TW562925B - Immunogenic compositions for use in immunoassay methods to measure diacyl hydrazines or derivatives thereof and antibodies raised by the same, and methods and kits of measuring diacyl hydrazines or derivatives thereof - Google Patents

Description

62925 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1 ) 本發明係&供一種測足一 s蠢基骄化合物的免疫分析方 法。 測足一醯基胼化合物的方法是已知的。例如，高壓液相 層析法（HPLC)、氣液相層析法（GLC)、GC(氣相層析）-質 讀分析和HPLC質譜分析是目前僅有少數可利用的方法。然 而，這些方法有數個缺點。這些方法通常需要筇貴和複雜 的儀器。再者，試樣製備和實際的分析可能是相當冗長 的，並且需要接受過這類方法之特別訓練的化學家和技術 員。此外’這類先前技藝的方法在相同的步驟中不能迅速 地篩選出類似物或代謝物或兩者。更確切地説，在檢測發 生之前通常需要分離個別的化合物。結果，這些方法不能 應付迅速低價之測定的需求，例如野外測試或大量體積之 測試。 發現二酿基胼化合物作爲除害劑是特別有用的。更特定 而呂，係作爲毛蟲蜕皮加速化合物（M A c )。就像所有可能 的危險化學物質，藉著政府實體來規範這類除害劑。在獲 知規足批准的過程中，可能需要在聯邦殺蟲劑、殺眞菌劑 和滅菌劑作用（Federal lnsecticide，Fungicide and Rodenticide Act) ( FIFRA)註册指導方針 〇 部份（Registrati〇n Guidelines，Subdivision 〇)之下的殘餘物分析，需要具有適 合這類用途的適當敏感性之分析。再者，該分析必須具有 與二醯基肼除害劑之主要代謝產物的適當交叉反應性，以 便適用於在FIFRA註册指導方針N部份中所需的代謝和環 境歷程研究。爲了監視該除害劑的使用也可能需要該分 標準(CNS ) A4· (請先閱讀背面之注意事項^^寫本頁)

訂

^62925 A7 B7 五、發明説明（ 析 結果，需要一種具有滿足FIFRA指導·方釙之敏感性和交 叉反應性、能夠迅速篩選，並在使用上是簡單和價廉的二 醯基胼分析。 本發明已經發展一種免疫化學分析；它是充份敏感的並 具有足以在FIFRA指導方針下使用的交叉反應性。此外， 該分析在使用上是簡單且價廉的。“ 一 在本發明的第一個觀點中，係提供一種免疫原，包括： 下式之化合物 - 0 fl (請先閲讀背面之注意事 丨丨 本頁

、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 其中R、R1、R2、R3和R4分別爲氫、（Ci-C6)烷基和經取 代的（CVC6)烷基、（C2-C6)^基和尨取代的（C2-C6)烯 基、（CrCJ烷氧基、（CrCd烷氧酸基和齒素；連結到一 載劑物質。 在本發明的第二個觀點中，係提供一種測定二醯基胼或

I 其衍生物的方法，包括下列步驟··（ A)提供含有.未知含量 \ 之二醯基胼的試樣；（B )使該試樣、在固定不動之二醯基胼 抗原的存在下，與對二醯基肼抗原具有結合親和力的抗體 接觸，以致於形成結合和未結合之抗體-抗原複合物；（C ) 從已結合之抗體-抗原複合物中分離未結合的抗體-抗原複 5- ΜΛ張尺度適用中國國家標準（CNS )八4^格（210X297公釐） 562925 A7 _____ B7 五、發明説明（3 ) 合物；（D )以可檢測之標記來標示已結合的抗體複合物； (E)引起該標記中可測量的變化；並（F)測定在該試樣中之 二醯基胼。 在本發明的第三個觀點中，係提供一種測定二醯基胼或 其衍生物的方法，包括下列步驟：（A)提供含有未知含量之 二醯基胼的試樣；（B)使該試樣與對二醯基肼抗原具有結合 親和力之固定不動的抗體接觸，形成固定不動的抗體_抗原 複合物；（C)使利用可檢測之標記標示的二醯基肼抗原與未 複合之固定不動的抗體接觸，形成經過標示之抗體_抗原複 合物，（D)引起該標記中可測量的變化；並（e )測定在該試 樣中之二醯基肼。 在本發明的第四個觀點中，係提供一種測定二醯基肼的 工具組，包括（A)對二醯基胼具有結合親和力之抗體；（B) 能夠與該抗體結合的標記；以及（c)在該標記的存在下能夠 產生可測量之變化的受酶質。 圖式簡單說明 圖（1)描述得自DEAE離子交換管柱之蛋白質洗脫側面 圖。 圖（2)描述RH2703之抑制曲線。 圖（3)描述RH2651之抑制曲線。 圖（4)描述RH5992之抑制曲線。 圖（5)描述RH0345之抑制曲線。 圖（6)描述RH2485之抑制曲線。 圖（7)描述在P B S T和基質空白試樣中獲得的外標準曲 -- " - ' ' --—--— - ft - _. 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ---—--- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562925 A7 B7 五、發明説明（ 圖（8)描述關於硬花甘藍（Br〇cc〇H)試樣2〇139_〇丨的計算 線性回歸線。 圖（9)描述關於硬花甘藍試樣2〇139_〇2的計算線性回歸 線。 圖（ίο)描述關於硬花甘藍試樣20139-04的計算線性回歸 線0 圖（1 1)描述關於硬花甘藍試樣2〇139_〇5的計算線性回歸 線。 圖（1 2 )描述關於土壤試樣15 i的計算線性回歸線。 圖（1 3 )描述關於土壤試樣157的計算線性回歸線。 圖（1 4 )描述關於土壤試樣丨75的計算線性回歸線。 圖（1 5 )描述關於土壤試樣丨87的計算線性回歸線。 圖（1 6) a和b描述直接分析曲線和直接分析標準曲線。 當在本文中使用”抗原"一詞時，明瞭其爲任何能夠刺激 柷體產生的物質。同樣地，明瞭”二醯基肼抗原”爲任何能 夠刺激抗體產生的二醯基胼化合物，其中所產生的抗體具 有對一酿基胼及其衍生物的結合親和力。此外，亦明瞭，，免 疫原一’包括任何用來誘發免疫反應的物質。免疫原通常 包括載劑分子和其他成份（半抗原）。 當在文中使用”測定”一詞時，明瞭其包含定性分析，也 就是確認分析物存在於試樣中，以及定量分析，也就是定 出該分析物在試樣中的含量。亦明白這類名詞可包含標準 物和標準曲線之製備，這類製備作用是此項技藝中已熟知 的。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇χ297公釐

