TW577924B - A process for the production of virus-inactivated immunoglobuoin and albumin from frozen plasma - Google Patents

Description

577924 柒、 指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（一）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 1.冷凍血漿 2.亞甲藍病毒去活化3·固體球蛋白 4··〇·02Μ醋酸鈉緩衝液(ρΗ5·2)洗出液 5·免疫球蛋白純化步驟 6.白蛋白 7.免疫球蛋白 捌、 本案若有化學式時•請揭示最能顯示發明特微的化 學式： 姐 一"、 玖、發明說明： (―)發明背景 1.免疫球蛋白與白蛋白之功能 免疫球蛋白與白蛋白甚具醫療價值及潛力，如免疫球 蛋白在預防及控制感染(1)、治療一些第二型自體免疫疾病⑵、 原發性體液免疫不全等皆有無法取代的地位；而白蛋白為 生理上維持滲透崔及物質輸送之主要工具，臨床應用於休 克狀態處理、燒燙傷急救、營養不良等用途亦相當廣泛。 而從血液中安全地提煉此二蛋白質之技術的建立’不但直 接影響國民之健康福祉，間接亦能保障國家之自主力 量；針對上述需求，建立適用於國内環境之jliL藏分餾技術兆 進一步應用其產製免疫球蛋白與白蛋白，發展具有相當規模 5 的血液科技產業，實已刻不容緩。 2. 免疫球蛋白與白蛋白之傳統製法 因為血液成分複雜，保存不易，在療效專一性、方便 性上有所缺限，故自1 940年代初期即利用血漿成分在冷酒 精中不同之溶解度的原理而分別沉避w，藉以純化出免疫球 蛋白、白蛋白與其他蛋白質，但是此種沉澱法無法完全消除 病原，尤其是一些人類病毒，雖經熱處理，亦能存活於最後 製劑内，因而使用後導致感染的情況時有所聞(57)。甚而國内 也相繼出現類似案例。而比較進步之方式，則採取色層分離 (chromatography)取代部分或全部之酒精沉澱步驟，以提高 純化之效益及流程中減少病毒的能力(Θ)。 此外，為進一步加強去病毒的能力和製劑安全，傳統製 程在半成品前均包括如巴氏滅菌法(pasteurization)和溶劑-清ί絮劑(solvent-detergent process) (9)或紫外線消毒等步驟 (1Q)，因而拉長生產流程提高成本；最後，傳統製法對原料 之選擇並不像直接使用冷凍血漿(IVozen plasma)那麼簡單， 而是必須以台灣較為稀有的新鮮冷凍血漿(fresh frozen plasma)為原料，雖然國外有些研究者從人類冷凍血聚成功 地分離出免疫球蛋白與白蛋白(11)，但含有去活病毒並普遍使 用冷凍成漿為原料之成功生產流程並不多見。 發明概述 本發明之目的在於建立一含有病毒去;舌步驟並可有效 地利用冷凍血漿分離出免疫球蛋白與白蛋白之生產流程。國 外技術常以新鮮冷凍血漿為原科，但是此類流程將導致國内 捐血中心無法提供充裕原料，而使工廠無法立即持續投產。 為解決這種問題，吾等建立一新的免疫球蛋白與白蛋白 之生產流程(詳參第一圖）。進一步應用(超)過遽及離心技術 配合離子交換色層分離方法，並以國内供過於求的袋裝冷 凍血漿為材料，同時導入亞甲藍一可見光反應直接在原料 階段進行病毒去活。本生產流程尚具有二個可斷點之特性： 袋裝冷凍血漿減毒處理後與球蛋白濃縮液製成後可冷凍或冷 藏儲存，可有效地調控免疫球蛋白與白蛋白之生產。 本生產流程所採用的亞甲藍一可見光反應已自 1 992年起在德國及瑞士實際使用於輸血用袋裝新鮮 冷凍血嚴的病毒去活處理(12)，其原理為使用如亞甲藍等 (methylene blue or toluidine blue)含苯環結構之光活性物 質與核酸結合，以其還原作用達成病毒去活之目的(13’14)。 吾人在此亦證實該反應亦能成功地應用於冷凍血嚴原料之病 毒去活。 發明的詳細說明

