TWI265035B - Collagen II/glycosaminoglycan/hyaluronan porous matrix and preparation thereof - Google Patents

Description

1265035 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種模擬生體環境之可供細胞貼附、增 生、遷移與分化的多孔性載體；該載體是利用冷凍乾燥與 父聯方式製備而得的’具備生物降解與相容性，可應用於 細胞工程、再生醫學及組織工程等。 【先前技術】 (1)組織工程載體所需具備的特性 生物組織由細胞、細胞外間質（extracellular matrix:)和 訊號傳遞系統（signaling system)所構成。因此組織工程首要 是製造生物可相容（Biocompatible)與降解（Biodegradable) 的月木（scaffold)或載體（matrix)，供應細胞於體外（in 生長所品的二度空間ί衣境。組織細胞例如軟骨細胞與骨母 細胞於體外平面（2D)增生培養時，細胞會依循去分化 (dedifferentiation)之路徑，失去原有之特性。因此，骨架 除了需要三度空間（3D)外，亦須提供去分化的細胞回復為 原本體内的正常分化（differentiation)狀態，而其多孔隙結 構可提供植回體内時，引導新舊組織結合為一體的媒介。 一般用於組織工程的骨架必須符合下列的性質[1 _2]: 1.細胞可貼附於骨架上。 2·骨架材料與其降解產物不可具有毒性與抗體原（antigen)。 3.合適的3 D結構。 4·孔隙度（P〇r〇sity)超過90%。提供最大的表面積給于細胞 .1265035 •間有效的交互作用、促進細胞遷移（migration)與細胞外間 • 質（extracellular matrix，ECM)的累積，並支持體外培養時營 • 養源傳送和氣體交換。 5_骨架在元成支持功能後’逐漸完全的降解。 6.細胞間質產生和骨架降解之間，呈現穩定狀態。 至於訊號傳遞系統則需要由生長因子或細胞激素 (cytokine)結合細胞外間質進行一連串的訊號傳遞，以達到 φ 增生、分化、遷移等目的[3]。因此骨架若能模擬細胞外間 質，將具有較優越的組織再生促進能力。 (2)組織工程骨架之製備方式 隨著組織工程技術的發展，已有許多製備方式可以製 • 造生物可分解的高分子多孔性性材料，依其製程可分為下 列之製造方法[4-5]: 1 ·纖維黏結法（Fiber Bonding)。 2·薄膜層壓法（Membrane Lamination)。 • 3·溶劑禱造鹽洗法（Solvent Casting and Particulate

Leaching) 〇 4·融化禱造法（Melt Molding)。 5·擠壓成形法（Extrusion)。 6.二度空間喷墨法（Three Dimensional Printing)。 7·飽和氣體發泡法（Gas Foaming)。 8·冷柬乾燥法（Freeze Drying)。 9·相分離法（Phase Separation)。 1 〇·顆粒燒結法（Particle Sintering)。 6 1265035 纖維黏結法及顆粒燒結法製作的原理在於利用物理性 的加熱融合，使高分子纖維或顆粒相互黏結而產生三度空 間的夕孔、”α構。丨中’高分子纖維黏結法的製作流程需 應用到兩種以上的高分子及溶劑，且其製程繁瑣不利大量 生產。而顆粒燒結法其顆粒顆粒間在燒結黏結後所能生成 的孔隙度較低’而且孔徑過小並不切實用。所以此二方法 共通的缺點在於其製程中皆需以熱處理的方式使材料黏

