TWI251466B - Oil body treated by cross-linking agent with increased stability - Google Patents

Description

1251466 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於經交聯劑處理過之穩定度提昇的油體， 該油體可為利用天然油體的主要成份三酸甘油酯、磷酸醋 及油體蛋白重組的人造油體或天然油體。 【先前技術 植物種子内有一儲存三酸甘油酯的胞器稱為油體，是 由一層半單位的填酷質（phospholipid )及特有蛋白質所包 圍。這些特有蛋白質以油體膜蛋白(oleosin)為主以及一些 微量蛋白。油體膜蛋白是一種構造蛋白於構造上之功能是 藉由立體障礙與負電性斥力保護油體的完整性與穩定性， 使其得以在成熟種子細胞内長期保存。油體膜蛋白可分為 三區：N端區、中間疏水區、及c端區。藉由延伸進到疏水 性的三酸甘油酯（疏水性作用力），中間疏水區扮演基底的

以在成熟種子細胞内長期保存

油體的大小平均在〇 5 ^ • -3.5%主要為油體膜蛋白的蛋白 〇·5·2微米（pm)間。根據此一比例將 1251466

此三種油體主要成伤二酸甘油醋、油體蛋白[oil body proteins (OBPs)]及磷酯質混合，並藉由超音波振盪法可在 試管中成功的組成人造油體（參見，例如，Tzen等人，J

Biochem 123: 318-323 ， 1998 ; Tzen 與 Huang ， J Cell Biol 117: 327-336 ， 1992) ° 由於油體的密度比水小（〇·93)，經離心則浮在上層可很 容易地與其他水溶性蛋白質及非水溶性蛋白質（沈殿於底 部）分離開來’因此純化上較一般其他傳統的蛋白質容易。 而且’油體膜蛋白在 面）’所以植物油體很適合用來發展表現外來蛋白質的系 統。已有實驗證明（參見，例如，Van Rooijen & M〇1〇ney

Bi〇/techn〇logy 13: 72_77, 1995)，若以基因工程的技術將 所欲表達的蛋白之基因接於油體膜蛋白基因後端，則表達 的轉殖植物之種子油體上便會發現此複合蛋白。經反覆離 心步驟便能將種子大部份蛋自質與油體分離開來。若在接 合油體膜蛋白與外來蛋白f之交接處設計—個可被專一性 高的蛋白水解酵素（如Fact〇r Xa)切除之胺酸序列，利用此 蛋白水解酵素的專—性把外來蛋白f與油體膜蛋白切分 開，再經一次離心步驟分離浮於上層的油體，便可 純度很高游離於水溶來 /、 0用^ I表達蛋自。㈣體也成功

