表現載體， 其中核酸係可以與一合適於宿主細胞表現該蛋白質之調控序列 黏接’此類的調控序列係可包括，例如：啟動子、增強子以及熟 習此項技術者所習知之其他可控制表現的要素。該表現載體可用 以轉染至宿主細胞並生產本發明之蛋白質或多肽。本發明之重組 表現載體係可將其設計可成在原核細胞或真核細胞表現重組蛋 白，舉例而言，原核細胞為，例如：大腸桿菌、以及昆蟲細胞（利 用昆蟲桿狀病毒）、酵母細胞、哺乳動物細胞或其他合適的宿主 細胞，參見：Goeddel，（1990)

Mei/zodn·/? 185, Academic Press, San Diego, CA。宿主 l272l〇4 M皰所表現的重組蛋白係可藉由習知的方法純化，例如：硫酸銨 儿;厲又與分液（ammonium sulfate precipitation and fractionation)以及 主層析（column chromatography)(例如：離子交換、膠體過濾、 、親合性層析等）。純化後的重組蛋白可以作為疫苗，利用下 施例一至四所描述的方式來強化受測對象產生對抗日本腦 =病毒之免疫反應。前述的表現載體可作為DNA疫苗，以強化 對象產生對抗日本腦炎病毒之免疫反應。 , 本發明之疫苗係包含合適的醫藥可接受之載劑（carrier)、稀 刮或賦形劑（excipient)，例如：滅菌水、生理生理食鹽水或其他 相似物。前述之疫苗亦可包含佐劑（adjuvant)材料，例如：弗氏完 全佐劑（Freund’s Complete Adjuvant ; FCA)或弗氏非完全佐劑 (Freund’s Incomplete Adjuvant; IC A)以強化免疫反應。 為達到令人滿意的免疫反應，前述之DNA疫苗或重組蛋白 係需要分次施用於受測對象，並且可選擇性的使用不同的施用途 徑。如下述實施例二與三所示，DNA疫苗以及重組蛋白均可用來 啟動或者是強化免疫反應。如Chen HW et al.，j. vin)1 73. 10137-10145, 1999所描述，DNA疫苗係可藉由肌肉注射或基因 搶的方式施用於受測對象。重組蛋白係可利用下述實施例二之方 式施用製受測對象上。在將DNA疫苗或重組蛋白注入之後，可 藉由下述實施例四之步驟來評估受測對象之免疫反應。 下述之實施例僅作為參考敘述，而不宜用以限制本發明之其 他可能的實施方式，相信不需進一步解釋，熟習本技術領域之人 士即可藉由本文敘述而徹底實施本發明。所有文中提及之出版物 係以全文引入作為參考。 實施例一 i.動物：雌性咖㈣小鼠（6_7週大）係構自國家實驗 動物繁殖及研究中心（台灣台北）。動物的照顧方式係遵照中研院 1272104 生醫中心動物委員會之規定。 2·病毒·日本腦炎病毒株一北京一號（Beijing-l)係培養於未

斷奶的小鼠腦中並以 Chia SC et al.，Microbial. Patho. 31: 9-19, 2001之方式製備。為了測定半致死劑量（LD5G)，將一組10〜12週 大的小鼠感染10倍序列稀釋後的日本腦炎病毒株--北京一號，之 後再以30 μΐ石粦酸緩衝液（PBS)進行腦内接種（intracerebral inoculation) ’即所謂的假接種（sham inoculation)以增加中央神經 系統對於感染的敏感性。利用一福馬林去活化的鼠腦衍生之日本 腦炎病毒當作參考疫苗（北京株，Tanabe Seiyaku Co.，Osaka，Japan) 以用作正控制抗原。結果顯示C3H/HeN小鼠之半致死劑量為 lxlO4 pfu/mouse 〇 3·用來作為DNA免疫之表現質體：利用聚合酶連鎖反應（PCR) 從pl5ME質體中製備出日本腦炎病毒北京一號之E蛋白片段