8°C以下儲存之約1 20 m丨袋裝冷凍血漿以27 °C水 浴經17分鐘解凍後以無菌裝置注入約2.5 rr\L之 mM亞甲藍溶液(Sigma, St· Louis，MO)，使最終亞甲藍在 血漿之濃度達1 mM/ Gso mg/L)，然後血袋在彳〇 X的暗 577924 房搖晃一 <卜時使亞甲藍均勻混合作用，光照反應以全光域燈 泡(Philips 50,0〇0 Uux)在20〇C的環境下進行一小時， 經處理過之血袋可立即拆開進行純化步驟，或是於45分鐘 内結凍於-1 8°C以下。處理步驟請詳參第二圖。 球蛋由濃縮液之製備 經亞甲藍去活病毒處理過之冷凍血聚以10,000 xg離心 去除沈锻物後以 XK1 6 管柱（Pharmacia Biotech，Uppsala， Sweden)及 Sephadex &25C 樹脂(Pharmacia Biotech)進行粗膠 體過漶，最後將以〇·〇〇5Μ MaAc (sodium acetate)緩衝液 (pH7X>)洗下之蛋白質溶液酸鹼度以1M醋酸調至pH5.2並於 4°C沉澱1 6小時後即為球蛋白濃縮液；球蛋白濃縮液可離心獲 得固體球蛋白。 白蛋白之純化 將固體球蛋白之離子度調整到0.02ΛΑ後以DEAE Sepharose Fast Flow (FF)樹脂(Pharmacia Biotech)進行陰離子交換藉以吸 附免疫球蛋白與白蛋白，先以0·〇2Μ MaAc緩衝液(ρΗ5·2)洗下 DEAE Sepharose FF上之免疫球蛋白後移出以進行免疫球蛋白 之純化動作，而白蛋白可由〇.025 Μ MaAc，pH4.5緩衝液洗出， 再以 CM Sepharose FT 樹脂(Pharmacia Biotech)進行陽離子交 換藉以吸附白蛋白，再由Ο· 1 1 M NaAc，ρΗ5·5沖出，最後以 30Κ cut-off ^ Jumbosep™ (Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Ml)做超過遽去除鹽分，即得7%〜10%純化之白蛋白。 免疫球蛋白之純化 DEAE Sepharose/FF 樹脂(Pharmacia Biotech)之沖出液移出 8 577924 首先以1Μ ΝαΟΗ與水調整酸鹼度(至pH6.5)及導電度(1.4〇mS) 後，以 Q Sepharose FT* 樹脂(Pharmacia Biotech)進行陰離子交 換藉以吸附免疫球蛋白，然後以0·02Μ MaAc緩衝液(ρΗ6·5)洗 下含有免疫球蛋白之部分後，再以CM Sepharose FF樹脂 (Pharmacia Biotech)進行陽離子交換藉以吸附掉不純物，最後加 入終濃度分別為〇·1 5 Μ及0.1 Μ之MaCI與glycine，並以30K cut-off 之」umbosep™ (Pall Oelman Sciences)及碟酸鹽緩衝液 做透析超過濾，即得純化之免疫球蛋白。

酵素免疫分析

以三明治酵素免疫分析法[sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay (EUSA)]與已知潰度的標準溶液比較，來 測量免疫球蛋白與白蛋白之產量：以50 mM, pH 9·6之碳酸 鹽緩衝液(carbonate buffer) 4,000倍稀釋的兔抗人免疫球 蛋白與白蛋白抗體(rabbit anti-human immunoglobulin and rabbit anti-human albumin, Dakopatts, Copenhagen, Denmark) 在37°C錢96孔EUSA盤一l·時並加以洗淨，然後每孔加入 50 ml之待測液，經37°C反應、室溫沖洗後再加入3,000 倍稀釋的兔抗人 IgG· (peroxidase-labeled rabbit anti-human lg& and anti-hunaan albumin; Dakopatts)，經呈色反應後，於厶9〇 nm測其吸光值；免疫球蛋白與白蛋白之標準溶液分別購自 Dakopatts與Sigma。以酵素免疫分析測量免疫球蛋白與白蛋白 之量並計錄(附表一）。 線狀噬線狀噬菌體M13病毒之定置 線狀。ϋ線狀嗤菌體JVM 3購自Pharmacia Biotech並於 JM1 01種系(Strata^ene, La Jolla，CA)之大腸桿菌上並以平板培 9 577924 養(plating culture)純化；大腸桿菌則用LB培養基於37^(3中培 養。噬菌體以在M9軟洋菜膠(soft agar)上使大腸桿大腸桿菌菌 落生長緩慢而形成的溶菌斑(plaque)數目計量(pfu)。實驗時先將 101CD噬菌體病毒注入血袋，然後經過減毒處理、球蛋白濃縮 液、免疫球蛋白與白蛋白之步驟，最後收集成品並適量稀釋後， 溶入200 ml的M9液體培養基中，強烈振盪(vortex)、靜置1 小時後與200 ml的大腸桿菌(006。。=0.6)及3 ml的軟洋菜膠 (5〇°C)，混合均勻後倒在M9固體培養基上，待凝固後放於28 °C培養1 6小時後，即觀察計量形成的溶菌斑。計算出來分離處 理前後二者噬菌體的比率(附表二）。 附表一：處理分離前後免疫球蛋白與白蛋白之變化及產量

