TWI237663B

TWI237663B - Method of analyzing expression of gene

Info

Publication number: TWI237663B
Application number: TW090130806A
Authority: TW
Inventors: Masumi Abe; Toshiyuki Saito; Atsushi Hattori; Shinji Sato; Yasuji Kasama
Original assignee: Masumi Abe; Maze Inc; Messengerscape Co Ltd; Nat Inst Radiolog
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2005-08-11
Also published as: US20040005625A1; CA2431170A1; WO2002048352A1; JP4437171B2; AU2261802A; JPWO2002048352A1; US20090325185A1; EP1348762A4; DE60141221D1; CA2431170C; EP1348762A1; AU2002222618B2; EP1348762B1

Description

1237663 A7 B7 五、發明説明（1 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本申請案爲根據平成1 2年1 2月1 2日所申請之日本專利申請編號2 0 〇〇 — 3 7 7 8 8 7號，且根據該申請案主張優先權。該申請案爲以引用編入本說明書中。 (技術領域）本發明爲關於製作基因表現解析圖之方法，及解析基因表現頻率之方法。〔背景技術〕西元2 0 0 0年，人類基因組的全部序列乃持續被定出。由此所得之龐大的資料爲總括性理解於全部基因及特定細胞中所表現包含此些基因產物之網路的基礎。現在，於解明此類網絡之手段上所使用的方法爲如下。例如，US5262311 及 US5599672 所揭不之分類性顯示法（Differential Display )，特表平經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 0 - 5 1 1 0 0 2所揭示之基因表現的逐次分析法（即， serial analysis of gene expression，以下簡稱爲 SAGE)，及 USP 5807522， USP 5700637及USP 5744305所揭示之微排列及D ΝΑ片斷等。分類性顯示法爲使用細胞所調製之c D Ν Α做爲受質的方法。對於該c D N A，經由使用複數種類之錨式引子和任意之引子進行P C R，則可解析細胞中各種任意的基因表現。但是，此方法不過僅爲分析全部基因中之一部分本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4- 1237663 A7 B7 五、發明説明（2 ) 。又，因爲使用錨式引子和任意的引子，故具有缺乏再現性之問題。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 相對地，對於細胞中之全表現基因可取得表現解析圖之方法爲S A G E。S A G E爲使用由細胞所調製之 m R N A調製之c D N A進行解析。對於所調整之 c DNA進行限制酶處理，切出9至1 1個鹼基對左右之片斷，並將來自各種c D N A之片斷予以連接後，進行定序列。但是，SAGE中，爲了取得全表現基因之50% 左右種類之資料，必須進行約1 0萬回的定序列，使得費用爲非常高。又，來自cDNA之片斷爲短，且實際上，亦多不可能由片斷卓離出基因。 U S 5 8 0 7 5 2 2的微排列，及 USP 5700637 及 USP 5744305 的 D N A片斷爲於固相中將已知基因的探針予以固定。經由該探針對樣品進行雜交作用，則可取得基因之表現解析圖之方法。此些方法中，做爲檢測對象之基因其序列必須爲已知不可。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製〔發明之揭示〕本發明之第一目的爲在於提供可於廣泛範圍中製作基因之表現解析圖之方法。又，本發明之第二目的爲在於提供關於對廣範圍基因解析其表現頻率之方法。上述之第一目的爲藉由製作基因表現解析圖之方法，其爲具備本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5- 1237663 A7 B7 五、發明説明（3 ) (a )對於由細胞所萃取之m R N A ’合成其3 ’終端加成標的物質之c D N A之工程， (b )將所得之反應產物以第一限制酶X予以切斷之工程， (c )將具有對第一限制酶X之限制酶切斷部位之序列呈互補性序列的X適應子，對於工程b所得之片斷進行結合之工程， (d )經由對該標的物質結合具有高親和性之物質’ 則可回收工程c所得片斷之工程， (e )將工程d所回收之片斷以第二限制酶Y予以切斷，除去結合至該標的物質之片斷，則可取得含有經切斷 c D N A 5 5側片斷之工程， (f )對於工程e所得之片斷，將具有對第二限制酶 Y辨識切斷部位之序列呈互補性序列之Y適應子予以加成之工程， (g )使用對該X適應子序列具有互補性序列且其 3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，與對該Y適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，並對於前述工程f所得之片斷進行 PCR反應之工程， (h )將所得之P C R產物進行電泳，經由檢測移動距離和波峰，製作基因表現解析圖之工程之方法則可達成。上述第二目的爲經由解析基因表現頻率之方法，其爲本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 • 6 - 1237663 A7 B7 五、發明説明（4 ) 具備 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (a )對於對照細胞和被檢細胞兩者，使用上述製作基因表現解析圖之方法，製作基因表現解析圖之工程， (b )經由比較所得之二個基因表現解析圖，解析被檢細胞之基因表現頻率變化之工程之方法則可達成。本發明之再其他目的及優點爲於下記記載及實施例中說明。根據此些記載及實施例則可更加明白理解本案發明。又，本發明之目的及優點爲經由下列所示之方法及組合手段而可詳細細解，並且達成。 (圖面之簡單說明）本說明書中所編入，成爲其一部分之附圖，必然爲詳細說明本發明之較佳態樣，及，上述一般的記載及後述之較佳態樣。又，爲用於使用說明本發明之基本的思想。圖1爲示出根據本發明態樣之基因表現解析圖之製作方法的槪要圖。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖2爲示出根據本發明態樣之基因表現解析圖之製作方法的流程。圖3爲示出根據本發明態樣所得之基因表現解析圖之一部分的圖示例。圖4爲示出任意二個鹼基序列之組合圖。圖5爲示出根據本發明態樣之基因表現解析圖所檢測之基因比例圖。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21.0X297公釐） 1237663 A7 B7 五、發明説明（5 ) 圖6爲示出X適應子與Y適應子之較佳例之圖。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖7爲示出由數據庫所得之人類芳基胺N -乙醯轉移酶之一部分基因序列圖。圖8爲示出關於限制酶所得片斷之資料例圖。圖9爲示出P 2 1表現之基因表現解析圖之一例之一部分圖。圖1 0爲示出m d m 2表現之基因表現解析圖之一例之一部分圖。圖1 1爲示出 cyclic G表現之基因表現解析圖之一例之一部分圖。圖1 2爲示出實施例2所使用之m R N A調製物組成圖。圖1 3爲示出實施例2中所得之基因表現解析圖之一部分圖。圖1 4爲示出實施例2中所得之基因表現解析圖之一部分圖。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製〔用以實施發明之最佳型態〕 1 ·發明之槪要本發明者等人發現經由將特定細胞中所表現之基因如何分類，則可大爲改變基因表現解析圖製作中操作之煩雜性和費用效能。根據此發現爲基礎進行致力硏究，結果達成本發明。若根據本發明之一個態樣，則爲提供可一次且簡便製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -8 - 1237663 A7 B7 五、發明説明（6) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 作包含於特定細胞中所表現之大約全部基因般之廣泛範圍之基因的表現解析圖之方法。經由可辨識所表現之大約全部的基因，則可比先前方法更加辨識更多之表現基因。本發明之一態樣爲以限制酶D N A片斷長和聚合酶鏈反應（即，P C R )爲基礎所開發之基因表現解析圖法。經由此類基因表現解析圖方法’則可辨識所表現之幾乎全部的基因，即，公知之基因和未知之基因均同樣可辨識。又，此方法爲不會漏掉一個一個基因’且可分別辨識檢測。此外，亦可決定其表現頻率。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製製作本發明基因表現解析圖方法的基本特徵之一，爲將特定細胞中表現之基因如下列般進行分類。於特定細胞中表現之mRNA考慮爲約2 0 0 0 0種。首先，由表現之mRNA合成出c DNA。將所得之雙股c DNA以適切的二個限制酶予以切斷，製作各種具有僅可辨識長度之片斷。其後，分類成可辨識所得片斷之一部分序列的 2 5 6個餾分。此分類爲首先使用任意設計的2 5 6種引子組進行。於依舊反映相對的表現量下，於各引子組成數個引子組中將該片斷放大，並且分類該片斷。對於分類，所得之餾分，例如，各個2 5 6個餾分，以每1餾分進行電泳，分離其成分。如此處理，由1個細胞所得之表現基因資料爲被分類至可解析之程度爲止。如此，則可簡便製作令幾乎全部之基因不令漏掉，且可正確捕捉一個一個基因表現量之基因表現解析圖。例如，使用圖1說明分類成2 5 6個餾分的具體性手本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ 297公釐） -9- 1237663 A7 ___B7 五、發明説明（7) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製段。由所表現之m R N A群1合成^ d Μ A群2。將其以適切的二個限制酶切斷則可取得c D n A片斷群3。根據此c D . N A兩終端之各2個驗基、全部4個鹼基之序列，即’根據此些序列爲腺嘌哈（以下簡稱爲A )、鳥嘌哈（以下簡稱爲G )'胞嘧啶（以下簡稱爲c )或胸腺嘧啶（以下簡稱爲T )之任一種予以分類。即，根據5，終端（圖1中以黑色表現）之鹼基首先分類成4個集團4。其爲根據下一驗基再分類成1 6個集團5，再根據3，終端之第2個驗基分類成6 4個集團6，且再根據3，終端之鹼基分類成2 5 6個之集團7。若由一般的表現mRNA種類推測，則於最終所得的2 5 6個集團7中，分別含有約 8 0至約1 0 0種的c D N A。即，若將各個集團進行電泳，則可檢測出約8 0個至約1 〇〇個之波峰。因此，由特定細胞所得之全m R N A爲以具有約8 0至約1 0 0個波峰之2 5個圖表型式表現。即，根據此2 5 6個圖表，構成所表現基因的解析圖。例如，此類解析圖中所含之一個圖表例爲如圖3所示。圖3之圖表爲示出於片斷之分類後，將各餾分以P C R予以放大，將反應產物進行電泳所得之一餾分中所含成分的圖表。又，本發明特徵之一爲將表現m R N A所得之 c D ΝΑ使用適切的二種限制酶，較佳爲M s ρ Ϊ和 M s e I予以適切地切斷。經由適切地切斷，則可達成上述分類。以下，更詳細說明本發明。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10- 1237663 Α7 Β7 五、發明説明（8 ) 2 詳細說明 (1 )基因表現解析圖製作本發明基因表現解析圖之方法基本上爲具備以下工程。即， (a )對於由細胞所萃取之m R N A ’合成其3 終端加成標的物質之c D N A之工程， (b )將所得之反應產物以第一限制酶x予以切斷之工程， (c )將具有對第一限制酶X之限制酶切斷部位之序列呈互補性序列的X適應子，對於工程b所得之片斷進行結合之工程， (d )經由對該標的物質結合具有高親和性之物質’ 則可回收工程c所得片斷之工程， (e )將工程d所回收之片斷以第二限制酶Y予以切斷，除去結合至該標的物質之片斷，則可取得含有經切斷 c D N A 5 ’側片斷之工程， (f )對於工程e所得之片斷’將具有對第二限制酶 Y辨識切斷部位之序列呈互補性序列之Y適應子予以加成之工程， (g )使用對該X適應子序列具有互補性序列且其 3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子’與對該γ適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，並對於前述工程ί所得之片斷進行 P C R反應之工程，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -11 - 1237663 A7 B7 五、發明説明（9 ) (h )將所得之p C R產物進行電泳，經由檢測移動距離和波峰，製作基因表現解析圖之工程。此處’雖無特別限定，但將意義鏈（與做爲模板之 m R N A爲相同之序列）之5 ’側視爲雙股c D N A的 5 ’側，意義鏈之3 ’側視爲雙股c D N A的3，側。使用圖2說明製作本案發明之基因表現解析圖方法的具體例。此處，圖2中各字母爲表示構成鹼基序列的鹼基 ° A爲表示腺嘌呤（以下簡稱爲a ) ，g爲表示鳥嘌呤（