(Chen HW et al·，J. Virol. 73: 10137-10145, 1999)。前述 pl5ME 質體係包含一段編碼全長E蛋白之CDNA片段，以及膜蛋白C端 15個胺基酸。該段cDNA片段係對應至日本腦炎病毒基因體的第 933-2477核苷酸鹼基，並且係構築至pcDNA3載體（Invitrogen， San Diego)。該日本腦炎病毒基因體之雙股片段係利用下述引子 進行聚合酶連鎖反應而取得。 M15EA 上游：5’-CGCGGATCCAAATGGTGGTATTCACCATC-3’ (SEQ ID NO: 13) M15EA 下游：5，-TTTTCTAGAGCTTAGGTTGTGCCTTTCAG-3, (SEQ ID NO: 14) EA 上游：5，-CGCGGATCCAAATGTTCAACTGTCTGGGA-3’ (SEQ ID NO: 15) EA下游： 5，-TTTTCTAGAGCTTAGGTTGTGCCTTTCAG-3’ (SEQ ID NO: 12 1272104 16) M15EB 上游：5、CGCGGATCCAAATGGTGGTATTCACCATC-3’ (SEQ ID NO: 17) M15EB 下游：5，-TTTTCTAGACGTTATGTTCTGAAGGCACC-3， (SEQ ID NO: 18) EB上游： 5，-GCTGCATATGGACAAACTGGCTCTG-3’（SEQ ID NO: 19) EB下游： 5，-TTTTCTAGACGTTATGTTCTGAAGGCACC-3’ (SEQ ID N〇： 20) 上游引子係包含一 辨識切點與一 ATG起始密碼子 (start codon)，下游引子係包含一終止密碼子（stop codon)與一 五coRI辨識切點以幫助選殖。將聚合酶連鎖反應之產物黏接到 一 PCR_純端載體（PCR-Blunt vector ; Invitrogen，San Diego)以便 做限制酶圖譜及定序。將前述經過確認無誤的質體利用合適的限 制酶切割已得到含有曰本腦炎病毒基因體序列第933-1877、第 978-1877以及第1851-2330之DNA片段。第一個片段係編碼E 蛋白之前的15個胺基酸之訊號胜肽與E蛋白（EA)之N端部分。 其後的兩個片段係分別編碼EA與EB蛋白質片段，並且涵括除了 跨膜區域（transmembrane domain )以及胞内尾端區域（cytoplasmic tail) (49個胺基酸）以外，高達90%的E蛋白。將這些片段接 入pcDNA3載體以使其分別生產pM15EA、pM15EB、pEA、與pEB。 M15係指第933〜978鹼基之核酸，係編碼15個胺基酸之訊號胜 肽。此類真核表現載體係包含巨病毒早期啟動子-增強子序列 (cytomegalovirus early promoter-enhancer sequence)與聚腺苦酸 (polyadenylation)以及取自牛生長荷爾蒙之3’-剪接訊號 (3’-splicing signals)。利用 Qiagen 質體大量純化套組（Qiagen 13 1272104