562925 A7 B7 五、發明説明（5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ‘在本文中使用’’二酸基耕化合物” 一詞時，明瞭在其範 圍内包括二醯基胼以及從其中衍生的代謝產物、合成的類 似物、環境降解產物和光化學降解產物。 當在本文中使用” I c 5〇” 一詞時，係限定爲減少吸光度至 在/又有抑制劑存在時測得之吸光度的一半，所需之抑制劑 的濃度。該測定係藉著使殘留活性的百分比（％)對抑制劑 濃度作圖來完成，藉著 活性％ =(八。-八；/八〇) X 100 知到殘留的活性％，其中A。爲在沒有抑制劑存在時測得的 吸光度’而八丨爲在ith之抑制劑濃度時測得的吸光度。然後 藉著100-(活性％)的關係式得到抑制百分比。 藉著等式導出交又反應性百分比： 叉又-反應性。/〇=(IC5。5992/IC5() ana丨。g)xl00 其中ICw，5992爲按照上文測定之RH5992的IC5〇濃度，而 ic5〇，ana丨。§爲類似物，也就srH27〇3、rH2651 *rH〇345 的 I C 5 0濃度。 按照在等式中的描述·· S = (Yint/m)xV 從得自標準濃度之重覆分析的標準偏差之回歸分析測定的 抑制劑濃度來計算以毫微克計之敏感性，其中S爲以毫微 克計l敏感性，Yint爲以吸光度單位計，得自重複分析之 標準偏差的回歸線的γ·截取値，m爲以每毫微克/毫升之 吸光度單位計的回歸線斜率，且V爲以毫升計，應用在微 量滴定上的試樣體’積。 從關係式：％& = ((：。/(^)父1〇〇 (請先閲讀背面之注意事本頁) ......---1 1- · 4 --. 太 訂 8- 本紙張A度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐 562925 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（ 來計算回收百分比，其中C。爲觀察到的（測得的）濃度，而 C a爲實際的（加料的）濃度。 如同上文詳述的，提供可用來製備對二醯基肼之抗體的 免疫原。通常該免疫原包括半抗原和载基分子。 半抗原通常是二醯基肼分子或其衍生物。在一個具體實 施例中，該半抗原是苯甲醯胼。苯甲醯肼化合物是根據上 文是（1)之化合物。 (C ! - C6)烷基的適當實例包括但不限於甲基、乙基、正· 丙基、異丙基、正-丁基、異丁基、第三-丁基、正-戊基、 異戊基、新戊基、正-己基、異己基等等。（C^Cs)經取代 燒基之適當實例包括但不限於以基、自素、（C i- c 4) :¾ 氧基和硝基取代的甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正_丁 基、異丁基、第三-丁基、正-戊基、異戊基、新戊基、正_ 己基等等。 (C C6)烯基的適當實例包括但不限於乙烯基、正-丙缔 基、異丙烯基、正· 丁烯基、異丁烯基、第三_ 丁晞基、正· 戊烯基、異戊烯基、新戊烯基、正-己烯基等等。（C c ) 經取代之烯基的適當實例包括但不限於以羥基、自素或硝 基取代的乙缔基、正-丙歸基、異丙烯基、正_ 丁缔基、異 丁烯基、第三_ 丁烯基、正-戊晞基、異戊晞基、新戊烯 基、正-己晞基等等。 (c i- C6)烷氧基之適當實例包括但不限於曱氧基、乙氧 基、正-丙氧基、異丙氧基、正-丁氧基、異丁氧基、第= 丁乳基、正-戊氧基、異戊乳基、新戊氧基和正-己氧基。 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

562925 、發明説明（ (ci-C6)烷氧酸基的適當實例括但不限於複基卜 (請先閲讀背面之注意事 COOH)、乙酸基（-CH2COOH)、丙酸基（-CH2CH2COOH) 和正·丁酸基（-ch2ch2ch2cooh)。 i素的適當實例包括但不限於cr、ΒΓ-、F·和Γ。 在較佳的具體實施例中，：^爲πΗΑΟΟΗ，R1和R2分別 爲甲基，且R3和R4分別爲氫。在更佳的具體實施例中，R 馬-COOH，R1和R2分別爲甲基，且RqpR4分列爲氫。 載劑物質可以是蛋白質，舉例而非限制：牛血清白蛋 白、卵清蛋白或鎖孔貝（keyhole limpet)血藍蛋白；多醣， 舉例而非限制：葡聚糖、瓊脂糖、瓊脂糖或纖維素；或是 石成的聚合物或共聚物，舉例而非限制：聚丙晞遂、聚醯 、1Τ 胺、聚丙烯醯胺、聚丁酸酯、聚脲、聚脲醯胺或聚苯乙 烯 0 在較佳的具體實施例中，該载劑物質爲載劑蛋白質，較 佳的是牛血清白蛋白（BSA)或鎖孔貝血藍蛋白（KLH)，最 佳的是鎖孔貝血藍蛋白。

可以利用本發明之免疫原來製備對二醯基肼化合物的抗 體。將該免疫原導入適當的動物體内，並收集、分離和純 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 化抗體。所得的抗體是多株抗體，對二醯基肼化合物及其 衍生物具有高親和力和交又反應性，特別是苯甲醯肼及其 衍生物。 .另外，可以經由使用此項技藝中已熟知的融合瘤技術， 利用該免疫原來製備單株抗體。 在一個具體貫施例中，與載劑物質連結的式（i)免疫原使 10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公董） 562925 五、發明説明（8 抗體昇高。在較佳的具體實施例中，與載劑物質連紝，直 中R爲.ch3COOH，r>r2爲甲基，r^r4爲氯的式㈠ ^原，使抗體昇高。在更佳的具體實施例中，與載劑物 質連結，其中Rfc〇OH , Rl和R2爲甲基，R3和 式（1)免疫原，使抗體昇高。 同上文詳述的，本發明提供一種測定二醯基胼或其衍 生物的万法。最初，該方法包括(A)提供包含未知含量之 二酿基耕的試樣之步驟。 試樣通常是任何可能含有二醯基胼的物質。適當的實例 包括空氣、水、土壤或生物物質。在一個具體實施例中， 試樣可以是空氣試樣或衍生自空氣試樣的試樣。在另一個 具體實施例中，試樣可以是水試樣或衍生自水試樣的試 樣。在另一個具體實施例中，試樣可以是土壤試樣或衍生 自土壤試樣的試樣。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在一個具體實施例中，試樣可以是生物物質或含有生物 物質的試樣，或是衍生自生物物質之試樣。生物物質之適 當實例包括但不限於植物物質；諸如血液、血清、血漿、 淋巴液、胃灌洗液、膽汁、玻璃體液之類的生物液；諸如 植物和動物組織之類的生物組織，以及諸如細菌和病毒之 類的微生物樣本。 在較佳的具體實施例中，該試樣爲土壤或植物物質，或 從其中衍生的試樣。 二醯基胼化合物是如同上文在式1中描述的，及其衍生 物。這類衍生物可以是，而非限定於從其中衍生的代謝產 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4娜（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562925 A7 B7 五、發明説明（9 ) 物、合成的類似物、環境降解產物、光學降解產物。特別 有用的二醯基肼是根據式1之苯甲醯肼，在下列的表1中詳 述之。 表1

苯曱醯肼 R R1 R2 R3 R4 RH5992 -CH2CH3 -ch3 -ch3 H H RH2485 Η -ch3 -ch3 -ch3 -och3 RH2703 -CH2COOH -ch3 -ch3 H H RH2651 -COOH -ch3 -ch3 H H RH0345 -Cl H H H H 使步驟（A)的試樣在步驟（B)中，在固定不動的二醯基月井 抗原的存在下，與對二醯基肼具有結合親和力的抗體接 觸。 抗體如同上文的描述，由含有RH2651之免疫原，最好是 與KLH連結的，使該抗體昇高。 固定不動之二醯基胼抗原中的抗原，可以是任何上述的 二醯基胼，與任何上述的載劑分子連結。在較佳的具體實 施例中，該固定抗原爲RH2651或RH2703，與載劑蛋白質 連結，較佳的是與B S A連結的RH2703。抗原與載劑分子的 組合被稱爲塗覆抗原。 塗覆抗原一般被固定在具有表面的固體支撑物上，該表 面負責附接這類抗原。適當的實例包括但不限於微量滴定 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