以下簡稱爲G ) 、C爲表示胞嘧啶（以下簡稱爲G )及T 爲表示胸腺嘧啶（以下簡稱爲T )。又，此處，N、W、 X、Y及Z爲表示任意的鹼基。又，X和γ、及w和Z爲相互互補性地結合。又，上述工程（a )至工程（h )之工程與圖2中之工程3至工程h爲分別以各個字母對應。首先，由做爲試驗對象之特定細胞萃取m R N A 1 1 ο 將所萃取之m R N A 1 1之3，終端聚Α尾端互補性的寡d T引子，以生物素1 3予以標幟化。將其使用做爲引子，合成c D N A，取得雙股1 2 (圖2，工程a )。此處，示出使用生物素做爲標的物質之例。將雙股1 2使用四鹼基辨識限制酶μ s p I做爲第一限制酶X予以切斷（圖2，工程b )。此處，示出使用 M s p I做爲第一限制酶X之例。其後，使用鏈霉抗生物素蛋白1 4捕捉生物素1 3。藉此，捕捉經切斷之雙股c D Ν Α的3，側（圖2 ，工程本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -12- 1237663 A7 B7 五、發明説明（10) c )。此處，示出使用鏈霉抗生物素蛋白做爲對標的物質具有高親和性之物質例。於所回收之雙股c D N A的5，側，結合對第一限制酶X，即，M s p I之辨識切斷部位具有互補性序列的X 適應子15 (圖2，工程d)。將其使用第二限制酶Y之限制酶M s e I予以切斷（圖2，工程e )。此處，示出使用M s e I做爲第二限制酶Y之例。其次，附加對限制酶Y，即，M s e I之辨識切斷部位具有互補性序列之Y適應子1 6 (圖2，工程f )。經由以上之處理，則可構築於該雙股兩終端含有已知序列的雙股序列1 7。其次，使用此雙股序列1 7做爲模板，並使用經螢光色素標幟之雙股D N A的5 ’側（反意義鏈用）P C R引子1 8，與不具有螢光標幟之雙股c D N A的3，側（意義鏈用）引子19，進行PCR反應（圖2，工程g)。此處，前述P CR用之X引子1 8及Y引子1 9爲分別使用對前述適應子，即X適應子及Y適應子之序列呈互補性序列，與於放大之方向再具有2個鹼基的序列。前述任意之2個鹼基，因爲設計成含有由A、G、C及T四種鹼基組合所得之全部序列，故可取得合計2 5 6種之引子組。即，使用此些引子組，對於全部該雙股c D N A進行 P CR ’則可將存在之全部c DNA分類成2 5群並且可同時進行P C R放大。該引子組之任意共計四鹼基組合示本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） f請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁；> -訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -13- 1237663 A7 B7 五、發明説明（1〇於圖4。圖4中記載AA — AA至ΤΑ — GA爲止之組合〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於最終工程之圖1工程h中，令所得之2 5 6個餾分之P C R產物進行電泳，測定波峰，取得基因表現解析圖 (圖1 ，工程h )。將所得2 5 6個餾分中之一個餾分予以電泳時所得之結果例如取得圖3所示之圖表。縱軸中，示出以螢光強度做爲指標之表現量。橫軸中，示出以電泳之移動距離做爲指標之分子量。又，亦可將前述工程c和工程d之順序更換。即，前述工程d亦可於工程c前進行。更且，將第一限制酶做爲第二限制酶，並將第二限制酶使用做爲第一限制酶，則可對於更多基因進行切斷，藉 .此可提高檢測感度。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製即，將上述工程a所得之雙股1 2分成二群，以 c D N A混合物A和c D N A混合物B，對於c D N A混合物A如上述進行工程b至h，與其並行或依序地，對於 c D N A混合物B亦可進行如下之處理。即，c D N A混合物B爲使用限制酶M s e I做爲第一限制酶，且使用限制酶M s p I做爲第二限制酶，其他點爲與上述方法同樣處理。如此，經由將第一限制酶與第二限制酶交換使用，則對於未交換時無法檢測出之基因亦可進行檢測。 c DNA混合物Β之處理具體而言爲將c DNA混合物Β中所含之雙股1 2，使用四鹼基辨識限制酶M s e I 予以切斷。其後，結合對限制酶M s e I之辨識切斷部位本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' '"— -14- 1237663 Α7 Β7 五、發明説明（d (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 具有互補性序列之M s e I適應子，使用鏈霉抗生物素蛋白捕捉生物素，回收經切斷之雙股1 2的3 ’側。其次，將其使用限制酶M s p I予以切斷。其後，附加於限制酶 M s ρ I之辨識切斷部位具有互補性序列的M s ρ I適應子。經由以上之處理，構築於該雙股1 2之兩終端含有已知序列的序列。其次，對於此序列，使用經螢光色素標幟之X引子1 8，與不具有螢光標幟之Υ引子1 9，對於 cDNA進行P CR反應。此處，前述二個引子1 8及 1 9爲分別使用對該適應子，即，Y適應子及X適應子呈互補性序列，加上於放大方向再附加2個鹼基之物質。所附加之任意的2個鹼基，因爲設計成含有由A、G、C及 T四種鹼基組合所得之全部序列，故可取得合計2 5 6種引子組（圖2工程a至工程f ，具體的2 5 6種N N — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 N N驗基序列爲示於圖4 )。即，使用此些引子組，對於全部之c D N A進行P C R，則可將存在之全部種類的 c DNA分類成2 5 6群。令所得之2 5 6群PCR產物進行電泳，並且測定移動距離和波峰則可取得基因表現解析圖。根據本發明態樣之方法所分類之表現基因爲如圖5所示般，例如於鼠之情況，隨意選出1 0 0個鼠之約8 5 % 基因爲被識別檢出。即，使用M s ρ I做爲第一限制酶且使用M s e I做爲第二限制酶之情形中，經表現之基因的約6 6 %爲被切斷。使用M s e I做爲第一限制酶，且使用M s ρ I做爲第二限制酶之情形中，經表現之基因的約本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -15- 1237663 A7 B7 五、發明説明（13) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 9 %爲被切斷。因此，經由將第一限制酶與第二限制酶交換，則全體爲經表現之基因的約8 5 %爲被識別檢出。藉此，可更正確製作基因解析圖。先前方法所識別之基因比例通常爲2 0至3 0%，最高爲5 0%。因此，根據本發明態樣所作成之基因表現解析圖中所識別之基因比例，爲比先前之比例更加大幅提高。理論上可稱爲幾乎完全可辨識1細胞中所含的基因。此處所使用之「基因表現解析圖」用語，爲表示於某條件下於特定細胞中之基因表現型式，包含公知及未知基因表現之有無，所表現之全部基因的表現量等資料。又，該基因表現解析圖可使用做爲解析基因表現之手段。此處所使用之「聚A尾部」爲指一般亦稱爲聚A的 m R N A之3 ’終端序列。又，經由對聚A尾部具有互補性序列之「寡d T引子」’則可由具有該聚A尾部之 mRNA合成c DNA。此處所使用之「寡dT引子」一般亦稱爲寡（dT)引子。以寡dT引子合成cDNA，可根據一般所進行的任何條件予以達成。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此處所使用之「標的物質」及「對標的物質具有高親和性之物質」爲指彼此具有高親和性且構成可專一性結合之結合對之一者之物質。上述之項目，即，於「（ 1 )基因表現解析圖」中所記載之例中，雖使用生物素做爲標的物質、鏈霉抗生物素蛋白做爲對標的物質具有高親和性之物質，但並非限定於此。若爲彼此具有高親和性且可專一性結合，即可使用。本發明中可使用之標的物質和對標的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' ~~ -16 - 1237663 A7 _____ B7__ 五、發明説明（Μ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 物質具有高親和性之物質組合例爲包含生物素與鏈霉抗生物素蛋白、生物素與抗生物素蛋白、F I TC與F I TC 抗體、D I G與抗D I G、蛋白質A與鼠I gG、及膠乳粒子等，但並非限定於此。又，於各組合中，可使用任一者做爲標的物質，且可使用任一者做爲對標的物質具有高親和性之物質。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此處所使用之「限制酶」，一般爲亦被稱爲限制內核酶之酵素，於特定之序列中將雙股D N A予以水解切斷之酵素。根據本發明態樣之方法中，爲了取得適切之片斷乃組合使用二種限制酶X及Y。本發明中可使用之限制酶，以可將表現基因之m R N A所合成之c D N A所組成的雙股，切斷成具有可識別長度之片斷的酵素爲佳。又，以所得之該雙股切斷成更多，較佳爲將幾乎完全之雙股予以切斷之酵素爲佳。此類酵素例示於表1。由表1之酵素選出任何二種，組合使用亦可。又，表1所示之酵素爲四鹼基辨識酵素，但其他四鹼基辨識酵素，或六鹼基辨識酵素亦可使用。特別，於根據本發明態樣之方法中，以使用四鹼基辨識酵素爲佳，且更佳爲組合使用M s p I和M s e I 。於上述例中，使用M s p I (或M s e I )做爲限制酶 X、MseI (或MspI)做爲限制酶Y。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -17- 1237663 A7 B7 五、發明説明（15) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