Plasmid Giga Kits)以製造商建議的方式自轉型的大腸桿菌DH5a 中純化出質體DNA，並將其以顆粒形式冷凍於—70。€，冷;東的 DNA在使用以前先利用滅菌生理生理食鹽水將其復原並溶解成 濃度1毫克/毫升。 4·於大腸桿菌中選殖與表現日本腦炎病毒E蛋白片段：於大 腸桿菌中選殖與表現日本腦炎病毒EA與EB蛋白的方式係如同於 Chia SC et al·，Microbial. Patho. 31: 9-19, 2001 所敘述。簡言之， 將PCR產物一編碼EA (第978-1877鹼基）與EB (第ι851_2330驗 基）之 DNA 片段接入 pET-28A 載體（Novagen，Madison，WI) 以得到pET-EA及pET_EB，將這些載體分別轉型到大腸桿菌 JMIO9/DE3，為刺激這些蛋白質於轉型後的大腸桿菌中表現，係 加入IPTG於30 C培養六小時。利用錄層析管柱(Nickel columns) 純化表現的蛋白質，並利用基質輔助雷射託附游離/飛行時間質譜 分析法（Matrix assisted laser desorption - time of flight (MALDI-TOF)，Applied Biosystems，Foster City，CA)來確認其胺 基酸序列。將利用前述方式製備的重組蛋白質命名為rEA與 rEB，以便與質體pEA與pEB作區隔。 5·免疫注射·根據 Chia SC et al·，Microbial. Patho. 31: 9-19, 2001·所述之方法，將純化的ΓΕΑ與rEB蛋白進行肌肉注射（im)至 前述雌性CsH/HeN小鼠。小鼠係被分為六組，其中第一至第三組 係每次注射25微克/注射之γΕα於其股四頭肌（quadricep muscles)，其中第一組注射一次，第二組注射兩次，第三組注射 三次。至於第四至第六組係以同樣方式注射rEB。於第一次注射 與之後的注射，該重組蛋白質係分別與CFA與IFA混合。 最後一次注射的兩星期後，根據（：：1^8€61&1.，]^(：1*〇1^&1· Patho· 31: 9-19, 2001所描述的方式，讓免疫小鼠係接受曰本腦炎 病毒致死劑量的挑戰。簡言之，半致死劑量（LD5g)之5〇倍劑量之 14 1272104 曰本腦炎病毒株--北京一號利用腹腔注射至每隻小鼠。之後，根 據 McMinn P J. of general virol. 78:2711-2722，1991 所描述的方 式，觀察日本腦炎病毒挑戰後的小鼠30天，以評估其是否出現 病毒性腦炎（viral encephalitis)的現象，並計算每組小鼠存活的比 例（即存活率或保護程度（level of protection))。 結果顯示注射rEB的保護程度分別為：注射一次20%，注射 兩次27%以及注射三次58%，另外rEA方面，即使注射達三次仍 沒有顯示保護程度。將這些結果與Chia SC et al·，Microbial. Patho. 31: 9-19, 2001相比較，顯示rEA為一不可溶性蛋白質，且較不具 有抗原性及免疫性，然而rEB為一可溶性蛋白質，且具有抗原性 及免疫性。 將pcDNA3、pM15EA、pEA，或pEB的質體進行肌肉注射（im) 至前述雌性C3H/HeN小鼠以強化產生免疫反應。免疫後的一星 期，於每隻小鼠的兩條腿上的股四頭肌注射200微升1)的10 微莫耳濃度（β M)心臟毒素（cardiotoxin ，Sigma，St. Louis)(每條 腿注射100// 1)，將小鼠分成十二組（組別1至12)，將其麻醉，並 分別施以如下表一第二攔所示之不同的免疫方式（immunization regimens)，其中第1與第2組之小鼠係分別注射一次100微升/ 注射之控制疫苗（Tanabe Seiyaku Co·，Osaka，Japan)與生理食鹽 水，第3、第4與第9組之小鼠係分別注射一次50微升/注射之 pcDNA3、pEA與pEb，第5至第8組，以及第10與第11組之小 鼠係分別隔兩週注射兩次或三次50微升/注射之PCDNA3、 pM15EA、pEA,與pEb，第12組之小鼠係隔兩週注射三次50微升 /注射之pl5MEA與pEB之混合物。 最後一次注射的兩週後，利用同於前述的方式，讓每組小鼠 係接受日本腦炎病毒致死劑量的挑戰，並且如前述方式計算其存 活率。結果係摘要於表一。 15 1272104 盘二攜帶有本腦炎蓋iiAig)基因之重組載體強化免疫 反應之結果 免疫方式(注射次ϋa ^ft fh~%rWWW 存活的數量/接受挑戰的小' _ 鼠數量 組別 1 控制疫苗 24/24 2 生理食鹽水 4/20 3 pcDNA3 5/25 4 PEA (1) 2/10 5 pEA (2) 3/11 6 PEA (3) 5/25 7 pM15EA (2) 3/10 8 pM15EA (3) 13/24 9 PEb (1) 2/10 10 PEB (2) 2/9 11 PEb (3) 12/30 12 —pM15EA+ pEB (3) 14/19 P < υ·υι，** p < 〇·0〇ι係利用第二組作為 (Fisher’s exact test) (%) 100.00** 20.00 20.00 20.00 27.27 20.00 30.00 54.17* 20.00 22.22 40.00* 73.68**_ 之Fisher’s準確性檢定 如表一所示，注射一次、兩次與三次的pEa (第4、5與6 =)分別可達到20%、27·27%與30%之保護程度，與注射pcDNA3 沒有太大的差別，相反地，注射pM15Ea (三次）可達到54%的保 護程度（第8組），比起注射pcDNA3有相當的進步。因為pMi5Ea 係編碼一含有15個胺基酸之訊號胜肽UM15Ea)之重組蛋白，A 然而PEA係編碼一不含訊號胜肽之重組蛋白，因此此結果係顯示 該訊號胜肽對於rM15EA具有免疫能力之重要性。 同樣顯示於表一的是，只有注射三次ρΕβ的組別（第u組） 可保濩小鼠不受到日本腦炎病毒的挑戰，一個有趣的發現是，一 起注射pm15e』pEb之後，第12組中多數的小鼠（73·6%)均可 破保護而不受到日本腦炎病毒的挑戰。 實施例二 人小鼠係接受一 DNA疫苗啟動、重組蛋白強化免疫反應之實 驗方法，之後再接受致死劑量的日本腦炎病毒的挑戰。 將小鼠以實施例一的方式預先用心臟毒素處理，一星期後將 16 1272104 小鼠分成十組，其中第卜2與3組的小鼠係如同實施例一所述 分別注射以控制疫苗、pcDNA3與生理食鹽水，第4與第7組的 小^係分別接受兩次50微克/注射之啟動，第5 與第6組的小鼠係分別接受兩次5〇微克/注射之pMi5Ea之啟 動，並在兩週後分別以γΕα (25微克/注射）強化免疫反應一次與兩 次，第8與第9組的小鼠係分別接受兩次5〇微克/注射之ρΕΒ之 啟動，並在以rEB (25微克/注射）強化免疫反應一次與兩次，最後， 第10組的小鼠係分別接受兩次50微克/注射2ρΜΐ5Εβ之啟動， 並以rEB (25微克/注射）強化免疫反應兩次。 最後一次注射的兩週後，利用同於前述的方式，讓每組小鼠 係接受日本腦炎病毒致死劑量的挑戰，並且如前述實施例一計算 其存活率。結果係摘要於表二。