結，而高分子材料在加熱的過程中往往將導致材料的裂 解’破壞材料原有的性質。 相分離法是近年來最常提及的方法，其製備原理“ 利用兩兩互不相溶的液轉γ卜、々 及體（水溶液/高分子溶液）攪拌洁 合，再以冷;東的方式將其混合液凝結，，然後放人模具中# 打冷珠乾燥將其中所含的水溶液抽出最後在室溫下真分 乾燥’將可得到多孔性的材料。此方法可得到高孔隙率（9 %左右）及孔洞相互連通的多孔性材料。 溶劑鎢造鹽洗法的製程中，將可分解性的高分子以一 溶劑溶解後，添加水溶性㈣類使之混合，再置於可 性高分子所不可溶解的溶液（如水或？醇）中將高分二 出’或以真空抽氣的方式將溶劑抽出，其後再 所含有的可溶性鹽類以大量的水溶解，即產生大量的; 洞。此方法的優點在於製備方法簡易，且材料 及 隙度可依添加的鹽類顆粒大小及多寡加以控制。點: 無法將内部的鹽類洗出與材料内部殘留許多的有機溶/ 因此，所製備的多孔性材料多半是薄膜的形式。 7 1265035 (3)至今組織工程載體發展的現況 製造載體的高分子可分為兩大類： 天然南为子[6_8]:褐藻膠（aiginate)、瓊膠（agarose)、 膠原蛋白（collagen)、透明質酸（hyalur〇nan，ha)、微纖維 (fibrin)、曱殼素（chit〇san)、燒結硬骨等；多孔洞的膠原蛋 白海綿（sponge)載體有無接枝醣胺素 (glyc〇SaminoglyCans，簡稱GAGs)，最近已廣泛應用於皮 φ 膚、硬骨、軟骨、半月軟骨和食道等組織再生之研究。實 驗結果顯示，豬的軟骨細胞維持圓形的比例，於膠原蛋白 二型載體上較一型高出許多，此外GAGs合成量，亦是膠 原蛋白二型載體上較高。載體上細胞的均勻分佈，孔洞大 . 小是特別關鍵的因素。較高的孔隙度，讓更多的細胞能穿 過細胞外間質貼附於膠原纖維上。 二、合成高分子[9-10] : p〇lyglyC〇iide acid (PGA)、 Polylactide acid (PLA)、P〇ly(glycolide co-lactideacid) • (PLGA)、Polycapralactone、Polydioxanone 或 Polyorthoester 專材料。此類的高分子是一種生物適應性良好的人工高分 子材料’其共聚合物在生物體内分解後，可分解為小分子 鏈段’這些產物將隨著人體内的新陳代謝過程排出體外， 因此’其裂解產物將不會殘留於體内。PLA、PGA和PLGA 通過 FDA (U.S Food and Drug Administration)的認可後，已 被使用當作手術上縫線與固定用的骨釘。因此，有些研究 者使用此材料當作組織工程軟骨的骨架，降解的速度可由 製程控制，低濃度的降解產物對細胞是無毒性的，但是在 8 1265035 - 兩濃度時，局部的pH降低，將導致組織的傷害。 (4 )組織工程之關節軟骨 世界醫療的技術進步，大大地延長了人類的壽命，伴 IW這個現象的重要問題是年紀老化的人口越來越多，於是 如何處理老化族群中常見的問題與疾病，譬如退化性關節 k (osteoarthritis，OA)。同樣的台灣也不例外需面對著這問 題，近年來已吸引愈來愈多科學研究的投注。由於受傷後 # 的軟骨降解機轉目前尚未明確，在關節軟骨受到創傷後， 常常會逐漸出現疼痛症狀，最後產生退化性關節炎，於是 研究人員開始尋求解決之道。目前關節軟骨受損的療法及 缺點如下[11-14]: • I 磨損（Abrasion)、微裂（Microfracture)和鑽孔 將軟骨文損的部位以鑽孔（subchondral drilling)的方 式’鑽透軟骨下骨（subchondral bone)，讓骨髓能夠流出， 進而在軟骨受損的部位長出新的軟骨，但是最後長出來的 _ 軟骨是屬於纖維性軟骨。另外還有一種是微裂 (microfracturing)及磨損關節形成術（abrasi〇n arthr〇piasty) 也疋利用骨髓的流出’使間葉幹細胞聚集，然後進行修復。 這些方法所新長出來的軟骨，短時間内多呈現纖維性軟骨 或類似透明軟骨（hyaline-like cartilage)，對於關節軟骨的 缺損’並無法達到良好修復的效果。最終會約化變成硬骨。 