TW589381B - Production of vaccines using arthropod vectored viruses - Google Patents

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經濟部中央標準局—工消费合作社印製 589381 ___ Η- 五、發明説明（1 ) 發明背景 發明範圍 本發明係關於一般病毒學及疾病控制。特定言之，本 發明係關於突變的節肢動物傳媒之病毒其作爲疫苗之用途 〇 相關技藝之描述 節肢動物傳媒之病毒（樹狀病毒（arb ovirus ))是病 毒的病源，天然的狀況下能經吸血的昆蟲傳染。許多此類 之病毒具有聯結了嵌入的膜蛋白質的雙分子層膜，該膜爲 病毒顆粒（東加（Toga )病毒）之保護的被膜（ Schlesinger，S· and M.J. Schlesinger，1 990 ) 〇 總之，節肢動物傳媒之病毒是· ^堇次於瘧疾之昆蟲-傳 染疾病來源並且在全世界造成人類及動物之死亡（Berge A. 0· 1 975 )。此類病毒的病源至少包括：東方、西方及 委內瑞拉馬腦炎病毒、骨痛溢血熱症、日本腦炎、聖安基 羅熱（San Angelofever )、及黃熱病。此外，此類病源引 起的疾病在北美地區因引入傳染蚊子白斑蚊（Sprenger， and Wuithiranyagool 1 985 )而有復趦的趨勢（NIAID Report of the Task Force on Microbiology and Infectious Diseases 1 992，NIH Publication No· 92-3320 )。 依其特性，樹狀病毒（a r b o v i r u s )能在無脊椎的昆 蟲及哺乳類寄主的組織中複製（Brown, D. T.，and L, Condreay，1986，Bowers et al. 1995 )。此二種寄主細胞系 _ . I _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公趁） ~ ： (ΐί先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 一衣. 、1Τ -4- 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 589381 ir . -- *- ------- -------——— ______ 五、發明説明（2 ) 統在遺傳及生物化學環境上的差異是病毒能在一種寄主中 複製產生，而無法在另一寄主（寄主範圍的突變）中複製 產生的基礎。 目前，骨痛溢血熱症及東方型馬腦炎及其他的昆蟲攜 帶的病毒在美國日漸猖獗。美國陸軍及其他政府機構自 1 9 6 0年代起即致力於此類病毒疫苗之製作，但是並不 成功。因此先前之技藝並無對抗大多數節肢動物傳媒病毒 及其他經細胞膜包覆的病毒之疫苗。本發明滿足了技藝上 長久以來的須求及期望。 發明摘要 本發明的其中一個目的是提供一種基因工程的，經細 胞膜包覆的病毒，其中病毒經細胞,1膜的蛋白質編碼中刪除 一個或多個胺基酸，當遺傳工程製作的病毒於昆蟲細胞複 製時，此經細胞膜的蛋白質能跨越病毒的細胞膜，但是病 毒於哺乳類的細胞製時，此經細胞膜的蛋白質不能跨越病 毒的細胞膜。本發明針對此一目標之具體實施例之一是提 供一種節肢動物傳媒之病毒作爲遺傳工程的，經細胞膜包 覆的病毒。此外較佳之具體實施例中，節肢動物傳媒之病 毒可選自東加（T〇ga )病毒、法必（FlaW )病毒及龐亞（ Bunya )病毒及所有其他的自然狀況下能在哺乳類的及昆蟲 細胞複製之經細胞膜包覆的病毒，以及經遺傳工程於病毒 或細胞處理後能在此處理的哺乳類的及昆蟲細胞複製之經 細胞膜包覆的遺傳工程之病毒。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210'乂 297公t )1 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5- 589381 經濟部中央標準局負工消f合作社印裝 μ w 五、發明説明（3 ) 於本發明另一具體實施例中提供產生病毒疫苗的方法 ，將來自遺傳工程經細胞膜包覆的病毒接種哺乳類’其步 驟包括：用遺傳工程的方法將病毒的經細胞膜的蛋白質之 一個胺基酸刪除，產生遺傳工程的病毒，其中當病毒在昆 蟲細胞中複製時，經細胞膜的蛋白質能跨越包覆的細胞膜 ，但當病毒在哺乳類的細胞，中複製時，此蛋白質無法跨越 包覆的細胞，而病毒仍能於昆蟲細胞中複製；引入突變的 病毒至昆蟲細胞；及使突變的病毒於昆蟲細胞中複製產生 病毒的疫苗。 本發明另一具體實施例中，提供接種之方法，包括以 下步驟：將本發明之病毒的疫苗引入哺乳類的細胞，產生 細胞及組織非產生的感染進行免疫.的監視。 最後，本發明亦有一目的，以· \經野生蚊子散佈哺乳類 疾病，來自基因工程的，包覆細胞膜之病毒提供產生病毒 疫苗的方法，該方法包括以下步驟：用遺傳工程的方法將 病毒的經細胞膜的蛋白質胺基酸刪除產生遺傳工程的病毒 ，其中此遺傳工程的病毒在蚊子細胞中複製時，經細胞膜 的蛋白質能跨越包覆的細胞膜，但在哺乳類的細胞中複製 時，則不能跨越包覆的細胞膜.，且病毒仍能在野生蚊子細 胞中複製；引入突變的病毒至野生蚊子；及使突變的病毒 於野生蚊子的細胞中複製以產生一種蚊子，該蚊子品系內 含病毒疫苗，且不含野生型（致病的）病毒，當蚊子叮咬 時能將疫苗傳遞至被叮咬的哺乳動物。 本發明其他更進一步的目的、特徵、及優點可用以下 :氏張尺度適用中國國家標準（ CNS ) Λ4規格（210X 297公# | 一 ;-6 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 、11 589381

