TWI251024B - A group of anticancer substances with small molecule and production method thereof - Google Patents

Description

1251024 A7

本辱利申請是1998年10月16日申報的美國專利申請 09/173，681的延續，該美國申請要求保護於1998年4月 14日申報的美國臨時專利申請6〇/〇81，712的時間優先。 本發明是關於一組物質，即具有顯著抗癌活性的特異 5支鏈脂腿，及其藥用鹽與衍生物，以及用於治療癌症的 方法；本發明還包括探用特異菌株，利用工業設備生產含 上述特異支鏈脂肪酸的發酵物的方法者。 " 癌症是威脅人類健康與長壽的最嚴重的疾病；目前^ 類對癌症的治療主要採取放療與化療，它們在抑制細胞斗 cr —m f —丄— 10衣故紋允淹細胞的同時，對入體都有一定的毒副作周；同 K，八們廣泛研究，尋找—種毒副作用小而有效的^ 癌物質。 _ 、饥.. 1987年，本人在實驗室培養白血病細胞K562時’偶然 發現有-個培養瓶中污染上細菌，48小時後KS62白^ 經濟部中央榡準局員工消費合作社_製 ------------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^細胞完全消失了；於是’本人便將這坚污染的小杆菌分離 純化，選用以大豆為主的培養基，加上適當的無機㈣行 發酵。然後將所得的發酵液用於動物試驗’發現它果然能 錢地抑制腫魅長，而且無毒副作用，從那以 來’成千上㈣敍病人，包括晚職人，服職這種發 2〇酵液制成的口服液來治療癌症，這些癌症病人有得白^ ，、舌癌、_癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝 癌、黑素癌、聲癌、食道癌、膜腺癌等；口服液對大

83. 3. 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（2 ) 病人都有效果，如病情得以缓解、腫瘤縮小甚至完全消 失，不少病人至今還健康地活在人世間，這些病例包括中 國 '日本、韓國、美國和其他國家的病人。 到底發酵液中是哪個活性物質對殺傷癌細胞起關键作 5用呢？十年來，本人堅持不懈對發酵液進行研究，與此同 時，世界上也發表不少書刊、論文，試圖解釋這種發酵液 為什麼具有抗癌活性；這些文章大多認為這種發酵液的抗 癌活性是來自大豆培養基的一些大豆異黃酮，如大豆染料 木素(Gemstem)、大豆黃酮(Daidzem)、大豆皂素(Saponin) 10 等；然而，一些臨床實驗卻表明，大豆異黃酮的抗癌活性 還不如發酵液的效杲，本人從這種發酵液中分離出大量物 質，終於證實：發酵液的抗癌活性主要來自兩種支鐽脂肪 酸：13甲基十四烷酸和12甲基十四烷酸；進一步深入研 究又發現：其它的支鏈脂肪酸也有顯著的抑制腫瘤作周， 15到目前為止，尚未有人報導過特異支鏈脂肪酸有抗癌活 性。 圖不說明： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第1A圖：係說明用電子顯微鏡觀察人白血病細胞 K562未處理的癌細胞發生凋亡時的形態變化。 20 第1B圖：係和說明用電子顯微鏡觀察用13甲基十四 烷酸(60pg/ml)處理4小時後之人白血病細胞K562，發 生凋亡時的形態變化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4洗格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 1251024 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（3 ) 第2A圖·係説明用光學顯微鏡觀察未處理的人肝癌細 胞SNU-423發生凋亡時的形態變化。 第2B圖：係說明用光學顯微鏡觀察人肝癌細胞SNU-423用13甲基十四烷酸(6〇μ§/πι1)處理24小時後發生凋 5 亡時的形態變化。 第3Α圖：係說明探用Η&Ε染色，在光學顯微鏡下觀 察未處理的人胃癌細胞SNIJ-1發生凋亡時的形態變 化。 第3Β圖：係說明採用η&Ε染色，在光學顯微鏡下觀 :G 察用13甲基十四烷酸⑽㈣吨處理8小時後人胃癌細 胞SNU-1發生凋亡時的形態變化。 第4A圖：係說明採周H&E染色，在光學顯微鏡下觀 察未處理的人前列腺癌細胞DU-145發生凋亡時的形態 變化。 15 第4Β圖：係說明採用Η&Ε染色，在光學顯微鏡下觀 察用13甲基十四烷酸處理8小時後人前列腺 細胞DU-145發生)周亡時的形態變化。 第5Α圖：係流式細胞計對未處理的人白血病細胞 Κ562的分析結果。 20 第5Β圖：係流式細胞計對用13甲基十四烷酸(60μ§/πι1) 處理24小時後人白血病細胞Κ562的分析結果。 第6Α圖：係流式細胞計對未處理的人乳腺癌細胞 本纸張讀適用中國國家縣（CNS ) Μ祕（·χ297公幻 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1251024 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) MCF-7的分析結果。 第6B圖··係流式細胞計對用12甲基十四烷酸(6〇μ§/πύ) 處理4小時後之人乳腺癌細胞MCF-7的分析結果。 第圖係、流式細胞汁對用I2甲基十四燒酸(^Opg/nj) ' 處理24小時後之人乳腺癌細胞MCF-7的分析結果。 第7Α圖·係流式細胞計對正常人未處理的外周血淋巴 細胞(PBL)的分析結果。 第7Β圖：係流式細胞計對正常人用13甲基十四烷酸 (60pg/ml)處理24小時後的外周血淋巴細胞⑺gL)的分析 !〇 結果。 苐8A圖：係用TUNEL反應物加入未處理的snim癌 細胞甲’在螢光顯微鏡下撿測凋亡細胞。 第8B圖：係用丁反應物加入用13甲基十四烷酸 (6〇pg/ml)處理8小時後的SNU-1癌細胞中，在螢光顯 15 微鏡下檢測凋亡細胞。 第9八圖：係用POD和底物加入未處理的K562癌細胞 中’在光學顯微鏡下檢測凋亡細胞。 第9B圖：係用p〇d和底物加入用13甲基十四炫酸 (6〇Pg/ml)處理2小時後之K562癌細胞中，在光學顯微 20 鏡下撿測凋亡細胞。 第9C圖··係用POD和底物加入用13甲基十四烷酸 (6〇Ag/ml)處理4小時後之K562癌細胞中，在光學顯微 本紙張錢適财關家轉（⑽）α4·(⑽χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1251024 A7 B7 五、發明説明（5 ) ^ ^-- 鏡卜檢測调亡細胞。 第圖：係用POD和底物加入未處理的h廳癌細 胞中，在光學顯微鏡下撿測凋亡細胞。 第圖：係用P㈤和底物加入用13甲基十四鎌 3 (6〇μ§/ΐη1)處理8小時後的H1688癌細胞中，在光學顯 微鏡下檢測凋亡細胞。 系11Α ® ·係用p〇D和底物加入未處理的D·5癌 細胞中，在光學顯微鏡下檢測凋亡細胞。 弟11B圖：係用p〇D和底物加入用13甲基十四烷酸 10 (6〇‘Ug/mi)處理8小時後的DU145癌細胞中，在光學顯 微鏡下撿測凋亡細胞。 第12A圖：係用P〇D和底物加入未處理的正常人外周 血淋巴細胞中，在光學顯微鏡下檢測。 第12B圖：係用P〇D和底物加入用13甲基十四烷酸 15 (60吗處理8小時後的正常人外周血淋巴細胞中，在 光學顯微鏡下檢測，A:未處理，B:。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第13圖：係人白血病K562細胞經13甲基十四按酸 (60pg/ml)處理後發生凋亡的DNA斷裂凝膠電泳圖。 第14圖：係說明人肝癌細胞SNU-423經13甲基十四 20 烷酸(6(Vg/ml)處理發生凋亡時，Caspase靶蛋白Lamin B裂解。 焦15圖：係說明人白血病細胞K562經13甲基十四炼 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3. !〇,〇〇〇 1251024 A7 B7 五、發明説明（6 ) 10 15 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 20 酸(6〇pg/ml)處理發生凋亡時，Caspase祀蛋白Lamin B 裂解。 第16圖：係說明人肝癌細胞SNU_423經13甲基十四 規酸(60pg/mi)處理發生调亡時，Caspase乾蛋白Rb去 磷酸化並分解。 第17圖：係說明人白血病細胞K562經13甲基十四按 酸(60pg/ml)處理發生凋亡時，caspase祀蛋白处去磷 酸化並分解。 第18圖：係人前列腺癌Dm45裸鼠模型兩個實驗組和 .對照組的裸鼠腫瘤對比。 寿19圖：係人肝癌LCI-D35裸鼠模型的實驗組與對照 組裸鼠腫瘤對比。 特異支鏈脂肪酸的定義 本發明係與具有顯著抗癌活性的特異支鏈飽和與不飽 和脂肪酸，即末端甲基支鏈的異脂肪酸和前異脂肪酸有 關；本發明還包括這些支鏈脂肪酸的各種衍生物，只要其 末端含有甲基支鏈的異脂肪酸與前異脂肪酸部分，這些月旨 肪酸可以用分子式RoCOOH來表示，其中R〇是末端甲基 支鏈的異或前異的飽和或不飽和的脂肪根，所謂“末端甲 基支鏈異脂肪酸”和“末端甲基支鏈前異脂肪酸”，其分 子式R〇基團中離羧基C〇〇H最遠端分別可表達為： 、紙張 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) * 準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1〇,〇0〇 1251024 五、發明説明（7 )

iO 15 CH3 ch3— ch 或 (異脂肪_ CH, CH3—CH2〜CH_ (前異脂肪酸） 脂肪基團Ro中，去掉上述的末端甲基支鏈異或前異 基團的其餘部分沒有限制，例如：可以是直鏈，也可以是 又細：，可以是飽和，也可以是不飽和的。 甲基支鏈的飽和脂肪酸的實例：上述脂肪基團中去 掉末端甲基支鏈異或前異根團的其餘部分為罝鏈的實例可 表達為分子式(1): CH, CH—(CH2)n—C0〇H ⑴ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本X ) 訂 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 20 CH3(CH2)m’ 上式⑴中，m為〇或1，η為整數，η的大小沒有上限 或下限，只要它是脂肪酸，（n + m)可大到96或96以上， 最常見是46以下，特別是η為7〜16。 甲基支鏈的不飽和脂肪酸也可用上式來表達，但n至 少等於2，而且在(CH2)n基團中至少有一個cHrCH2團要 換成(CH二CH)基圑。 含X個碳甲基支鏈飽和脂肪酸的末端甲基支鏈異脂肪 本纸張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4洗格（21〇X297公釐） 83· 3· 10,000 1251024 A7 B7 五 _ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 發明説明（8) 酸分子式如上式，其中n=X-4，m二0，在本發明中表示為 “isoCX” ；例如，13甲基+四烷酸可表達為“iso-C15” ，分子式： 5 CH3 CH, 10 15 20