562925 五、發明説明（10 盤；諸如硝基纖維素、纖维夸、 :確的γ办仏 素纖、准素乙鉍酯、聚碳酸酯 卿ί 珠、管柱填充材料之類的 東、粒，以及具有結合功能部，彡 並卜的圹4主 肊夠、…泛抗原使其附接於 八上的竹生表面。通當無漁 皇覆抗原塗抹在固體支撑物上並 吸附於其上。 人碎初上卫 在一個具體實施例中，使塗覆抗原吸附在微量滴定盤 上0 = :(B)中’在自由抗原，也就是在試樣中未知含量的 冬甲酬，和固定抗原，也就是已結合抗原之間，發生了 y有-SS基肼（$親和力的抗體上對於結合位置的競 f -果形成已結合和未結合的抗原_抗體複合物。在步驟 中’從未結合的複合物中分離出已結合的複合物。可 I曰著此項技藝中已熟知的任何方法來分離之，像是但不限 於=分離、磁性分離，並沖洗以移除未結合的複合物。· 一旦從未結合的抗原_抗體複合物中分離出，便在步驟 (D)^利用可檢測的標記來標示已結合的複合物。該標記 可以是任何能夠固定在已結合之抗原-抗體複合物上，並可 被檢測出來的物質。可經由與受酶質之交互作用，直接或 間接檢測該標記。適當的實例包括但不限於酵素、有色的 染料、螢光物質、化學發光物質、生物發光物質和放射性 同1素在較佳的具體貫施例中，該可檢測標記爲酵素。 L ^使酵素與對已結合之抗體-抗原複合物具有結合親和力 的物質連結。該標記對該複合物的結合作用可藉著抗體_抗 原、蛋白質·配體或抗生物素蛋白（鏈黴素抗生物素蛋白卜 13- 本纸張从適用中國國家標準（CNS ) Μ· ( 2數297公着 (請先閱讀背面之注意· 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562925 A7 B7 五、發明説明（ 11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 生物素的結合作用。在較佳的具體實施例中，該結合作用 爲抗體-抗原的結合作用，其中使該標記與對已結合之抗， -抗原複合物有結合親和力的抗體結合。這樣的二 致典型的此項技藝中已熟知的”三明治”構型。與該標記結 合的抗體可以是多株或單株的。此外，也可以使用:有^ 體之結合區域的任何上文詳述之抗體的抗體片段，諸: Fab片段。與該標記連結的特定抗體，當然將依據與抗原 連結之抗體的種類。也就是説，與該標記連結的抗體將選 擇對固定不動之抗體-抗原複合物有結合親和力者。 例如，在較佳的具體實施例中，在兔子體内會使與本發 明之抗原連結的抗體昇高。結果，與該標記連結的抗體是 對兔子抗體有結合親和力的抗-兔抗體。 一旦標示了固定不動的抗體-抗原複合物，便在步驟（£) 中引起可測定之變化。可藉著利用紫外光、螢光、電波形 的刺激引起可測定的變化，或是受酶質與該標記進行交互 作用的導入，產生可測定的變化。已知該可測定之變化， 可以是標記固有的，例如該標記可以是放射性同位素，可 單純地藉著導入來誘發其中的放射性，例如r射線，達到 測定放射性之目的。 在一個具體實施例中，係藉著使已經標示之複合物與受 酶質接觸而引起可檢測之變化。這類受酶質是此項技藝中 已熟知的，當然也依據所使用之標記的種類。在較佳的具 體實旅例中.，該標記爲酵素而該受酶質爲能夠與該酵素交 互作用的化合物，產生可測定之變化。在更佳的具體實施 -14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公楚 (請先閱讀背面之注意事^^寫本頁} t 、π

經濟部中—II

的抗體-抗原複合物。在步驟(C)中，使利用:二=

本紙張尺度適用中國圉家標準(CNS 562925

^ ^ ’孩酵素爲磷酸酶且該受酶質爲磷酸化合物。酵素與 爻酶質的交互作用，通常使得該化合物具有可測定之特 唑:例如，化合物爲螢光的，具有強烈的吸光度等等。 旦在步驟（E)中引起可測定之變化，就在步驟 ' 、測疋二醯基肼。這類測定係藉著此項技藝中已熟知的 万去，例如紫外光分光光度計、螢光分析、^計數等等。 t知上文詳述的分析通常是間析。#明，直接分析 :二^本發明的範圍内。一開始，直接的方法包括步驟⑷ 均二含未知含量之二醯基肼的試樣。該試樣和二醯基胼 叼如同上述。 肼樣，在步驟(B)中與固定不動、對二酿基 複-; 抗體接觸，形成固定的抗體_二酿基耕 俨:。⑽體如同上述，最好是對RH2651會昇高的抗 體⑽體固定在具有負責附接這類抗體之表面的固 二：』。通當的實例包括但不限於微量滴定盤；諸如 狀二“酸醋、聚碳_的膜 及具有能夠:合::::上:， 羞 …、 < 抗又結合功能部位的衍生 定在：、fi佳具體實施例中，該抗體爲塗覆抗體，將其固 在上述有關塗覆抗原的固體支撑物上。 在步驟（B)中，在固定多妷γ轉 原裝滿，A 1 a A 儿肢上的結合位置被自由的抗 縣滿纟就疋在試樣中未μ

經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 562925 A7 ---------— B7______ 五、發明説明（13 ) "" 標示的二醯基肼抗原與未結合來自試樣中之苯甲醯胼的固 定抗體上的位置接觸。因此已標示之抗原將會裝滿抗體上 殘餘的結合位置。因爲固定抗體將會連結已標示和未^示 之抗原。該二醞基肼抗原和標記均如同上述。然而，在車六 佳的具體實施例中，該抗原爲RH2651而該標記爲酵素，最 好是辣根過氧化酶（HRP)。 最後’在步驟（D )中引起標記中可測定的變化，並在步 自（E)中測定二醯基肼。引起可測定的變化和測定二醯基 胼，均如同上文有關間接分析的描述。 在本文中描述關於諸如rH5992之類的二醯基肼，及其諸 如RH2703、RH2651、RH0345和RH2485之類衍生物的分 析，足以應付FIFRA註册所需應用之野外殘餘物研究的敏 感性。此外，該分析與不同結構之類似物具有足夠的交叉 反應性，像是RH0345 ,咸相信該分析將可適用於全部種類 的經取代N-第三-丁基-N，Ν’-苯甲醯胼除害劑。 撇開該分析的敏感性（百萬分之一）及其以RH5992爲代表 之除害劑類的一般用途不提，最大的優點可能是增加的實 驗室效力。例如，已經顯示出一個分析師每天可輕易地處 理二十個試樣。這個判斷包括試樣的製備和結果的計算。 假設每天1 0小時，每個試樣的工作成本僅負擔大約3 〇人_ 分鐘。 •本發明之抗體的額外用途包括使該抗體與固體支撑物結 合’以便濃縮來自試樣基質的殘餘物，而使得可以利用營 光標來標示之，並使用於組織研究中，以便確認除害劑 ·16_ 本g尺度適用中國國家標準（CNS )八4胁（210Χ297公釐) ' ""^

