TW518246B - High performance liquid chromatography method and apparatus - Google Patents

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五、發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明-般而言係關於色譜術，且更特定言之，係關於 達成經改良高效液相色譜（HPLC)之方法與程序。 、 發明背景 藉高效液相色譜術分離之利用性，已被証實涵蓋寬廣範 圍之應用，包括分子之分析與純化，其涵蓋之範圍從低至 高分子量。在液相色譜術中，如同在氣相色譜術中，有顯 著之限制，特別是來自分析所需要之時間所發生者。爲充 分瞭解此等限制，此等分離程序所依據之理論基礎之簡述 ，可能是有用的。 其分離程序係依據以下事實，許多成份溶質分子，在流 體滲遽經過被稱爲固定相之粒子填充床之流動液流中，可 有效地彼此分離。個別試樣成份係經分離，因爲各成份對 固定相具有不同親和力，導致對各成份之不同潛移速率， 及對自管柱露出之各成份之不同離開時間。分離效率係決 定於當溶質橫貫床或管柱時溶質帶擴展之量。 關於此種分離之理論背景，係伴随著所謂” Craig機器 "產生（如由G. Guiochon等人，在預備與非線性色譜術 之基礎，大學出版社（1994)，第174頁中所述者），其中分 離可被認爲是在多個經連接、相等、不連續、假設階層中 進行，其中每一個體積均包含固定與移動相，且其中每一 個均建立完全平衡。每一個此種階屠係被稱爲一個"理論 *·塔板。在此種情況下，管柱中理論塔板之數目，係從分 離程度計算而得。每一個所計算理論塔板之管柱長度，係 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

518246 A7 B7 五、發明説明（2 ) 稱爲"相當於理論塔板之高度••或Η，且係爲譜帶變寬現象 之一項度量。在色譜術中，一個相係爲固定的，而另一個 相則在相對較快速率下移動通過該第一個相，以致完全平 衡事實上不會在兩相之間達成，且當然不會發現不同階層 。儘管如此，塔板理論還是常被用以描述溶質之通過色譜 管柱，以許多速率因數爲觀點，解釋譜帶變寬作用。 在應用塔板理論至色譜管柱時，必須假定所有溶質最初 係存在於管柱之第一個塔板體積中，分配係數對所遭遇之 溶質濃度係爲常數，且溶質本身將迅速分配在各塔板體積 中之兩相之間。 由於提供經分離試樣譜帶之最低變寬作用之管柱，係爲 特別是預備的現代HPLC系統必備之物，故被放入管柱中之 填充物之本性，及裝填管柱之方式，所有與被辱找以回收 之溶質有關聯之事項，均格外重要。測定相對譜帶變寬， 及因而造成對管柱性能之有害作用之各種程序，因此一般 期望被降至最低。一般認爲每一個此等程序對於塔板高度 Η之作用，可藉由速率理論而與誓如移動相速度u 、填充 粒子直徑dp及在移動相中之溶質擴散係數之實驗變數產生 關聯。在HPLC中，對相當於理論塔板高度Η有貢獻之主要 譜帶變寬程序，一般被認爲是： (1) 满流擴散，aedp (2) 移動相質量傳遞，aBdp2u/D 二Aun (3) 縱向擴散，bD/u = B/u，及 (4) 停滯之移動相質量傳遞，cdp2u = Cu 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（公釐） \ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 518246 A7 ______ 五、發明説明（3 ) 其中ae、aB、b及c爲塔板高度係數；n爲分級指數，A、 B及C爲特定管柱之常數，及D爲料在㈣相巾之擴散係 數0 加入此等不同貢獻，係提供用以描述譜帶擴展之古典表 示式，各稱爲Van Deemter方程式，其可以簡化形式書寫 成： (方程式 1) H = Aun + B/u + Cu 一種典型H對u (以公分/秒表示）圖，係顯示於圖 〇 於圖1中，A區域係表示管柱填充物特徵之渦流擴散項 ，意即經過管柱之流動，將在粒子間發現不同長度之彎曲 通道。於是，分子可能運行不同距離，同時橫貫管柱，而 造成譜帶擴展並減弱分離效率。假設經過管柱之流動形態 仍然保持恒定，則在流體流經管柱之所有線性速度之數値 下，A項勢必亦將保持常數。