/W __________ 五、發明説明（4 ) 描述之較佳的具體實施例加以表明。此類之具體實施例是 用以揭示本發明。 詳細的發明說明 對熟於此技藝之專業人士而言，經本文揭示後可對本 發明進行各種取代及修飾，而不超脫本發明之範圍。 本文中”經細胞膜包覆的病毒”指含雙分子層脂類細 胞膜之病毒作爲保護的外層部份。 本文中”病毒的被膜”指含病毒及其相關蛋白質之細 胞膜的脂類細胞膜組成物。 本文中”節肢動物傳媒之病毒”或”樹狀的病毒（ arbovirus ) ”指能在節肢動物（昆蟲）或哺乳類的細胞複 製及產生病毒子代的病毒製劑。包東加（Toga )病毒、 法必（Flavi )病毒及龐亞（Bunya )病毒。 本文中”東加（Toga )病毒”指含一般分類之細胞膜 的病毒，包括α病毒。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本文中”雙分子層膜”指含反向兩性磷脂的雙層構造 。雙分子層的橫切面排列是從極性的頭部基團至非極性碳 鏈至非極性的碳鏈至極性的頭部基團極性的頭部基團。 本文中”糖類蛋白質跨細胞膜的部位”指嵌入細胞的 蛋白質跨越雙分子層膜部位之胺基酸序列。 本文中”病毒的疫苗”指具抗原性質但不會引發疾病 的病毒或突變病毒品系。 本文中”免疫的監視”指血液中淋巴細胞測量哺乳動 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ 297公龄j '' "7 589381 ΙΓ 'Ml" ' —_ι__ _ι· I I 一 -你··—·,· - .·- 一—*»*« · · > . . I __， 五、發明説明（5 ) 物的細胞及組織測定外來（病毒）蛋白質是否存在的過程 以及刺激能標定產生外來蛋白質細胞的淋巴球之產生以破 壞此細胞。此過程亦導致血液循環中對抗外來蛋白質抗體 之產生。 本文中”感染的病毒顆粒”指能進入細胞並產生病毒 蛋白質之病毒，而不論是否能產生病毒子代。 本文中”非感染的病毒顆粒”指不能感染或進入細胞 的病毒。 本文中”脊椎動物的細胞”指任何哺乳類的細胞。 本文中”無脊椎動物的”指任何的昆蟲細胞。 本發明係關於基因工程的，經細胞膜包覆的病毒，其 中此病毒經細胞膜的蛋白質之編碼刪除一個或多個胺基酸 ，因而此遺傳工程的病毒在昆蟲細/胞中複製時，經細胞膜 的蛋白質能跨越病毒的細胞膜，但病毒在哺乳類的細胞中 複製時，不能跨越病毒的細胞。本發明此目的之具體實施 例之一是提供節肢動物傳媒的病毒，該病毒選自東加（ 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁}

Toga )病毒、法必（Flavi )病毒及龐亞（Bunya )病毒， 以及所有其他在自然狀況下能在哺乳類的及昆蟲細胞中複 製的經細胞膜包覆的病毒，以及經遺傳工程於病毒或細胞 處理後能在此處理的哺乳類的及昆蟲細胞複製之經細胞膜 包覆的遺傳工程之病毒。 本發明亦包括用基因工程產生病毒的疫苗、包覆細胞 膜之哺乳類的接種病毒之方法，其步驟包括：用遺傳工程 的方法刪除病毒經細胞膜蛋白質的胺基酸，產生遺傳工程 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公f ) -8- 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 589381 五、發明説明（6 ) 的病毒’其中此遺傳工程的病毒在昆蟲細胞中複製時，經 細胞膜的蛋白質能跨越此細胞膜被膜，但病毒在哺乳類的 細胞中複製時不能跨越此細胞膜被膜，而此病毒仍能在昆 蟲細胞中複製；引入突變的病毒至昆蟲細胞，產生突變的 病毒作爲疫苗。 此外’本發明提供爲個體接種疫苗之方法，包括以下 步驟：引入本發明的病毒疫苗至個別的細胞；並使疫苗在 個體中產生免疫監視的病毒蛋白質。 最後，本發明提供產生病毒對抗疾病的疫苗經野生蚊 子傳佈之方法，包括以下步驟：用遺傳工程的方法刪除病 毒經細胞膜的蛋白質的胺基酸產生遺傳工程的病毒，其中 該遺傳工程的病毒在蚊子細胞中複製時，該經細胞膜的蛋 白質能跨越該細胞膜被膜，但該病)毒於哺乳類的細胞複製 中時，不能跨越該細胞膜被膜，而病毒仍能在蚊子細胞中 複製；引入突變的病毒至野生蚊子；並使突變的病毒在野 生蚊子細胞中複製，產生之蚊子攜帶疫苗品系之病毒，並 無野生類型（致病的）病毒，因而經蚊子叮咬能將疫苗傳 遞至被叮咬的哺乳動物。 依據本發明，可用傳統的分子生物，微生物及重組 D N A技藝。此類技藝參考以下文獻。參見，Maniatis， Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual( 1 982); MDNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis丨丨（M.J· Gait ed· 1 984); ’’Nucleic Acid 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297^>t ] — -9 - (請先閱讀背而之注意事項再項寫本頁) •鈿衣· 、11 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 589381 to ΙΓ .--- ---. —- -. 1 ' " .-.»i ——- 1 " - . . -··.-· 一. ·—>♦·<.丨__ 丨· ，_，，·—· . •一Ί" ' 1 ^ 五、發明説明（7 )

Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins edS. (1985)); Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. ( 1 984)); "Animal Cell Culture丨丨（R.I. Freshney，ed.( 1986));'丨Immobilized Cell And Enzymes" (IRL· Press，（1986 ));B. Perbal，"A Practical Guide To Molecular Cloning"( 1 984) 〇 因此本文中之名稱必須加以定義如下。 ”載體”是一種複製子，例如：質體、噬菌體或黏接 質體，能將另一 D N A片段聯接並複製聯接之片段。”醫 藥學上可接受的”載體指可被接受動物容忍之載體。試劑 治療之”有效的治療量”是指該試劑之治療量具生理學地 顯著性。若此試劑能顯著改變接受此試劑的哺乳類之生理 即此試劑具生理學地顯著性。例如/在治療病毒的感染時， 能降低感染程度或感染引起的生理損害之化合物，則可視 爲具有效地治療性。 ” D N A分子”指單股形式或雙股螺旋形式之去氧核 糖核苷酸（腺嘌呤、鳥糞呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶）之聚 合形式。此名稱僅指分子的一級及二次級結構，不包括特 定的三級結構形式。因此此名稱包括雙股D N A，尤其是 線性的D N A分子（例如，限制片斷）、病毒、質體、及 染色體。本文討論中之構造是依傳統的方式排列從5 ’至 3 ’的非轉錄D N A序列（即與m R N A相同的序列）。 D N A ”編碼序列”指在適當的調控序列控制下轉錄 及轉譯至多胜肽的雙股D N A序列。此編碼序列之範圍起 成張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公龄( ~ -10 - (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 、1Τ \v ___ \v ___ 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 589381 to 五、發明説明（8 ) 自5 ’ （胺基）端的密碼子終於3 ’ （羧基）端的翻譯終 止密碼子。編碼序列包括（但非限於）：原核的序列、來 自真核生物m R N A的c D N A、來自真核生物（例如， 哺乳類）的基因組D N A序列的D N A、及合成的D N A 序列。聚腺苷酸化作用信號及轉錄終止序列位於編碼序列 之3 ’端。 轉錄的及轉譯的控制序列是D N A調控的序列，例如 :啓動子、增強子、聚腺苷酸化作用信號、終止子等提供 寄主細胞表達之編碼序列。 ”啓動子序列”是D N A調控的部位能結合細胞內之 R N A聚合酶並啓動下游（3 ’方向）編碼序列之轉錄。 爲了定義本發明，啓動子序列聯結於轉錄起始位置之3 ’ 端並且向上游（5 ’方向）伸展，:1包含啓始轉錄至背景値 以上之量，所須要的最小數目之鹼基或元件。啓動子序列 內包含轉錄起始位置（用核酸酶S 1界定），及R N A聚 合酶結合之蛋白質結合結構區（一致序列）。真核生物的 啓動子通常含（但非絕對）” T A T A ”匣及” C A T，， 匣。各種啓動子可用於驅動載體。 本文中”寡核苷酸”或”探針”指含核糖核苷酸或去 氧核糖核苷酸分子。寡核苷酸或探針真正的大小視許多因 素而定’即視最終功能及使用之寡核苷酸而定。探針的長 度並不重要，通常包括至少大約1 2個鹼基，更當包括至 少大約1 6個鹼基，而探針能與部份細菌的基因組互補； 然而探針不須與基因組完美的互補。探針可用適當的合成 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公梦 (τί先閱讀背而之注意事項再頊寫本頁) ,#衣·