表1 Acc II c0yco Hpa II C/CGG AT8I QT/AC Ηδρ92 II CATO/ Alul AG/CT HtpAI G/CGC AspLEI 6CG/C kzofil /GATC Bfal C/TAG Mae I C/TAG BscFI /GATC Mbol /GATC Beh12361 CGJCG Msel T/TAA Bshl GQ/CC Msp I (^CGG BsiS! C/CGG Mvnl CG/CG Ββρ143I /GATC Nde II /GATC BstU I CQ/CQ Nla III CATO/ BsuFU GQ/CC Pall QO^CC C切I OOQIC Rsal GT/AC CspBI G/TAC Seu3A 1 /QATb Wpn II Mat。幺 se91 /AATT FnuD II co/co Taql T7CQA Hae III 6G/CC Thai C0/CQ Hap II C/C^G Trull ΤΑΓΑΑ Hhal GCG/C TruSI T/TAA Hin2l C/CGO Tip5091 /AATT Hin6 册 G/CGC TspE 1 /AATT HinP11 O/CGC TthHBB 1 T/CQA (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -18- 1237663 Α7 Β7 五、發明説明（16) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此處所使用之「適應子」爲使用於將最終p c R放大時所用之引子予以結合者。所使用之適應子爲根據所使用之限制酶而設計。即，結合限制酶X之辨識切斷部位的X 適應子，爲含有對限制酶X之辨識切斷部位呈互補性序列，且再亦可具有任意之序列。再任意序列及鹼基之長度可考慮P C R之效率而設計。較佳爲將X適應子設計成1 5 個鹼基左右。如此可進行安定的p c R。結合限制酶Y之辨識切斷部位的Y適應子，爲含有對限制酶Y之辨識切斷部位呈互補性序列，且再亦可具有任意之序列。再任意序列及鹼基之長度可考慮P C R之效率等而設計。較佳爲將 Y適應子設計成1 5個鹼基左右。如此可進行安定的 P C R 〇例如，使用M s p I做爲限制酶X時之較佳的X適應子序列示於圖6 ( a )，使用M s e I做爲限制酶X時之