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於圖1中之B區域，係爲流體經過管柱之線性速度之函 數，且在該速度之低數值下顯然是更重要的，於高速度下 變成對譜帶擴展贡獻上之一項可忽視闼數，此係由於溶質 分子之軸向分子擴散程序所致。此種分子擴散係被濃度梯 度所驅動，因此當在管柱中之時間長度變得較短時，其對 譜帶擴展之相對貫獻變得較小。 於圖1中之C區域，係以對B相反之意義改變，意即其 對Η之貢獻，係随著增加流率而增加。當溶質分子流動較 快時，分離效率變成受到試樣成份擴散進出粒子中孔隙之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518246 A7 ___B7_ 五發明説明（4 ) "—— 能力所限制。因此，C項係表示此擴散驅動程序之質量傳 遞限制。因此，由圖1所舉例之色譜程序，具有有限時間 分析界限。因此，習用理論之舉例，Van Deemter方程式 係陳述吾人必須設定固定分析時間，以達成最大分離效率 〇 類似圖1之曲線族群，可經由將Η對管柱直裡上之變異 //、填充粒子大小、固定相之量及其類似參數作圖而獲得 。根據速率理論，如藉由Van Deemter方程式所舉例者， 在此種曲線族群中之最低值，係指示移動相經過管柱之最 佳流速，以使譜帶變寬作用降至最低。重要的是，此曲線 顯露出當、經過管柱之流率在C區域中增加時，塔板高度jj 及因此是譜帶變寬作用，亦會増加。 在警如圖1之圖形中描述HPLC管柱之函數時，習用上係 與Van Deemter曲線一樣，以塔板高度η對移動相之線性 速度u作圖。由於HPLC程序爲一種擴散驅動程序，且由於 不同溶質分子具有不同擴散係數，故吾人可在將此程序應 用至廣範圍不同分子量之溶質時，考慮此後述變數。此外 ，在管柱中之粒子大小，可逐一管柱本同，且亦可被視爲 另一項變數，及同樣地，可考慮溶劑對溶質之黏度。爲使 圖形正規化，以將此等變數納入考量，則吾人可有利地採 用對比坐標，特別是以h取代Η ，及ν取代u ，警如由 Giddings所陳述者，及在現代液相色譜術導論，第二版， 如前文出處，第234 - 235頁中所描述者，而產生對比形式 之Van Deemter方程式，如下述： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518246 A7 B7 - -----— 一—— - ____-— ------------ 五、發明説明（5 ) (方程式2) h 二 Μ + M/v + cxv，或 (方程式 3) H = a^dp + b^D/u + cxudp/D 其中坐標h係定義爲H/dp，其中dp爲粒子直徑，且因此h 係爲無因次坐標。同樣地，無因次坐標v係定義爲udp/D ，其中D爲溶質在移動相中之擴散係數。應明瞭的是，v 亦被稱爲PSclet數。但是，應強調的是對比坐標或P6clet 數v ，當使用於本發明之此項解説時，係爲描述流體流經 管柱中粒子間之間隙體積中之通道，而不應被認爲是描迷 流體在構成管柱中填充床之多孔性粒子之孔隙内之流動。 從方程式3，可明瞭渦流擴散項a*dp係爲粒子大小之函 數。因此，Van Deemter對比方程式預測當粒子大小増加 時，其效率應會降低。縱向擴散項WD/u經証實係爲流體 速度與擴散係數之函數，相反關係顯示對於在極低流體速 度下之小分子而言，此項將更爲重要。當流體速度增加時 ，此項將由質量傳遞項所支配。後述項yudp/D，經証實 係爲全部三種變數，意即粒子大小、流體速度及擴散係數 之函數。當流體速度增加時，此方程式預測質量傳遞項將 會支配效率，其中退化作用係與速度及粒子直徑之乘積成 正比。對於一個特定擴散係數而言，根據Van Deemter方 程式之效率，因此總是應以此區域中之流體速度之函數降 低。於後文將説明Van Deemter方程式之此等方面，對於 在擾流體系中之流動並非有效的。 J· C· Giddings 在化析化學，第35卷，1338 (1963)中 ，提出將方程式3中之a*項，與在移動相中之質量傳遞結 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