CH—(CH2)U—COOH 含X個碳的甲基支鏈飽和脂肪酸的末端甲基支鏈前異 脂肪酸分子式，為上述分子式中n=X-5，m=l，在本發明 中稱之為“anteiso—CX” ；例如12甲基十四烷酸可表達 為“anteiso-C15” ，其分子式： CH,

CH—(CH2)10—COOH ch3—ch2 在本發明中，末端甲基支鏈不飽和異脂肪酸的實例有： CH3 \ CH—(CH2)5—CH-CH—(CH2)6—COOH CH3 / 並可記作 iso-17:lco9c。 本發明還包括上述末端甲基支鏈的異脂肪酸和前異脂 肪酸的藥用鹽，它可通過與無機鹽反應而獲得，如與氫氧 -10- 本纸張又度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1251024 A7 __ B7 五、發明説明（9 ) 化鈉反應，它們都能抑制癌細胞生長；這種物質如 RoCOONa ’其碳的個數大於12 ;或R〇c〇〇K，其碳的個 數大於6，式中Ro如上定義，Na為納元素，κ為辨元 素。 5 村明還包括上述末端甲基支鏈的異脂㈣和前異脂 肪酸的藥用脂蛋白，它可通過與蛋白質結合獲得，包括多 肽和寡肽，它們都能抑制癌細胞的生長。 本發明還包括上述末端甲基支鏈的異脂肪酸和前異脂 肪酸的除脂蛋白外的各種藥用衍生物，如酰胺、酯類等， 1〇它可通過脂肪酸與相應的胺類、醇類等先導物反應獲得， 匕丨門都ΙμΦ币!j癌細胞生長，运種衍生物包括但不限制於分 子式為RoCO-A的化合物，其中Ro如前面所定義，八代 表下列基圑之一： 15 1) 2) (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 20 4)

L Γ \/ N ^ch3 < ch2ch3 -11 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明U〇) 5) 6)

Ο—C—R。1 δ) 9)

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 13) 〇 丄丨丨 \

ΗΝ——CH-f-C——NH——CH-f-COOH I τ I Τ

R R -12- 本纸張尺度適用中國國家標準1 CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（il) 上述分子式7)中的Ro7和Ro定義一樣，但可以是Ro， 也可以不是R〇 ;上述分子式13)中R是氨基酸的侧鏈，η 為〇或任何整數。 本發明還包括一些上述末端甲基支鏈的異脂肪酸和前 異脂肪酸，其分子式中有一個-CH2-基團的一個氫或兩個氫 元素被X基團所取代，X如α、I、Βι*、〇H或ΝΉ2，它們 都能抑制癌細胞生長，這種置換後的脂肪酸的分子式可寫 成RoCHXC〇〇H或R〇CX2C〇〇H，碳個數在8個以上， R〇定義如前，這種化合物如： 10 CHi

CH—(CH2)i0—CH—C〇〇H CH3

Cl 15 和

Cl CH, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 20 CH,

CH—(CH2)i〇—CH—COOH

Cl 本發明還包括上述置換脂肪酸的藥用鹽、脂蛋白和其它 13 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 83.3. 10,000 A7

-發明，除非特別指 1251024 發明説明（L2) 衍生物。 本發明的末端甲基支鏈異脂肪酸和前異脂肪酸，可_ =關特=魅賴發_麵鋪中分 侍现用化學万法合成而得，或從天然材料中提取而得。 5、在對本發明作以上的概括介紹後，以下將舉—些實例 供深入理解，這些實例只是為了描述本1 明，否則它不限制本發明的範圍。 一.特異支鏈脂肪酸的抗癌活性與安全性的實驗論證 實例1，體外抗癌活性實驗 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本貢) 10 樣

口 P 兩種 甲基十四烷酸(1S〇C15)，包括天然提取與人工合成的 订 15 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 20 提取的1S〇C15是用高性能液相層析(HpLC)從發酵液 中分離出來，發酵液是用寡養單胞嗜麥芽 則肌s 菌株 Q-can 特異菌種，以及 本發明的培養基與生產方法發酵而得。 合成的 iso-C15 是由 Sigma Chemical 公司（St. Louis M〇，USA)購得。 其它的特異支鏈脂肪酸包括： 10甲基十一烷酸 （1S0-C12) 11甲基十二烷酸 CisoC13) 12甲基十三烷酸 （1S〇-C14) -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^格（210X297公釐） 83. 3. 10,00° 1251024 A7 B7 發明説明（i3) 11甲基十三烷酸 12甲基十四烷酸 14甲基十五烷酸 13甲基十五烷酸 15甲基十六按酸 16甲基十七烷酸 15甲基十七烷酸 17甲基十八烷酸 18甲基十九烷酸 (anteiso-C14) (anteiso-C15) (iso-Cl 6) (anteiso-C16) (iso-C17) (iso - C18) (anteiso-C18) (iso - C19) 15 經濟部中夬榡準局員工消費合作社印製 20 (iso-C20) 以上樣品均由Sigma Chemical公司購得。 人白血病細胞系K562和人胃癌細胞系SGC7901。 丨-、ϊ 以ΜΊΤ試驗檢測細胞毒活性，Κ562和SGC7901細胞培 養於添加了丨5%加熱滅活胎牛血清的处隨164()培養液， 選用指數生長期細胞，在％孔微量培養板中每孔加入細胞 的密度為2 X 104/100μ1，在每一實驗孔加入含不 电^ 口口的培養基，使加ls〇_C15 (包括人工合成和天然提 二 品）實驗孔的終濃度為五個梯度(7.5，15，％ 的樣 ^ U ? 60 9〇‘ug/mi),其它樣品的終濃度為，6個气照 含樣品的培養基，培養板置二氧化碳培養箱加不 5%C〇2、飽和濕度培養24小時，用快翻法除去上、 -15 適用中國國家橾準（CNS ) A4祕（210X297公慶

f請先閎讀背面之注意事^再填寫本頁j -------^ 訂— 4 1251024 A7 _B7_ 五、發明説明（14) 在每個孔中加20μ1的50mg/ml的MTT溶液，再培養4小 時，每孔加lOC^g/ml的DMSO，振盪培養板1〇分鐘，於 酶聯免疫檢測儀(BmTek EL 311S型)570nm測吸光度α57〇 : 抑制半(％)=1—(實驗孔平均A57Q值/對照孔平均A57Q值） 5 結果 录2天然提取的iso-C15對癌細胞生長的抑制率(％) 細跑 90‘ug/ml οΟμ^πιΙ 3〇‘ug/mJ 15μ^ιη1 1 7.5ug/ml Κ562 87.2 83.7 72.2 51.2 27.1 SGC7901 68.8 62.1 51.2 28.1 一 *樣品用10%乙醇溶解 表1人工合成的1SO-C15"對癌細胞生長的抑制率(％) 細胞 90μ^ιη1 όΟμ^ιηΙ 30μ^Γ〇1 15μ^πι1 7.5μ^ιη1 Κ562 85.3 83.1 71.6 50.1 26.2 SGC7901 木士兰口 m 1 π( 68.4 63.1 50.5 27.5 — *樣品用丨〇 %乙醉溶解 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 录3.幾種特異支鏈脂肪酸對Κ562細胞生長的抑制率(％) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4^. a 像口口 iso-C12 iso-Cl 3 iso-C14 iso-C16 iso-C17 iso-Cl 8 抑制率％ 70.69 71.03 72.15 71.58 70,79 68.39 樣品 is〇C19 iso-C20 anteiso- anteiso- anteiso anteiso- C15 C14 C16 C18 -16- 83. 3. 10,000 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1251024 ------五、發明説明（15 ) 62.58 A7 73.10 72.59 70.68— 71.73 10 特異支鏈脂肪酸的濃度為SO.ug/mi，用NaOH溶解，終溶 液 pH二7.5 實例2，ED5〇、1〇75和①如的測定 天然提取的十三甲基十四烷酸(1S0_C15)系從用特異菌株 养赍早胞嗜麥牙(你⑽咖⑽⑽仍則/邮脑a)Q_Can菌種及 本專利方法生產的發酵液中，用高性能液相層析(HpLC)分 禮巧，樣品溶解於Na〇H和0.5%吐溫80(Sigma Chemica! 公司，St.Louis，M〇，USA)，pH=7.5。 ΜΜΆ K562人白血病細胞；MCF-7人乳腺癌細胞；SNU-I人 胃癌細胞；DU145人前列腺癌細胞；SNIj_423人肝癌細 跑；HCT116人直腸癌細胞；H1688人肺癌細胞；pBL人 的外周血正常淋巴細胞。 七種癌細胞均由美國典型物培養和保藏中心(ATCC， Manassas ’ VG，USA)購得；人的正常細胞PB]L是從健康 人的全血中分離出來。 癌細胞按ATCC要求進行培養： K562人白血病細胞和SNU4人胃癌細胞懸浮培養在 RPMI1640培養基中，添加熱滅活的胎牛血凊。 17- ——1-----眷---1---、訂------Φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 20 本纸浪尺度適用中國國家棣準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） 83. 3. 10,000 1251024 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 .B7 五、發明説明（16 ) '一~—-- 一膨7人乳腺癌細胞和則45人前列腺癌細胞貼壁 培贵在MEM培養基中，添加1〇%熱滅活的胎牛血清。 SNU-423人·_和H人肺餘職壁培養在 RPMI1640培養基中，添加1〇%熱滅活的胎牛血清。〇 < 5 HCT116人直知癌細胞貼壁培養在Mcc〇y，s &培夢甘 中，添加10%熱滅活的胎牛血清。 人的PBL細胞保存在RPMI1640培養基中，添加同〜 個人的10%ii漿。 方法_ 10 所有貼壁細胞以5X104/孔密度加到96孔培養扳上， 並立即加1S〇C15處理，周培養基稀釋母液使終濃度為七 _ 台 F皆(〇，1.5，3.0，6.0，15.0，30.0，όΟ.Ομθπχΐ)，啊照 孔一組是未處理，另一組加溶劑(Na〇H和吐溫80)處埋·、 處理後的細胞在37°C培養48小時，然後除去上凊液，將 15早層細胞消化成含EDTA-胰蛋白酶的均勻細胞懸浮液，〜 用台盼蘭排除法測定存活率。 得 懸浮生長的細胞(PBL、K562和SNU-1)加入96孔长^ 板上，K562和SNU-1密度為5X 104/孔，PBL為w :

Λ I〇V 孔。加入1S〇-C15，用培養基稀釋母液，使終濃度為七侗A 20 階(〇，1.5，3.0，6·0，15.0，30.0，60.0pg/ml)，對照孔 組是未處理，另一組加溶劑(NaOH和吐溫80)，在3yc扭 養48小時後，直接從孔中取出細胞計算存活率。 d -18- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210父29<7公釐) 83.3.1〇,〇0〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁，>