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562925 五、發明説明（14 ) ί細胞隔間：的位置。該資訊提供了有關特定二酿基耕化 σ物心：用杈式或毒性機制和代謝的重要資訊。再者，可 將直接免疫分析方法併入野外八把、 斤f外分析 測量尺”試驗和測量 類型的應用中。 在下列的實例及專利説明金沾甘、 j Λ月書的其他邵份中使用下列的縮 寫： BCA 二辛可寧酸 BSA 牛血清白蛋白 DCC 二環己基碳化二亞胺 DE Α 二乙醇胺 DMF 二甲基甲醯胺 HRP 辣根過氧化酶 K L Η 鎖孔貝血藍蛋白 N H S Ν -备基3虎拍醯亞胺 P B S 嶙酸緩衝生理食鹽水 PBST P B S 和 0.01 % 吐溫 2 〇 ΡΝΡΡ 對-硝苯基鱗酸鹽 實例1 免疫原的合成

在5毫升梨形的燒瓶中加入2 1微莫耳半抗原，並 將其;谷解於200微升DMF(Fisher Scientific )中。在單獨的4 毫升試管中將16毫克DCC(EM Science)和9.1毫克 NHS (Sigma Chemical)溶解於 200 微升的 DMF 中。將DCC 和N H S移至含有半抗原的燒瓶中，並容許在室溫下攪拌該 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）

562925 A7 B7 五、發明説明（15 ) 反應物大約2小時。將該反應移至冷房中，並在4乇下繼續 攪拌過夜。 (請先閲讀背面之注意事

在5.4耄升的去離子水中，重新組成载劑蛋白質KLH (Imject® ’ Pierce Chemical Co.，在重新組成時爲 2〇 毫克 蛋白免在PBS pH 7.2中）。將已經活化之半抗原移至微量離 心機（微量離心機235B型，Fisher Scientific)，並離心5分 鐘，以移除經取代之尿素沉澱物，將上清液移至重新組成 的載劑蛋白質溶液中，並在室溫下繼續攪拌4小時。 、11

以14000 rpm離心蛋白質反應混合物5分鐘，以移除沉殿 的蛋白質。將全部體積之上清液應用在Swift⑧聚丙烯醯胺 脱鹽管柱（Pierce Chemical Co.)上，並以在3毫升溶離份中 0·01 Μ之PBS(pH 7.3)洗脱。在將該試樣完全裝入管柱上之 後收集溶離份。得到十份3毫升的溶離份，並在2 8 0毫微米 處測足母個落離份的吸光度。收集含有免疫原的溶離份， 並藉著BCA法（參見BCA蛋白質分析試劑指示_Pierce Chemical Co ·)測定蛋白質之濃度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如下定出半抗原/蛋白質結合率。建力KLH在〇微克/ 毫升到1200微克/毫升之範圍内，在254毫微米處的吸光 度標準曲線。從標準曲線中，將藉著B C A法測定之免疫原 溶離份的蛋白質濃度換算成在254毫微米處的吸光度。建 立在254毫微米處，在濃度範圍爲RH2703到2 6到260毫微 莫耳/毫升，以及RH2651的6.5到2 10毫微莫耳内的半抗原 RH265 1和RH2703之吸光度標準曲線。 •在254毫微米處測得的免疫原之吸光度（Ac<)nj)，減去計算 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 562925 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7五、發明説明（16 ) 出在254毫微米處由KLH貢獻的吸光度（aklh)，得到因爲 半抗原引起之吸光度的昇高（AHap)。從半抗原的標準曲線 將該値換算成濃度（毫微莫耳/毫升）。 從經過計算之半抗原的濃度（毫微莫耳/毫升）除以測得 的免疫原濃度，計算出半抗原與蛋白質之莫耳結合率。 KLH之平均分子量係使用6·7 X 106道爾吞。藉著以670除莫 耳結合率’算出每10, 〇〇〇 amu (分子質量單位）KLH的半抗 原平均分子數。結果顯示在表2中。 實例2 額外免疫原的合成 根據實例1之程序來製備免疫原，除了半抗原使用 RH2703之外。結果顯示在表2中。 實例3 塗覆抗原的合成 根據在實例1中製備免疫原之程序，來製備塗覆抗原 (RH2703 和 RH2651 )，除了以 BSA(Imject⑧，Pierce Chemical Co·)來代替KLH作爲載劑蛋白質之外。在計算莫 耳結合率時所使用的BSA之平均分子量，爲68,〇〇〇道爾 吞。藉著以6.8除莫耳結合率來計算每10,000 amuBSA的半 抗原平均分子數。所製備之塗覆抗原的結果顯示在表2 中。 (請先閲讀背面之注意事

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___ -19- :紙張从適用中國國家標準（CNS )八4祕（21GX297公釐) 562925 A7

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（18 ) 血液的產製。 實例5 兔子抗血清之分析 在塗覆緩衝溶液（P B S，pH 7.2 )中重新組成塗覆抗原， 至大約1 0微克/毫升之原始濃度。保留9 6孔微量滴定盤中 第1和第2行的孔給對照組試樣。開始在第3行的孔中加入 200微升原始濃度的塗覆抗原。從第4到1 2行的孔中，含有 100微升的塗覆緩衝溶液。將一份1〇〇微升、在第3行孔中 的塗覆抗原移至第4行的孔中，並與其中的塗覆緩衝溶液 混合，並以類似的方式，在每個後續一行的孔中，以塗覆 緩衝溶液按1 : 2連續稀釋塗覆抗原。該稀釋過程持續到第 1 1行，其爲1 : 256倍稀釋的塗覆抗原。拋棄最後的1〇〇微 升。在第1 2行中的孔僅含有無抗原的塗覆緩衝溶液，作爲 陰性對照組。孔A1和A2爲空氣空白，並不接受試劑。孔 B 1和B 2以塗覆杌原塗覆，而成爲背景孔。以i 〇〇微升在塗 覆緩衝溶液中之KLH(大約1〇微克/毫升）來塗覆孔Cl* C 2，作爲陽性對照組。剩下的孔D丨到H 2不作處理。將如 此製備之培養盤以密封膠帶密封、覆蓋，以塑膠包裝材料 包裝，並置於冰箱中在4 °C下培養過夜。 在培養過夜之後，從冰箱中移出該培養盤並將其倒空。 以300微升BSA封阻溶液（1%BSA，pH72，由溶解於 毫升PBS中之！.〇克BSA來製備）來封阻在孔中未結合的結 合位置（除了 A 1和A2之外）。在室溫下培養該溶液至少i 〇 分鐘。