，1T -11 - 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 589381 ____ 五、發明説明（9 ) 技藝合成，並包括可偵測的標記。通常合成的序列可在選 殖載體共同公共區有效的展開以及在適當的寄主中得到大 重之探針。 展開的載體可標記後作爲探針，或含互補股可切割及 標記成較短之片斷。製備及使用核酸探針進行疹斷測試之 方法描述於上述之參考文獻，.及Falkow，et al之 U.S. Patent NO. 4,3 5 8,5 3 5 。 本文之”引子”指寡核苷酸，不論是天然發生經限制 水解後純化或合成產生者，置於引子伸展產物的合成條件 下均能作爲合成作用之起始部份，該引子與一股核酸互補 ，包括，即在核酸及引發試劑（例如：D N A聚合酶）存 在下及適當的溫度及P Η下進行反應。此引子可爲單股或 雙股並且其長度在引發試劑的存在)下足以引發須要的伸展 產物之合成。引子真正的長度視許多因素而定，包括溫度 、引子的來源及使用之方法。例如，於疹斷時，視目標序 列複雜性而定，典型之寡核苷酸引子含1 5 - 2 5或更多 之核酸，亦可含較少之核酸。 本文選擇之引子爲”大體上”互補至特定目標DNA 序列之不同股。亦即此引子必須足以互補雜交至其對應股 。因此引子序列不必反應出真正的模板序列。例如非互補 的核酸片斷可連接至引子的5 ’端，其餘的引子序列可互 補至模板股。此外，非亙補或較長序列之鹼基可散布於引 子內，提供引子序列與模板雜交足夠的互補性，合成伸展 產物。 成張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X^7公舞)1 " ' 丨· -12- 請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 衣. 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 589381 五、發明説明（1〇 ) 本文中”限制核酸內切限制酶”及”限制酶”指細菌 的酵素，各酵素可在特定的核酸序列切割雙股D N A。 細胞”轉染”指將外生性或非同源D N A引入細胞。 轉染的D N A可以或不必嵌入（共價鍵的連接）細胞 的基因組。”群落”指一群經有絲分裂來自單一細胞或共 同祖先的細胞。”細胞株”指能在離體生長許多代的初級 細胞之群落。 ”非同源的”部位之D N A構建體是在一個較大的 D N A分子內一段可辨識的D N A片段，該片段在自然狀 況下並沒有聯結在一起。因此當非同源的部位編碼哺乳類 的基因時，此基因周圍的DNA通常不是來源生物體基因 組周圍的哺乳類基因組D N A於另一實驗例中，編碼序列 構建體之編碼序列在自然狀況下並沐存在（例如，基因組 編碼序列c D N A含插入，或含不同於天然基因密碼子的 合成序列）。 預期醫藥學的成分可利用本發明新穎的突變病毒製備 。此狀況下，藥學的成分含本發明新穎的病毒及醫藥學上 可接受的載體。一般熟於此技藝之專業人士不必實驗即能 決定適當的劑量及此病毒接種疫苗化合物的治療路徑。 於活體中進行治療時，用有效治療量（即接種個體進 行治療與特定病毒聯結疾病之量）的本發明疫苗治療病人 或動物。通常爲非經腸的治療，較佳者爲靜脈治療，但其 他適當的治療路徑亦可使用。治療的疫苗量介於大約1 0 3 至大約1 0 6 P f u / k g之病人重量。此流程會最適化治 紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /\4規格（210'乂297公飨1)1 一 (銷先閱讀背而之注意事項再填寫本頁)

、1T -13- 589381 Λ7 ____ ΙΓ 五、發明説明（11 ) 療效應’平衡治療的反效果。參見r e m i n g 10 n，s Pharmaceutical Science, 17th ed. ( 1 990) Mark Publishing Co.，Easton，Penn.;及 Goodman and Gilman's: The Pharmacological base of Therapeutics 8th ed (1990)

Pergamon Press ;全文在此并入參考文獻。非經腸的治療時 ’最常見的疫苗是配製成單位劑量注射形式（溶液、懸浮 液、乳劑）與醫藥學的可接受的非經腸的賦形劑結合。此 賦形劑較佳者可爲非毒性及非治療性的賦形劑。此賦形劑 之實施例爲水、生理食鹽水、林格氏（Ringer )溶液、葡 萄糖溶液、及5 %人類血淸蛋白素。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本發明之疫苗是基於經細胞膜包覆的病毒經細胞膜的 結構區蛋白質之刪除突變。產生此類突變之策略是基於以 下之資料：昆蟲細胞與哺乳類的細她膜不同不含膽固醇（ Clayton 1964，Mitsuhashi et al 1983 )。含膽固醇之細胞 膜較厚。膽固醇越多細胞膜越厚（Bretscher，1993 )。許 多包覆膜的病毒於其表面具細胞膜糖類蛋白質，能辨視及 感染標的細胞（Schlesinger，S. and M.J. Schlesinger，1990 )。此類細胞膜糖類蛋白質具疏水的跨越細胞膜結構區， 能將蛋白質固定在雙分子層細胞膜上（Rice et al 1 982 ) ο 此類經細胞膜的蛋白質之跨越細胞膜結構區，必須長 到足以從雙分子層的一端達到另一端以將蛋白質固定在細 胞膜上。實驗顯示若結構區內刪除胺基酸縮短結構區，則 蛋白質無法適當的與細胞膜結合並脫落（A d a m s a n d R 〇 s e · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公飨）,1 " (-14 - 589381 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A? ΙΓ五、發明説明（12 ) 1 985 )。 因爲昆蟲細胞膜不具膽固醇’昆蟲產生的病毒細胞膜 較哺乳類產生的病毒細胞膜在橫切上較薄。因爲昆蟲細胞 膜較薄，所以昆蟲細胞膜嵌入蛋白質跨越細胞膜結構區不 必如嵌入哺乳類細胞膜一般長。因此可能產生遺傳工程的 病毒，從病毒的糖類蛋白質中刪除經細胞膜的結構區之胺 基酸。因此正常病毒複製時能嵌入昆蟲細胞細胞膜之糖類 蛋白質，不能嵌入哺乳類複製之病毒的細胞膜。因此昆蟲 細胞寄主能如同複製野生型病毒般產生的突變病毒。換句 話說，於哺乳類中突變病毒可感染寄主產生病毒的蛋白質 ;然而因爲突變的病毒糖類蛋白質不能跨越及固定於哺乳 類的膜，於哺乳類的細胞中不能產生子代病毒。本發明另 一附加的優點是突變爲遺傳工程的/刪除突變體，因此絕對 地無一般病毒疫苗法回復爲野生表現型的問題。 本發明之疫苗可使用於許多脊椎動物及無脊椎的細胞 經細胞膜包覆的病毒。本發明應用之經細胞膜包覆的病毒 可爲遺傳工程的病毒生長於昆蟲細胞，或經細胞膜包覆的 病毒生長於遺傳工程修飾的昆蟲細胞。 以下的實施例是用以說明本發明之各種具體實施例而 非限制本發明之範圍： 實施例1定點突變Toto 1 101 : 利用完整長度選殖之α病毒新必（Sindbis )，描述於 (Liu et al 1 996，Rice et al.，1 9 87 )，將病毒糖類蛋白 戒張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公漦）1 (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) f