2·異體移植（allograft) 捐贈者的體型並非與受贈者相符，必須再配合骨切除 術，來調整移植部位，使符合骨與軟骨的正常型態。本方 1265035 -法的缺點是捐贈者的來源有限，並且會有免疫排斥的問題。 ， 3_ 自體移植（mosaicPlasty or autograft，ACT) - 在l964首先使用自體移植的技術，將身體非荷重部 位，或是運動時报少會用到的軟骨連帶硬骨組織 (osteochondral graft)取下植入受損部位，來治療軟骨的缺 損。例如取股骨末端的關節前側面的軟骨組織，用來填補 於承受重力面的關節軟骨面，此種方法稱為瓜咖叫吻 _ (Han§ody，Μ al·，2〇01)，為目前較理想的治療方法，能夠 避免異種或異體移植，所引發的免疫系統排斥反應。身體 可取的硬骨組織有限，這便成了自體移植的限制。 關節炎治療方式之選擇因人而異，有些人只要稍做休 息即可獲得改善。另外一些人則選擇下列的方法： 一、物理治療：保護關節，避免過渡使用，必要時使 用輔助器材（如手杖），已減輕關節之負擔。 一、藥物冶療·服用止痛藥（Analgesics)或非類固醇消 • 炎藥（NS AIDS)，可減輕疼痛。非類固醇消炎藥有許多選擇， 除選用田彳作用低者外，已被確定會促進軟骨代謝分解者， 使用時須特別注意。 (I) 類固酵（corticosteroid)，已知會抑制軟骨合成pGs與促 進代謝，應盡量避免使用。但是在急性發炎時，關節内注 射類固酵可迅速消炎，避免因過度發炎而造成軟骨之破壞。 (II) 軟月保護劑（ch〇ndr〇protective agents)，如 gly cosaminogly canpeptide complex (GP-C) 及 glycosaminoglycan p〇lySuifate (GAG-PS)，這類藥物由動物 •1265035 -的軟骨、骨髓、肺臟及氣管中萃取，經動物實驗證實有調 解軟骨細胞代謝，增加軟骨細胞抵抗力與抑制軟骨中—些 ' 蛋白分解作用，藉此保護關節軟骨。口服硫酸軟骨素 (chondroitin sulfate，Cs)和葡萄糖胺（gluc〇samine)是處理 退化性關節炎的新方法，稱為軟骨保護法 (Ch〇ndr〇Pr〇teCti〇n)，與傳統處理法相反’軟骨保護法的目 標在增強關節軟骨防禦機制並提升其重組與自我癒合的能 籲力。根據歐美研究指出硫酸軟骨素可幫助維持關節的強勒 與柔軟性，同時可促進關節軟骨的修復，而在關節炎的時 候還會抑制elastase和hyaluronidase對軟骨的傷害，並改 善關節滑囊液的品質。所以硫酸軟骨素和葡萄糖胺在過去 健康食品市場上已行銷多年，許多小型的臨床研究指出它 們對於改善退化性關節炎的效果不錯，將兩種成分加起來 7進行的雙盲臨床試驗’硫酸軟骨素和㈣糖胺對於膝關 節炎的症狀緩和非常地有效，比起對照組的效果，是Μ% 籲比28%。因此，美國國家衛生研究院投入大批人力與金錢， 進行大規模的臨床實驗，驗證硫酸軟骨素和葡萄糖胺對於 退化性關節炎的改善效果。未來，將可預估擁有龐大的市 場[14]。 二、手術治療：當藥物治療無效時，或關節已有嚴重 =形時’可考慮外科治療’包括關節成形術㈣h卿心⑺， 骨融合（fusion)，骨切除術（〇ste〇t〇my)或關節置換術㈣^ joint replacement)等，以減輕疼痛或根本解決問題。 1265035 對於目前醫學界處理OA問題，非盡善盡美的情況下， 紛紛朝向組織工程與細胞療法前進，試圖尋求解決之道。 (5)註[參考資料] [1] Freed, L.G.; Marquis, J.C.; Nohria, A.; Emmanual, J.; Mikos, A.G.; Langer, R. Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers. J Biomed Mater Res 1993, 27, 1 1-23.