控制疫苗 pcDNA3 生理食鹽水 pM15EA (2) pM15Ea (2) + γΕα5/1〇 (1) ρΜ15ΕΑ (2) + rEA 9/10 (2) 100.00** 30.70 25.00 30.00 50.00* 90.00** 7 8 9 10 ρ < 0.01， ρΕΒ (2) 2/9 ρΕΒ (2) + γΕβ (1) 4/10 ρΕβ (2) + γΕβ (2) 13/18 ρΜ15ΕΒ (2) + γΕβ 18/18(2) _____ "ρ <0.001 係利用第二組 22.20 40.00* 72.20** 100.00** 之Fisher’s準確性檢定 如表二所示，注射（兩次）pM15Ea或pEB並未提供任何明顯 的保護對抗日本腦炎病毒的挑戰，出乎意外的是，注射兩次 pM15EA作為啟動並且接著以無免疫性的出八進行一或兩次的免 疫強化反應（第5、6組）可達到比pcDNA3或生理食鹽水高出許多 17 1272104 的保護程度（50%肖90 %)。第六組的保護程度幾乎與控制疫苗 相當，這些結果顯示如果給予足夠的啟動，則無免疫產生性的戍八 就可以作為有效的免疫原。 Α 注射兩次的ρΕβ作為啟動並且接著以γΕβ進行一或兩次的免 疫強化反應（第8、9組）可達到明顯的保護程度（4〇%與72 2%)， 保護程度比單獨注射ΡΕΒ (兩次）或γΕβ (兩次’參見表一）的結果要 來的高，顯示DNA疫苗啟動、重組蛋白強化之方法較單彳^使用 DN^疫苗或單獨使用重組蛋白之方法來的有效。最後，令人意外 的是，注射兩次的PM15Eb作為啟動並且接著以γΕβ進行兩:的 ^疫強化反應（第Η)組）的所有小鼠均可受到保護對抗日本腦炎病 毋的挑戟，此結果顯示Μ15訊號胜肽可以增強Εβ的免疫產生力 (inimuiiogenicity)。 實施例三 小鼠係接受一重組蛋白啟動、D N A疫苗強化免疫反應之 方法，之後接受致死劑量的日本腦炎病毒的挑戰。 …、 =鼠分成六組，其中第卜2與3組的小鼠係如同實施例一所 迷为，注射以控制疫苗、pcDNA3與生理食鹽水，第4、今與6組 ^小鼠係分別接受兩次肌肉注射25微克rEa或γΕβ蛋白（ς⑽ 2備）之啟動，並在兩週後分別再注射以於IFA中製備之25 ϋ AS rEB蛋白以再次啟動。一週後，這三組小鼠係以撕 一曰之10械莫耳濃度之心臟毒素注射於股四頭肌。於一星期與 ^星，後，分別將這三組小鼠接受每次計量25微克之ρΜΐ5Ε^ Hρ Ε Β強化免疫反應。讓每組小鼠係接受日本腦炎病毒致死 二：的挑戰’並且如前述實施例一計算其存活率。每組小鼠均達 订“火獨立實驗，其結果係摘要如表三。 二 -- 活的數量/接受挑戰的小鼠 干1 DNA疫苗強化免疫反應之結果 18 1272104 1 2 3 4 90.00" 20.00 20.00 100.00** rEA(2) + pEA (2) rEB (2) -l· pEB (2)

之 Fisher’s 準確 __ 數量 疫苗 9/10 生理食鹽水 2/10 pcDNA3 2/10 rEA (2) + pM15EA8/8 (2) 如表三所示，第4與第6組的小鼠係分別有1〇〇%與71·43% 的比例可X到保4對抗日本腦炎病毒的挑戰。其保護程度非常顯