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線I -15- 589381 ΙΓ I --------, - - - 一 ··》 . — . ·.» — · -** ·· · 〜峰觸 _ 〜五、發明説明（13 ) 質E 2胺基酸序列之位置3 9 1的編碼離胺酸刪除3個鹼 基。此離胺酸是此蛋白質推定的跨越細胞膜結構區（Rice et al 1 982 )。 定點突變用於產生Toto 1101之刪除突變（ 經濟部中央標準扃負工消費合作社印製 L Y s 3 9 1 )，含新必（Sindbis) cDNA 全長及 S P 6啓動子之質體可從離體選殖體轉錄感染的R N A ( Rice et al. , 1 987 Liu and Brown，1 993a )。利用巨引子 之 P c R 定 點 突 變 方法（Sarkar an d Sommer, 1990 ) 描 述 如 -V 刖 ( Li u an( i Brown, 1 9 9 3; a ) 將三 ‘個 1核酸 丨從 To to 1 101 之 c D N A選殖體 中 移 除 核 酸 (η t s : ) 9 8 〇 1 9 8 〇 2、9 8 〇 3 ， 結 果 移 除密 碼 子 A A A ( K 3 9 1 ) O 用 3 0 個 驗 基 寡核苷酸 序 列 ,丨5 贅 C T C A C G G C G C G C A C A G G C A C A T A A C A C Τ G C 3 > 作 爲 定 點 突 變 引 子 O 此引子沿 著 、八 刖 進 引 子 ” 5 > C C A T C A A G C A G T G C G T C G 3 ψ ( 1 8 m e r ) ) 產 生 5 1 8 個 驗 基 的 ”巨引子 ” ( 核 酸 9 2 9 5 — 9 8 1 3 ) ο 第 二 個 P C R J S應含0 z 5 // g之巨引子， 1 0 0 β g To to 1 101之模板及0 • .5 β g 之 ” 反引 子 jj 5， G G c A G T G T G C A C C I T A A T C G C C T G C 3 > 〇 所 有 的 P C R反 應 進 行 3 0 個 循環 ， 於 9 5 °C 下 進 行 1 分 鐘 j 6 4 °C下進 行 1 分 鐘 7 2 °C 下 進 行 1 分 鐘，最後在7 2 °C下反應8分鐘。產生的P C R產物（ 114 9 nts)用 BCL I 及 SPL 插入 T〇toll〇l 適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（),1 "~~ -- (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 衣· -一口 589381 五、發明説明（15 ) 6 m Μ聚葡萄糖之電穿透作用緩衝液中轉染蚊子的細胞。 此三種細胞最適的電穿透作用係數爲2 κ ν 2 5 p F、 ⑺電阻。轉染細胞在3 7 °C下反應直到具細胞病理效應爲 止（大約2 4小時）。 反應2 4小時後，從感染的細胞株及無r n A轉染之 控制組中收集培養液。 . 用噬菌斑測定來測試來自各細胞株之培養液中是否有 感染蚊子及Β Η K - 2 1細胞單層的病毒（描述於Renz and Brownl976 )(表 1 )。