' ;生物性膠囊以包埋乳酸菌作為f α γ Μ M (參見，例如m 上的利用發展 u U 荨人，J Diary Sci. 86: 424-428，20(m 因此植物油體或人造油體的 ♦ 要的因素。在南豐p &在其應用上便具相當重 在商業上的應用時、增加油體的穩定度將使其 1251466 應用於更廣的範圍上。 生物組織或蛋白在經化學交聯劑修飾後其表面特性會 有所改變使其結構穩定度改變。然而目前大多的交聯劑多 為化學合成如：甲酸、戊二酸（glutaraldehyde)、二駿殿粉 (dialdehyde starch)以及環氧化物（epoxy compound)等，過 去實驗結果也都證實它們具有相當高的毒性（參見，例如， Lohre 等人，Organs，16: 630-633，1992)。 京尼平（Genipin)可由槐子的果實（gardinia fruit)萃取 出來的geniposide經過β-解普酶（p-giucosidase)去除其上的 葡萄糖（glucose)分子而產生。槐子的果實在傳統中藥上常 被用於治療各種免疫性疾病及肝病等。也有研究證實京尼 平是一種很好的蛋白質天然交聯劑（參見，例如，Fujikawa 等人，Biotechnology Letter 9: 697-702，1987)。由於京尼 平及其相關衍生物在傳統中藥及食品色素的應用上相當成 功因此其毒性應相當的低，過去研究報告也證實其細胞毒 性要遠低於戊二搭及其它化學交聯劑（參見，例如，Sung 等人，J Biomater· Sci· Polymer Edn，10: 67-78，1999 ; EP1260237A1)。 申睛人於我國專利申請案第891248 18號揭示用3·羥基 丙醛來交聯及消毐一生物分子的方法，和含有交聯的生物 分子的生物相容性植入物、替代品或傷口敷料。 【發明内容】 本發明的一主要目的即在提供一種利用化學交聯劑處 I251466 理天然油體或人造油體而提昇其穩定度的技術。 本發明的另一目的是在提供一種利用天然及毒性低的 的化學交聯劑處理天然油體或人造油體而提昇其穩定度的 技術。 本發明的另一目的是在提供一種利用天然及毒性低的 的化學交聯劑處理人造油體而提昇其穩定度的技術，其中 可調整天然油體的主要成份：三酸甘油酯、磷酸酯及油體 蛋白的比例來重組各式大小且穩定的人造油體。 本發明利用化學交聯劑處理油體以增加油體的穩定 度，使其降解速率變慢以利長期儲存。此外，利用使用毒 性極低的天然交聯劑如京尼平及乳特寧更可使處理過的油 體運用於食品工業、藥物傳輸（drug 及生醫材料領 域上。 【實施方式】 本發明揭不一種化學交聯劑處理過的油體，其係將油 體與一化學交聯劑接觸而製備。 較佳的，該化學交聯劑係選自京尼平、乳特寧、甲醛、 戊一醛、一醛澱粉（dlaldehyde starch)以及環氧化物（叩⑽乂 compound)所組成的族群，以京尼平、乳特寧或戊二醛為更 佳，尤以京尼平為最佳。 適用於本發明的油體可為天然油體或人造油體，以人 b由體為u ° 由體係由三酸甘油醋、填酸醋及油 體蛋白重組而成。一合適的比例為94一9的三酸甘油酯、 1251466 0.5-2%的磷酯質及〇·5_3.5%的油體膜蛋白，以三者的重量 和為基準。所重組的人造油體其主要部份的大小在〇.5一2 微米（// m)間。 本發明的化學交聯劑處理過的油體，較佳的係將油體 與一含有化學交聯劑的水溶液混合一段時間而製備。該混 合較佳的係在室溫進行丨分鐘至4小時。較佳的該含有化 學交聯劑的水溶液含有O.OOU。/。的化學交聯劑。 本發明將以下述實施例進一步說明本發明之技術内 容，然而所列之實施例僅做說明之用，而無意於限定本發 明之範圍。 實施例1 ·人造油體之製備 A·油體蛋白[oil body proteins (OBPs)]之純化： 取10克成熟芝麻種子加入50 ml冷藏於4 °c的缓衝液A (Buffer A: 1M蔗糖及lOmM磷酸鈉緩衝溶液，ρΗ7·5)混合。 利用組織均質機將種子完全磨碎後，以三層紗布過濾。將 濾液分裝置離心管中，並緩緩加入等倍的緩衝液B (Buffer 3:〇.61\4森糖及1〇111]\1填|复納缓衝溶液，0{£7,5)於濾液上 層。