著，並且與前述實施例二(譯者按：敎為實施例―，應為誤I 請發，人確認）中DNA疫苗啟動、重組蛋白強化的組別（參見表 一’第6與第9组）程度相當。相反地，第5組的小鼠僅有ΐ2·5% 受到保護，顯示15個胺基酸的訊號胜肽對於免疫產生性的重要 性。 刚述之貫施例二與三係顯示意料之外的結果：γΕα其本身並 不具有免疫產生性或不具有保護性，但其不論在啟動或強化反應 中均可作為一非常優異的免疫原。產生這些結果的原因之一是 ι·Εα含有某些微小的抗原決定基（epit〇pe)因此，雖然本身 不具有免疫產生性，但當利用一具有免疫產生性的媒介（例如： pMlsEA)進行啟動或強化時，γΕα可刺激產生強大的二次免疫反應。 實施例四 利用 Chia et al·，Microbial· Patho· 31: 9-19, 2001 所述之酵素 連結免疫吸收分析（ELISA)方法測試實施例一至三存活的小鼠是 否有抗-日本腦炎病毒E蛋白之抗體。 已知不同的免疫方式（例如··不同的抗原輸送途徑）可能影 響免疫反應中抗體的同種型（isotype )以及τ幫助細胞（T helper cell)的類型。例如··肌肉注射DNA由於刺激了 Th〖細胞的活化， 所以產生的抗體幾乎全為IgG2a抗體。相反地，利用基因搶輸送 19 1272104 質體DNA，由於刺激的是Th2細胞的活化，幾乎僅會產生IgGl 抗體，並且，Th2細胞的活化會抑制igG2a之生成。 為測試抗日本腦炎病毒E蛋白之抗體的存在，於病毒加入的 兩天前（挑戰前）及兩天後（挑戰後），分別收集利用前述免疫 方式操作的每一組4至5隻小鼠的血清。將每個血清樣本加入塗 佈有曰本腦炎病毒之微量滴定盤（microtiter plate )的孔洞中，前 述曰本腦炎病毒係自組織培養中製備。如此，抗日本腦炎病毒E 蛋白之抗體將會與日本腦炎病毒結合。 之後’為測試樣本中的IgG，將前述含有樣本之微量滴定盤 與HRP連結之山羊抗小鼠IgGFc (稀釋比例l:l〇〇〇，ICN/Cappel， Aurora，OH)，接著再與ABTS共同培養使呈色後，便可利用酵素 連結免疫吸收分析（ELISA)其於405奈米（nm)之吸光值，其吸 光值係可反應樣本中IgG量之多寡。 為了測試樣本中IgGl或IgG2a同種型，將前述含有樣本之 微量滴定盤與生物素連結之大鼠抗小鼠IgGl (稀釋比例1:1 〇〇〇， PharMingen，San Diego，CA)或大鼠抗小鼠igG2a (稀釋比例 1:1000，PharMingen)共同培養。其結果係可藉由加入Avidin-HRP (稀釋比例1:2000，PharMingen)以及ABTS，之後如同前述方 式，量測其405奈米（nm)之吸光值。 結果顯不’不論免疫之方式為何’ 一般而言，IgG2a之OD405 續值係大於IgG 1。在挑戰前，不論是DNA疫苗啟動、重組蛋白 強化，或者是重組蛋白啟動、DNA疫苗強化的方式，各組小鼠樣 本其IgG2a與IgGl的OD4〇5讀值並無很大的差異，於此類老氣 中，IgG2a的量顯著比IgGl高出許多。而在挑戰後，每組小鼠的 kG2a量明顯增加，然而IgGl量僅些微提升。並且，igG2a的量 係高出IgGl的量許多（p值從< 〇·〇1至< o.ooi )，再者，比起 他種抗原，ΕΑ抗原傾向提升較高的IgG2a量，而PcDNA3則會 20 1272104 導致低量的IgGl與IgG2a。 為了檢測自免疫小鼠身上所收集的抗血清對於中和日本腦 炎病毒病毒之能力，係利用Johnson等人於p. 189-192· In H· Ginsberg，F· Brown，R· A· Lerner，與 R. Μ· Chanock (ed·)， Vaccines 88. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν·Υ·中所描述之於BHK-21細胞進行50°/。病毒斑減少試驗（50% plaque reduction assay)之方式進行病毒斑減少中和性試驗（plaqUe reduction neutralization test ，PRNT)。於病毒挑戰的兩天前（挑 戰前）及兩週後（挑戰後），分別收集前述實施例第1組至第3 組的小鼠的血清樣本。將樣本利用5% BCS-PBS進行系列稀釋， 並且培養於56°C、30分鐘以去活化補體（cornplement)。將每組 樣本與含有曰本腦炎病毒之等量最少必須培養基-BCS (minimum essential medium-BCS ，MEM-BCS )以生成一含有約 1〇〇〇 pfu 病毒/毫升之混合物，將該混合物置於培養於4。(：中18至21小時 後，將其加入每孔含有高緻密度單層BHK-21細胞之六孔盤中（三 重複）’之後將如述六孔盤於3 7 C中培養^一小時，並每15分鐘溫 和的震動搖勻一次。接著加入2毫升之1%之甲基纖維素繼續於 37°C ，5% C〇2的環境下培養4天，前述曱基纖維素係溶於含 有5% BCS之MEM培養基中。 在病毒班出現在六孔盤的孔洞中後，利用萘盼藍黑（naphth〇i blue Mack)染色並且於顯微鏡底下計算病毒斑數目。比較在沒有 任何抗血清情況下的日本腦炎病毒的控制組，將病毒斑減少5〇 %之最高稀釋倍數的倒數即可計算出中和性抗體滴度 (neutralization antibody titer )。每組至少有三個血清樣本以決定 PRNT滴度，結果係如表四所示。 表四、從中和抗體滴度以及生存率反應免疫效果 21 1272104 組別 免疫方式 病毒斑中和滴度 挑戰前 生存率（％)

如表四所示，在挑戰前階段，除了已經利用控制疫苗免疫過 的、、且別（第1組）、pM15EA+rEA (第8組）以及γΕα+ρΜ15Εα (第 η組）的小鼠其PRNT滴度係介於1:2〇至1:8〇之外，其他多數 ，、且別的小⑽僅有介於1:5 i 1:1Q之低pRNT滴度。而在挑戰後 =段’所有組別的小鼠之PRNT滴度均大幅上升，並且與各組小 =的生存率呈現正相關現象。_般而言，pRNT滴度在ι:4〇即足 夠保護小鼠抵抗病毒的感染。 其他實施態樣 本發明所揭露之所有特徵均可以任何組合形式組合 f明所揭露之每種特徵均可以其他特徵取代以達到相同、相等i 相似之目的。因此，除非特別聲明，本發明之者 : 之特徵僅是-系列相等或相似特徵中的—個實二例。工晏露 熟習本技藝之人士由前述說明中輕易得知本發 色，並且在不違背本發明之精神盘範择 土本斗寸 做各種改變或驢以配衫_料，可崎本發明 樣也同樣包括於本發明之中請專利範^况’因此’其他實施態 22 03p0387序列表 1272104 序列表 <110> 中央硏究院 <120> 預防感染黃質病毒的免疫方法 <130> 03p0387 <140> TW92129417 <141〉 2003-10-23 <150> US 10/459,155 <151> 2003-06-11 <160> 20 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 300 <212> PRT <213> 曰本腦炎病毒 <400> 1

Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe lie Glu Gly Ala Ser 15 10 15

Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr 20 25 30 lie Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met lie Asn lie 35 40 45