表I 用野生類型或突變K 3 9 1新必rSimdhis )病毒轉染 Β Η K 2 1或白斑蚊細胞產牛轉染尚病毒 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 轉 染的 轉 換 的 含 野 生 含 K391 轉染 的 含 野 生 含 K391 細 胞株 BHK 控 型 RN A RN A 之 AA控 制 型 R N A R N A 之 制 組2 1 之 BHK BHK 組 之 AA AA 培 養液 沒 有 感 染 沒有 沒有 感 染 沒有 對 Β Η K 偵 測 到 5 X 107 偵測 .到 偵’測 到 2 X 107 偵測 到 滴 定 病 毒 病 毒1 'ml 病毒 病毒 病 毒, lm\ 病毒 培 養液 沒 有 感 染 沒有' 沒有 感 染 沒有 對 A A 偵 測 到 8 X 107 偵測 到 偵測 到 4 X 107 1 X 107 滴 定 病 毒 病 毒/ ,ml 病毒 病毒 病 毒i /ml 病毒1 'ml Α 控制組指轉感染過程中不含RNA。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X29*7公發f 589381 _ h1 _ 五、發明説明（16 ) 如表1 ，突變K 3 9 1只有在昆蟲細胞中複製才能產 生感染的病毒顆粒。此病毒只能在蚊子細胞中產生噬菌斑 。Β Η K細胞轉染K 3 9 1後於Β Η K或白斑蚊細胞中測 定均無可偵測的病毒產生。若培養的Β Η Κ用來自轉染蚊 子細胞的病毒感染，則無可偵測的病毒產生。R Ν Α編碼 的野生型病毒會產生感染的病毒，於此二細胞株中產生噬 菌斑（表1 )。 實施例3 代謝的放射性活性標記病毒的蛋白質：

將次滿的單層Β Η K 2 1細胞於2 5 c m 2之燒瓶中， 如上述之方法，用野生類型或K 3 9 1突變R Ν A轉染。 將單層細胞於不含甲硫胺酸一及半胱胺酸（Μ E Μ - E ) ，含1%FCS，麩胺醯胺,1酸及5% TPB之培 養液（禁食培養液）中禁食3 0分鐘。轉染後1 6小時， 細胞加入標記的禁食培養液，含5 0 // C i / m 1 [ 3 5 S 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 劫先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 〕M e t / C y s標記蛋白質，混合2 0分鐘。用含7 5 V g / m 1環己醯亞胺之P B S淸洗單層細胞後終止標記 。單層細胞在含十倍正常甲硫胺酸及半胱胺酸濃度及7 5 // g / m 1環己醯亞胺的培養液中追縱4 5分鐘。 實施例4 免疫沈澱及聚丙烯醯胺凝膠電泳： 放射性標記的病毒蛋白質用抗血淸進行免疫沈澱（參 見 Knipfer and bROWN， 1 989 ) 。 〔 3 5 S 〕M e t / C y s標記的細胞用冷的P B S淸洗兩次並在溶解緩衝液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公# i " -19- 589381 1Γ 五、發明説明（17 ) :0.5% NP — 4〇，0.〇2M T r i s H C 1 pH7.4，0.05M NaCl， 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 0 . 2 m M PMSF，〇.2mM TPCK 及 〇· 0 2 m Μ T L C K中溶解。細胞核用離心沉澱法沈 澱後丟棄。上淸液用1 0 0 // 1之蛋白A /瓊脂糖玻璃珠 (S i g m a )預先吸附後懸浮於溶解緩衝液中1小時，然後沈 澱玻璃珠。預先被吸附的上淸液用2 0 0 // 1之蛋白質A /瓊脂糖玻璃珠耦合至兔子抗S VHR血淸或E 2尾端單 一專一的多株血淸處理並在4 °C下攪動過夜。此免疫沈澱 的珠-抗體-蛋白質複合物用溶解緩衝液淸洗三次然後溶 於S D S - P A G E之樣品緩衝液，含1 2 %甘油，4 % SDS，5〇mM Tris ρΗ6·8，5%锍基 乙醇及0 · 0 2 %溴酚藍。樣品在/ 9 5 °C下加熱3分鐘後 從樣品中用離心沉澱法移去玻璃珠。凝膠電泳於1 〇 . 8 % SDS — PAGE或16% Tncine凝膠中進行（參 見 Liu and Brown，1993 a，b)。進行顯相時（參見8〇111^ and Laskey, 1974 )，乾燥的凝膠用Kodak XAR-5軟片感光 (參見圖1 )。 實施例5 穿透式電子顯微鏡 將用來自蚊子細胞轉染之K 3 9 1進行感染或用 K 3 9 1 R N A轉染的單層Β Η K — 2 1細胞用胰蛋白 酶處理一定時間後從培養盤中釋出，細胞以低速離心沉澱 法沈澱。沈澱細胞用P B S淸洗兩次並在4 °C下固定於4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )，\4規格（210 X 297公瓦1 ' -20 - 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 589381 π ir 五、發明説明（18 ) %戊二醛過夜。然後細胞用0 · 2 Μ二甲砷酸鹽緩衝液（ Ρ Η 7 · 2 )淸洗三次，在室溫下用2 %餓酸酐後固定1 小時，並用二甲砷酸鹽緩衝液淸洗三次。細胞用0 · 5 % 之醋酸鈾醯在室溫下染色（en bloc ) 1小時。淸洗三次後 ，細胞沈澱包埋於1 %瓊脂糖並用試劑級之乙醇/丙酮依 序脫水。最後在7 0 °C下包埋於Mollenhauer、（1 964) Epon -Araldite環氧化物混合物# 1中兩天。用Sorvall MT5000 切片機進行Ultrathin切片並用1 5 0 m e s h之銅網收集 。切片用1 %醋酸鈾醯及/或檸檬酸鉛染色並用Jeol 100CX穿透式電子顯微鏡顯相（參見圖2)。 雖然感染K 3 9 1病毒之Β Η K細胞或轉染K 3 9 1 R Ν Α不會產生可偵測的病毒噬菌斑，電泳P A G Ε顯 示其產生病毒構造蛋白質（圖1 )]。此外電子顯微鏡顯示 細胞之內有組合的（非感染的）病,毒核心（圖2 )。 實施例6 使用新必（Sindbis )刪除突變K 3 9 1及其 他的東加（Toga )病毒產生的相似突變： K 3 9 1在蚊子細胞中複製，產生新必（Smdb1S )病 毒顆粒。蛋白質暴露的部位（外結構區）是野生型序列。 此野生型蛋白質使病毒進入哺乳類的細胞並產生病毒蛋白 質（參見圖1 )，但是在電子顯微鏡下顯示新病毒並無組 裝，如圖2。 K 3 9 1是一種疫苗品系。在培養的昆蟲細胞中產生 非常高之濃度。但是當病毒注入哺乳類的寄主時，病毒在 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公# j 丨，-21- 請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 589381 五、發明説明（19 ) 血液中循環並感染哺乳類的寄主細胞，此感染的細胞經免 疫的監視產主及呈現病毒蛋白質，但因爲膜結構區被截斷 ，感染僅限於此類起始時接種之細胞。因爲疫苗品系是刪 除突變的產物，所以逆轉回野生型病理的表現型並不可能 〇 此外，遺傳工程的刪除突變可引入野生蚊子。此類病 毒從母親經病毒的感染（Leakey 1 984 )傳佈至子代。當此 類蚊子叮咬脊椎動物時，會提供免疫的劑量（1 0 6感染的 顆粒）之疫苗品系（例如：K3 9 1 ) 。Karpf and Brown (1 997 )指出α病毒感染昆蟲細胞可預防細胞被另一病毒 感染，即使是α病毒的遠親且時間間隔久遠（超過兩年之 細胞培養，而蚊子的壽命爲2 8天）。因此，疫苗品系（ 例如新必（Sindbis ) Κ 3 9 1 )可1抑制此類昆蟲其他相關 的及致病的病毒之傳佈。 、 實施例7 本發明描述之方法可用於任何在昆蟲及哺乳類複製的 病毒（部份構造含嵌入的膜蛋白質，稱爲東加（Toga )病 毒、法必（Flavi )、病毒及龐亞（Bunya )病毒、及所有 其他的自然狀況下能在哺乳類的及昆蟲細胞複製之經細胞 膜包覆的病毒、以及經遺傳工程於病毒或細胞處理後能在 此處理的哺乳類的及昆蟲細胞複製之經細胞膜包覆的遺傳 工程之病毒 ° 於被膜的病毒中移除蛋白質跨越膜結構區之胺基酸， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4«L格（210X 297公龄/ (邡先閱讀背而之注意事項再填寫本頁)