-21 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562925 A7 - -........ - - _ B 7 五、發明説明（19 ) 以封阻溶液按丨：1000來稀釋受試的試樣，並從孔八3開 始將200微升應用在a排的孔中。在33到^[3排的孔中含有 100微升的封組溶液。將在A排之孔中的受試試樣（1〇〇微升） 和土 B排的孔中’並徹底混合。以類似的方式將試樣連續 稀釋1 ·· 2至G3排的孔中（1 : ，並拋棄最後1〇〇微 升。Η 3排的孔中不含有抗體，作爲陰性對照組。將背景孔 Β1和Β2與100微升預先放血並以封阻溶液稀釋i : 5〇〇的血 清一起培養。將陽性對照組孔C1和C2與1 : 1000倍稀釋之 受試試樣一起培養。將培養盤與受試試樣一起培養大約工 小時。 在培養之後移除受試試樣，並以沖洗緩衝溶液沖洗各 孔。以緩衝落液裝滿各孔4 - 5次。在第三或第四次沖洗期 間’在拋棄之前容許緩衝溶液停留在各孔中，浸泡3 _ 5分 鐘。以1毫升50%的甘油重新組成〇·6毫克、連結有鹼性磷 酸酶之山羊抗-兔IgG(Pieixe Chemical Co·)，並以封阻溶液 稀釋1 : 5000。將1〇〇微升的該溶液加至每個孔中，並在室 溫下培養該培養盤至少丨小時。洗去過量的抗-兔抗體，並 在每孔中加入100微升PNPP溶液（5毫克PNPP溶解於8毫升 去離子水和2毫升DEA緩衝溶液中）。在室溫下培養該培養 盤3 0分鐘。然後加入5 0微升2N NaOH以中止該酵素反應。 利用Dynatech MR5000微量滴應盤閱讀機，在41〇毫微米處 測定各孔的吸光度。結果描述於表3中。 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

562925 A7 B7 五、發明説明（20 表3 免疫原 兔子# 受試血液#1 受試血液敗 生產血液#1 生A血液#2 RH2651-KLH 1331 1/32000 1/64000 1/64000 1/128000 ft Μ 1332 1/32000 1/128000 1/64000 1/128000 Μ 11 1333 1/32000 無血液2 1/64000 1/128000 ” ” 1334 1/32000 1/64000 1/128000 1/128000 ft 19 1335 1/32000 1/32000 1/12800.0 1/128000 RH2703-KLH 1336 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 ” 99 1337 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 tt ft 1338 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 ft 9t 1339 1/32000 1/64000 1/64000 1/128000 " M 1340 nd1 1/64000 1/64000 1/128000 未測仔抗體力價。 在違動物中耳朵結症防礙採取受試血液。 實例6 起ft的分離和站化 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 集中在實例3中的整個注射過程中收集到的免疫血清，並 藉著β C A法分析全部的蛋白質，發現爲6 6毫克/毫升。測 定免疫血清的體積，並分成各9 〇毫升的兩等份。以兩份體 積的去離子水稀釋一等份。接著以一份體積的4 Μ硫酸銨稀 釋所得的溶液，得到最後的2 Μ硫酸銨溶液。容許在室溫下 攪掉該懸浮液過夜。藉著以iOjOOg-av離心30分鐘收集蛋 白質沉澱物。將蛋白質小球溶解於少量的〇.〇2 Μ磷酸鈉緩 —--------23-_ 本紙張又度適用巾國g家標準（⑽）〜胁（21Gx297公楚） 562925 A7 B7 五、發明説明（21 ) 衝溶液（pH 8.0)中，其係由〇·ι Μ磷酸鈉緩衝溶液的稀釋作 用來製備之。 在室溫下將重新組成的蛋白質溶液對2公升〇·〇2 Μ磷酸鈉 緩衝溶液（ρ Η 8 )進行透析四小時，然後在4 °C下對4公升透 析過夜，最後在室溫下對4公升透析4小時。 得自收集抗血清之IgG的離子交換純化作用，係以兩個 獨立的等份，利用DEAE纖維素（DE52， Whatman， Ιη〇·)，濕體積150毫升來經營，將其填塞至2·6公分（内徑） 的管柱中，墊高度大約2 6公分。以0.02 Μ磷酸鈉緩衝溶液 (pH 8.0)來平衡該管柱。該管柱具有大約1 5克（每毫升濕 體積1 0毫克）的蛋白質容量。將全部體積的透析蛋白質溶 液倒入管柱中，並以0.02M磷酸鈉緩衝溶液，pH 8.0開始 洗脱。調整流速至大約5毫升/分鐘，並捕捉5毫升溶離 份。前15 0毫升的流出物含有任何未保留的蛋白質。 在前150毫升·之後，以直線梯度連續改變莫耳濃度至 〇·3Μ。在兩個槽中形成梯度，前一個梯度在第一個槽中含 有250¾升〇·〇2Μ緩衝溶液’而在第二個槽中含有250毫升 〇·3Μ的緩衝溶液。在洗脱作用期間持續攪拌第一個槽。以 5愛：升溶離份爲單位收集下一個500毫升流出物。藉著在 280毫微米處測定吸光度來監視蛋白質之洗脱，將吸光度 對洗脱體積作圖（溶離份#)而得到色譜。 •藉#在本文中描述的間接方法來分析每個溶離份之一等 份的IgG。收集含有IgG的溶離份，並利用帶有八爪沁抓滤 器（分子量排除限制-10,000道爾呑）的揽拌細胞濃縮器減少 (請先閱讀背希之法意事寫本

tr 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

-24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

562925 A7 五、發明説明（22 ) 體積。收集蛋白質的濃縮物，並藉著標準BCa法分析經過 濃縮的I g G溶離份。將疊氮化鈉（〇 〇2 %重量/體積）加至經 過無菌過濾並冷凍儲存在-20。(：下的蛋白質溶液中。得自 DESE離子X換管柱之蛋白質洗脱側面圖描緣於圖j中。空 心圓代表全部蛋白質在280毫微米處測得的吸光度。實心 圓代表藉著間接分析在410毫微米處測得每個溶離份的抗 體力價。收集溶離份5 1 - 8 0，以便藉著蛋白質親和力層析 法進行進一步的純化。 利用蛋白質A AffinityPak^管柱和ImmunPure® IgG緩衝溶 液（ImmunoPure® IgG 純化工具組，Pierce Chemical Co)對 經DEAE純化過的I g G ( 1毫克/毫升）進行親和力純化。容 許蛋白質A管柱和緩衝溶液回復至室溫，並以5毫升結合緩 衝溶液沖洗該管柱。將經過DEAE純化的I g G稀釋1 : 9， 得到濃度爲6毫克/毫升的蛋白質，並將1毫升的一等份應 用在管柱中。以另1 5毫升的結合緩衝溶液沖洗管柱。 以5毫升immunoPure® IgG緩衝溶液完成I g G的洗脱，並 補捉1毫升溶離份。在280毫微米處測定每個溶離份的吸光 度，並利用已經先以10毫升0.02m PBS(20 mM磷酸鈉， 100 mM NaCl，pH 7.4)調節過的 5 毫升Excellulose® 管柱， 將具有明顯吸光度的溶離份（溶離份3 )脱鹽。利用十份1毫 升的0.02M PBS洗脱，並收集1毫升溶離份。藉著BCA法分 析每個溶離份之吸光度的總蛋白質。 將經過蛋白質A親和力層析法純化的I g G稀釋1 ·· 5，得 到濃度爲1毫克/毫升的蛋白質。從66毫克/毫升之平均 -25- f請先閲讀背面之注意事