1251024 五、發明説明（17) 每-種細麵id5。、ID75和叫是通過每—組實驗重 復兩次求得，每一次實驗要在相同條件下重復二产· 1〇5〇、ID75和1〇9〇定義為殺死50%、75%和90%細胞(與未 處理的對照組細胞對比)所需要的iS(>C15濃度，用根据周 5氏父子卩r.T.C.Ch0U)中效定理編制的專用軟體 CalcuSyn(Biosoft，Cambridge，UK)進行計算。結果 通過測定幾種人的血液細胞和實體瘤細胞系的瓜冗、 ID75和ID9〇(pg/ml或μΜ)來定量表達iso_ci5的細胞毒、舌 :0 1*生，由表4看出，1S〇-C15對所研究的各種癌細胞系均有活性。 其中對人的乳腺癌MCF-7細胞和對人的白血病Κ562 細胞作用最強，而對人肺癌細胞H1688和人的直腸癌細胞 HCT116作用較弱些，但是在遠遠超過癌細胞致死的劑| 15 下，仍對人的正常淋巴細胞沒有毒性。 表4 iso-C15對人的癌細胞和正常細胞體外殺傷劑量 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

MCF-7 人乳藤ϊ〇.03± 0.9715.99± 1.28~~2549ΓΓόδ~ K562 人白血病癌 11.45± 1.82 22.27± 4.60 43.57± 6.71 -19 本紙張尺及:適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210XM7公嫠） 83. 3. !〇,〇〇〇 1251024 A7 ------ B7 五、發明説明（18 ) DU145人前列腺癌 13.98± 2.15 40.43± 5.72 81·87± 8.85 H1688人肺癌細胞 15.08± 1.92 35.03± 3.59 61·37± 8.06 HCT116人直腸癌 18.49± 6.23 67.96± 8.25 108.65± 13.35 SNU-1人胃癌 20.77± 2.47 47.43± 4.95 80.49± 10.03 SNU423人肝癌 24.26± 3.98 70.46± 9·36 120.77± 15.82 PBL人正常淋巴細 >400 胞 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例3 ’體外誘導人癌細胞凋亡及其分子路徑的驗證實驗 試劑 RPMn640 ’ DMEM和McCoy培養基以及胎牛血清和 -小丁皿滑’均由 Life Technologies (Long Island，New York ’ USA)購得，DNA凝膠電泳實驗所用瑗脂糖由FMC 公司fe侍’蛋白質印跡實驗所用丙稀酰胺由Bi〇-Rad公司 購传’ 於人的蛋白 c-myc，caspase3，caspase 8， PARP ’ Lamms ’ p53和Rb的抗體由Oncogene公司購得， 10 缓衝液所用樂品及其它試劑均由Sigma公司購得。 細胞培養 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 人的癌細胞系·· DU145(前列腺癌）、K562(白血病）、 HCT116(直腸癌）、Η1688(肺癌）、SUN423(肝癌）、 MCF7(乳腺癌）' CRL-1687(胰腺癌）、SUN-1(胃癌），均由 15 美國典型物培養與保藏中心(ATCC)購得；30ml血探自一 -20- 83. 3. 10,000 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 1251024 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（i9) 個健康人，並用Fic〇U分離液(Sigma公司)分離出正常的人 外周血單核細胞，所有細胞都培養在、DMENi 或McCoy培養基中，並添加10%胎牛血凊、1〇〇mg/ml鏈 霉系和100ii/ml青霉京，正常人的外周血單核細胞、K562 5 和SUN-1疋每每細胞’經過1 ’ 500轉/分旋轉5分镇後去 除上清液，再將細胞懸浮擴展在新鮮的培養基中，其它的 癌細胞是貼壁細胞，用0.05%胰蛋白酶 Sc^ntific公司，CA，USA)消化後擴展，將細胞植入丁75 培養瓶中(2Χ106/瓶），培養基中添加1〇。/。胎牛血凊，在37 10 °C和5% C〇2培養24小時，用1%的ls〇—C15、或碰叫〇_ ' C15、或對照溶劑處理1、2、4、8、24小時後，用收集細 胞的到棒Scientific公司）將貼壁細胞剝離下來，並與 飄浮的細胞混合，然後分別根據不同試驗的要求處理細 胞，供流式細胞計分析、原位細胞死亡檢測、斷裂電 15泳、蛋白黃印跡k等武驗，沉激細胞用丨S0_C15或對照溶 劑處理2小時和4小時，再保存在-7(rc下準備後面作基因 調節實驗用。 方法 特異支鍵脂肪酸引起癌細胞)周亡由四種方法證實：1) 20形態學，觀察代表凋亡典型特徵的形態變化；2)流式細胞 計量，識別正在凋亡的細胞，區分凋亡與壞死細胞；3)原 位細胞死亡檢測s式劑盒POD ’在單個細胞水平上，檢測调 -21 - 本紙張尺度適用中國國家揉CNS ) A4規格（210X297公釐）^ ' 〜-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1251024 A7 B7 五 、發明説明（20) 10 15 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 20 亡引起的DNA斷裂；4)凝膠電泳試驗，觀察凋亡細胞的 DNA斷裂。 特異支鏈脂肪酸引起凋亡的分子機理，是用蛋白質印 跡分析來研究。 流式細胞計量實驗採用流式細胞計FACScan和分析吉欠 體 Consort 30，（Becton Dickinson，San Jose，CA)，並用自 行死亡試劑盒(aP〇pt〇S1S detect· kit，R&D Systems)定量測 疋正仕自行死亡的細胞數，因為正在自行死亡的細胞能與 Annexm V相結合而排斥pi，實驗的細胞用冷卻的啦洗 兩遍後再㈣故合it麵巾，㈣將㈣螢光標記的 Annexm V和PI加到細胞中，加染料的細胞立即送流式細 胞計分析，織霞鮮出側邮轉賴光，由信號檢 溯器FU和FL2分別接受染料Annexe V和PI所發出的信 號:於是，在⑴肌2 _上將會出現三類細胞：活細胞-_染料均染不上(3區）；壞死_及自行死亡後期細胞— 兩種染料均染上(2區）；正棚亡的編—只染上細_ \’(4 區）。 本實驗採用原位細胞死亡檢測試劑盒P0D (Mannhe皿 Boehrmger GmbH)來探測單個的调亡細胞，其原理是基 於：細胞调亡時，基因組DNA _裂會產生雙鍵小分子 量的DNA服，以及有單鏈斷點的大分子量dna，酶促 反應中用改造的·酸標記3’- 0H自由端，從而可以識別 -22· 本纸張变適用宁國國豕標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 83.3. 10,000 —---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1251024 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2i) 這些鏈的斷點；這種試劑盒是用螢光dUTp，通過末端氧 核百酸轉移酶（丁(ΓΓ)來標記基因組DNA的自由3，-〇H 末端’結合上的螢光基團可以直接在螢光顯微鏡下觀察； 此外’螢光也可與抗螢光抗體加POD相結合，通過底物反 5應檢7則’被染色的細胞可直接用光學顯微鏡分析。 凝膠電泳實驗用於檢測凋亡特異的細胞核小體間DNA 降解’癌細胞沉澱後，用isoC15和對照溶劑處理，在lml 低滲裂解液中裂解，（l〇mM Tns，pH 7.5 ; ImM EDTA ; 〇.2% Tntonx]00)，在 4°C 下以 14，000 轉/分離心 20 分 10鐘’然後將上凊液倒在新的試管中，分别用RNA酶和蛋 白酶K處理；用苯酚/氯仿萃取上清液兩次，用乙醇沉澱斷 裂的DNA ’在1倍TAE缓衝液的1.5%瓊脂糖凝膠中對樣 品進行m泳’凝膠用溴化乙錠染色，用蒸餾水脫色，然後 在紫外光下觀察DNA片段。 15 蛋白質印跡分析法，將丨SO-C15或溶劑處理過的各種細 胞沉澱收集起來，在15〇μ1裂解緩衝液（0.5% NP-40， 〇·5%脫氧腺苷酸及ImM PMSF)中進行分解，細胞的裂解 液與等體積的2倍Laemmli緩衝液混合，加熱沸騰5分鐘 後加到凝膠孔中，蛋白質用8%SDS-PAGE凝膠分離，轉 2〇移到硝酸纖維素膜上，濾膜用含5%脫脂奶粉的PBS-T緩 衝液C磷酸缓衝液配0.1%吐溫80)阻斷丨小時，然後再 用適當稀釋在含2%脫脂奶粉PBS-Τ緩衝液中的一級抗體 -23- 本纸浪尺度適用中國國家棣準（CNS ) Α4说格（210Χ29?公着） 83. 3.10,000 ----------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1251024 A7 __—_B7 五、發明説明（22) ~ 培養1小時，這些膜用PBS-丁洗6次，每次5分鐘，再用 稀釋1:800.0含2%脫脂奶粉的PBS_T缓衝液中的二級抗體 _培養1小時，用PBS-T洗6次後，免疫綜合體可以用 ECL非同仅系檢測系統在底片上顯影，經一級抗體撿測 5 後，濾膜用 O.lmM TTns ρΗ7·5 和 〇.〇5mM β-metacapenanol 在下處理30分鐘，這些膜在用含5%脫脂奶粉的 PBS-T缓衝液阻斷之前，要用3〇〇nilpBS_T缓衝液洗兩 次，每次1〇分鐘，然後再用單克隆的老鼠抗人體肌動蛋白 檢測每個孔的上樣量是否一致。 10 Ί愚 1、形態變化 清細胞凋亡時的形態學特徵是：細胞鈹縮、染色質凝 聚、細胞核斷裂、細胞膜完整、細胞膜上大量形成皰狀、 並出現凋亡小體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 (請先閲讀背面之注意事¾再填寫本頁〕 15 帛1圖是電子顯微鏡下難賴正在)壯的白血病細 胞K562的形態變化，與未處理的芫好的細胞（第ία圖） •相比，可以看到經1S〇C15 UOng/mi)處理4小時後的細 胞（第1B圖）表現了典型的凋亡特徵：如染色質凝聚、 在核膜邊緣形成塊狀、細胞膜完好、細胞皺縮等。 2〇第2圖至第4圖是光學顯微鏡下觀察到的癌細胞在调亡 時的形態改變，人肝癌細胞經ante1S0-Cl5(6(Wml)處理24 小時後（第2B圖），與未處理的細胞相對照(第2八圖）， -24- 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251024 A7 B7 五、發明説明（23) 10 15 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 20 呈現細胞皺縮而體積變小，細胞内出現跑狀；人胃癌細胞 SNTJ-1 經 anteiso-C15(60pg/ml)處理 8 小時後，通過 H&E 染色來觀察其形態變化（第3B圖），與未處理的對照組 (第3A圖）相比，可以看到染色質凝聚，細胞質呈顆粒 狀；人前列腺癌細胞DU-145用isoCl5(6(Vg/ml)處理8小 時後，通過H&E染色來觀察其形態變化（第4B圖），與 未處理的對照組（第4A圖）相比，看到細胞膜上起泡。 2、流式細胞計量 至少分析了 1〇4個細胞事件，從未處理的人白血病細胞 KS62的FL1/FL2圖形(第5A圖)看到，細胞主要分布在3 區，KS62細胞經ls〇Cl5處理24小時後(第5B i)，大部 分的細胞止在调亡、（即4區，Annexin V陽性，pi陰 性）；anteisoC15對人乳腺癌細胞MCF-7作用的動態過 程，可由第6A、6B和6C圖看出，它們分別對應於MCF_ 7細胞經anteiso-Cl5(6〇pg/mi)處理0小時，4小時和24小 時；經anteiso-C15處理4小時後，許多細胞已進入凋亡 (4區’第6B圖）’而經過24小時後，大部分細胞都已 死亡（凋亡的後期，2區，第6C圖）；未處理的正常人外 周血淋巴細胞的流式細胞圖（第7A圖），與許is〇 Cl5(60pg/ml)處理24小時的結果(第％圖)對比，看出它們 的FL/FL2圖形幾乎相同（都在3區，即活細跑，未發生凋 亡），說明is〇-C15對正常人的淋巴細胞沒有明顯作用。 25- 本纸張只：^適用中國國家梂準（〇奶）八4%格（210/297公釐） 83.3. 10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1251024 A7 ----—-— _B7^_ 發明説明（2奏） ' "— - 0、原位細胞死亡檢測 四種人癌細胞：人白血病細胞K562，人胃癌細胞 SN^，人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞H1688，以及 正常人的外周血淋巴細胞均經過驗Cl5(6〇]Lig/ml)處理。 5 細胞用1S(>C15處理8小時後，加入TUNEL反 應擒’在37C下±緖6G分鐘，用磷_衝鹽水沖洗三遍 後，直接用螢光顯微鏡就能分析細胞的形態；與未處理的 細胞（第8A圖）相比較，處理s小時的細胞中可以看出 凋亡細胞發出的黃色螢光斑點（第8B圖）。 “ 人油胞H1688、K〕62、DU145和人的正常外周ii淋 巴細胞均加入POD，在37。(：下培養30分鐘，用_酸緩衝 鹽水沖洗三遍後，再與底物AEC反應，在室溫下培養1〇 分鐘，然後在光學顯微鏡下分析細胞變化，對比未處理的 白血病K562細胞（第9A圖）和處理2小時與4小時的細 15胞（第9B和9C圖），可以看到處理2小時後的細胞開始 發生凋亡（染上紅色），隨著處理時間增加，凋亡的細胞 個數增多，和未處理的人癌細胞H1688相比（第丨0A 圖），可以看出處理8小時後（第圖）癌細胞已經调 亡（染紅色），癌細胞DU145處理8小時後，有些已經凋 2〇 T：而染色（第11B圖），但在未處理的對照組中細胞不染 色（第11A圖）；但是，人的外周血淋巴細胞處理8小時 後與未處理的幾乎相同（第12A和12B圖），只有幾個細 •26- 本纸張尺>变適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝·