、1T -22- 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 589381 Λ] )Γ 五、發明説明（2〇 ) 可製作抗任何含膜病毒之疫苗。經移除前述選殖之病毒 c D Ν Α的鹼基。將來自其他選殖體轉錄的R Ν Α轉染至 昆蟲細胞。產生之病毒重覆的在昆蟲細胞中生長放大直到 得到大量之突變病毒爲止。此病毒於哺乳類的細胞中測試 其感染及產生子代的能力。測試在哺乳類的細胞不會產生 子代的病毒對實驗動物產生免疫之能力。產生免疫力之病 毒則是已知技藝中產生人類及動物疫苗的候選病毒。此方 法可用於任何樹狀的病毒（arbovirus )或其他經細胞膜包 覆的病毒。 以下爲本文引用之文獻：

Adams G.A. and Rose J.K. ( 1 985) Structural requirements of a membrane-spanning domain for protein anchoring and cell surface transport Cell. 41(3):1007-15

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Bonner, W. M., and R. A. Laskey. 1 974. A film detection method for tritium-labeled proteins and nucleic acids in polyacrylamide gels. Eur. J. Biochem. 46:83-88.

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Bretscher MS. (1993)Cholesterol and the Golgi apparatus. Science. 261(5126):1280-1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公# ) 1Λ先間讀背而之注意事項再填寫本頁) 衣. i —- - _ ;-23 - 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 589381 A? _ Η*7 五、發明説明（21 )

Brown, D.T., and L. Condreay ( 1986). Replication of alphaviruses in mosquito cells. In The Togaviridae and Flaviviridae. S. Schlesinger (ed.), pp. 473-501.

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Knipfer, M. E., and D. T. Brown. 1 9 8 9. Intracellular transport and processing of Sindbis virus glycoproteins. Virology 170:117-122.

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Liu N., H. Lee, R. Hernandez and D.T. Brown(1 996) Mutations in the Endo Domain of Sindbis Glycoprotein E2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公# (邡先間讀背而之注意事項再填寫本頁)

-24- 589381 A ! 一 Η - 五、發明説明（22 )

Block Phosphorylation, Reorientation of the Endo Domain and Nucleocapsid Binding. Virolog 222: 236-246.

Mitsuhashi et al 1 9 8 3. Sterol free eucaryotic cells from continuous cell lines of insects. Cell Biol. Int. Rep. 7: 1057- 1062.