518246 A7 B7 五、發明説明（6 ) 合，而得一個項，其係低於單獨之axdp或cxv。Giddings 主張此種結合理論，會預測出塔板高度趙近常數值，意即 ，在高流率下塔板高度係與流動速度無關，且主張其已証 實在液相色譜術中之塔板高度值低達2.5。同一作者，隨 後在色譜術期刊，第13卷，301 (1964)中窝到”...h之 數值不能夠被降至低於2很多，意即塔板高度Η不能夠被 推進至低於兩個粒子直徑很多"，其提出曲線預測最適宜 之塔板高度，在對比速度下經發現係在1與2之間。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,11 應明瞭的是，譜帶變寬作用之減到最低限度，係爲所期 望的，以確保獲得溶質之最適宜分離，特別是在分析色譜 術上’及產物純度，特別是在預備色譜術上。雖然此等目 標在生物巨分子之分離上是特別眞實的，譬如工業酵素， 供使用於治療及診斷程序上之各種蛋白質，及其類似物， 但此種所要之分子在極大髖積之流體中通常僅以微小量產 生，且極大部份具有相應地小擴散係數。因此，所要分予 藉HPLC之分離，若受限於由Van Deemter曲線所指示最適 宜之移動相流率，則將令人苦悶地緩慢及過度地昂貴。此 外，生物製劑可能會在預備溶液中時、因熱或由於蛋白特 及其類似物之存在而降解，因此迅速分離是極爲需要的。 以液相色譜分離程序對生物學巨分子所達成之生產效率， 可以產物量/金錢爲觀點加以描述。爲達成最適宜生產， 則生產速度及產能是很重要之考量，其均爲目前未被良好 地滿足的。 已努力建立HPLC系統，其中分離之特徵在於高解析度及

518246 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（7 ) ^ 、 i?祕七%' 大量處理之高時間速率。例如，在美國專利後 文稱爲’270專利）中所揭示與請求之方法，其特別涉及溶 質之流體混合物，流經以兩組互連孔隙所形成之基質，各 組具有實質上不同於另一組之平均直徑。爲達成此程序， 對流流體流動之速率’其顯然是在壓力梯度下，其經過具 有較小平均直徑之孔隙組，必須超過一個低限速度，其係 超過溶質經過較小孔隙組之擴散痒率。 同樣地，美國專利5,228,989 f後文稱爲，989專利），其 係爲’270專利劃分之連續案，陳述藉由填充粒子形成管柱 ，粒子之特徵爲具有雙峰之孔隙結構，此等粒子具有之孔 隙係位在兩種不同直徑範圍内，具有粒子直徑對較大範圍 孔隙之平均直徑之特定比例。美國專利5,384,042(後文稱 爲’042專利），其爲’989專利之劃分案，揭示並請求一種 基本上由’989專利中所請求之粒子所形成之基質。 儘管’270、’989及’042專利之陳述，宣稱從流體流經色 譜管柱之速度中解開譜帶擴展之現象，但應注意的是Van

Deemter假説之正當性，基本上並未於其中受到挑戰，因 此，此等專利陳述C項並非完全與床速度無關，並將所請 求之改良性能歸因於兩個相關孔隙組之存在。 另一個相關先前技藝之實例，係在液相色譜術導論，第 二版，Snyder 與Kirkland, John Wiley & Sons, Ν·Υ·( 1979)中提出，其在目前係被認爲是關於此項主題之權烕 敎科書之一，其係顯示在第238頁，.表5·25，其特徵是"在 可預見之未來，應用至可能99%之所有LC分離"。該表指 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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述以下結論"較高操作壓力通常會產生較大N値（假設L係 成比例地增加）···但是，主要在P上増加（如錄5.25中 所述之十倍）之優點，僅對於小數値之^及/或大數值之 t爲重要的。使用小粒子（5_1〇微米）及15分鐘至2 5小時 之分離時間，财P上之1G倍増加，會產Μ上之約略2 倍之増加。對遠爲較小粒子及長分離時間而言，於p上之 10倍増加，可轉化成N上之十倍増加。但是，所涉及之實 驗條件完全不實用，此係由於分離時間極其過長，且‘之 數值並非最適宜的。”（其中N爲塔板數，P爲壓力，“爲 粒子大小及L爲管柱長度）。此敎科書繼續提及如下：··當 分離時間t増加時，dp之最適宜數値會移轉至較高數値， 例如對分離時間1天而言爲5微米。在較高操作壓力下， 較低dp數值疋有利的......因此，由於DB係随著増加試樣 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 分子量而降低，故dp之最適宜値亦會降低"。於第241頁上 之表，斷言對於具有分子量3〇〇,〇〇〇之溶質之最適宜的dp 値，係爲約0.03至0·1微米，且此敎科書係以下列陳述作 結論π自前述數據，吾人明瞭亞微米粒子係無疑地有利於 大分子之分離，及"· · · ·壓力高於5000 psi並未顯示相 配於LC分離（第240頁）。正如將於後文明瞭的，本發明係 實質上與先前技藝特徵之此等主張與結論成對比。