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^洛（210X297公釐） 562925 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ---- B7五、發明説明（23 ) 總血清蛋白質中得到估計爲9毫克/毫升的IgG濃度，IgG 的估計回收値爲6 7 %。實例7 _間接分析的最佳方法 利用RH2703 -BSA作爲塗覆抗原。使在最少量抗原 (RH2703 )存在下得到可讀反應（〇 3 _ 〇 5吸光度單位@41〇 笑微米）所需的濃度，藉著西洋棋盤式之分析參見v〇Uer 等人 ’ Bull of World Health Organization， 53， 35 (1976)),在固足含量之蛋白質A純化IgG(1()微升的2〇微 克/¾升落液，100毫微克/孔）的存在下發揮最大效用。 先前已經使蛋白質A純化之IgG的濃度，在固定含量之塗覆 抗原的存在下發揮最大效用，得到對最少含量之RH5992的 可讀反應。 最佳的抗體濃度是大約2 〇微克/毫升（每個微量孔爲1〇〇 毫微克），而最佳的塗覆抗原爲25毫微克/毫升或每個微 量孔2.5耄微克。當換算成莫耳基礎且假設半抗原/蛋白質 結合率爲55時，該半抗原超過所加入之IgG的三_倍莫耳濃 度。 在最適當之RH2703-BSA塗覆抗原之濃度的存在下，定出 RH2703、RH2651、RH5992、RH0345 和 RH2485 對蛋白質 IgG的抑制百分比。每種受試物質分析七個濃度，範圍從 無受試物質之0毫微克/毫升到1〇〇〇毫微克/毫升。每個 濃度重複分析七次。提供抗原陰性和抗體陰性孔作爲陰性 對照組，同時利用κ L Η /抗κ L· Η孔作爲陽性對照組。 (請先閲讀背面之注意事

4 、1Τ

-26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297^7 562925 A7 B7 五、發明説明（24 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 利用含有0· 1 %吐溫2 0的塗覆緩衝溶液進行受試物質母液 的連續稀釋，得到1000毫微克/毫升、1〇〇毫微克/毫 升、10毫微克/毫升、1毫微克/毫升、ο·ι毫微克/毫升 和0.01¾微克/毫升的分析濃度。使用帶有01%吐溫2〇的 塗覆緩衝溶液作爲〇毫微克/毫升的分析濃度。在室溫下 將受試物質之分析濃度（各190微升）與1 0微升蛋白質a igG —起培養一小時。在培養期間之後，將10q微升受試物 質-IgG混合物移至適當的微量滴定盤孔。該微量滴定盤孔 已經預先以最佳濃度之RH2703-BSA塗覆過，並以0.3毫 升、在塗覆緩衝溶液中的1 % B S A溶液封阻過量的蛋白質 結合位置。在室溫下培養該盤額外的一小時。 在第二次培養之後沖洗該盤，並加入與鹼性磷酸酶連結 的山羊抗-兔免疫球蛋白（〇 6毫克，以1毫升5 〇 %甘油重新 組成’且隨後以封阻溶液稀釋i : 5〇00 - Pierce Chmical Co.)。培養該盤，沖洗並按照實例5中之描述加入pNpp受 酶質。不加入NaOH中止溶液。並在在410毫微米處讀取吸 光度之別，先容許該盤展開兩小時。在圖2到6中描緣抑制 曲線。有關純化抗體之特徵的特殊資料顯示在表4中。 如同上文的詳述定出π50。藉著與Microsoft Excel© Analysis ToolPak (Microsoft Corporation，Copyright 1993 ) 一致的指數曲線來分析活性百分比對抑制劑濃度的作圖。 要计算I C 5〇，解出當y等於5 〇時，也就是殘留5 〇 %活性或 5〇%抑制，指數方程式y = bmnx形式中的乂値。利用 M_S〇ft EXC_，Ver 5 〇 的圖式（Microsoft Corporation， (請先閲讀背面之注意事

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-27- 562925 A7 B7 25 五、發明説明（

Copyright 1993 )完成繪圖。 從如同上文詳述的I C 5〇計算交叉反應性的百分比。利用 Microsoft Excel©，Ver 5.0 的圖式（Microsoft Corporation， Copyright 1993 )進行獲自七種抑制劑濃度之七個重複分析 之平均吸光度的作圖。可使線性動力範圍具像化，如同從 在410毫微米處各種抑制劑濃度之吸光度圖中獲得的曲線 之直線部份。如同上述計算敏感性。 _ 決定檢測的範圍爲三倍背景雜音。欲評估背景雜音，計 算每個抑制劑濃度之重複分析的標準偏差，並完成回歸分 析的最小二乘法。取回歸線的y -截取値作爲因爲雜音引起 的背景吸光度。背景吸光度乘以3之因數，並藉著除以由 整個直線範圍獲得之標準曲線的斜率換算成抑制劑濃度。 將所得的濃度定義爲抑制劑的檢測範圍。 (請先閱讀背面之注意事

、1T 經 濟 部 中 央 標 準 員· 工 消 費 合 作 社 印 製

表4 受試 IC5〇 敏感性 檢測範圍 交叉反應性 物質 毫微克/毫升 毫微克 毫微克/毫升 % RH5992 0.61 0.07 0.66 100 RH2703 1.13 0.19 1.7 54 RH2651 1.59 0.22 1.9 38 RH0345 6.5 0.08 0.75 9 RH2485 0.05 0.08 1.8 NA 實例8 - 1 9

28- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562925 A7 五7明説明(26 ) " - 間接分析 以100微升/孔的RH2703-BSA塗覆抗原（1 0微克/毫升） 來塗覆微量滴定盤，得到每孔塗覆1微克。在4下培養該 盤過夜。在使用之前先以300微升/孔、在塗覆緩衝溶液 中之1 % B S A溶液來封阻未結合的蛋白質結合位置。 取得每一等份大約1克的硬花甘藍和土壤試樣。確認硬花 甘藍試樣#03 ( 1.0191克）和土壤試樣#49( 1.0180克）爲對照 組’並摻入5 0毫微克或500毫微克的R5992，以測量回 收。在下文表6中確認試樣身份和試樣質量。 知一等份試樣置於25¾升圓錐形離心管中，並將回收試 樣摻入50或500毫微克，以PBST稀釋RH5992母液標準物 (1¾克/毫升，在乙腈中）而製備的RH 5992。 藉著聲波震盪利用聲波細胞破壞機（Sonicat〇r®，Heat