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Rice., C.M., R. Levis, J.H. Strauss, and H.V. Huang. 1 9 8 7 Production of infectious RNA transcripts from Sindbis virus cDN A clones: mapping of lethal mutations, rescue of a temperature sensitive marker, and in vitro mutagenesis to generate definec mutants. J. Virol. 6 1:3809 -3819.

Sarkar，G·，and S. S. Sommer. 1990· The 巨引子" method of site-directed mutagenesis. BioTechniques. 8:404- 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21〇X29h>^ ) -25- 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 589381 Η"7 五、發明説明（23 ) 407.

Schlesinger, S. and M.J. Schlesinger (1990). "Replication of Togaviridae and Flaviviridae.M (D.M. Knipe and B.N. Fields, eds.), In Virology Vol. I, pp. 697-711. Raven Press, Ltd., New York.

Sprenger, D. and T. Wuithiranyagool (1985). The discovery and distribution of Aedes albopictus in Harris County, Texas. J. Am. Mosquito Control Assoc. 2:217-219 本文引用之任何專利或文獻代表熟諳此技藝者對本發 明之相關水準。此外，若個別之文獻已特定的及個別的并 入參考文獻，此類之專利或文獻全文在此并入參考文獻。 對熱悉此技藝的專業人士而言，閱讀本文後即可知本 發明實現之目的及優點。本發明描)述之實施例、方法、流 程、處理、分子、及特定之化合物用較佳之具體實施例代 表，此類實施例不是用來限制本發明之範圍。熟諳此藝者 可對本發明作出修正，但均屬於本發明之申請專利範圍之 內。 圖形簡述 此處之附圖可突顯本發明之上述特徵、優點及目的並 可詳細了解本發明。同時附圖中說明之較佳具體實施例不 應用以限制本發明之範圍。 圖1說明從轉染的組織培養細胞中回收放射性標記的 新必（Sindbis )病毒蛋白質。未經轉染的b Η K - 2 1細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 規格（210X297公焚j, LIL-----参-丨 (翊先閱讀背而之注意事項再填寫本頁)

、1T -26- 589381 五、發明説明（24 ) 胞（1)，用突變的A391 RNA轉染（2)，及用 A 3 9 1 R N A轉染白斑蚊細胞（3 )，用如描述於實 施例3之方法用放射性的胺基酸進行標記。轉染後2 4小 時’用抗病毒專一性的血淸如實施例4之描述將蛋白質沈 澱。此圖顯示轉染刪除突變R N A之Β Η K - 2 1細胞及 白斑蚊細胞，能產生三種未轉染細胞所沒有的病毒構造蛋 白質Ε 1 、Ε 2、及C。 圖2 a及2 b是Β Η Κ - 2 1細胞（2 a )及轉染新 必（Sindbis )病毒刪除突變a 3 9 1之R N A的白斑蚊細 胞（2 b )的電顯圖。細胞之轉染如描述於實施例2。 Β Η K - 2 1細胞（a )在細胞細胞質（a )具有核心構 造之病毒串’即使此類細胞不產生成熟的病毒（表1 )。 白斑蚊細胞（b )亦能產生病毒核:1心串；雖然此類核心類 似Β Η K - 2 1細胞（a )位於細胞細胞質並與細胞膜（ B )聯結。後者不存在於B H κ 一 2丨細胞，顯示糖類蛋 白質Ε 1及E 2就算出現亦不會黏結在一起。 l·I-^-----0衣-I (劫先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 本紙張尺度適用中國國家才^^7^叫八4规格（210'乂297公势| -27-

Claims (1)

1. 589381

   f \Γ*. A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 附件 2 : (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第871 1 6968號專利申請案 修正後無劃線之中文申請專利範圍替換本 民國92年12月26日修正 1 · 一種遺傳工程之新必（Sindbis)病毒，其包含病 毒跨膜糖蛋白E 2，該病毒跨膜蛋白質能跨越昆蟲細胞之 膜但不能跨越哺乳動物細胞之膜，其係因爲該跨膜蛋白質 中之1或多個胺基酸係遭刪除，且其中該病毒能夠感染昆 蟲細胞並於昆蟲細胞中產生子代病毒，且能夠感染哺乳動 物細胞但不能於哺乳動物細胞中產生子代病毒。 2 ·如申請專利範圍第1項之遺傳工程之新必病毒， 其中該昆蟲細胞爲蚊子細胞。 3 .如申請專利範圍第2項之遺傳工程之新必病毒， 其中該蚊子細胞是白斑蚊細胞。 4 ·如申請專利範圍第1項之遺傳工程之新必病毒， 其中該哺乳動物是人類。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 .如申請專利範圍第1項之遺傳工程之新必病毒， 其中該病毒是K391病毒。 6 · —種自遺傳工程之新必病毒製造用於接種哺乳動 物的病毒疫苗之方法，該方法包括步驟··構築申請專利範 圍第1項之遺傳工程之新必病毒； 導入該病毒至昆蟲細胞中；及，令該病毒於昆蟲細胞 中複製以產生病毒疫苗。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公瘦）

   — A:

   871 16968號專利申請案 民國90年3月呈

   圖2A 58938