較佳的X適應子序列示於圖6 ( b )。又，使用M s p I 做爲限制酶Υ時之較佳的Υ適應子序列示於圖6 ( c ) ’ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製使用M s e I做爲限制酶Υ時之較佳的Υ適應子序列示於圖6 ( d )。但是，並非限制於此。工程g所使用之「引子組」爲由工程f中所得之雙股 c D N A經由P C R放大所使用之一組X和Y引子所構成。詳言之，爲如上述，此處所使用之「任意之二鹼基序列 N N」爲由腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤及胞嘧啶所任意選出之序列。如上述，以任意之序列做爲二鹼基（即’ N N )時，於1樣品之P C R所得之圖表中，含有約8 0至約本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇><297公釐） -19- 1237663 A7 B7 五、發明説明（j (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 0 0個之波峰。此處，以各任意序列做爲二鹼基者，爲考慮該方法之簡便性和解析精度之結果。因此，於根據本發明態樣之方法，較佳之各任意序列爲二鹼基N N，較佳之引子組數爲2 5 6。但是，並不限定於此。該二個引子中所分別含有之任意的二鹼基序列N N，對於任一引子（ X或Y引子）或兩者引子（X及Y引子）亦可作成三鹼基以上。如此可增加引子組中所含之引子種類。此時，所得之餾分分別爲1024或4〇96。又，若根據本發明之態樣，則爲了令P C R後之檢測容易’較佳於該引子之任一終端預先結合螢光物質。較佳爲結合至對X適應子具有互補性序列之X引子的5 ’終端。本發明方法中可使用的螢光物質包含6 -羧基螢光素（以下，稱爲 FAM)、4，7，2，，4，，5，，7，— 六氯一6—羧基螢光素（以下，稱爲HEX) 、NED( Applied Biosystems Japan 公司）及 6 —羧基—X —若丹明（以下，稱爲R 〇 X )等。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製根:據本發明態樣所實施之P c R反應可於一般進行的條件下實施。例如，於9 5 t： 1分鐘、（9 5 °C 2 0秒鐘、6 8 °C 3 0 秒鐘、7 2 °C 1 分鐘）X 2 8 回、6 0 °C 3 0分鐘等條件下進行。根據本發明態樣可使用的電泳手段，若爲一般可根據分子量將試料分離之電泳手段即可使用。例如，可使用包含 Sequencar ABI PRISM 3 10 0( Applied B i o s y s t e m s J a p a η 公司）及 Mega BACE 1 0 0 0 ( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X撕公釐） -20- 1237663 A7 B7 五、發明説明（18)