Glu Ala Ser Gin Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser 50 55 60

Val Thr Asp lie Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala 65 70 75 80

His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gin Gly Phe 85 90 95

Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 lie Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala lie Gly Arg 115 120 125 第1頁 03p0387序列表 1272104

Thr lie Gin Ser Glu Asn lie Lys Tyr Glu Val Gly lie Phe Val His 130 135 140

Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gin Val Gly 145 150 155 160

Ala Ser Gin Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser lie 165 170 175

Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro 180 185 190

Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser 195 200 205

Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro 210 215 220

Trp Thr Pro Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met 225 230 235 240

Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gin Ser Val Val Ala Leu Gly 245 250 255

Ser Gin Glu Gly Gly Leu His Gin Ala Leu Ala Gly Ala lie Val Val 260 265 270

Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg 275 280 285

Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr 290 295 300 <210> 2 <211〉 160 <212> PRT <213> 曰本腦炎病毒 <400> 2

Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys 15 10 15 第2頁 03p0387序列表 1272104

Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val 20 25 30 lie Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys lie Pro lie 35 40 45

Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val 50 55 60

Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu 65 70 75 80

Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr lie Val Val Gly Arg 85 90 95

Gly Asp Lys Gin lie Asn His His Trp Tyr Lys Ala Gly Ser Thr Leu 100 105 110

Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gin Arg Leu Ala Ala 115 120 125

Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser lie Gly Gly Val Phe Asn 130 135 140

Ser lie Gly Lys Ala Val His Gin Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr 145 150 155 160 <210> 3 <211〉 315

<212> PRT <213>日本腦炎病毒 <400> 3

Val Val Phe Thr lie Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe 15 10 15

Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe lie Glu Gly Ala Ser Gly 20 25 30

Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr lie 35 40 45

Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met lie Asn lie Glu 第3頁 03p0387序列表 1272104 50 55 60

Ala Ser Gin Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val 65 70 75 80

Thr Asp lie Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His 85 90 95

Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gin Gly Phe Thr 100 105 110

Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser lie 115 120 125

Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala lie Gly Arg Thr 130 135 140 lie Gin Ser Glu Asn lie Lys Tyr Glu Val Gly lie Phe Val His Gly 145 150 155 160

Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gin Val Gly Ala 165 170 175

Ser Gin Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser lie Thr 180 185 190

Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg 195 200 205

Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys 210 215 220

Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp 225 230 235 240

Thr Pro Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu 245 250 255

Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gin Ser Val Val Ala Leu Gly Ser 260 265 270

Gin Glu Gly Gly Leu His Gin Ala Leu Ala Gly Ala lie Val Val Glu 第4頁 03p0387序列表 1272104 275 280 285

Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu 290 295 300

Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr 305 310 315 <210> 4 <211〉 500

<212> PRT <213>日本腦炎病毒 <400> 4

Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe lie Glu Gly Ala Ser 15 10 15

Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr 20 25 30 lie Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met lie Asn lie 35 40 45

Glu Ala Ser Gin Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser 50 55 60

Val Thr Asp lie Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala 65 70 75 80

His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gin Gly Phe 85 90 95

Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 lie Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala 工le Gly Arg 115 120 125

Thr lie Gin Ser Glu Asn lie Lys Tyr Glu Val Gly lie Phe Val His 130 135 140

Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gin Val Gly 145 150 155 160 第5頁 03p0387序列表 1272104

Ala Ser Gin Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser lie 165 170 175

Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro 180 185 190

Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser 195 200 205

Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro 210 215 220

Trp Thr Pro Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met 225 230 235 240

Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gin Ser Val Val Ala Leu Gly 245 250 255

Ser Gin Glu Gly Gly Leu His Gin Ala Leu Ala Gly Ala lie Val Val 260 265 270

Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg 275 280 285

Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys 290 295 300

Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly 305 310 315 320

Thr Val Val lie Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys 325 330 335 lie Pro lie Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly 340 345 350

Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser 355 360 365

Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr lie Val 370 375 380 第6頁 03p0387序列表 1272104

Val Gly Arg Gly Asp Lys Gin lie Asn His His Trp Tyr Lys Ala Gly 385 390 395 400

Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gin Arg 405 410 415

Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser lie Gly Gly 420 425 430

Val Phe Asn Ser lie Gly Lys Ala Val His Gin Val Phe Gly Gly Ala 435 440 445

Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp lie Thr Gin Gly Leu Met 450 455 460

Gly Ala Leu Leu Phe Trp Met Gly lie Asn Ala Arg Asp Arg Ser lie 465 470 475 480

Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr 485 490 495

Asn Val His Ala 500 <210> 5 <211> 15

<212> PRT <213>日本腦炎病毒 <400> 5

Val Val Phe Thr lie Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 15 10 15 <210> 6 <211〉 900 <212> DNA <213> 曰本腦炎病毒 <400> 6 60 120 ttcaactgtc tgggaatggg caatcgtgac ttcatagaag gagccagtgg agccacttgg gtggacttgg tgctagaagg agacagctgc ttgacaatca tggcaaacga caaaccaaca ttggacgtcc gcatgatcaa catcgaagct agccaacttg ctgaggtcag aagttactgc 第7頁 180 03p0387序列表 1272104