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較佳的，該透明質酸具有一介於5000至5 x 106的分 子量。更佳的，該透明質酸具有一介於1 X 1〇4至1 X 106 的分子量。 較佳的，1-乙基- 3- (3 -二甲胺丙基）碳二醯亞胺 ((l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide))被用作為該交聯的交 聯劑為。 較佳的，京尼平（genipin)被用作為該交聯的交聯劑為。 較佳的，本發明之多孔性載體係由包含下列步驟的方 法製備：將含有醣胺素及透明質酸的膠原蛋白溶液置入於 一個模具内，經由冷凍乾燥使該膠原蛋白溶液於該模具内 成形一纖維載體，再將成形的纖維載體浸於一含有交聯劑 的溶液中進行交聯。更佳的，該模具的内部具有圓柱型、 方型、不規則型或薄膜之三度空間立體形狀。 較佳的，該成形體為圓柱型，而且具有介於7.9瓜瓜至 9.2mm之直径，及介於4 3mm至9 之厚度。 本發明亦揭示一種多孔性載體之製備方法，包含下 步驟·· 、^原蛋白二型溶解於含醋酸的水溶液中，並盥透 質酸及選自硫酸化軟骨素、硫酸化肝素、硫酸化角質素 化皮膚素及匕們之混合物所組成群組的醋胺素均句 合；將所獲得的混合液注人模具較成形，經冷來乾燥 成一纖維載體；除去該纖維載體所殘留之醋酸；及將該 維載體浸於一含有交聯劑的溶液中進行交聯。 x 車又佳的，該冷;東乾燥係在_2〇〇c或更低的溫度進行。 15 1265035 佳的’ β冷4乾燥係利用不同冰;東溫度抓…8〇。〇或 ]96t製備不同孔洞大小之纖維載體。 ▲於本發明之製備方法中，較佳的該纖維載體被浸泡於 、:交聯劑的’酉精水溶液中進行交聯反應，以該纖維载體被 /又泡於3交聯劑的酒精水溶液中在m進行w小時的 交聯反應為更佳。 於本發明之製備方法中，較佳的該纖維載體具有蜂窩 •狀或層狀的表面結構，及其内部具有多孔性相互連通網狀 結構。 狀 於本^明之製備方法中，較佳的該除去該纖維載體所 戔留之醋酉夂的步驟包含將該纖維載體浸於酒精水溶液。 • 於本發明之製備方法中，較佳的該硫酸化軟骨素係雙 ^醣單元（Unh)為1至20以上的硫酸化軟骨素八、8或c。 口於本發明之製備方法中，較佳的該硫酸化肝素係雙醣 單元（Unit)為1至2〇以上的硫酸化肝素。 ^ ⑨本發明之製備方法中，較佳的該透明質酸具有一介 於5_至5χ1〇6的分子量，以介於1χ1〇ι ΐχΐ 子量為更佳。 於本發明之製備方法中，較佳的該交聯劑為丨_乙基 _3_(3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺 ((l-ethyH(3-dimethylaminopropyi)carb〇diimide)。 於本發明之製備方法中，較佳的該交聯劑為京尼平 (genipin) 〇 1265035 【實施方式】 理想的組織工程軟骨應該適量的包含主要的細胞外間 質，如蛋白多醣(PGs)、膠原蛋白第二類型，同時必須類似 天然軟骨的結構與機能。有鑑於此，發明人積極著手製作 載體，並經過多次試驗，終獲本發明之產生。而本發明之 主要目的即針對上述問題提供一種複合的載體，主要係包 括膠原蛋白第二型（COL II)、透明質酸（HA)、交聯劑（例如 φ 京尼平（genipin))與不同分子量的醣胺素，其中每單位體積 醋酸溶液含0.8-1% (w/v)的膠原蛋白二型、適量的透明質酸 與醣胺素，且以0.25-0.1。/❶（w/v)交聯劑進行交聯。另外， 透明質酸分子量的分佈範圍為5χ1〇5、7 3χ1〇5、2 2χΐ〇5、 3·9χ104 (g/mole)等，至於醣胺素分子量範圍則是5〇〇 (g/mole)以上。藉此，可得孔隙度9〇〜95%、孔洞大小5〇〜 300 nm、可長期保存且穩定的c〇L n/HA/cs的載體。cs 為硫酸軟骨素（chondroitin sulfate)是醣胺素的一種。 • 本發明之另一目的即在建立複合載體的交聯方法，其 交聯方法係依組成將膠原蛋白二型、不同分子量大小的透 明質酸、醣胺素均勻混合在醋酸溶劑中，利用冷凍乾燥法 於-52 C下去除溶劑，得到大小適中的圓柱形載體，之後， 將該載體浸泡於酒精中除去殘留的醋酸，再使用交聯劑京 尼平（genipin)於37t，1 〇〇 rpm下進行48小時的交聯反應， 而製得孔隙度90%以上的多孔性膠原蛋白二型複合载體， 並具有容易且可長期保存之利用價值者。 