Jfil殿分離代 各 步 驟 的 產 物 量 MB*-light 處 球蛋白潰縮液 終產 品 號 (每公升總含 理後 量） 免疫球 白蛋白 免疫球 白蛋白 免疫球 白蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 4.3 12 3.Λ 20. 3.1 20. 3.0 20. _ 9# 1 8 g 〇 g g 2 g g Og 23. 7 g* 3·2 ΟΙ 3.0 1 4-. 2.8 15· 2.0 14. 〇广 g# 25 g 9 g g 3 g g 9 g m 3 g* #免疫球蛋白 *白蛋白 10 577924 附表二：處理分離後噬菌體的數目 血漿分離代 號 產物内 噬 菌 體 (pfu) 的 數 目 MB氺-light 處 球蛋白濃縮液 免疫球蛋白與白 理後 蛋白 861218 1.2 X 1 Ο4 3.0 X 1 Ο3 0.9 X 1 Ο2 870125 7.6 X 1 Ο3 0.3 X 1 Ο3 〇§ 870220 8.4 X 1 Ο3 1.4 X 1 Ο3 Ο 870302 6.3 X 1 Ο3 0.9 X 1 Ο3 〇 #開始時每個血袋注入1 01°pfu M1 3

* methylene blue §表大腸桿菌培養觀察不到溶菌斑

11 577924 參考資料 1. Pollack M. Antibody therapy in gram-negative bacterial disease. In: Morell A, Mydegger UE, eds. Clinical use of intravenous immunoglobulins· London: Academic Press, 1 986:31 7-26. 2. Bussel J, Hilgartner MW. The use and mechanism of action of intravenous immunoglobulin in the treatment of immune haematologic disease. Br J Haemat 1 984-;56: 1 3. Hassig A· Intravenous immunoglobulins: Pharmacological aspects and therapeutic use. Vox Sang 1986; 51:1 07· 4. Cohn EJ, Strong LE, Hughes WL Jr, et al. Preparation and properties of serum and plasma proteins: IV· A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J Am Chem Soc 1 9^6; 68:4-59. 5. Moll S, White GO 2nd. Treatment of the hemophilias. Curr Opin Hematol 1995; 2:386· 6. Busch MP. Transfusion and HIV. Curr Opin Hematol 1 994;1:4-38. 7. Chamberland M, Khabbaz RF. Emerging issues in blood safety. Infect Dis Clin North Am 1998; 12:217. 8. Dion DM, O^onnor K, Phillips D, Vella GJ, Warren W, Mew family of high-resolution ion exchangers for protein and nucleic acid purifications from laboratory to process scales. J Chromatogr 1 990; 535:1 27. 12 577924 9. Prince AM, Horowitz B, Horowitz MS，Zang E. The development of virus-f ree labile blood derivatives- a review· Eur J Epidemiol 1 987; 3:1 03. 1 〇· Stephan W. Virus safety of labile plasma products from the German viewpoint· Beitr Infusionsther 1 9Q9;2A:AO. 1 1. Fourcart J, Saint-Blancard J, G-irot P, Boschetti E Separation of albumin and IgG· by direct chromatographic fractionation of human plasma on DEAE and CM-trisacryl M. Rev Fr Transfus Immunohematol 1 982; 25:7. 12· Mohr H Bachmann B, Klein-Struckmeier A, Lambrecht B. Virus inactivation of blood products by phenothiazine dyes and light. Photochem Photobiol 1997; 65:441 eMohr H Lambrecht B, Knuever-Mopf 丄 Virus inactivated single-donor fresh plasma preparations. Infusionsther Trans fusionsmed 1992; 19:79· 13. Abe H Wagner SJ，Kuwabara M，Kamo N, Ikebuchi K， Sekigachi S. Factors affecting M13 bacteriophage inactivation by methylene blue photosensitization. Photochem Photobiol 1997; 65:873. 13 577924 圖式簡要說明 第一圖-1 :免疫球蛋白與白蛋白之生產流程，步驟一；球蛋白濃縮 液之製出。 第一圖-2 :免疫球蛋白與白蛋白之生產流程，步驟二；白蛋白之製出。 第一圖-3 :免疫球蛋白與白蛋白之生產流程，步驟三；免疫球蛋白 之製出。 第二圖：亞甲藍病毒去活化步驟。 14

Claims (1)

1. L —種可使用冷凍儲存至少一年以上之生物性溶液為原料之分離純 化經去病毒化的免疫球蛋白與白蛋白的方法，其中含有： (1) 含苯環結構之光活性物質經光激化劑反應後進行去病毒活 化； (2) 經過濾及酸化製備球蛋白濃縮液；及 (3) 將球蛋白濃縮液進一步以離子交換及透析超過濾純化出人類 免疫球胥白或白蛋白的步驟。 2.如申請專利範圍第1項的方法，其中從冷凍儲存至少—年以上之 生物性溶液為人類冷凍血漿。 15