、1T 83. 3. 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（25) 10 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 20 胞调亡而染色’以上結果證明，1sq_c15能弓丨起癌細胞调 亡，但對正常人的細胞則不起作用。 4、 DNA斷裂的凝膠電泳 DNA斷裂的凝膠電泳是表現細胞凋亡變化最常用的/ 種方法’第13圖給出人白血病細胞K562用-<315(60μθηιΙ)處理伎的電泳結果，用對照溶劑處理$小時 的泳道’只有DNA條帶；經1S0_ci5處理2小時的泳道， 可看到小分子量的斷裂DNA條帶；而處理8小時泳道的 條帶則更明顯；上述處理過的細胞出現寡核小體階梯，# 明1SO-C15引起癌細胞凋亡，使雙鏈DNA斷裂。 5、 蛋白質印跡分析 第14圖一第17圖的蛋白質印跡分析結杲，是用於說 明特異支鏈脂肪酸激活癌細胞凋亡的信號傳遞路徑。 第14圖和第15圖分別表示人肝癌細胞SNU-423和人 白血病細胞K562凋亡時，Caspase的一種靶蛋白Lamm B 發生裂解，癌細胞分別用對照溶劑和1S0-C15處理，時間 長短已分別標在圖上，細胞裂解物用SDS-PAGE分離， Lamm B用單克隆抗體通過免疫印跡法檢測；在第14圖可 看到45KDa和32KDa的裂解產物，在第15圖可看到 MKJDa的裂解產物，Caspase靶蛋白LammB的裂解，證明 細胞凋亡時Caspase級聯被激活了；第16圖和第17圖分 別表示SNU-423和K562癌細胞RB蛋白的蛋白質印跡分 -27- ^尺度適用中國國家榡隼（CNS ) A4· ( 210X297公策） 83. 3. 10,000 广请先0讀背希Μ泣意事項I填寫冬貢〉 1251024 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 _ 五、發明説明（26) 析結果，它說明is〇_C15使高磷酸化的RB蛋白 (pRB120/hyper)變成低磷酸化的形式（PRB115/hypo)， 在第16圖和第17圖看到全長RB裂解為pRB68KDa片 段，在第16圖還看到更小的pRB48KDa片段。 5 實例4.體内抗癌活性實驗 1、測定半數致死劑量ld50 材料與方法 13甲基十四按酸(iso-C15)由Sigma公司(St.Louis，M〇， USA)購得，將它溶解於NaOH和0.35%吐溫80，pH二7.5。 :〇 ICR小鼠雌雄各半，體重為20.5-22.5g，實驗組每E1分 三次口^^so.C15，對照組服相同劑量的溶劑，每一個劑量 組含2隻小鼠，劑量從1〇到SOOmg/kg，（10mg/kg、 20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg、800mg/kg)，每 天觀察小鼠的生理狀態，共實驗七天。 15 結果 小鼠連續七天服用iso-C15，劑量高達800mg/kg亦未見 小鼠死亡，說明iso-C15基本無毒，沒有求出半數致死劑 量 LD50 〇 2、用人前列腺癌DU145的原位裸鼠模型進行的iso-20 c15藥效實驗 材料與方法 isoC15是在本人的實驗室裡，按實例5所介紹的方法 -28- 標準(CNS ) χ 29兩 81 3.10,000 ： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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A7 B7 10 15 經 濟 部 中 夬 標 準 員 工 消 t 合 作 社 印 製 20 ^ (27) 化學合成，純度99.8%，將它溶解於施册溶液和〇观 吐塭 80，pHH7·5。 24隻4〜5周齡的BALA/C雜垆穿^ , 雄?不鼠，餒鸯在無特定病 原體環境中。 、將人前列腺癌而Η5的腫瘤組織，用手術從皮下植入 裸鼠腋下，在靡對數生長期取出腫瘤，用於原位移植， 取下腫瘤的周邊組織，切成約1_3的小碎塊。 將裸鼠麻醉，沿下腹部中央切一小口，露出膀脫和前 列腺，打開前列腺並植入三| DU145腫瘤碎塊，用8·〇針 法將前列腺囊缝合，再用6-〇針法缝合腹部。 手術後第一天，將原位移植DU145的裸鼠隨機分成— 個對照組和兩個實驗組，每組8隻搮鼠，對照組每天一次 灌餵生理鹽水，實驗組每天灌餵一次上述製備的ls〇_Cl5， 低劑量組與高劑量組分別為35mg/kg和7〇mg/kg的ls〇一 C15，共給藥43天。 在實驗後第44天，用吸入c〇2方法處死所有裸鼠， 記錄其瘤重和體重，用蘇木精和曙紅對腫瘤組織標本染 色，供顯微鏡檢查。 瘤重抑制率(ΤΠΙ)反映實驗組平均瘤重汀)和對照組平 均瘤重(C)之差，表達為(C-T)/C(%)，並用檢驗分析其統 計學顯著性。 結果 -29· --------— I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Φ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 83. 3. !0,〇〇〇 1251024 五 發明説明（28) 在人前列腺癌DU145原位移植裸鼠模型f驗中，當 iso-C15継為35mg/kg和7Gmg/kg時’顯示健的抑癌效 果，如表5所示，瘤重抑制率分別達54 8%(?<〇〇5)和 84.6%(ρ<〇·〇1)。 表5 1S〇-C15對人前列腺癌DU145裸鼠模型的作用

第圖對比實驗组與對照組的祿鼠腫瘤大小；應當注 意的是’高劑量组中有4隻裸鼠移植的腫瘤沒有生^ 來’從體重曲線和組織切片檢驗均未發現 毒性。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

、1T 10 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 15 :、用人肝腺癌LCI-D35的原位裸鼠模型進行的⑼ C15藥效實驗 工sow是在本人的f驗室裡，按f例5所介紹的方法 化學合成，純度99.8%。將它溶解於Na〇H溶液和〇35% 吐溫 80，pH=7.5。10隻4〜5周龄的BALA/C雌、雄裸鼠，餵養在無特 83. 3. 10,000 30- 1251024 A7 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明 定病原體環境中。 人肝癌LCI-D35原取自一個45歲女性病人的腫瘤， 將其組織用手術從皮下植入裸鼠腋下，至腫瘤對敷生長期 取出腫瘤，用於原位移植，取下腫瘤的周邊組織 ^ 5. 1皿η3的小碎塊。 以 將裸鼠麻醉，沿上腹部中央切一小口，露出左半葉肝 臟，在其表現切一小口，用84針法將2塊腫瘤碎片缝在 切η上，最後再用6_〇針法縫合腹部。 w亍術後第二天，練位移植LCI-D35的裸鼠隨機分成 Μ照砠和實驗組，每組8隻裸鼠；對照組每天—次灌^ 理η水，實驗組每天灌緩—次1S0_C15，劑量為， 共給藥40天。 I實驗後第41 *，用吸入C〇2方法處死所有提鼠， 並記錄其瘤重和體重，用蘇木精和曙紅射賸瘤組纖 色，供顯微鏡檢查。 ·$ ^ :瘤重抑制率(TIR)反映實驗組平均瘤重(τ)和對照組平 均瘤重(C)之差，表達離T)/c(%)，並用喵驗分^ 計學顯著性。 共4 在人肝癌LCI-D35原位移植裸鼠模型實驗 Ρίς # 曰 、风丫，画 ISO- 劑1為70mg/kg時顯示很強的抑癌效果， 示，瘤重抑制率達64.9%(p<0.01)。 4 6所 10 15 20 83. 3. !0,〇〇〇 -------、叮------AW (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 31 - 1251024 A7 B7 五、發明説明（30) 表6 1S〇-C15對人肝癌LCI-D35裸鼠模型的作用 組別 劑量 給藥 鼠數 始/末 體重 始/末 瘤重 x± SD(g) TIR (%) P 對照組 口服 8/8 17.31/21.50 0.202± 0.117 iso-C15 70mg/kg 口服 8/8 18.23/21.75 0.071± 0.052 64.9 0.0086 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第19圖對比實驗組與對照組的裸鼠腫瘤大小，應當注 意的是：貫驗組中有2隻裸鼠移植的腫痛沒有生長起來， 5 從體重曲線和組織切片檢驗均未發現1SO-C15有任何毒 性'° 4、iso-CIS安全性人體臨床實驗 材料與方法 化學合成(純度99.8%)的iso-C15裝成0.20g的膠囊，6 10 名健康的成年志願者(4男，2女)平均年齡35.6歲，分成三 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 組，口服isoC15膠囊30天，低劑量組：一例，日服 〇.6g ;中劑量組：兩例，日服1.2g ;高劑量組：三例，日 服 1.8g。 實驗前、實驗中和實驗後分別進行檢查，包括健康體 15 檢、血常規和尿常規化驗、心、肝、腎功能檢查、肺部X 光透射，以及自覺症狀。 -32- 83.3. 10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251024 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