17 1265035 實例一乡孔性膠原蛋白栽體的製備 將利用酵素法萃取所得 代，〇.5M2〇ml醋酸中，均/原蛋白二型100叫浸泡於 ^ 句勻攪拌16小時；再加入2 ml 冰冷的去離子水使溶液均句 具中（直徑H)mmX高8軸）Z料原蛋白溶液滴入模 mm)，經冷凍固化形成圓柱狀之載 f 1體孔洞大小之調控，以各種冰隸件（_2代、 = nc)與〇.5M之醋酸加入量控制，經24小時冰滚 後，再進行24小時冷束乾燥（训，真空度：〇2醜邮， 即可產生具有孔洞的膠原蛋白載體。請參考圖—在冰康溫 度（-20°C)之膠原蛋白二型載體的 生戟體的SEM圖，可觀察到膠原蛋 白一型載體的表面結構為蜂窩狀與層狀結構。然而，圖二 的結果顯示，不同的冰凍溫度（以_2〇。(：、1):_8〇。〇、〇:_196它） 是會影響載體的孔洞大小。另一方面’再取第二型膠原蛋 白50 mg於10 ml 0.5M醋酸溶液中攪拌16小時之後再 加入1 mgHA(分子量MW: 5x105)與1 mgCS，待混合均句 後’注入模具中’經-20 C冰康12小時，再進行12小時的 冷凍乾燥後（-53°C，真空度：0.2 mmHg)，則可得到c〇L II/CS/HA的複合載體。再由這些載體篩選出適合軟骨生長 的孔洞大小，以進行軟骨細胞之培養。一般而言，载體内 部孔洞大小150 μηι〜300 μιη之間有利於細胞的生長。本實 例所使用的CS有兩種，包括長鏈的BTCS (十個雙醣單元 (unit)以上）及短鏈的CSCΑ8 (4個雙醣單元）。 實例二交聯膠原蛋白二型載體 18 •1265035

分別取實例一的膠原蛋白第二型載體（i 〇 mg ,無HA 及 CS)及 COL II/CS/HA 的複合載體（1〇mg，有 ha、CS)， 浸泡於2 ml的乙醇水溶液（50%)中，此溶液含有〇 25% (w/v) 京尼平（〇卩）或1-乙基-3-(3-二甲胺丙基碳二醯亞（14化丫1_3_ (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，（EDC))，整個交聯反 應於3 7°C ’ 1 〇〇 rpm下反應48小時。交聯反應後之外表型 態如圖三所示，圖三（a)是以GP交聯的C0L n/cs/HA載 體，呈現深藍色的外表，而經EDC交聯的COL II/CS/HA 載體則是白色透明（圖三（b))。取出交聯反應後之載體，以 去離子水清洗3次’每次1.5小時；再以酒精（7〇%)浸泡至 隔仪。之後，移至無菌操作台，再使用無菌酒精浸泡隔夜， 以達滅菌完全。於37。〇，5%(：〇2和溼度為95%之條件培養 下，使用經GP與EDC交聯之膠原蛋白二型載體培養軟骨 細胞，培養基成分為DMEM (Gibco)與1〇% fbS，經過五星 期培養後，其增生、分化情況請参考圖四（a )與（b )。 實例三軟骨細胞培養於COL II/CS/HA載體中 將COL II、HA (1〜5 ug/載體，MW:5xl〇5)及含有各種 CS (BTCS··長鏈段的cs，CSCA8:短鏈段的CS，1〜5 ug/載 體，MW·· 500〜3·6χ1〇6)之複合載體，進行細胞培養以評估 HA與CS的生物效應（bi〇l〇gic effect)。置於24-孔培養盤中 的複合載體，經過培養基浸潤後，利用注射法將丨〇〇μ[的細 胞懸浮液（含有1χ10軟骨細胞）注入載體中，以c〇2 和溼度為95%之條件培養，培養基成分DMEM (⑴心幻與⑺ 1265035 . %FBS，2〜3天更換一次。將經過數週培養的COLII/CS/HA 載體進行H&E染色、艾爾遜藍染色劑（alcian blue)染色及細 . 胞數與醣蛋白之定量。細胞數與PGs的含量分別以Hoechst 溶液（0.2 pg Hoechst 3 3 528 /ml) (Fluka 14530，USA)與 1，9-二甲基曱浠藍（1，9-di me thy 1 methylene blue，DMMB)溶液憤 測。由圖五，可知COL II/CS/HA載體中CS與HA的生物效 應，經過六星期的培養後，BTCS具有促進軟骨細胞生化 _ 合成速率。圖六之H&E染色與艾爾遜藍染色劑染色，顯示 軟骨細胞維持正常的型態（phenotype)與分化情形。 