Amersham Pharmacia公司）之一般的電泳裝置。 (3 )波峰之鑑定 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 更且，若根據本發明之態樣，則亦可鑑定如上述所得之該圖表各波峰中所含的基因。經由鑑定該波峰，則可鑑定特定狀況中所表現，或，表現量增減的基因。該基因之鑑定爲經由回收該圖表中之波峰，例如，以定序列等一般所進行之方法等實驗性手段，並且決定其序列則可進行鑑定。又，未使用如上述之實驗性手法，於電腦上，亦可理論上求出。例如，由一般可使用之數據庫所取得之數據，並以所使用之限制酶辨識部位和切斷所得片斷之分子量爲基礎，於電腦上進行鑑定。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由數據庫所取得之任意基因序列以特定限制酶切斷時所得之片斷長度，與該限制酶之辨識部位，可於電腦之顯示器上輕易決定。另一方面，實際上，本方法所使用之限制酶切斷所得之片斷長度可經由進行電泳而闡明。因此，若考慮所使用之適應子序列，則即使不進行實驗性解析，亦可鑑定該片斷爲來自何種基因。使用電腦之理論性鑑定法之一例爲於後述實施例1中說明。又，此處可使用的電腦，可爲一般所使用的電腦，例如，可使用具備鍵盤及滑鼠等輸入部、印表機及顯示器等輸出部、C P U等演算部等裝置。又，可取得數據之數據庫例可列舉 GenBank 、本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（21 ox297公釐）~' -21 - 1237663 A7 B7 五、發明説明（19) EMB L及D D B I等之公共的 DataBank 、及商用數據庫等其他 DataBank之數據，但並非限定於此。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，亦可組合進行實驗性手法和理論性手法兩者。 (4 )基因表現頻率解析又，根據本發明態樣製作基因表現解析圖之方法中，被檢細胞所表現之基因表現量爲反映該圖表中所示之各個波峰之大小。因此，經由觀察該波峰大小之變化，則可解析基因的表現頻率。例如，可進行正常細胞與異常細胞之比較、正常細胞與癌細胞之比較、不同細胞間之比較、及不同條件所處理之細胞間的比較等。又，若預先根據本方法，鑑定特定刺激所表現或表現量變化之基因，則可於其後之試驗中，僅使用關於此特定基因之引子，即可製作一部分之基因表現解析圖。如此，則可解析目的基因之表現頻率。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實施例1 照射放射線對於P 2 1、m d m 2及C y c 1 i n G表現量之影響如下述，檢討照射放射線對於Ρ 2 1 、m d m 2及 cyclin G表現量之影響。使用對於鼠乳癌細胞株S R -1進行放射線照射後所得之m R N A、與未照射之該細胞所得之m R N A，製作基因表現解析圖，並且比較。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇'〆297公釐） -22- 1237663 A7 B7 五、發明説明（20) 1 ·基因表現解析圖之製作實際製作根據本發明態樣之基因表現解析圖。工一1 mRNA之萃取和cDNA之合成於7 5 c m 3燒瓶（Falcon公司）中之αΜΕΜ培養基中，培養鼠乳癌細胞株S R - 1 (由橫濱市大、小山博士所分得）。對於此細胞，由上方，使用P A N T A C 胃 '津製作所之7 G y照射放射線。照射時間爲3小時。又 ’並行準備未照射細胞做爲對照群。由各個細胞，使用 Fast Track 2 . 0 Kit ( Invitrogen 公司）萃取總 mRNA20微克。將萃取之2 0微克mRNA於0 . 8微升中與1 0 0 pmole之5’ 一生物素化寡dT引子（BRL公司）混合 ’且於6 5 °C培養5分鐘。冰冷後，將其於逆轉錄緩衝液 20 · 0微升中，與最終濃度5mM之MgCl2和 0 · 5mM之dNTP混合物（BRL公司）和l〇mM 之DTT(BRL公司）共同於42它培養60分鐘。接著’將其於雙股合成緩衝液1 5 〇 · 〇微升中，與最終濃度0 · 27 m Μ之dNTP混合物（BRL公司）和 1 · 33mM之DTT (BRL公司）和20 · 0單位之 E. coli連接酶（BRL公司）和40 . 0單位之 E. Coli DNA聚合酶（Brl公司）和2 · 0單位之 RNaseH (BRL公司）共同於16°C培養120分鐘，其後於7 〇 t培養1 5分鐘，令反應停止。將所得之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇'乂 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237663 A7 B7 五、發明説明（21 ) 反應產物予以二等分，視爲反應產物混合物A和反應產物混合物B。 1 一 2 *反應產物混合物A之處理如下述處理反應產物混合物A。此處，使用M s p I 做爲第一限制酶、M s e I做爲第二限制酶。首先，於1 0 0微升中令最終濃度2 0單位之限制酶 M s p I ( Takara )、和1〇微克含有mRNA之反應產物混合物A，於3 7 °C反應3 6 0分鐘。反應後，使用乙醇予以精製（500微升x3回）。其次，將其於 1 5微升之T4 DNA連接酶緩衝液中，使用具有GC 序列（即，限制酶M s p I之切片斷斷部位之互補性序列 )之5 . 0微克的X適應子（B R L公司）、和1 〇單位之Τ4 DNA連接酶（ΝΕΒ公司）進行連接。其後，於此反應液中，添加固定有鏈霉抗生物素蛋白（Dinal 公司）的磁珠粒。對於被固定之鏈霉抗生物素蛋白，令反應液中之雙股所含有之生物素予以結合，取得連接產物。其後，將其於2 0 0微升中，與最終濃度5 0單位之限制酶Ms el (NEB公司）於37 °C反應360分鏤。將其上淸液移至另一管中，以乙醇精製（1 000微升 x3回）。其後，將其於10微升之T4 DNA連接酶緩衝液中，與具有A T序列（即，限制酶M s e I之切片斷斷部位的互補性序列）之1 〇 pmole Y適應子 (B R L公司），使用1 〇單位之T 4 D N A連接酶（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項I填寫本ΐο tr 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -24- 1237663 Μ __Β7__ 五、發明説明（d N E B )進行連接。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其次，對於所得之連接產物進行P C R。此處，於χ 適應子具有互補性序列之X適應子5 ’側，結合三種螢光色素FAM、NED及NED之任一種。更且，X適應子爲於3 ’側具有任意的二鹼基N N。另一方面，於Y適應子具有互補性序列之Y適應子爲於3 ’側具有任意的二鹼基NN。各NN與螢光色素之組合爲如圖4所示。圖4中將標幟所用之各物質，即，以F A Μ所標幟之序列於a欄中記載，相同地Η E X於b欄中記載，N E D於c欄中記載，且以（X引子之NN) — (Y引子之NN)型式記載任意之二鹼基序列。此處，雖使用三種螢光探針，但其爲用以提高作業效率。因此，即使使用一種螢光探針亦可同樣實施。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製具體而言，連接終了後，將此反應液使用 Tris-HCl 緩衝液（以下，簡稱爲T E )稀釋成6 1 2微升。對此稀釋反應液1微升，將圖4所示F AM和HEX和NED各個欄中所具備之第一序列，即，混合含有a ) F A Μ爲「 ΑΑ — ΑΑ」、b) HEX 爲「CT — ΑΑ」及 c) NED爲「CA — AA」引子之各1微升溶液添加混合。同樣地，將各個位置記載序列之引子以三個1組混合者與該稀釋反應液1微升混合。a) FAM之第8 1至第9 6 爲止因不存在Η E X和N E D，故單獨與該稀釋反應液1 微升混合。將依據上述操作由2 5 6種引子組所產生之 P C R反應產物作爲9 6個電泳用樣品。本^張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210父297公釐）一 -25- 1237663 A7 B7 五、發明説明（Z3) i --------»衣！ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 對於此9 6個電泳用樣品進行電泳。電泳爲使用毛糸田管定序機（ABI PRISM 3100、APpiied Bio systems Japan公司），於泳動電壓1 5 k V及泳動時間2 0 0 0秒之條件下進行。電泳結果於橫軸取得以移動距離做爲指標之分子量、縱軸取得以螢光強度做爲指丰票之表示表現量之圖表。一個樣品中雖包含三種螢光物質所標幟之P c R產物，但可根據改變波長而將其辨別。 1 - 3 反應產物混合物B之處理除了使用M s e I做爲第一限制酶、M s p I做爲第二限制酶以外，與上述反應產物混合物Α同樣地處理反應產物混合物B。又，與反應產物混合物A同樣地，對9 6 個樣品進行電泳則取得圖表。經由上述1 - 1和1 - 2同樣之方法，以電泳結果圖表型式取得基因表現解析圖。 1 - 4 基因數據庫之解析經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對於所得之基因表現解析圖中所檢測到的波峰，使用數據庫的數據，鑑定其中所含的基因，取得關於所使用的限制酶切斷部位、和經由切斷所得片斷之資料。首先，將 GenBank之數據庫闡明mRNA全長之基因、與僅註冊一部分序列之E S T所得的全部數據予以集結，並且將每種來自各基因之數據整理成一個。由集結的數據求出共通序列。共通序列與構成共通序列所用之一部本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 1237663 A7 B7 五、發明説明（y 分序列示於圖7 (圖7 )。最上方所示之序列爲共通序列。此處所使用之「共通序列」爲指關於一種基因之相同部位，於鑑定複數序列之全部序列中，經由決定高或然率共通序列所得之共通序列。圖6爲示出人類芳基胺N -乙醯轉移酶之基因序列的一部分。其次，對於此共通序列、和構成共通序列所用之全部數據，檢測出最靠近3 ’側之限制酶X的辨識序列。其次，檢測出限制酶X之辨識部位開始於3 ’方向最近的限制酶Y的辨識序列。M s p I之辨識序列爲C / C G G，於「/」之位置切斷。又，M s e I之辨識序列爲 T / T A A。更且，由如此處理所得之限制酶X及Y之切片斷斷，理論上算出所得D NA的鹼基數。如上述處理所得數據之一例示於圖8 (圖8 )。圖8中可知，由 GenBank之數據庫之數據和E S 丁之許多的註冊數據，取得1 0 4 b p之切片斷斷（參照圖 8之「長度」欄。但是，又，由該數據亦提示於數個數據中有變異或序列之讀取差異，亦有取得2 3 b p切片斷斷的可能性（參照圖8之「長度」欄）。其次，由該基因數據庫中，對於得知放射線照射增加表現之基因、p 2 1 、mdm2 、 cyclin G 及 gadd 4 5，調查其切片斷斷長度、和限制酶辨識部位內側之二鹼基序列。 1 — 5 基因之鑑定本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 -27- 1237663 A7 _____B7 五、發明説明（25) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經由比較檢討上述1 一 2及1 一 3所得之數據，和1 - 4所得之數據’則可進行本發明基因表現解析圖所檢測之波峰中所含之基因的鑑定。以數據庫所得之p 2 1 、m d m 2 、cyclin G及 g a d d 4 5之切片斷斷長度、和限制酶辨識部位內側之二鹼基序列爲基礎，則可判知本方法所使用之5 1 2種引子中，由何種引子組，即，X引子和Y引子之組合，檢測出 P 2 1、m d m 2、cyclin G 及 gadd 4 5。又，同樣闡明所檢測出的D N A長度。以此爲基礎，由電泳所分類之分子中，分取相當於對應分子量之波峰。對於所分取之波峰中所含之D N A，經由定序列調查鹼基序列’確s忍目的基因’ fiP ’ p 2 1 、m d m 2 、c y c 1 i η G 及 gadd 4 5 0