Systems，Inc. W-225R型，帶有h_1型微形管尖探針），在 8 0%出力下三分鐘以5毫升一等份之PBST萃取試樣。以 4,000g離心該萃取混合物五分鐘，並慢慢倒出pBST層。以 PBST稀釋一等份的各個試樣，得到i : ι〇〇倍稀釋（硬花甘 藍試樣）和1 : 500倍稀釋（土壤試樣）的原始試樣萃取物。 將一等份經過稀釋之試樣（180微升）與1 〇微升各個 RH5992 標準物（2、10、20、100、200 和 2000 毫微克 / 毫 升）和IgG( 10微升）混合，得到具有終rh 5992濃度分別爲 0·1、0·5、1、5、10和100毫微克/毫升的試樣。在以 8 X 1 2排列、9 6孔格式的硼矽酸鹽玻璃管中徹底地混合試 樣。相當於抗原陰性孔的管中含有丨〇微升緩衝溶液。相當 _________ -29- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂 562925 A7 B7 五、發明説明（27 於抗體陰性孔的管中不加IgG但含有在ρΒ§τ中i〇〇 ppb的 RH5992。相當於KLH陽性對照組的管子保持空的。 在一小時的培養期間之後，將1〇〇微升加料試樣移至微量 滴定盤中’並繼續培養另_個小時。 在培養該盤之後，如同先前的描述沖洗之，並加入100微 升連結有鹼性磷酸酶之山羊抗_兔1§(}，並在室溫下培養一 小時。在培養该盤之後再度沖洗，並加入100埤升受 酶質。與該受酶質一起培養並持續一到兩個小時，並利用 DynatechMR5000微量培養盤閱讀器，在41〇毫微米處測定 吸光度。平均在抗原陰性孔中測得的吸光度，並自動從受 試孔中減去。同樣地移除因爲抗體之非-專一性結合而昇高 的吸光度。 藉著“準加成法來定量在試樣中剩餘的量。利用 Microsoft Excel©，Ver5 〇的圖式，從非專一性結合的平均 逆數減去雙重試樣之吸光度，獲得逆吸光度對加入抑制劑 之;辰度的作圖。利用 Micr〇s〇ft Excel(g) AnalySis ToolPak， 將所得的數據代入y = mx + b的方程式中。在這個關係中，y 是以貫驗測得的逆吸光度，b爲常數，m爲計算出之斜率而 X爲加入之抑制劑的濃度。計算每個數據點相對於得自推 測落液之計算値到線性方程式之標準誤差，並從最後的溶 液中省略偏離的値。 藉著解出設定y等於未加入抑制劑所測得之逆吸光度時的 線性方程式之X，獲得試樣的濃度。藉著乘以相對應的稀 釋因數將結果換算成總毫微克。藉著將總毫微克除以取得 -30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） • Ί 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事

頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562925 五、發明説明（28 ) 試樣的質量，計算出最後按毫微克/克計之結杲。 建立標準曲線，以便藉著外標準法來定量試樣殘餘物。 利用Microsoft Excel© Analysis ToolPak完成指數曲線配合 和線性回歸分析。如同上文描述計算回收百分比。 藉著分析的外標準法和内標準（加成方法）法兩者，來分 析加料5 0毫微克/克和500毫微克/克的回收試樣。關於 在括弧中之回收百分比的結果，顯示在表5中。在PBST中 和基質空白試樣所獲得的標準曲線之作圖（硬花甘藍試樣 #03和土壤試樣#49)顯示在圖7中。 (請先閱讀背面之注意事

表5 試樣 内標準C毫微克/克 外標準C毫微克/克 硬花甘藍仏 52(104%) 53(106%) 硬花甘藍r2 471(94%) 426(85%) 土壤Ri 55(110%) 55(110%) 土壤r2 511(102%) 514(103%)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 得自硬花甘藍和土壤試樣之内標準分析的結果顯示在表6 中。在一週後再分析兩個硬花甘藍和土壤萃取物，以評估 試樣基質的穩定性。結果顯示在括弧中。爲每個試樣計算 之線性回歸線顯示在圖8到1 5中 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 562925 A7 B7 五、發明説明（29) 表6) 試樣身份 C微克/克 試樣身份 C微克/克 硬花甘藍 土壤 20139-01 1.75(1.41) 92-0017-151 41.4 20139-02 2.41 92-0017-157 20.0 20139-04 5.92 92-0017-175 18.4 20139-05 13.2(12.9) 92-0017-187 - 28 (請先閲讀背面之注意事 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實例2 0 經標示之抗> 原的合成 將4.6毫克（10·5微莫耳）量的RH2651放置在5毫升梨形燒 瓶中，並溶解於100毫升DMF中。在分開的試管中，使4.6 毫克NHS和8.8微升DCC各自溶解於100微升的DMF中。 將NHS和DCC加至RH265 1中，並在室溫下攪拌大約一小 時。在4 °C下持續攪拌過夜。第二天將1 0毫克H RP溶解於 2.7毫升0.01Μ的PBS，pH 7.2中。在Beckman微量離心機 E( Beckman Instruments)中離心該 RH2561 /NHS/DCC 反 應混合物三分鐘。在上清液中逐滴加入H RP並攪拌之。在 室溫下攪拌該混合物4小時，然後在微量離心機中離心3分 鐘。利用以P B S平衡過的Swift®脱鹽管柱（Pierce Chemical Co.)將含有連結蛋白質之上清液脱鹽。以P B S洗脱蛋白 質，並收集3毫升溶離份。收集按照在280毫微米處藉著吸 光度定出含有蛋白質共軛物的溶離份，並藉著BCA Protein Assay (Pierce Chemical Co.)定出蛋白質之濃度。 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）

訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 562925 Α7 Β7 五、發明説明（30) 如下證實RH2651對HRP的結合作用。以100微升10微克 /毫升2651 -HRP塗覆微量培養盤孔，並儲存在4°C下過 夜。在排空該盤後，以1 %在P B S中之B S A封組該孔。在 封阻之後，將根據實例6(從1 : 500開始）製備之1 : 2連續 稀釋的蛋白質A純化2651 IgG加至該孔中，以探測 RH2651。在室溫下培養卜J、時之後，以〇·01%吐溫2〇 PBS 沖洗該盤。加入以鹼性磷酸酶標示之山羊抗-鳥Ϊ g G，並在 室溫下培養額外的1小時。沖洗該盤，並加入對-硝基苯磷 阪鹽受酶質。在1 5分鐘的展開時間後，利用Dynatech MR5000微量培養盤閱讀器，在410毫微米處測定吸光度。 RH2651對辣根過氧化酶的結合作用之評估。證實 26；>1IgG對1微克2651-HRP有1 : 32000之力價。這表示一個 成功的結合反應。 實例2 1 望覆抗體的最佳方法 以2651 IgG塗覆微量培養盤。從第1行開始，在每孔中加 入100微升的10微克/毫升2651IgG，並越過該盤進行i : 2 之連續稀釋。密封該盤並儲存在4 °C下，直到準備使用爲 止。在排空之後，以0.01 %在PBS中之吐溫20沖洗，並在 室溫下以在PBS中之1%BSA封阻大約1小時。在封阻之 後’排2該盤’並在每孔中加入15 0微升的P B S。然後將 50微升265 1-HRP稀釋液加至培養盤中，以1〇微克/毫升 開始，並連續以Γ : 2向下稀釋至培養盤。在室溫下培養i 】時之後’如别述沖洗该盤’並在每孔中加入15 〇微升1 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（2i〇x297公釐） '' --— (請先閱讀背面之注意事寫本頁)