【圖式簡單說明】 圖一表示本發明之膠原蛋白二型載體180倍之SEM放 大圖，其表面結構為蜂窩狀與層狀結構（無HA、CS， 冰 凍溫度-20°C)〇 圖二表示本發明以不同冰凍溫度製備膠原蛋白二型之 φ 多孔性載體（無 HA、CS)，（A)-20°C ; (B)-80°C ; (C)-196°C。 圖三（a)表示本發明之COL II/CS/HA多孔性複合載體 之外觀，其係以京尼平作為交聯劑進行交聯。 圖三（b)表示本發明之COL II/CS/HA多孔性複合載體 之外觀，其係以EDC作為交聯劑進行交聯。 圖四（a)表示以不同交聯劑交聯載體之軟骨細胞生長情 形結果圖。其中EDC COL I代表膠原蛋白第一型載體以 EDC交聯，GP COL II代表膠原蛋白第二型載體以GP交 聯，及GP COL I代表膠原蛋白第一型載體以GP交聯。 20 1265035 圖四（b)表示以不同交聯劑交聯載體之軟骨細胞生化 合成結果圖。其中EDC COL I代表膠原蛋白第一型載體以 EDC交聯；GP COL II代表膠原蛋白第二型載體以GP交 聯，及GP COL I代表膠原蛋白第一型載體以GP交聯。 圖五（a)表示本發明之不同COL II/HA/CS複合載體其 軟骨細胞生長情形結果圖，其中BTCS代表：COL II + HA + CS (長鏈段，十個雙醣單元（unit)以上）；CSCA8代表：COL II + HA + CS (短鏈段，4個雙醣單元）；COL II代表不含 HA、CS的膠原蛋白第二型載體。 圖五（b)表示本發明之不同COL II/HA/CS複合載體其 軟骨細胞生化合成情形結果圖，其中BTCS代表：COL II + HA+ CS (長鏈段，十個雙醣單元（unit)以上）；CSCA8代表： COL II + HA + CS (短鏈段，4個雙醣單元）；COL II代表不 含HA、CS的膠原蛋白第二型載體。 圖六（a)表示本發明之COL II/HA/CS複合載體，培養 軟骨細胞之H&E染色圖。 圖六（b)表示本發明之COL II/HA/CS複合載體，培養 軟骨細胞艾爾遜藍染色劑之染色圖。 21

Claims (1)

1265035 質酸具有一介於5 000至5χ 106的分子量。 8·如申請專利範圍第7項之多孔性載體，其中該透明 質酸具有一介於1 X 1 〇4至1 X 1 06的分子量。 9 ·如申請專利範圍第1項之多孔性載體，其中用於六 聯的交聯劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺 ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carb〇diimide))。 10·如申請專利範圍第1項之多孔性載體，其中用於交 聯的交聯劑為京尼平（genipin)。 11 ·如申請專利範圍第1項之多孔性載體，其係由包含 下列步驟的方法製備：將含有醣胺素及透明質酸的膠原蛋 白溶液置入於一個模具内，經由冷凍乾燥使該膠原蛋白溶 液於該模具内成形_纖維載體，再將成形的纖維載體浸於 一含有交聯劑的溶液中進行交聯。 12·如申請專利範圍第u 具的内部具有圓柱型、方型、 立體形狀。 項之多孔性載體，其中該模 不規則型或薄膜之三度空間 23 1265035 介於4.3mm至9.3mm之厚度。 種多孔性載體之製備方法，包含下列步驟： •將膠原蛋白二型溶解於含醋酸的水溶液中，並與明 :!及選自硫酸化軟骨素、硫酸化肝素、硫酸化角質素、 广化皮膚素及它們之混合物所組成群㈣醣胺素均勾混 所獲得的混合液注人模具^成形，經冷綠燥形 、，維載體，除去該纖維載體所殘留之醋酸；及將該纖 維載體浸於··含有交聯#丨㈣液巾進行^ 15·如申請專利範圍帛14項之製備方法，其中該冷凍 乾燥係在-20°C或更低的溫度進行。 16·如申請專利範圍第15項之製備方法，其中該冷凍 乾燥係利用不同冰凍溫度_2(rc、-8(rC4_196CC製備不同孔 洞大小之纖維載體。 17·如申請專利範圍第14項之製備方法，其中該纖維 载體被浸泡於含交聯劑的酒精水溶液中進行交聯反應。 18·如申請專利範圍第17項之製備方法，其中該纖維 載體被浸泡於含父聯劑的酒精水溶液中在3 7 °C下進行4 8 小時的交聯反應。 24 1265035 26.如申請專利範圍第14項之製備方法，其中該交聯 劑為京尼平（genipin)。

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