項目 WBC "gran" ~~RBC^ HB PLT 項目 發明説明（3U 結果士明表,7糾1S°_Q5對㈣規觸，彡，它 -明.白血球(WBC)和粒細胞(G細)數 ，口果匕胞卿）、梅拳腾娜取=差^ ㈣能(额觀6_^)柯魏(血尿^ #)均未發現異常，見表8，心電圖(EKG)和胸透均未見 異常’尿常規亦未見異常。 表7 iS0-C15對血常規和血小板影響 例數 6 6 實驗前

X土 SD 實驗後

P

S.80- 0.95 Xl〇9/L 3.20± 0.59 X l〇s 4.64±0.40 xi〇12/l

122.00± 10.40 g/L 203.0± 331^1^ .8〇± 〇，89 —Ο03ΪΤ 4.62± 0.69 128.00± 16.90 232.0± 52.1 ~〇Ό809~ 表8 iso-Cl5對肝功和腎功影響 ALT BUN 例數 X土 SD -'""""--- P — 實驗前 實 6 15.17± 8.70 u/L 15.00± 10.33 0.4398 6 6.69± 2.14 mmol/L 6.47± 1.72 〇.2850~^ ........ ——~~--- -33- --~-- i適用中CNS) A4麟;_( ^&^公董） 83· 3. !〇,〇〇〇 it 蠡 1251024 A7 B7 五、發明説明（32) :〇 15 經濟部中央榇準局員工消費合作社印製 實驗證明：口服1S〇-C15安全性範圍較大，每天服用 〇.6-1.8g達一個月未見毒副作用；另外，白血球和粒細胞 數增加，說明:iSO-C15具有提高免疫功能的作用。 iso-C15的服用劑型包括液態、粉劑、片劑、膠囊、針 劑、或用脂質體包裹；可以通過消化道輸送，也可直接送 入血液。 5、ls〇-ci5對dmba(7，η —二甲苯蔥)引起白鼠乳腺癌 的藥物預防作用 材料與方洼 isoC15溶解於Na〇H)容液和0.35。/。吐溫80 , ρΗ=7.5。 5〇隻雌性Sprague-Dawley白鼠用實驗室飼料餵養，長 到50天時由胃管灌入5mg的DMBA(Slgma化學公司， St丄oms，M〇，USA)，月艮用DMBA七天後，將白鼠隨機 分成2組各25隻；對照組每周灌餵5次〇.5ml的0.35。/。吐 溫80 ’實驗組每周灌锻5次0.5ml濃度0.7%的iS(>ci5溶 液，飼料和水隨意取用；服用DMBA後20周，將所有白 鼠處死，切除所有可能摸到的腫瘤。 結果 20 組別 例數 長瘤鼠 發癌率 瘤數 每隻瘤數 長秀 數 平 -34- 、纸張^度適用中國國家榡準（CNS ) A4说格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 —^^裝-- 項再填寫本頁)

、1T 平均瘤重(g) 83.3. 10,000 1251024 五、發明説明（33) A7 B7 均每隻瘤 數 對照組 25 21 84% 52 2·1土 1.7 2.5± 2.4 2.4土 5.8 Iso-C15 25 3 12% 4 〇.2± 0.1 1.3土 0.5 0.8± -->—, 1.3 10

經濟部中央標準局員工消費合作社印I 15 衣9的結果表明’ 1S0_C15顯著減小乳腺癌的發病率， 匕對於所實驗的乳腺癌有預防致癌作用；雖然它不能完全 阻止腫瘤發生，但使腫瘤生長缓慢。 6 ' 1S〇-C15對於紫外線B(UVB)引起皮膚癌的藥物預防 作用。 返iL與方法 isoCb溶解於Na〇H溶液和0.8%吐溫80，ρΗ=7·5， iso-Cl5的終濃度為1〇。/〇。 4〇隻雌性沒有毛的SKHq小鼠隨機分成對照組和實驗 組’每組20隻，每隻老鼠均用5.12pgDMBA溶於2〇Ομ1两 酮的藥液外敷一次，引發皮膚癌；一周後(第8天），實驗 組老鼠開始每隻每天塗2〇〇μΐ的ls〇-C15溶液，對照組每隻 母天塗200μ1吐溫，並於塗藥3〇分鐘後用紫外線b(即 290〜320mn)照射，劑量為(i8〇mJ/cm2/天)以連到紫外線Β 輻射促使腫瘤生長，從開始紫外線B照射起30周內，每 -35- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張认賴t ® 縣（ δ3. 3. !〇,〇〇〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1251024 A7 ______B7 五、發明説明（34) 周敷用1S〇-C15或溶麵次，30周後檢查小鼠的皮膚癌發 展。 結果 實驗結果表明，1S0-C15在皮膚癌誘發階段能起預防作 5 .用，在實驗結束時看到，1S〇Cl5處理過的實驗組小鼠皮膚 癌發病率降低40% ’·而且與對照組相比，實驗組發病鼠的 腫瘤大小亦減小90%。 二·特異支鏈脂肪酸的生產方法 本7X明揭示了具有抗癌活性的特異支鏈脂肪酸的生產 10 方法。 本会明的特異支鏈脂肪酸可以從天然資源中提取，包 括但不隈於從富含特異支鏈脂肪酸的有機體中提取，如動 物脂肪或綠色植物的葉綠醇。 本發明的特異支鏈脂肪酸還可以用化學或生物方法合 I5成，支鍵脂肪賴科爾比(Kolbe)電解合成技術是眾所周知 $ ’下面以1SOC15的電解合成為例說明；本發明崎異 又鏈脂肪酸生物合成方法，是利用細胞脂肪中富含特異支 键脂肪酸的特異菌株發酵或培養，下面舉例說明^含^ 支鏈脂肪酸並具有抗癌作用的發酵液的生產方法。 〃 20 實例5，13甲基十四烷酸的電解合成的方法 I3甲基十四燒酸(跡⑽可才艮據科爾比電解反應原 理，用異戊酸和十二燒酸單甲醋’在甲醇溶液中通過電解 -36- 本紙張纽適用中國國家^__ 83. 3. !0,〇〇〇 >1· aMMmw ml i ϋϋ ml m· mu ϋϋ «.1 —nil am mu TJ ml mu ϋϋ In ml (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1251024 A7 B7 五、發明説明（35) 合成。 10 經濟部中央襟準局員工消費合作社印製 20 十二烷二酸二甲酯是通過含5%(W/V)濃硫酸的5倍量 (V/W)甲醇，將十二烷二酸酯化來製備的，十二烷酸單甲 酯通過真空蒸餾提純。 氧¥偶合反應’是用單脂與2倍分子量的異戊酸，在 含甲醇鈉的無水甲醇中，通過兩個連接到可調直流電源上 的10cm2鉑電極，維持適當電壓進行電解反應，當溶液呈 現鹼性時’說明反應完成。 反應完成後’將反應混合物冷卻至室溫，過濾除去沉 澱的副產物十二烷二酸二甲酯，濾出液用乙酸酸化，減壓 系除甲醇，並通過真空分餾提純十三甲基十四烷酸甲酯。 最後，在過量的丨〇%Na〇H水溶液和甲醇中，通過回 流使十三甲基十四烷酸甲酯水解，得到的白色固體由真空 要错提純’在丙酮中重結晶，真空乾燥，得到十三甲基十 四烷酸白色晶體，熔點51—52°C。 實例6’富含特異支鏈脂肪酸的發酵液的生產方法 本專利所說的富含特異支鏈脂肪酸的發酵液的生產方 法舉例說明如下： 首先’在斜面瓊脂培養基上培養種子24小時，然後 接種到燒瓶中的液體培養基中，在搖床上培養24小時，接 著將燒瓶中的培養液接種到種子罐中，接種比例為〇.μ 〇J%(\V/W) ’經過種子罐發酵24小時後，將培養液移到生 I #^------1T-----Φ, (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -37-

210X297公釐） 83. 3.10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（36 ) 產罐中發酵48小時，並通入無菌空氣；一般來說，從種子 罐到生產罐的放大比約為10，培養條件為：通氣量丨：0.6 〜1.2(質量：空氣)V/V，攪拌速度為180〜26〇轉/分，溫度 為 28-38°C。 5 培養結束後，將培養液在loot下高壓消毒30分鐘， 然後將液體收集 '装瓶，在12〇°c下高壓消毒，這樣得到 的產品是供人飲用的具有抗癌和保健功能的口服液。 用不同的方法還可得到另外的產品，包括但不限於以 下方法·如培養結束後，在培養液中加入一定量的鹽酸， 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製 Γϋ 使ΡΗ降到3〜4，在l〇〇°C高壓下消毒3〇分鐘，冷卻後離 心，3到的液中土要成除是大豆皂（saponin)，可調 成各種σ味的營養飲料，在沉澱中加入相同體積的95%乙 醇和相同體積的2Ν的Na〇H，攪拌並加熱至丨〇〇。〇，冷卻 離心後將上清液收集待用，在剩下的沉澱中加入相同體積 15的的HC1 ’並加熱80°C5分鐘，冷卻離心後，收集上 清液，將兩次收集的上清液合在一起，將pH調到9.0，它 就是濃縮的口服液；產品含有特異支鏈脂肪酸，尤其是 lso-Cl5(以鈉鹽形式存在）’另外還有sap〇riin、daidzein、 genistem，及其它抗癌物質。 2〇 我們還可採用另外方法，或在培養結束後，直接將培 養液噴霧乾燥，形成粉未產品，然後將粉末装成膠囊或壓 成片劑，或用乙醇、乙醚之類有機溶劑及普通的提取脂肪 -38- 83. 3. 10,000 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1251024 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ^------ -67 ___ 發明説明（37) 酸的方法，從發酵液中分離出特異支鏈脂肪酸，製成主要 成分為支鏈脂肪酸鈉鹽的針劑；或用各種提取柱，如離子 又接柱或樹脂柱，直接從發酵液提取有效成分，然後再製 成供癌症病人用的針劑、粉末或口服藥。 5 在上述方法中，探用以下生產培養基，按重t比給出 成分，其餘為水，除了所說的營養成分外，還加入適量的 人體所需的微量元素。 大豆培養某： 大豆 5-10% 或豆奶、或豆餅 5-10% .酵母膏 0.02-0.5% 或酵母粉 0.02-0.5% CaC03 0.05-0.25% k2hpo4 0.02-0.10% MgS04 0.01-0.05% NaCl 0.01-0.04% Na2M04 5.0-30ppm ZnS04 2.5-15ppm CoCl2 5.0-20ppm 除了已被識別的富含支鏈脂肪酸的細菌，如寡養單 10 胞菌屬⑽，黃單胞桿菌屬(¾加/i⑽洲仍）， 座黃菌屬，二氧化碳嗜纖維菌屬 (Cap/ioqyio/^aga)，互生單胞菌屬(zl/ter⑺〇腿61)，嗜細胞菌 >39- ----------------'玎-----Φ (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸浪尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X29*7公瘦） 83. 3. 10,000 1251024 A7 B7