以4500g離心20分鐘後，取油層至界面活性劑溶液 (Detergent solution·· 0.1%Tween_20，〇·2Μ蔗糖及 5mM 磷酸 納缓衝液，ρΗ7·5)混合均勻後，缓緩加入等倍的緩衝液D (Buffer D ·· 10mM磷酸鈉緩衝溶液，pH 7·5)於溶液上層，離 心，取油層至冷藏於4°C的緩衝液C (Buffer C: 2M氯化鈉及 10mM麟酸納緩衝溶液，pH 7.5)混合均勻後，缓緩加入等倍 1251466 的緩衝液D於溶液上層，離心，取油層至9m尿素溶液中， 、 於室溫下以50rpm轉速振盪10分鐘，接著緩緩加入等倍的緩 ' 衝液D (Buffer D : 10mM磷酸鈉緩衝溶液，pH 7.5)於溶液上 層’離心，取油層至緩衝液A混合均勻後，緩緩加入等倍的 緩衝液B於溶液上層，離心，取油層至緩衝液a混合均勻 後’加入等倍的乙if強力振盪混合均勻，離心，取溶液中 間固體介面層於另一離心管，靜置於室溫下等乙醚揮發完 全後，以10m磷酸納緩衝液溶解後，於_80°C儲存。 B·人造油體之製備 % 於微量試管中加入15mg的三酸甘油酯（TAGs)、150pg 磷酸酯（PL)及225pg前述製備的油體蛋白，溶於lml的l〇mM 磷酸納緩衝液溶，pH 7.5，以超音波振盪器（條件為20秒，30 振幅（amplitude)，2 pulser)以間隔五分鐘振盪三次，進行油 體重組，以上述比例即可重組與天然植物油體大小比例相 似的人造油體。 請參閱圖1所示，由結果發現在顯微鏡下觀察所組成之 0 人造油體與天然植物油體相似。 C.油體穩定度測試： 油體的熱穩定度測試，將油體置於不同溫度下處理30 分鐘，當溫度愈高油體愈不穩定而觀察到油體融合成大油 滴。 ^ 請參見圖2中所示’結果發現植物油體及人造油體均 隨溫度的提高而變得不穩定。 10 1251466 實施例二·油體及人造油體之交聯劑處理以增加其穩定度 A. 交聯劑處理油體及人造油體 將天然油體及人造油體〇.2mi分別置於〇,785ml的 10mM磷酸納緩衝液溶混合均勻並加入1%戊二醛0,015ml 於溶液中，於室溫下均勻混合作用20分鐘；另一交聯劑京 尼平則以0·5ηι1的0.2%濃度水溶液處理〇.5ml油體，置於 混合器以每分鐘30轉的速度於室溫下進行反應2-3小時。 B. 油體之熱穩定度測試 將經交聯劑處理後之油體置於不同的溫度下30分鐘 並觀察其穩定度表現。 請參見圖3所示、無論天然油體或人造油體經交聯劑 處理後，其溫定度大幅提升，可由圖2的60°C提升至90 °C。 圖1顯示可利用三酸甘油酯、磷酸酯與油體蛋白、组成 大小與天然油體相似的人造油體，並由圖2可看出人造油 體的穩定度與天然油體相似，故本發明可利用三酸甘油 酯、磷酸酯與油體蛋組成穩定且與天然油體類似的人造油 體。 由圖3的結果可瞭解無論天然或人造油體經交聯劍處 理後，油體的穩定度可大幅的提升，證明本發明對油雜的 應用有莫大幫助。 【圖式簡單說明】 1251466 圖la，lb及lc分別代表顯微鏡下觀察芝麻種子之油 體、純化油體及人造油體的顯微照片（倍數】000)。 圖2表示光學顯微鏡下觀察純化油體與人造油體在不 同溫度下之穩定度的顯微照片（倍數4〇〇)，其中同一列代表 相同的溫度，同一行代表相同的起始油體。。 圖3表示光學顯微鏡下觀察油體在交聯劑處理後在不 同溫度下的穩定度的顯微照片（倍數4〇〇)，其中同一列代表 相同的溫度’同-行代表相同的起始油體及交聯劑。

任何習知本項技藝人士，皆 、 j根據本發明及具體實施 例所述，在不偏離本發明精神及笳 哥邳汉軏圍下，作任意修飾及更 改’惟仍應涵括於本發明之範圍内。

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Claims (1)

1. "Ί (2005年10月修正) 13251466-! I Μ..:/、· τ:?，r'.i 1¾ ；ί ^ Μ 2 Η ^ L .、〜... ..'m 3*.ά · ό·:〜孔‘1"^ Λ 拾、申請專利範圍： 1 · 一種化學交聯劑處理過的油體，其係將油體與一含 有京尼平的水溶液混合1分鐘至4小時而製備，其中該含 有京尼平的水溶液含有0.00 1-1%的京尼平。 2.如申請專利範圍第1項的化學交聯劑處理過的油 體，其中該混合係在室溫進行。

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