tatcatgctt cagtcactga catctcgacg gtggctcggt gccccacgac tggagaagcc 240 cacaacgaga agcgagctga tagtagctat gtgtgcaaac aaggcttcac tgatcgtggg 300 tggggcaacg gatgtggact tttcgggaag ggaagtattg acacatgtgc aaaattctcc 360 tgcaccagca aagcgattgg aagaacaatc cagtcagaaa acatcaaata cgaagttggc 420 atttttgtgc atggaaccac cacttcggaa aaccatggga attattcagc gcaagttggg 480 gcgtcccagg cggcaaagtt tacagtaaca cctaatgctc cttcgataac cctcaaactt 540 ggtgactacg gagaagtcac actggactgt gagccaagga gtggactaaa cactgaagcg 600 ttttacgtca tgaccgtggg gtcaaagtca tttttggtcc atagggaatg gtttcatgac 660 ctcgctctcc cttggacgcc cccttcgagc acagcgtgga gaaacagaga actcctcatg 720 gaatttgaag aggcgcacgc cacaaaacag tccgttgttg ctcttgggtc acaggaagga 780 ggcctccatc aggcgttggc aggagccatc gtggtggagt actcaagctc agtgaagtta 840 acatcaggcc acctaaaatg caggctgaaa atggacaaac tggctctgaa aggcacaacc 900 <210> 7 <211> 480

<212> DNA <213>日本腦炎病毒 <400> 7 gacaaactgg ctctgaaagg cacaacctat ggtatgtgca cagaaaaatt ctcgttcgcg 60 aaaaatccgg cggacactgg tcacggaaca gttgtcattg aactttcata ctctgggagt 120

gatggcccct gcaagattcc gattgtctcc gttgctagcc tcaatgacat gacccccgtc 180 gggcggctgg tgacggtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gcgccaactc aaaggtgctg 240 gtcgagatgg aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag 300 attaaccacc attggtacaa ggctggaagc acgctgggca aagccttttc aacgactttg 360 aagggagctc aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga 420 ggggtcttca actccatagg gaaagctgtt caccaagtgt ttggtggtgc cttcagaaca 480 <210> 8 <211> 945

<212> DNA <213>日本腦炎病毒 <400> 8 gtggtattca ccatcctcct gctgttggtc gctccggctt atagtttcaa ctgtctggga 60 第8頁 03p0387序列表 1272104 atgggcaatc gtgacttcat agaaggagcc agtggagcca cttgggtgga cttggtgcta 120 gaaggagaca gctgcttgac aatcatggca aacgacaaac caacattgga cgtccgcatg 180 atcaacatcg aagctagcca acttgctgag gtcagaagtt actgctatca tgcttcagtc 240 actgacatct cgacggtggc tcggtgcccc acgactggag aagcccacaa cgagaagcga 300 gctgatagta gctatgtgtg caaacaaggc ttcactgatc gtgggtgggg caacggatgt 360 ggacttttcg ggaagggaag tattgacaca tgtgcaaaat tctcctgcac cagcaaagcg 420 attggaagaa caatccagtc agaaaacatc aaatacgaag ttggcatttt tgtgcatgga 480 accaccactt cggaaaacca tgggaattat tcagcgcaag ttggggcgtc ccaggcggca 540 aagtttacag taacacctaa tgctccttcg ataaccctca aacttggtga ctacggagaa 600 gtcacactgg actgtgagcc aaggagtgga ctaaacactg aagcgtttta cgtcatgacc 660 gtggggtcaa agtcattttt ggtccatagg gaatggtttc atgacctcgc tctcccttgg 720 acgccccctt cgagcacagc gtggagaaac agagaactcc tcatggaatt tgaagaggcg 780 cacgccacaa aacagtccgt tgttgctctt gggtcacagg aaggaggcct ccatcaggcg 840 ttggcaggag ccatcgtggt ggagtactca agctcagtga agttaacatc aggccaccta 900 aaatgcaggc tgaaaatgga caaactggct ctgaaaggca caacc 945 <210> 9 <211> 1500 <212> DNA <213>日本腦炎病毒 <400> 9 ttcaactgtc tgggaatggg caatcgtgac ttcatagaag gagccagtgg agccacttgg 60 gtggacttgg tgctagaagg agacagctgc ttgacaatca tggcaaacga caaaccaaca 120 ttggacgtcc gcatgatcaa catcgaagct agccaacttg ctgaggtcag aagttactgc 180 tatcatgctt cagtcactga catctcgacg gtggctcggt gccccacgac tggagaagcc 240 cacaacgaga agcgagctga tagtagctat gtgtgcaaac aaggcttcac tgatcgtggg 300 tggggcaacg gatgtggact tttcgggaag ggaagtattg acacatgtgc aaaattctcc 360 tgcaccagca aagcgattgg aagaacaatc cagtcagaaa acatcaaata cgaagttggc 420 atttttgtgc atggaaccac cacttcggaa aaccatggga attattcagc gcaagttggg 480 gcgtcccagg cggcaaagtt tacagtaaca cctaatgctc cttcgataac cctcaaactt 540 第9頁 1272104 03p0387序列表 ggtgactacg gagaagtcac actggactgt gagccaagga gtggactaaa cactgaagcg 600 ttttacgtca tgaccgtggg gtcaaagtca tttttggtcc atagggaatg gtttcatgac 660 ctcgctctcc cttggacgcc cccttcgagc acagcgtgga gaaacagaga actcctcatg 720 gaatttgaag aggcgcacgc cacaaaacag tccgttgttg ctcttgggtc acaggaagga 780 ggcctccatc aggcgttggc aggagccatc gtggtggagt actcaagctc agtgaagtta 840 acatcaggcc acctaaaatg caggctgaaa atggacaaac tggctctgaa aggcacaacc 900 tatggtatgt gcacagaaaa attctcgttc gcgaaaaatc cggcggacac tggtcacgga 960 acagttgtca ttgaactttc atactctggg agtgatggcc cctgcaagat tccgattgtc 1020 tccgttgcta gcctcaatga catgaccccc gtcgggcggc tggtgacggt gaaccccttc 1080 gtcgcgactt ccagcgccaa ctcaaaggtg ctggtcgaga tggaaccccc cttcggagac 1140 tcctacatcg tagttggaag gggagacaag cagattaacc accattggta caaggctgga 1200 agcacgctgg gcaaagcctt ttcaacgact ttgaagggag ctcaaagact ggcagcgttg 1260 ggcgacacag cctgggactt tggctctatt ggaggggtct tcaactccat agggaaagct 1320 gttcaccaag tgtttggtgg tgccttcaga acactctttg ggggaatgtc ttggatcaca 1380 caagggctaa tgggggccct actactttgg atgggcatca acgcacgaga ccgatcaatt 1440 gctttggcct tcttagccac aggaggtgtg ctcgtgttct tagctaccaa tgtgcatgct 1500