由M· Golay所解説之色譜術理論（氣體色譜術，D· H

Desty 編著，第36頁，Buttersworths,倫敦，1958)係以 許多假設爲基礎，其僅對經過管柱之層流爲正確的。此係 由J. C· Giddings所確認（於氣體色譜術中塔板高度理論 -10 - 度適用中國®^標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) · 一 518246 A7 B7 五、發明説明（9 ) 上之進展，分析化學，第35卷，第4期，1963年4月，第 439-448頁），其發現Van Deemter方程式之缺點，斷言 此方程式不能夠成功地在色譜管柱中從獨立數據預測塔板 高度之數值，因其未含有用以固定有效薄膜厚度量之項目 ，且含有關於渦流擴散、氣相質量傳遞及液膜轉移之誤差 與省略。 V· Pretorius與T· Smuts (擾流色譜術·•一種較快速 分析之新穎研究途徑，分析化學，第38卷，第2期，1966 年2月，第274 - 280頁），評論所有解析特定溶質對所需要 之最少時間之先前研究，均僅僅是關切移動相之層流。 Pretorius等人之論文，説明若色譜術係在具有擾流替代 層流之開口管狀管柱中進行，則最少分析時間可被顯著地 降低。Pretorius等人指出，在擾流條件下，G〇iay表示 式失效，並特別參考由R. Aris在Proc· R〇y. Soc, A235 ，67(1956);同前出處A252, 538(1959)中所提供於擾 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 流條件下之譜帶分散之先前研究，以導出方程式，其係被 認爲是經假定對層流與擾流均有效之Golay表示式之一般 形式。Pretorius等人提供圖形顯示根據該新方程式之實 驗與計算之塔板高度，其在雷諾數约1〇3下，從層流轉移 至擾流，經過開口管件時，會顯著地降低。此論文之結論 是，藉由採用擾流而非層流，則關於氣相色譜術之分析時 間，係經改良約一個數量級。作者推測對於其中移動相爲 液體之色譜術而言，分析時間應會縮短約1〇4之因數，此 係基於比較其在習用氣相與液相層析中使用層流之分析時 -11 -

518246 A7 B7 五、發明説明（10 ) 間之外推法。Pretorius等人亦註明，使用於具有擾流之 液相色譜術中之開口管狀管柱，其長度必須是層流之約十 倍長，簡易分離需要數個大氣壓之壓降，而更困難之分離 則意謂超過100個大氣壓之壓降。使用擾流液相色譜術以 獲得具有高準確度與高速之預備分離，由Pretorius等人 之陳述内容看來，似乎成爲禁忌，其在第280頁，第2攔指 出，在具有直徑0.1公分且長度2000公分之管件中分離（具 有分離因數爲1.5)，將顯然地花費24天，並推測在具有分 離因數爲0.75下，其分析時間可能會縮短至約6天。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 擾流在毛細管色譜管柱中之利用性，已在多年前被倡導 ，成爲達成高度有效分離之吸引人之方式，但並未被擴展 至填充管柱，因爲獲得擾流所必須之壓降，對實際考量而 吞’咸認過大。參閲M· Martin等人，在援流液相與氣相 色譜術中滯留對於譜帶變寬之影嚮，Anal· Chem·, 54, 1533-1540 (1982)。類似結論係由I · Halasz在理想與幾 何學上變形開口管件中之質量傳遞-II,理想與盤繞管件 在液相色譜術中之可能的應用，J· Chromatogr, 173, 229 -247 (1979)中達成，其特別拒絕討論在擾流區域中之液 相色譜術，因爲其比滲透性係至少比層流中之情況低3， 其h值係高於理論預測十倍，高壓降是無法令人接受的， 且注射在高入口壓力下是極困難的。再者，一般認爲在色 譜環境中，於擾流條件下維持固定相，在最好情況下也是 困難的，並顯示不實用，因其涉及高剪切力。 