1—6 放射線照射對於P 2 1 、m d m 2、c y c 1 i n G 及 gadd 4 5表現量之影響。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製根據上述方法所得之P 2 1、m d m 2及 cyclin G 之各個基因的波峰示於圖9、1 0及1 1。各圖上段之圖表爲來自未照射放射線細胞所得之m R N A之基因表現解析圖之一部分。下段圖表爲來自3小時之7 G y被照射細胞所得之m R N A之基因表現解析圖之一部分。以箭頭表示目的基因之波峰。如圖9至1 1所示般，可確認經由照射放射線，則可令P 2 1、m d m及 c y c 1 i n G各別表現量增加。又，雖本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -28- 1237663 A7 B7 五、發明説明（26) 然未示出數據，但gadd 4 5亦取得同樣之結果。實施例2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 基因表現頻率解析更且，進行基因表現頻率解析。細胞爲使用分裂酵母 (以下，以S · p .表示）和出芽酵母（以下，以s . c ·表示）。與實施例1同樣萃取，並將所得總m r n A 之混合比、S . p .之mRNA量以〇、〇 . 〇2、〇 · 2、1、2 及 2 微克、S · c •之mRNA 量以 2、 2、2 ' 2、2及Ο，如圖1 2所示般分別混合。對於如上述調製之六種m R Ν Α調製物，如實施例工所記載般製作基因表現解析圖。所得基因表現解析圖之一部分圖表示於圖1 3。各圖表之來自m R N A調製物之組成爲分別示於左側。最上段之圖表爲示出S · p ·基因表現解析圖之一部分，且最下段之圖表爲示出S _ c ·基因表現解析圖之一部分。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖14爲將圖13所示圖表中來自S·p·之波峰以縱軸予以連結。如圖1 4所示般，波峰大小之變化爲依賴於該m R N A調製物中所含之S · p .的m R N A量。由實施例1及2可知，根據本發明方法製作基因表現解析圖，且所得之基因表現解析圖中所示之基因表現量，爲充分反映試料中所存在之m R N A量。因此，可根據本發明方法，解析基因表現頻率。根據本發明態樣之方法，則可簡便作成關於在廣範圍本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -29- 1237663 A7 B7 五、發明説明（27) 表現之基因的基因表現解析圖。又，根據此類基因表現解析圖，則可比先前方法識別更多的表現基因，即，可識別幾乎全部經表現的基因。又，根本發明態樣之基因表現解析圖可對一個一個基因，進行各基因之識別。又，更且，因爲其爲反映基因的表現量，故亦可解析基因表現頻率。特別，關於未知之基因’亦可與已知之基因同樣地解析其表現頻率。其他之優點及變更可由業者輕易地想出。因此，於此廣泛的側翼中，並無法將本發明限定於此處所示之詳細的說明及典型的態樣中。因此，在不超脫所附之申請專利範圍及其均等物所明示之全盤發明之思想精神或範圍，可作出各種變更。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -30- 1237663 A7 B7 五、發明説明（2S) 序列表 <110〉 AISIN SEIKI KABUSHIKI KAISHA National Institute of Radiological Sciences MAZE INC. Masumi Abe Toshiyuki Sairo <12ϋ> Method for analysing of gene expression

<130> 01S1459P <150> JP 2000-377887 <151〉 2000-12-12 „ . 衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <160〉 24 <170〉 Paieniln version 3. 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 - 1237663 A7 B7 五、發明説明（29) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 1 (211) 22 <212> DNA <213〉人工 <400> 1 ! cgggicgxax cagactigca ca 22 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210〉 2 <211> 20 <212〉隨 <213> <400> 2 igigcaagtc tgatacgacc 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -32- 1237663 A7 B7 五、發明説明（30) <210> 3 <211> 22

<212> DNA <213> 人工丨 <400〉 3 ! I tacatcaggx gtccgatgat re 22 <21ϋ> 4 <211) 20 <212〉 DNA <213〉人工 <400) 4 gaatcatcgg acacctgaig <210〉 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ·裝· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -33- 1237663 A7 B7 五、發明説明（31) 丨衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <211> 22 <212> DNA (213〉人工 <400> 5 cgagtcgtat cagacttgca ca 22 I <210> 6 I <211> 20 <212> DNA <213〉人工經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 6 igigcaagic igaxacgaci:· 2〇 <210> 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -34- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237663 A7 B7 五、發明説明（32) <211> 22 <212> DNA j <213> 人工 <400〉 7 xacttggact acagtcgtga ca 22 <210〉 8 〈211〉 20 <212> DNA <213〉人工 . <400〉 8 tgtcacgacx gtagiccaag 20 <210> 9 <211> 116 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1.---*--------：---、訂------« (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -35- 1237663 A7 ____ B7五、發明説明（33) <212^ DNA <213> Homo sapiens 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 9 gaaaccgggg tgggtggtgt ciccaggica atcaacttct gtacigggct ctgaccacaa 60 icggxtttca gaccacaaxg naggagggt atttttacat cccxccag-ττ aacaaa 116 (210> 10 <211> 116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gaaaccgggg tgggtggtgt ctccaggtca aicaactict giactgggcx ctgaccacaa 60 tcggttttca gaccacaarg ttaggagggt atniiacai cccxccagxi aacaaa 116 IK---.------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36- 1237663 A7 B7 五、發明説明（34) <210> 11 <211> 116

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gaaaccgggg rgggxggigx ciccaggxca atcaactrct gtactgg^ct cigaccacaa i tcggttttca gaccacaatg tiaggagggi attixxacai ccciccagxx aacaaa 60 I- I - 一 - - i _ - ..... - - - I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 <210> 12 <211> 116

<212> DNA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <213> Homo sapiens <400〉 12 gaaaccgggg tgggxggtgt ctccaggtca atcaacttct gtactgggct ctgaccacaa 60 本紙張尺度適用中國國家標準（) A4規格（2l〇x297公釐） 37- 1237663 A7 B7 五、發明説明（35) tcggmtca gaccacaatg txaggagggx atttttacai ccctccagti aacaaa 116 <210> 13 <211> 116 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400〉 13 gaaaccgggg igggiggtgi ciccaggtca atcaacxxct gtacigggct ctgaccacaa 60 i I icggxixtca gaccacaatg itaggagggt atttttacai ccctccagti aacaaa 116 <210> 14 <211> 116 〈212〉 DNA <213> Homo sapiens 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 297公釐） I----.----衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237663 A7 B7 五、發明説明（泥） <400> 14 gaaaccgggg tgggtggtgi ctccaggrca aicaacttct giacigggct cxgaccacaa icggttitca gaccacaatg itaggagggt aimtacai ccutccagn aacaaa <210〉 15 <211〉 116 <212> DNA <213> Homo sapiens

I ! <400〉 15 gaaaccgggg igggtggtgt ctccaggtca atcaacttct gxacigggci cxgaccacaa

I icggmica gaccacaatg itaggagggt aitmacai ccctccagit aacaaa

<210> 16 <211> 116 I <212〉 DNA <213> Homo sapiens 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、r 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -39- 1237663 A7 B7 五、發明説明（37) <400> 16 gaaaccgggg tgggtggigt ctccaggica axcaacnci gtactgggct ctgaccacaa 60 tcggxittca gaccacaatg ttaggagggx amitaxai ccctccagit aacaaa 116 <210> 17 <211〉 116 <212> DNA <213> Homo sapiens i <400> 17 gaaaccgggg tgggiggtgx ciccaggxca atcaacitct gtactgggct ctgaccacaa 60 tcggitxxca gaccacaatg naggagggt azzzixazaz ccciccagtt aacaaa 116 <210> 18 <211〉 116 I--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -- Γ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇><297公釐） -40 - 1237663 A7 B7 五、發明説明（38)

<212> DNA <213> Homo sapiens <400〉 18 , gaaaccgggg tgggiggtgt ctccaggtca atcaacttcx giacxgggci ctgaccacaa 60 icggttttca gaccacaatg itaggagggt aixxtiacat ccciccagzz aacaaa 116 <210> 19 <211> 116 I . i ! <212> DNA ·