<210> <211> <212> <213>

10 45 DNA 曰本腦炎病毒

<400> 10 gtggtattca ccatcctcct gctgttggtc gctccggctt atagt 45 <210> 11 <211〉 175 <212> PRT <213>日本腦炎病毒 <400> 11 Val Val Phe Thr 工le Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Asp 1 5 10 15

Lys Leu Ala Leu Lys 20

Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe 25 30 第10頁 03p0387序列表 1272104

Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val lie 35 40 45

Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys lie Pro lie Val 50 55 60

Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr 65 70 75 80

Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val 85 90 95

Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr lie Val Val Gly Arg Gly 100 105 110

Asp Lys Gin lie Asn His His Trp Tyr Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly 115 120 125

Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gin Arg Leu Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser lie Gly Gly Val Phe Asn Ser 145 150 155 160 lie Gly Lys Ala Val His Gin Val Phe 165 <210> 12 <211> 480 <212> DNA <213> 曰本腦炎病毒 <400> 12

Gly Gly Ala Phe Arg Thr 170 175 gacaaactgg ctctgaaagg cacaacctat ggtatgtgca cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg cggacactgg tcacggaaca gttgtcattg aactttcata ctctgggagt gatggcccct gcaagattcc gattgtctcc gttgctagcc tcaatgacat gacccccgtc gggcggctgg tgacggtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gcgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag attaaccacc attggtacaa ggctggaagc acgctgggca aagccttttc aacgactttg aagggagctc aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga 60 120 180 240 300 360 420 第11頁 1272104 03p0387序列表 ggggtcttca actccatagg gaaagctgtt caccaagtgt ttggtggtgc cttcagaaca 480 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列 <400> 13 cgcggatcca aatggtggta ttcaccatc 29 <210> 14 <211〉 29 <212> DNA <213>人工序列 <400> 14 ttttctagag cttaggttgt gcctttcag

29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列 <400> 15 cgcggatcca aatgttcaac tgtctggga 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列 <400> 16 ttttctagag cttaggttgt gcctttcag 29

<210> 17 <211〉 29 <212> DNA <213>人工序列 <400> 17 cgcggatcca aatggtggta ttcaccatc 29 <210> 18 <211〉 29 <212> DNA <213>人工序列 <400> 18 ttttctagac gttatgttct gaaggcacc 第12頁 29 03p0387序列表 1272104 <210> 19 <211〉 25 <212> DNA <213>人工序列 <400> 19 25 gctgcatatg gacaaactgg ctctg <210> 20 <211〉 29 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 20 ttttctagac gttatgttct gaaggcacc 29 第13頁

Claims (1)

1272104 拾、申請專利範圍：i h s {i 1. 一單離出的重組蛋白係包含SEQ ID ΝΪ):Γ。—“ 2. —單離出的重組蛋白係包含SEQIDNOill。 3. — DNA疫苗，係為一表現載體，包含可編碼SEQIDN0:3或 SEQ ID NO: 11之核酸，其中前述核酸係可連結至一表現調控序 列。 4. 一可保護受測對象對抗日本腦炎病毒的疫苗，係包括一表現載 體，該表現載體包含可編碼SEQIDN0:2、3或11之核酸，並 且前述核酸係可連結至一表現調控序列，以及一醫藥可接受之 載劑。 5. —可保護受測對象對抗曰本腦炎病毒的疫苗，係包括SEQ ID NO:3或11之重組蛋白，以及一醫藥可接受之載劑。