D· S· Horne等人，於氣相與液相色譜術中移動相分教 -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518246 A7 ____ B7 ____ 五、發明説明（11 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 之比較，Sep· Science, 1(5), 531-554 (1966)，提出流 體經過管柱之流體動力學之研究，並認爲在極高液體速度 下，擾流會影嚮分散在流動中之速率。其最高速度，在液 相實驗中証實係爲l〇g v = 3.8，其大約是在對比速度爲 6,500附近。此論文陳述在極高速度及雷諾數超過約10之 下，對比塔板高度變成與速度無關。此論文係以管柱進行 之研究爲基礎，該管柱係以管柱對粒子直徑比爲10至30所 填充之500微米直徑非多孔性玻璃珠所製成。未達成色譜 分離，因爲無溶質被保持在珠粒上。同樣地，H. Kaizuma 等人，藉氣相與液相色譜術之動態比較評估結合與擾流， J. Chrom· Science,第8卷，630-534 (1970年11月），於 流體經過管柱之流體動力學之另一個研究中，該管柱係裝 填未具有色譜活性之500微米非多孔性、球形玻璃珠，其 指出結合與擾流將會造成塔板高度對速度之圖，完全異於 Van Deemter形式，其係基於使用輸入管柱壓力高達123 大氣壓，以獲得極端高速度。此後述論文証實對液體而言 ，log對比塔板高度對log對比速度圖，係擴大至對比速 度超過8,000，並説明在塔板高度（约10)開始降落之前， 最大值係在大約5000左右。此論文之結論是擾流在LC中似 乎並不重要。 關於不可壓縮黏滯流體經過具有均句橫截面與相對較平 滑管壁之中空圓柱形管或管件之流動，長久以來已明瞭有 一個臨界或過渡流動速度，使穩定層流（意即其中壓降係 與速度成正比）且流體係在諸層中移動而無不規則大波動 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518246 A7 ____B7 五 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 、發明説明（12 ) ，與不規則且不穩定或擾流之體系（意即其中壓降會更接 近地随著速度之平方而改變，且在流體中之局部速度與壓 力會不規則地波動）分隔。此種流動可以雷諾數Re爲觀點 加以描述，Re係定義爲 (方程式4) Re 二 p vd / " 其中P爲流體密度（克/立方公分），v爲流體速度（公分 /秒），d爲管件直徑（公分）及"爲流體黏度（克/公分秒 )。雷諾數未具有尺寸單位，因此充作流體流動類型之標 準。例如，習知一般情況下，若雷諾數很小，例如低於約 2100，則在此種平滑壁管件中之流動係爲層狀，而在較高 雷諾數下，例如高於约3〇〇〇，則流動將爲擾流。於雷諾數 介於约2100與3000間之流動，會構成臨界過渡階段。雷諾 數之值，如上述，在某種程度下係依流體所流過之導管内 部表面之平滑性而定。其中導管之内部表面係爲粗糙的， 意即不規則的，則過渡至擾流係發生在稍微較低雷諾數下 。由於擾流，至少在含水類型之流體中，咸認大部份係僅 發生在若雷諾數超過約21〇〇時，故獲得此種流經色譜管柱 填充床之不實用性，似乎顯然是因爲吾人不能夠接近此雷 諾數，除非是在需要巨大壓力容器之壓力下，且更重要的 是，會使管柱中之多孔性粒子崩潰。 發明目也 本發明之主要目的係爲提供經改良之色譜裝置與方法， 以提供高容量、高解析度之溶質分離。本發明之又另一個 一 14 -本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518246 A7 B7 五、發明説明（13 ) 重要目的，係爲提供此種裝置與方法，當其在HPLC中用於 溶質分離時，係與先前技藝之陳述内容相反，其係顯示實 質上與Van Deemter曲線相反之特徵曲線，其特徵在於當 經過HPLC管柱之移動相速度從B片段增加至A片段時，譜 帶變寬作用會增加，而當經過管柱之移動相速度増加超過 A片段時會減少。本發明之其他目的，係爲提供此種裝置 與方法，其將顯著地提高同時對於譬如生物製劑及其類似 物之小與大分子之分析與預備色譜術之速度與容量，以使 得此種裝置與方法能夠以相當地大於任何迄今所採用之移 動相速度實施，而具有顯著經改良之結果，以使得此種裝 置與方法能夠以填充粒子床實施，其中粒子係實質上大於 先前技藝所常用者，及使得此種裝置與方法能夠在相當地 低於先前技藝關於擾流液相色譜術所陳述之壓力下實施。 發明摘述 因此，本發明係針對進行液相色譜術之新穎方法，其中 色譜管柱或本體係被製成堅硬、固態、多孔性粒子之實質 上均句分佈之多重性，該粒子具有實質上均勻平均橫截面 尺寸或直徑不低於約30微米，典型上爲50微米或較大，在 某些情況中，至高達到（但不限於）1〇〇〇微米，其將於後文 描述。於本文中使用之"粒子"一詞，不應被解釋爲受限於 任何特定形式或形狀，與其對稱性或缺乏對稱性、縱橫比 、規則性及其類似性質無關。於本文中使用之，•固體"一詞 ，係欲指物質之物理狀態，不應被解釋爲排除多孔性粒子 -15 -