I i <213> Homo sapiens <400> 19 gaaaccaggg tgggtggtgi ctccaggtca axcaacrccx gtacigggct ctgaccacaa 60 tcggititca gaccacaatg tiaggagggt aimiacat ccctccagtt aacaaa 116 <210〉 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -41 - 1237663 A7 B7 五、發明説明（39) <211> 116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gaaaccgggg rgggtggigi ctccaggtca aicaacttci gxactgggcx cigaccacaa 60 icggtxttca gaccacaatg ttaggagggt aittttacat ccctccagtt aacaaa 116 <210> 21

I ! ' <211〉 116 I . <212> DNA 〈213〉 Homo sapiens I <400) 21 gaaaccgggg igggtggigi cxccaggxca atcaacxtci giacigggcx cxgaccacaa 60 tcggttttca gaccacaatg ttaggagggt atttttaiai ccctccagtt aacaaa 116 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 k9·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -42- 1237663 A7 B7 五、發明説明（4〇) <210> 22 <211> 116 〈212〉 DNA <213> Homo sapiens (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <400> 22 gaaaccgggg tgggiggigi ctccaggtca aicaacxtct gtacigggct ctgaccacaa 60 ! ^cggrmca gaccacaatg naggagggt atttttacat ccctccagtt aacaaa 116 ! <210> 23 <211> 116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）訂 # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 43 1237663 A7 B7 五、發明説明（41) gaaaccgggg tgggtggigi ctccaggtca atcaacrtci gtacxgggct ctgaccacaa 60 tcggttttca gaccacaatg ttaggagggi aimiacax ccctccagtt aacaaa 116 <210) 24 <211〉 116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400， 24 I gaaaccaggg tgggiggtgi ctccaggtca atcaacttci giactgggci ctgaccacaa 60 tcggtitica gaccacaatg ttagga^ggt atttxiaiat cccxccagri aacaaa 116 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44-

Claims

1237663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 ^、_重諸專系i範圍 1 1 · 一種製作基因表現解析圖之方法，具備下述步驟 (a )對於由細胞所抽提之m R N A，合成於其3 ’ 終端上加成標的物質之c D N A之步驟， (b )將所得之反應產物以第一限制酶X予以切斷之步驟， (c )將具有對第一限制酶X之限制酶切斷部位之序列呈互補性序列的X適應子，對於步驟b所得之片斷進行結合之步驟， (d )經由對該標的物質結合具有高親和性之物質，則可回收步驟c所得片斷之步驟， (e )將步驟d所回收之片斷以第二限制酶Y予以切斷，除去結合至該標的物質之片斷，則可取得含有經切斷 c D N A 5 ’側片斷之步驟， (f )對於步驟e所得之片斷，將具有對第二限制酶 Y辨識切斷部位之序列呈互補性序列之Y適應子予以加成之步驟， (g )使用對該X適應子序列具有互補性序列且其 3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，與對該Y適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，並對於前述步驟f所得之片斷進行 P C R反應之步驟， (h )將所得之P C R產物進行電泳，經由檢測移動距離和波峰，製作基因表現解析圖之步驟。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ΉΟΧ297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