562925 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Μ Β7______五、發明説明（31 ) Step® Slow-TMB (得自 Pierce Chemical Co.的過氧化酶受酶 質）。在展開1小時之後，加入150微升的IN H2S〇4，以中 止反應，並利用Dynatech MR5000微量培養盤閱讀器，在 450毫微米處測定每孔的吸光度。對照組包括沒有塗覆抗 體的孔，以及其中未加入265 1-HRP的孔。定出0.625微克 /毫升的205 1 IgG塗覆抗體濃度和1.25微克/毫升的2561-HRP濃度，是最適合l-Step® Slow-TMB受酶質使用的濃 實例2 2 直接分析 以100微升各0.625微克/毫升的2651IgG塗覆微量培養盤 的各孔。保留一排不塗覆，作爲對照組。將該盤保持在4 °C下過夜。第二天以在p B S中之0.01 %吐溫2 0沖洗，並以 在P B S中之1 %B S A封阻至少3 0分鐘。從1毫克/毫升母液 來製造 RH5992、RH2651、RH2703 和 RH2485 的標準溶 液。從0.1毫微克/毫升、0.5毫微克/毫升、1毫微克/毫 升、5毫微克/毫升、10毫微克/毫升、50毫微克/毫升 和100毫微克/毫升，來製備RH0345的標準溶液。在排空 封阻溶液之後，在適當的孔中加入150微升的標準物。關 於零對照組，加入150微升PBS。在室溫下培養45分鐘之 後，在每孔中加入50微升1.25微克/毫升的2651-HRP，並 震動培養盤，以便混合内容物。一行含有抗體和標準物的 未收到265 1-HRP，但收到50微升？65，作爲陰性對照組。 在室溫下培養4 5分鐘之後，如前述沖洗該盤養盤，並在每 ______-34- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事 :寫本頁) 訂 4 562925 A7 B7 32 五、發明説明（ 孔中加入150微升265 1-HRP，再震動該培養盤，以便混合 内容物。一行含有抗體和標準物的未收到265 1-HRP，但收 到5 0微升P B S，作爲陰性對照組。在室溫下培養4 5分鐘之 後’如前述沖洗該盤養盤，並在每孔中加入丨5〇微升Step 1 Slow TMB。在室溫下2小時之後，在每孔中加入15〇微 升IN H2S04 ,並利用Dynatech MR5000微量培養盤閲讀 器，在45〇毫微米處讀取吸光度。 圖16a説明從該分析中產生的典型曲線。見到該曲線的 直線部份在0.01毫微克/毫升到1〇毫微克/毫升之間。藉 著圖16b解釋在該分析之直線範圍中的典型標準曲線，^ 用逆吸光度產生正的斜率。算出檢測的範圍爲〇()96毫微克 /毫升，並算出敏感性爲0.005毫微克腕州。關於 RH5992和類似物的數據，提供在表7中。 表7 (請先閱讀背面之注意事

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 IC5〇 毫微克/毫升 敏感性 毫微克 檢測範園 皇升 交叉反應性 RH2651 RH5992

35- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4g ( 210X297公釐）

Claims (1)

1. 562925 第086111727號專利申請案 g 中文申請專利範圍修正本（91年10月丨$8六、申請專利範圍

   1· 一種用於測定二醯棊肼化合物或其衍生物之免疫分析方 法之免疫原組合物，包括·· 下式之化合物

   R1

   其中R為-COOH或-CH2C00H，r1及r2為甲基，及 R及R為氫；與載劑物質結合。 2·根據申請專利範圍第丨項之免疫原組合物，其係作為塗 覆抗原。 ' 3·根據申請專利範圍第丨項之免疫原組合物，其中該載劑 物質係選自包括蛋白質、多醣'合成的聚合物=共聚 物。 4·根據申請專利範圍第丨項之免疫原組合物，其中r為· COOH。 5·根據申請專利範圍第1項之免疫原組合物，其中r為 -CH2COOH。 6· —種根據申請專利範圍第1項之免疫原組合物而提昇的 多株抗體。 7· —種根據申請專利範圍第4項之免疫原組合物而提昇的 多株抗體。 562925

   8. —種根據申請專利範圍第5項之免疫原組合物而提昇的 多株抗體。 9· 一種測定二醯基肼或其衍生物的方法，其包括下列步 驟： (A) 提供含有未知含量之二醯基肼的試樣； (B) 使該試樣在固定不動之二醯基肼抗原的存在下， 與對二醯基肼抗原具有結合親和力之多株抗體接觸，以 致於形成已結合和未結合的抗體·抗原複合物；其中該 多株抗體係由包括下式化合物之免疫原所提昇：

   其中R為-COOH或·<：Η2(：ΟΟΗ，R1及為甲基，及 R3及R4為氫；與載劑物質結合； (C)使未結合的抗體·抗原複合物與已結合的抗體-抗 原複合物分離； (D )以可檢測之標記來標示該已結合之抗體複合物； (E) 引起該標記中可測定的變化；並 (F) 測定在該試樣中的二醯基肼。 10·根據申請專利範圍第9項之方法’其中該可檢測的標記 係選自酵素、有色染料、螢光物質、化學發光物質、生 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 562925 A8 B8 C8

   物發光物質和放射性同位素。 11·根據申請專利範圍第9項之方法，其中該可檢測之標記 為能夠與該抗體結合的酵素-抗體共轭物。 12· —種測定二醯基肼或其衍生物的方法，其包括下列步 驟： (A) 提供含有未知含量之二醯基肼的試樣； (B) 使該試樣與固定不動且對二醯基肼抗原具有結合 親和力之多株抗體接觸，形成固定不動的抗體-抗原複 合物； (C) 使、纟可檢測標兄標不之二酿基耕抗原與未複合之 固定不動的多株抗體接觸，形成經過標示之抗體-抗原 複合物； (D )引起該標記中可測定的變化；並 (E)測定在該試樣中的二醯基肼， 其中該固定不動的多株抗體係由包括下式化合物之免 疫原所提昇：

   其中R為- COOH或_CH2COOH , Rl及R2為甲基，及 R3及R4為氫；與載劑物質結合。 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) ^0^925

   i3·根料請專_圍第12項之方法，其巾該可檢測之標記 係選自酵素、有色染料、螢光物質、化學發光物質、生 物發光物質和放射性同位素。 14.根據申請專利範圍第12項之方法，其中該可檢測之標記 為能夠與該抗體結合的酵素-抗原共軛物。 15· —種測定二醯基肼的套組，其包括： (A)對二醯基肼有結合親和力的多株抗體，其係由包 括下式化合物之免疫原所提昇： R1

   其中R為-C00H或-CH2COOH，R1及R2為甲基，及 R3及R4為氫；與載劑物質結合； (B) 能夠與該多株抗體結合的標記；以及 (C) 能夠在該標記的存在下，產生可測定之變化的受 質。 根據申請專利範圍第1 5項之套組，進一步包括二醯基肼 抗原，其包括下式之化合物： -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 562925 、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8

   其中R為-COOH或-CH2COOH，R1及R2為甲其 3 4 巧丁丞，及 R及R為氫。 17·根據申請專利範圍第15項之套組，其中該標記為連結至 對該多株抗體有結合親和力之抗體的酵素。 18·根據申請專利範圍第15項之套組，其中該標記為連結至 對該多株抗體具有結合親和力之二醯基肼抗原的酵素。 19·根據申請專利範圍第9項之方法，其中該固定不動的抗 原包括下式之化合物：

   ^其中R為-COOH或- CH2C00H，Rl及R2為甲基，及 R3及R4為氫；固定至固體支持物。 20·根據申請專利範圍第丨2項之方法，其中該經標記之二醯 基胼抗原包括下式之化合物：

   562925 8 8 8 8 A B c D

   Chi3 申請專利範圍

   C-NH 其中R為-COOH或-CH2COOH，R1及R2為甲基，及 R3及R4為氫；結合至檢測標記。 6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)