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（38 ) 屬（&師仏㈣，芽胞桿菌屬（此，金黃桿菌屬 穩桿菌屬，金桿菌屬 (加，葡萄球菌屬伽咖/⑽⑽），固氮菌屬 (加論’以及假單胞菌屬(細^_叫外，本發明所 5說的特異菌株還包括其他天然存在、1•旦目前尚未識別的富 含特異支鏈脂肪酸的菌株。 _ 用富含特異支鏈脂肪酸的菌株，以及本發明的培養基 與生產方法所生產的口服液、膠囊、片劑或針劑，均具有 抗癌功能及對人和動物的營養和保健作用。 10 二.画含特異支鐽脂肪酸的發酵液的抗癌和保健功能 本發明所說的發酵液，是採吊富含支鏈脂肪酸的特異. 囷株、及本發明設計的培養基(如大豆培養基)和生產方法 生產而成的，追種發酵液含具有顯著抗癌活性的各種特異 支鏈脂肪酸，以及來自大豆培養基與細菌代謝產物的豐富 I5營赞，為了充分論邊發酵液的抗癌和保健功能，特介紹以 下動物實驗與6品床實驗及其結果，作為例子，在下面介紹 的實驗中採用的發酵液是“Q-can 口服液”。 這種口服液是用寡養單胞嗜麥芽 ma/iop/n//a)Q-can菌株作為生產菌株，並採用上述大豆培 2〇養基及本發明設計的生產方法所生產的；類似的動物實驗 與臨床試驗也對膠囊形式產品進行過，其結果和Q-can 口 服液產品的結果一致。 -40- -----------丨， C請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 本纸張>^度適用中國國家標準（（：奶）八4規格（210\297公釐） 83. 3. 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（39) 這種生產菌株，即寡養單胞嗜麥芽Q-can菌株，具有 現已保存在美國典型物培養與保藏中心(ATCC，10801 University Bodevard，Manassas，VA20110-2209，USA)、 保藏號為ATCC202105的樣株完全一樣的特性；ATCC對 5 該菌種特性鑒定如下： 細胞形態為遊動、無芽孢、革蘭氏陰性、需氧桿菌。 菌落形態如下：在ATTCC#3培養基(營養瓊脂)上培養 24小時，菌落為：90%圓形（直徑約lmm)，邊緣整 齊、隆起、表面粗糙、半透明、淺米黃色；II，小圓形(直 10 徑<lmm)，邊緣整齊、隆起、半透明、光滑、顏色較工 沒，菌落在ATCC#18(T-大豆瓊脂）、#44(BHI瓊脂）、及 #260(綿羊血瓊脂)培養基上顯示出相同特性.，兩種菌落性 質相同。 寡養單胞嗜麥芽Q-can菌株的細胞脂肪酸組成如下： 15 脂肪酸(占總脂肪酸％) 酸 肪 脂 鏈 直 酸 肪 匕0 月 鏈 支 .---------•裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T Φ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5 δ 4 4 1 0.3. 2 5 ο ο ο 1—ίο ·*···* ··· 131511515116 • 1 * 1 3 · 1 * 1 2 5 .344402 本紙張尺>变適用中國國家榡準（CNS )人4規格（21〇Χ297公釐） 83. 3. 10,000 1251024 ill ： ο ι19 ： 〇 3.68 0.33 A7 B7 五、發明説明（40) 羥基酸i 3OH-10 ： 0 0.12 BOH-ill ： 〇 1.51 3HO-112 ： 0 2.68 30H-113 ： 0 3.57 20H-13 ： 0 0.29 *冒號左侧為碳原子個數，右側為雙鍵個數。 異脂肪酸，a二前異脂肪酸。 因為細囷的脂肪酸組成文生物合成條件影響(溫度和pH 等），所以以上數據只是一組典型數據。

tMMMM (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5 每5〇〇ml Q-car. 口服液中脂昉酸的典型含量如下： 直鏈脂肪酸μ 氺氺 10 : 0 2.0-2.7mg ill : 0 11.2-15-4mg 12 ： 〇 2.9-4.0mg il5 : 〇 106.0-145.8mg 14 ： 〇 13.0 - 17.7mg il6 : 〇 3.1-4.3mg 15 ： 0 2.8-3.8mg il7 ： 〇 12.4-17. Omg 16 ： :〇 251.7-346.lmg il9 : 〇 2.2-3.Omg 17 ： :〇 2.9-4.Omg al5 : 〇 23.4-32.Img 18 : ：0 75.6-104.Omg 20 :0 5.5-7.6mg 12 ：1 4.3-5.9mg aim 16 ：1 21.0-28.9mg 3〇H-ill ： 0 6.3-8.6mg -42- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 l25l〇24 A7 B7 五 、發明説明（41) 18 ： 1 18 ： 2 1，_動物實驗 實例7，Q-can 口服液的急性毒性實驗 .材料與方法 Q-can 口服液；ICR小鼠，體重 20.5-22.5g。 取空腹體重20.5-22.5g的ICR小鼠20隻(雌雄各半）， 由於預實驗無法測定半數致死劑量LD5Q，以最大可承 Q-can 口服液量，即3倍濃縮液lml7隻灌餵，24小時内共 >1 四次（10a.m.、4p.m.、10p.m.及次日 6a.m.)。 #果 結果觀察到：所有受試小鼠在每次灌餵5分鐘後活 488.8- 672.Omg 30H-12 * Ο 825.9- 1135.6mg 30Η-ι13 ： Ο 12.0、165 13 么 18.1 mg mg ：0 15 經濟部中夬標準局員工消費合作杜印製 20 減少，大約在1小時後才恢復，有3隻小鼠在藥後l 出現腹瀉，但連續7天無一受試小鼠死亡，療程結束後將 受試鼠處死活殺解剖，肉眼觀察未見臟器異常，上述限度 式驗表明，Q-can 口服液即使在急性大劑量給藥時仍無毒 性反應，按體表面積換算，該劑量相當於體重70kg成人每 天服用Q-can 口服液4，642ml。 實例8，Q-can 口服液的亞急性毒性實驗 鼓赴_與方法 Q-can 口服液；昆明小鼠體重22-24g。 -43- 天 83. 3. 10,000 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁)

1251024 A7 B7 五、發明説明（42) " - 24隻小鼠(雌雄各半)隨機分為對照組和實驗組，分別灌 服生理鹽水和Q-can 口服液，劑量為0.8ml/隻，連結灌服 21天，第22天由各組隨機抽出2隻小鼠活殺，取内臟作 石蠘切片鏡下撿查，剩下每組1〇隻小鼠再連續觀察七天。 5 . 結果 肉眼觀察和鏡下檢查均未發現内臟有任何病變，剩下 母組隻小鼠停藥後觀察七天無一死亡；上述實驗結果說 明，連續灌服21天Q-can 口服液不會引起毒性反應，也不 會使小鼠出現病變。 10 實例9，Ocan 口服液長期毒性實驗 材 Q-can D服液；80隻Spraque-Dawley大白鼠（雌雄各 半），體重 60± 〇.75g。 15 80隻白鼠隨機分成4組··大劑量組(20ml/kg的Q-can 口 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 服液）、中劑量組(10ml/kg的Q-can 口服液）、小劑量組 (5ml/kg的Q_can 口服液）、對照組(同體積的生理鹽水）；灌 餵給藥，每日一次，連續三個月，在實驗過程中，觀察白 鼠的動作，食欲，胃腸反應及體重變化，測量血常規、血 20小板、心電圖、肝功能和腎功能；給藥3個月後將實驗鼠 處死解剖，對主要臟器作肉眼觀察及病理檢查，包括心、 肝、脾、腎、胃、空腸和腦。 -44- 83. 3.10,000 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) έ 本纸浪尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1251024 A7 B7 五、發明説明（43) 結果 總的來說，受試白鼠情況良好，無異常行為，無胃腸 道反應，食慾良好，實驗組的體重增長曲線與對照組基本 相似(P>0.05)，心電圖撿查正常，血液學(包括血常規和血 5.小板)實驗組和對照組無統計學上的差異(P>〇.〇5);肝功能 (包括ALT和TTT)及腎功能(包括BUN和Cr)無明顯差異 (P>0.05)，雖然實驗組的肌酐略為升高，但仍在正常值範 圍內，主要臟器病理切片檢查表明，實驗組的細胞結構和 組織形態學與對照組比較無明顯不同；總之，Q-can 口服 10 液連續給藥不會出現毒性反應，所以可以安全服用。 實例10，Q-can C服液對延長杲蠅壽命的作周 方法 雌雄杲蠅兼用，分成對照組和實驗組；在製備杲蠅飼 15 料時，對照組用自來水，實驗組分別用2%、10%和20% 濃度的Q-can 口服液來調製，每天計數各組果蠅的死亡 數，直到最後一隻死亡結束，計算各組果蠅的平均壽命 (mis)和最尚脊命(MLS) 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 結果 20 表10 Q-can 口服液對果蠅平均壽命和最高壽命的影響 -45- 83.3. 10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251024 五、發明説明（44) 平均壽命(天)X 土 SD 最高 雄 雌 對照組 31,9±_9·7 26Ϊ9±9.6 40.6+4.3 (46) (47) [〇] Q-can 2% 30.8±6.5 31.8土9.5 * 39.5+2.1 (45) (48) [〇] Q-can 38.9±13.3 * 35.9±12.4 ** 64.5+2.1 10% (45) (47) [5] 50.8±15.8 ** 45.5±14.6 ** 64·5±2、1 Q-can 20% (44) (47) [12] ~ -—-— 與對照組比·· *ρ<0.025，**ρ<〇.〇〇1 〇

-)) 雌 l0±[0]5±[l]0±[0]5±2s 1.9 4 7 ±0· 2 ±4 5 •t — (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁〕

Q-can η服液顯著地提高了果蠅的平均壽命和最高^ 命，說明Q-can 口服液具有抗衰老的功能。 實例11，Q-can 口服液對於小鼠體内脂質過氧化物 (LPO)水平的影響 方法 40隻Balb/C小鼠雌雄兼用，隨機分成對照組和三個實 驗組，實驗組分別用10%、20%和30%濃度的Q-can 口服 液代替飲水供自由飲用4周；至第29天，各組均停供飼料 -46 - 本紙浪尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（21〇χ29?公釐）