-45 - 1237663 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 參如串請專利範圍第方法 5 其中對該 X 適應子序 3 5 終端具有任 -Afe：二個鹼基 5 3 終端加成螢光物質藉爲經由檢測出該螢光物質之 3 • 如串請專利範圍第方法，其中該限制酶 X 及該群中分別 « 出； A C C I I A S P L Ε I B f a I Λ B S h 1 2 3 6 I B S h B s P 1 4 3 I 、 B S t U C f 〇 I C S P 6 I D Η a e I I I Η a P I I Η i n 6 I Λ Η i η P 1 I Η s P 9 2 I I Η S P A Μ b 〇 I Μ S e I Λ Μ s \ N 1 a I I I Λ Ρ a 1 I S s e 9 I Λ Τ a q I Ν T τ r u 9 I Τ s Ρ 5 0 9 τ t h Η Β 8 I o 4 • 如串請專利範圍第方法其中該限制酶 X 爲 M Μ s e I 〇 5 • 如串請專利範圍第本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1項之製作基因表現解析圖之列具有互補性序列且其序列N N之引子，係再於其此，該P C R產物之電泳結果螢光量而進行。 1項之製作基因表現解析圖之限制酶Y爲由下列所示之酵素、AfaI、AluI、 B s c F I 、 I、B s i S I、 I、B s u R I、 pnII、FnuDII、、HhaI、Hin2I、、H p a I I 、 I 、Kz〇9I 、MaeI 、 pi 、MvnI 、NdeI I 、RsaI、Sau3AI、· hal、Trull 、 I、T s p E I 及 1項之製作基因表現解析圖之 s p I ，且該限制酶Y爲 1項之製作基因表現解析圖之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T -46- 1237663 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 方法，其中該X適應子中所含之NN和Y適應子中所含之 N N爲將腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤及胞嘧啶組合設計者，且全部使用2 5 6種之X及Y適應子。 6 .如申請專利範圍第1項之製作基因表現解析圖之方法，其中該標的物質與對標的物質具有高親和性之物質之組合係選自由生物素和鏈霉抗生物素蛋白、生物素和抗生物素蛋白、F I TC和F I TC抗體、D I G和抗 D I G、蛋白質A和鼠I g G、及膠乳粒子所組成群。 7 .如申請專利範圍第1項之製作基因表現解析圖之方法，其爲於經由將該P C R產物予以電泳，檢測出移動距離和肅峰，製作基因表現解析圖之步驟後，再具備將檢測出之波峰回收且藉由定序列決定出其所含之P C R產物之序列，並且鑑定所表現基因之步驟。 8 ·如申請專利範圍第1項之製作基因表現解析圖之方法，其爲再具備將該限制酶X及限制酶Y之辨識序列、和步驟a所得之反應產物以限制酶X及限制酶Y切斷所得之片斷長度、和任意數據庫所取得之數據，於電腦上進行比較，鑑定出經表現基因之步驟。 9 . 一種製作基因表現解析圖之方法，具備下述步驟 (a )對於由細胞所萃取之m R N A，合成於其3 ’ 終端上加成標的物質之c D N A，並將所得之合成產物分成二個餾分之步驟， (b )將所得之反應產物以第一限制酶X予以切斷之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -47- 1237663 Α8 Β8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍 4 步驟， (c )將具有對第一限制酶X之限制酶切斷部位之序列呈互補性序列的X適應子’對於步驟b所得之片斷進行結合之步驟， (d )經由對該標的物質結合具有高親和性之物質，則可回收步驟c所得片斷之步驟， (e )將步驟d所回收之片斷以第二限制酶Y予以切斷，除去結合至該標的物質之片斷，則可取得含有經切斷 c D N A 5 ’側片斷之步驟， (f )對於步驟e所得之片斷’將具有對第二限制酶 Y辨識切斷部位之序列呈互補性序列之Y適應子予以加成之步驟， (g )使用對該X適應子序列具有互補性序列且其3 ，終端具有任意二個鹼基序列NN之引子，與對該Y適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，並對於前述步驟f所得之片斷進行P C R 反應之步驟， (h )將步驟a所得之第二合成產物餾分以該限制酶 Y予以切斷之步驟， (i )將具有對該限制酶Y之限制酶切斷部位之序列呈互補性序列的Y ’適應子，對於步驟h所得之片斷進行結合之步驟’ (j )經由對該標的物質結合具有高親和性之物質，則可回收步驟i所得片斷之步驟， t紙張尺度適用中_國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-48- 1237663 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製· (k )將步驟j所回收之片斷以限制酶X予以切斷’ 除去結合至該標的物質之片斷，則可取得含有經切斷 c D N A 5 ’側片斷之步驟， (1 )對於步驟k所得之片斷，將具有對該限制酶X 辨識切斷部位之序列呈互補性序列之X ’適應子予以加成之步驟， (m )使用對該Y ’適應子序列具有互補性序列且其 3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子所構成之組合，與對該X ’適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子所構成之組合，進行 P C R反應之步驟， (η )將步驟g和步驟m中所得之P C R產物進行電泳，經由檢測移動距離和波峰，製作基因表現解析圖之步驟。 1 〇 .如申請專利範圍第9項之製作基因表現解析圖之方法，其中對步驟g中所使用之該X適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，係再於其5 ’終端加成螢光物質；及對步驟m中所使用之該Y ’適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子爲再於其5 ’終端加成螢光物質；藉此，該P C R產物之電泳結果爲經由檢測出該螢光物質之螢光量而進行。 1 1 ·如申請專利範圍第9項之製作基因表現解析圖 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) £ 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -49- 1237663 κ、申請專利範圍 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製之方法 5 其中該限 :制酶 X 及該限制酶〖Υ爲由下歹〔 1所 ‘示之酵素群中分別選出 ; A C C I I > A f a I > A 1 U I A S P L E I Λ B f a I 、Β S c F I > B S h 1 2 3 6 I Λ B S hi Λ B s i S I 、 B S P 1 4 3 I Β S t U I Λ B s u R I 、 C f 〇 I C S P 6 I Dp η I I 、F n u D I I Λ Η a e I I I Η a P I I ^ Η ha I、H i n 2 I Η 1 n 6 I Η 1 η P 1 I > Η P a I I > Η s P 9 2 I I Η S P A I K z 〇 9 I 、M a e I Μ b 0 I 、 Μ s e I Μ s p I 、M v η I 、N d e I I 、 N 1 a I I I Λ Ρ a I I ^ R s a I 、S a u 3 A I S s e 9 I Λ T a Q I Λ T h a I ^ Trull τ r u 9 I 、 T s Ρ 5 0 9 1 Λ T s Ρ E I及 τ t h H B 8 I 0 1 2 • 如甲請專利範圍第 9 項之製作基因表現解析圖之方法其中該限制酶 X 爲M S pi ，且該限制酶’ F爲 Μ s e I 〇 1 3 • 如串三主日円專利範圍第 9 項之製作基因表現解析圖之方法 5 其中該 X 適應子中所含之N N和Y適應子中所含之 N N 爲將腺嘌呤 Λ 胸腺嘧啶 Λ 鳥曝呤及胞嘧啶組合設計者且全部使用 2 5 6 種之X 及 Y適應子。 1 4 . 如串請專利範圍第 9 項之製作基因表現解析圖之方法其中該標的物質與對標的物質具有高親和性之物質之組合係選白由生物素和鏈霉抗生物素蛋白、生物素和 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）、1Τ, -50- 1237663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 7 抗生物素蛋白、F ITC和F ITC抗體、D I G和抗 D I G、蛋白質a和鼠I g G、及膠乳粒子所組成群中。 1 5 ·如申請專利範圍第9項之製作基因表現解析圖之方法，其爲於經由將該P C R產物予以電泳，檢測出移動距離和波峰，製作基因表現解析圖之步驟後，再具備將檢測出之波峰回收且以定序列決定出其所含之P C R產物之序列，並且鑑定所表現基因之步驟。 1 6 ·如申請專利範圍第9項之製作基因表現解析圖之方法，其爲再具備將該限制酶X及限制酶Y之辨識序列、和步驟a所得之反應產物以限制酶X及限制酶Y切斷所得之片斷長度、和任意數據庫所取得之數據，於電腦上進行比較，鑑定出經表現基因之步驟。 1 7 · —種解析基因表現頻率之方法，具備下述步驟 (1 )對於對照細胞被檢細胞兩者，經由進行下列步驟，以製作基因表現解析圖之步驟； (a )對於由細胞所抽提之m R N A，合成於其3 ’ 終端上加成標的物質之c D N A之步驟， (b )將所得之反應產物以第一限制酶X予以切斷之步驟， (C )將具有對第一限制酶X之限制酶切斷部位之序列呈互補性序列的X適應子，對於步驟b所得之片斷進行結合之步驟， (d )經由對該標的物質結合具有高親和性之物質，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-51 - 1237663 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 8 則可回收步驟c所得片斷之步驟， (e )將步驟d所回收之片斷以第二限制酶Y予以切斷，除去結合至該標的物質之片斷，則可取得含有經切斷 c D N A 5 ’側片斷之步驟， (f )對於步驟e所得之片斷’將具有對第二限制酶 Y辨識切斷部位之序列呈互補性序列之γ適應子予以加成之步驟’ (g )使用對該X適應子序列具有互補性序列且其 3，終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，與對該Y適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列NN之引子，並對於前述步驟f所得之片斷進行 P C R反應之步驟， (h )將所得之P C R產物進行電泳，經由檢測移動距離和波峰，製作基因表現解析圖之步驟；及 (2 )經由比較該步驟（1 )所得之二個基因表現解析圖，解析被檢細胞之基因表現頻率變化之步驟。 1 8 · —種解析基因表現頻率之方法，具備下述步驟 (1 )對於對照細胞和被檢細胞兩者，經由進行下列步驟，製作基因表現解析圖之步驟； (a )對於由細胞所抽提之m R N A，合成其^終端加成標的物質之c D N A，並將所得之合成產物分成二個餾分之步驟， (b )將第一合成產物餾分以第一限制酶X予以切斷1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -52- 1237663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 9 之步驟， (C )將具有對第一限制酶X之限制酶切斷部位之序列呈互補性序列的X適應子，對於步驟b所得之片斷進行結合之步驟， (d )經由對該標的物質結合具有高親和性之物質，則可回收步驟c所得片斷之步驟， (e )將步驟d所回收之片斷以第二限制酶Y予以切斷，除去結合至該標的物質之片斷，則可取得含有經切斷 c D N A 5 ’側片斷之步驟， (f )對於步驟e所得之片斷，將具有對第二限制酶 Y辨識切斷部位之序列呈互補性序列之Y適應子予以加成之步驟， (g )使用對該X適應子序列具有互補性序列且其 3，終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，與對該Y適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子，並對於前述步驟ί所得之片斷進行 P C R反應之步驟， (h )將步驟a所得之第二合成產物餾分以限制酶γ 予以切斷之步驟， (i )將具有對該限制酶Υ之限制酶切斷部位之序列呈互補性序列的Y ’適應子，對於步驟h所得之片斷進行結合之步驟， (j )經由對該標的物質結合具有高親和性之物質’ 則可回收步驟i所得片斷之步驟’ 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-53- 1237663 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1〇 (k )將步驟j所回收之片斷以限制酶X予以切斷，除去結合至該標的物質之片斷，則可取得含有經切斷 c D N A 5 ’側片斷之步驟， (1 )對於步驟k所得之片斷’將具有對該限制酶X 辨識切斷部位之序列呈互補性序列之X ’適應子予以加成之步驟， (m )使用對該Y ’適應子序列具有互補性序列且其 3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子所成組合’與對該X ’適應子序列具有互補性序列且其3 ’終端具有任意二個鹼基序列N N之引子所成組合，以進行P C R反應之步驟， (η )將步驟g與步驟m中所得之P C R產物進行電泳，經由檢測移動距離和波峰，製作基因表現解析圖之步驟；及 (2 )經由比較該步驟1所得之二個基因表現解析圖，解析被檢細胞之基因表現頻率變化之步驟。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X：297公釐）