經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 83. 3. 10,000 1251024 A7

7 B 五、發明説明（45) 和試液24小時，僅供飲水，於第30天處死、放血、取 樣，測定組織中丙二醛_A)含量，以rnnol/g鮮組織代表 LPO水平。 結果

表11 Q-can 口服液對饑餓24小時小鼠的肝、腦LPO 水平的影響 (MDA nmol/g 鮮組織，X土SD) 組別 例 雌 雄 數 肝 腦 肝 腦 糸;· πδ _ 10 75.8±5,50 106.S±2.67 74.8±4.93 108.8±4.1〇 Q-can 10 56.3±2.2〇* 83.0±4.83* 55.〇±3.13* 87,0 士 5.13* 30% Q-can 10 63.2±2.30*° 92.5±3.27*° 60.8±3.07*° 94.0±3.39*° 20% Q-can 10 62.2±3.33* 96.7±3.83* 61.0±2.27* 98.8±2.50*° 10% 與對照組相比：* p<〇.〇〇l ; Q-can的20%組與30%組相 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製 10 比：。p<0.01。 動物組織的脂質過氧化物(LPO)水平過高是促使衰老的 生化過程，Q-can 口服液顯著降低了饑餓小鼠的肝、腦 LPO水平，說明它具有抗衰老的功效。 -47- 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251024 A7 B7 五、發明説明（钧） 實例12，增強化療藥物作用 Q—口服液；小鼠肝癌HAC瘤株；雄性昆明種小 5.鼠，體重20-25g ;注射用環磷酰胺(CP)。 取小鼠40隻，隨機分為5組；三個實驗組分別傻36 %、6〇%和100%的Q_can 口服液，而對照組和陽性對照 組餵飲用水，於實驗第8天，在無菌操作下給全部小鼠腹 腔注射癌細胞HAC懸液(l〇7/ml)〇.2ml/隻，在接種細 10胞後丨，3，5日，三個實驗組初陽性對照組小鼠各腹腔注 射壤碟酰胺50nil/kg—次；從接種HAC後第9天起，恢復 實驗前正常欲食，觀察並記錄各鼠的死亡時間，計算平均 存沾期和生命延長率；其生命延長率(rLS%)定義為： 气實驗組存活期-對照組存活期)/對照組存活期 15 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 以下衣12的結果表明，化療藥物CP和Q-can 口服液 合並應用’其抗癌作用得到增強，無藥陰性對照組荷瘤鼠 的存活期僅10.63± 1.03天，而單純環磷酰胺陽性對照組為 U6± 3·〇3天，生命延長率為22.86% ;而合併應用CP和 20 Q~Cai1 U服液(劑量60%和100%)，無論以平均生命延長率 或以存活期延長60%(17天)的鼠數計算，均超過單純cp 的抗癌作用；所以，合併使用60%和100%Q-cna 口服液， -48- 83.3.10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張碰適财關家轉（⑽）以祕（21QX297公变） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其差異有統計學顯著意義。 衣12 Q-can 口服液對CP治療肝癌的增效作用 而 ------ P------------ 藥物 天鼠— 數 延長天數 ILS(%) ρ* 1 l〇.63± 1.03 0 2 j6%Q- can+CP 12.38± 2.39 -------- 1 i.75± 2·05 16.46 <0.10 3 —------ 60%Q- can+CP 14.44± 3.54 2 3.94± 2.98 35.84 I <0.02 1 4 100%Q-can 十 CP 16.56± 3.96 6 5·94± 2 96 55.75 <0.01 5 CP 13.06± 3.03 1 2.44± 2.58 22.86 <0.05 *與第1組(對照組)比較. ·- —J -----— 1251024 A7 - ------~-— __— B7 五、發明説明（47) ^- 分別將cp產生的生命延長率再提高56·78%和1汜祕％ 貫例13 Q-can 口服液對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用 被料與方法 Q-can濃縮口服液每毫升含特異支鏈脂肪酸3.6mg ; F1小鼠(C57/B1與DBA/2雜交第一代小鼠)體重18_22g， 1〇 雌性；Lawis肺癌瘤種。 治療組10隻小鼠先口服Q-can濃縮口服液1〇天，特 異支鏈脂肪酸劑量是36mg/kg，然後接種小鼠Lewis肺癌 腫瘤，所有的小鼠均從腋窩皮下植入直徑約2_的Lewis -49- 本纸浪尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（21〇X297公董） IT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 83. 3. 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（48 ) 腫瘤，治療組接種後繼續口服給藥18天，與其他組同時解 剖；陽性對照組10隻小鼠接種Lewis肺癌後第二天就開始 給藥，腹腔注射CTX，劑量30mg/kg，連續8天；對照組 12隻小鼠也是腹腔注射生理鹽水8天，最後，所有小鼠均 5 斷頸處死，切除腫瘤，測量瘤重和體重。 結果 從試驗結杲(表13)來看，Q-can 口服液具有顯著的抑瘤 作用，雖然Q-can組比腹腔注射化療藥物CTX的陽性對照 組抑瘤率低21%，但是從小鼠的存活率來看，Q-can組 10 100%存活，而陽性對照組隻有70%，說明化療藥物CTX 有毒，如杲加大口服劑量，或改變給藥途徑，有可能提高 抑瘤率。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表13 Q-can 口服液對小鼠Lewis肺癌的治療作用 級別 劑量 給藥 動物數 體重 瘤重 抑瘤 Ρ值 方式 開始/最 開始/最後X士 SD(g) 率％ 後 生理鹽水 - Φ 12/11 21.2/22.5 L90± - CTX 30mg/kg Φ 10/7 21.2/20.3 0.96 62.2 <0.0 Q-can 36mg/kg po 10/10 20.9/21.9 0·71± 41.6 1 氺 0.36 <0.0 1.11 土 0.46 Μη—-------·裝----1—1Τ------MW (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 83.3. 10,000 -50- 1251024 A7 B7 五、發明説明（49) Q-can劑里系指含特異支鏈脂肪酸的有效成份量 實例14 ’ Q_can D服液對人胃癌SGC刀901裸鼠移植瘤 治療作用 5 .材料與方法 雌性Balb/c裸鼠，6周齡，體重18_22g，整個實驗期 間在無特殊病原體(Spf)條件下，濃縮Q_can 口服液每 笔升中含特異支鏈脂肪酸3.6mg，絲裂霉素C(MMC)購 cur 貝。 10 建互人胃癌SGC-7901移植瘤，實驗時剪切成直徑 2mm左右的碎片，接種於裸小鼠右腋窩皮下：在接種後第 5天隨機分成5組，正常對照組和陽性對照組每天一次分 別腹腔注射生理鹽水和絲裂霉素(2mg/kg)，實驗組於同一 天開始每天η服給藥一次，連續丨4天，分三種含特異支鏈 15知肪酸的劑量18mg/kg、36mg/kg和72mgml/kg。接種後20 天停止實驗，將小鼠斷頸處死，取出腫瘤並對比實驗組與 對照組的瘤重，計算抑制率，實驗重覆兩次。 Γ--------- (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

‘表14 Q-Can 口服液對人胃癌SGC-7901裸小鼠下栘植瘤的 20 治療作用 實驗I

組別 劑量給藥給藥小鼠數 體重 瘤重 抑制 P -51- 本纸浪纽適财關家縣（⑽）Α4· (21()><297公董） 83,3.10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（50) NS - ip Qdxl4 12/12 MMC 2.0mg/kg ip Qdxl4 6/6 Q-can 18mg/kg* p〇 Qdxl4 6/6 Q-can 36mg/kg* p〇 Qdxl4 6/6 Q-can 72mg/kg* p〇 Qdxl4 6/6 nm % 21.9/23.3 0.17± Ο.45 _ 22.4/22.0 0.33± 〇·24 7U9 <〇 〇i 22·0/22·5 0·80± 〇·42 31.19 <0.05 21·9/22·〇 0·60± 0.45 48.23 <0.05 21.6/21.7 0.57± 〇.35 51.28 <〇.〇5 SI~~給藥 、..... 瘤 万式時間開始/最開始/最後χ± SDg 垄 方式時間開始/最後x±sS^一'^ 後 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁} 後 12/2 6/6 6/6 6/6 6/6 NS ip Qdxl4 MMC 2.0mg/kg ip Qdxl4 Q-can 18mg/kg* p〇 Qdxl4 Q-can 36mg/kg* p〇 Qdxl4 Q-can 72mg/kg* p〇 Qdxl4 % 21.6/23.5 U5± 〇3〇 2U/21.1 CK30：t 〇·33 73 51 <〇 21.9/22.3 0.90± 〇.59 2ΐ 5δ <〇 22.0/21.6 0.66± 〇 49 42 47 <〇 22.3/20.3 〇.51± 〇 37 55 45 <〇. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 量。 上述結杲测，鎌瘤接難，以18mg/kg、 和Wmg/kgz^劑量(指含特異支鏈脂肪酸的有效成份量） 每天口服Q-can 口服液一次，連續14天，可對人胃癌 -52- 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ29?公釐） 83. 3· 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（51) [〇 15 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製 20 制作用，物 口服劑呈增大，賴率提高，腫瘤明顯縮小。 2，臨床實驗 實例15L 口服_助治療癌症臨床實驗 方法 Q-can 口服液_治療癌症的•試驗是在中國五^ k進订，共包活癌症病人333例，分成化療和放療南;A 化療純括單純療(贿組如例和憾並用本志 (冶療組）136例；以胃、肝、合试 、— 司肝食B、大腸、肺、乳腺癌等J =，在兩㈣分轉有可隨_.丨）。難純括單純仆 鐵對照組)32例和货療並用本品（治療組讲例；以鼻嗜 ^、喉癌為主’在兩組的分布具有可比性(ρ>〇 ι);同時， 想症病人的性別和特的分布均具有可比性(P>0.1)。 治療組每日並用Q-can 口服液2次’每次8〇m]，療程 60天。 每日作臨床觀察與記錄，並填寫統一的觀察表，治後 每周填寫虛證變化、症狀、血常規和血小板、放、化療毒 性反應、以及Q-can 口服液的副作用，每個月檢測心、 肝腎功蛇、生活質量評定、腫塊大小變化，治療前與治 療結束分別檢測三蛋白、細胞免疫功能(淋巴細胞轉化、 Μ細胞、T淋巴細胞)與體液免疫功能。 -53 本纸張適财_家網^ ( CNS )八4聽^ ( 21QX297公董） 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事' 1· 項再填· 裝-- .寫本頁) 、訂 i 1251024 A7 B7 五、發明説明（52) (1)對臨床症狀的影響 對虛證的療效評定分四級： 顯效：治療結束時，虛證症候消失或明顯好轉； 有效：治療結束時，虛證症候好轉； 5 穩定：治療結束時，虛證症候不變； 無效：治療結束時，虚證症候惡化。 化療的治療組虛證總有效率(顯效加有效)67.46%，顯著 高於對照組的40.60%(p<0.01)，放療的治療組虛證總有效 率亦顯著高於對照組，p<〇.〇5。 i〇 衣15 y-can 口服液對化療組症狀有改吾作用 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表16 Q-can 口服液對化療組體f影響 組別 例數 增加例(％) 穩定例(％) 下降例(％) P值 治療組 136 63(46.32) 33(24.27) 40(29.41) <0.01 對照組 131 2(15.27) 35(26.72) 76(58.01) -54- 症狀 組別 例數 _ (%) 穩定例(％) 加重例 P值 (%) 食慾減 泪療組 77 49(68.6) 18(25.00) 5(6.94) <0.01 退 對照組 81 18(22.22) 33(40.74) 30(37.04) 乏力 治療組 90 56(62.22) 28(31.11) 6(16.67) <0.01 對照組 70 13(18.57) 20(41.43) 28(40.00) 83. 3. 10,000 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1251024 A7 B7 五、發明説明（53) *治後平均比治前^0.5公斤者為增加，S0.5公斤者為下 降，介於兩者之間者為穩定。 (2)對免疫系統的影響 5 表17 Q-cna 口服液對化療組有提高細胞免疫功能的作用 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 指標 組別 例數 治前 (X± SD)% 治後 (X± SD)% P值 自身 組間 LTT 治療組 65 55.95± 8.02 56.28± 8.55 >0.05 <0.01 對照組 75 55.85± 8.87 49.41 土 <0.01 12.21 cd3 治療組 30 43.53± 4.55 43.47± 5.1〇 >0.05 <0.01 對照組 30 45.47土 3.56 38.57± 4.50 <0.01 cd2 治療組 30 44.07± 4.60 43.10± 5.13 >0.05 <0.01 二 J j \\\ 30 42.60± 5.20 38.27± 5.62 <0.01 NK 治療組 30 9.6〇± 5.11 12.00± 4.23 <0.05 <0.01 Cell 對照組 30 12·96± 4.31 10.80± 4.00 <0.05 表18 Q-can 口服液對化療組有提高體液免疫功能的作用 ¥1 組別例數 Μ Wi ΡΪ (X± SD)% (Χ± SD)% 自身 組間

IgC 治療組 71 ~~10.90± 4.69 11.92± 5.06""""<0.05 <0.01 對照組 75 11.90± 4.38 11.05± 4.99 <0.05 -55- 83.3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1251024 A7 B7 五、發明説明（54)

IgA 治療組 72 1.63± 0.67 1.73± 1.32 >0.05 <0.01 對照組 75 1.65± 0.76 1.38± 0.76 <0.05 IgM 治療組 71 1.24± 0.59 1.55± 1.05 <0.05 <0.01 對照組 75 1.53± 0.78 1.30± 0.73 <0.05 化療與Q-can 口服液並用的治療組，細胞免疫功能和 體液免疫功能均得提高，放療與Q_can 口服液並用，可提 咼 IgA 〇 (2)對化療毒性反應的影響 表19 Q-can 口服液對化療組血液系統毒性反應的影響 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 指標 組別 例數 治前 (X± SD) 治後 (X± SD) ΡΪΓ WBC 治療組 30 4.74± 1.21 5.45± 0.86 <0.01 (Xl09/L)對照組 30 529± 0.85 4.45± 0.80 粒細胞 治療組 30 3.20± 0.82 3.66± 0.69 <0.01 (xlO9) f+EJS% -•-'J / \ns 30 3.72± 0.58 3·09± 0.45 血小板 治療組 30 140.30± 4.88 160.03± 4.36 <0.01 (xlO9) 對照組 30 157.33± 3.52 145.53± 5.33 Hb 治療組 30 94.63± 18.00 96.89± 16.08 <0.01 (g/L) 一>1 / a'XL 30 103.67± 13.24 99.20± H.63 治療組的血常規和血小板數沒有像對照組那樣發生下 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公策） 83.3. 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（55) 降，這說明Q-can 口服液能夠預防化療引起的血象降低 表20 Q-can 口服液對化療組有保護肝功作用 組別 例數 p

治療前 WWW SGPT (nm〇l/L，X土SD) 治療組 89 460.06±25.34 330.11+245.01 <0Ό5~ 對照組 84 261.47+19L23 284.00±217.30 表21 Q-can 口服液對化療組血清蛋白有升高作用 (g/L，X土SD) 項目 組別 例數 治療前 治療後 Ρ 總蛋白 治療組 101 65.3i±10.01 67.47±5.99 <0.01 對照組 103 65,64±6.53 64.20±6.07 白蛋白 治療組 107 38.78±5.65 39.13±5.26 <0.01 對照組 102 39.44±4.74 38.18±5.24 丨--------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 化療並用Q-can 口服液，可降低SGPT，提高血清蛋 白，這一結果說明，Q-can 口服液減輕了化療對肝功的破 壞，促使蛋白合成，因而能保護肝臟。 10 表22 Q-Can 口服液對化療組有保護腎功能的作用 57- 本紙張尺度適用中國國豕操準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公董） 83. 3.10,000 1251024 A7 B7 6 5 /V 明説 明發 Λ五 ο 項目 組別 例數 治療前 治療後 P 血尿素 治療組 111 5.13±2.95 4.95±1.33 <0.01 氮 對照組 100 4.26 士 1.03 5.04±1.42 血肌酐 治療組 110 97.15±30.64 97.99±23.46 <0.01 對照組 90 89.28±22.13 107.08±41.27 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 化療並用Q-can 口服液，可降低血尿素氮和血肌酐， 說明Q-can. D服液減輕了化療對腎功能的破壞。 5 總之，與單純化療的Π1例對比，化療並周Q-Can □腹 液使療效顯著增強，並具有統計學顯著性，這些作用包 括：改善虛證、增進食慾、消除疲乏、提高生活品質、提 高免疫功能、減輕化療引起的白細胞下降幅度、保護肝功 能和腎功能等；與單純放療的病人相比，放療並周Q_can 10 口服液可改善虛證、提高免疫蛋白IgG的水平，Q-can 口 服液對血、心臟、肝、腎均無毒副作用；所以，Q-can 口 服液可作為癌症病人的輔助治療藥物。 貫例16，Q-Can 口服液治療35例美國前列腺癌病人的 15 臨床觀察 在美國兩家醫院撿測36個前列腺癌病患者(年齡從37- -58- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ Γ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3. 10,000 1251024 A7 B7 五、發明説明（570 80歲，平均年齡為66歲），服用Q-can濃縮U服液(每瓶 25〇ml，含特異支鏈脂肪酸300mg)，8周〜I8周(平均14 周）；病人在治療期間不接受放療、化療或激素治療，每日 服用250ml，Q-Can濃縮口服液，35例患者都抽血測定 PSA(前列腺特異性抗原)指標的變化，其結果如下： 表23 Q-Can 口服液對前列腺癌病人PSA指標的影響 病例數服用前(mg/ml)X± SD服用後(mg/nil)X± SD P值 35 1〇.22± 10.72 7.45± 6.06 <〇.〇1 -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 10 15 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 20 以上臨床觀察表明Q_can D服液對前列腺癌病人有降 低其PSA的作用。 實例17, ls〇C15對皮膚銀屑病(牛皮癬)的作用 13甲基十四烷酸(1S0_C15)溶解於Na〇H溶液和〇 8%吐 溫80，PH4.5，使終濃度為10%，用脂質體包裹技術將 iso-C15製成乳膏。 J 1立過/肖病皮膚病人在皮膚損傷處外塗iso-Cl5乳膏， 每天3次，療程一個月，結果發現病人的症狀，如瘙癢、 鱗片狀、紅斑等明顯好轉，其中一個病人的牛皮癬斑消失 了，另外兩個病人的斑塊面積縮小一半。 實例18，工業生產發酵液的方法

、1T .t 83. 3. 10,000 59- 1251024 A7 B7 五、發明説明（5¾) 10 15 經濟部中央標準局—工消費合作社印製 20 以下實施例是為了更具體地介紹工業生產Q-can 口服 液的一種方法。 以Q-can菌種生產菌株，用i噸的發酵罐為種子罐， 進料量為0.4噸，其培養基各種物質量：大豆4〇kg磨成漿 (去造）’磷酸氫一鉀200g，碳酸鈣2〇〇g，酵母膏I60g硫 酸鎂8〇g，氯化納80g，鉬酸鈉1〇ppm，硫酸鋅1〇ppm，氯 化鈷5Ppm，亞硒酸鈉2ppm，豆油4kg(作為消皰劑），加水 至400kg，通入無氣i2〇°C消毒30分鐘，然後冷卻至3〇°C 接入3kg Q-Can培養液(該培養液在3〇它下搖床振盪％小 時名资所得）；種子罐溫度保持3〇它，攪拌速度2〇〇轉/ 量1 : 1(V/V_)，發酵24小時後統撿有否染 囷，確定無染菌後再轉人10·發酵罐開始正式生產，1〇 嗜發酵罐絲基齡龍子輯餘齡，數量是種 子罐的1〇倍，生產罐的培養基消毒、發酵溫度、攪拌速 度、逋氣量均與種子罐一樣，連續發酵仙小時，統檢盤染 菌’發酵成功；然後升溫至靴_ 3Q分鐘，待冷卻 開始装瓶，裝好瓶的Q-can發酵液還要再一次11§它45 鐘的消毒成齡成品，經過„_合格後，包 ^ can 口服液產品。 .在本發明的上述說明書中，當給出一個數值範圍和一 倘困屬時，已分別涵蓋了該範圍內所有可能的數值和 可能的菌種、菌株。 有 -60- 本紙張度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210χ297公釐） 83. 3. 10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1251024 A7 B7 五、發明説明（59) 本人於1998年10月16日申報的美國專利申請號 09/173，681的說明書，以及本人於1998年4月14日申報 的美國臨時專利申請號60/081，712的說明書謹供參考。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 .61 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000

Claims (1)

1. 年月曰 _______ 補瓦| 125 1 (ΜΛι 12837號專利申請案 Α8 中文申請專利範圍替換本(94年12月）g D8

   六、申請專利範圍 1· 一種生產含至少一種末端〒基支鏈脂肪酸的發酵液之方 法’該方法包括在大豆培養基中培養募養單胞嗜麥芽菌 株以形成含該脂肪酸的發酵液；其中該末端甲基支鏈脂 肪醋係選自下列群組：9曱基十烷酸，1 3甲基十四烷 酸’14甲基十五烷酸，15 $基十六烷酸，I?甲基十八 烧酸及12甲基十四烧酸。 2· —種由請求項丨之方法所製得之發酵產物，其特徵是該 發酵產物包含至少一種選自下列群組末端甲基支鏈脂肪 酸· 9甲基十烷酸，1 3曱基十四烷酸，1 4甲基十五烧 酸’ 15甲基十六烷酸，丨7甲基十八烷酸及I]曱基十四 烧酸。 3·如請求項2之發酵產物，其係用於製造治療癌症、預防 癌症、增強放療化療效果、抑制皮膚炎症、提高免疫功能或延緩 衰老的藥物。 4.如請求項2之發酵產物，其可調配成液體、粉末、膠囊 或錠劑。 " 97058-941215.doc - 1 _

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