518246 A7 B7 五、發明説明（14 ) 。此等粒子係選自某一範圍之各種尺寸與形狀，並在本體 或管柱中固定在一起，譬如藉壓力、燒結及其類似方式， 因此具有全部間隙體積不低於管柱總體積之約45%之間隙 通道，係在粒子之間形成。粒子之表面，包括粒子中孔隙 之内部表面，係爲色譜上活性的，譬如藉由塗覆色譜固定 相層。此方法包括使一種流體混合物流經管柱之步驟，該 混合物含有至少一種溶質或懸浮相，其係與粒子表面交互 作用，以裝填管柱。由於粒子及填充物在管柱中之本性， 故流體混合物經過管柱之流動，可在高流率下，較佳是在 平均對比速度（如後文定義）大於約5〇〇〇下，且在某些將於 後文描述之情況中，係包括高達70,000或更高之對比速度 值。一般認爲在此種條件下，混合物之擾流係在至少主要 部份之間隙體積内被引發，並假設此種擾流事實上會提高 傳質速率，因此增加管柱之動態容量。本發明進一步確立 的是，具有極大平均直徑（例如dp爲500微米或較大）之色 譜上活性粒子，與擾流，特別是在高數值之對比流動速度 v (例如40,000或較大）下之組合，係令人意外地提供對比 塔板高度値爲1或較低。 〜 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 本發明之方法亦可包括以下步驟，在使混合物伴随著其 溶質流經管柱後，於對比速度亦較佳地大於約5000下，使 溶離劑流體通過管柱。正如即將説明者，經由使溶離劑流 體在此種對比速度下流經管柱之間隙體積，則來自管柱所 溶離之溶質所經歷之譜帶擴展，將與Van Deemter預測完 全相反，在此等條件下之譜帶擴展，係爲關於溶離劑流動 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518246 A7 B7 五、發明説明（15 ) 之雷諾數之反函數，且係爲該溶質在該溶離劑流體中之擴 散係數量之直接函數，溶質之分子量係爲擴教係數中之一 個很大因數。 本發明亦具體表現在色譜裝置上，其包括經填充之多重 堅硬固體粒子所形成之色譜管柱，該粒子具有不低於約30 微米之實質上均勻平均直徑。此等粒子係經成形並經選擇 在某一範園之大小與形狀，及在足夠壓力下填充，以在粒 子之間形成間陈通道或間隔，在該粒子之間界定之間隙體 積不低於該管柱總體積之约45%。此等粒子之表面具有色 譜上活性，譬如已塗覆一或多個色譜上固定相之薄層。在 一較佳具體實施例中，特別是其中管柱之粒子係接近橫截 面尺寸之可接受範圍之下端，則此等粒子如後文定義，係 爲不規則的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 提供裝置使流體混合物在對比速度至少約5000下流經管 柱，咸認此種對比速度足以在至少主要部份之間隙體積中 引致混合物之擾流，此混合物含有至少一種與固定相層具 有交互作用之溶質。本發明進一步包括用以使溶離劑流體 ，在經選擇之速度下流經已經加料管柱之裝置，以致使自 管柱藉溶離劑流體所溶離之溶質之譜帶擴展，係爲溶離劑 流動之雷諾數與溶離劑流體中溶質之分子量兩者之反函數 。因此，溶離劑流體之流動，係在對比速度大於約5000下 達成。 於本發明之又另一項具體實施例中，其特別可用以分離 具有相對較小分子量之溶質分子（例如，甚至低達50或更 -17 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 518246 A7 B7 五、發明説明（16 ) 低），則係提供具有平均直徑爲數百（例如500)微米或較大 之粒子之填充床。此項具體實施例亦包括用以使試樣與溶 離劑之流體混合物，在對比速度高達70,000或更高下，流 經管柱之裝置，咸認此種對比速度係爲提供必要之擾流。 在關於此種管柱之dp與v之此種典型數值下，目前已令人 意外地發現對比塔板高度h係與移動相之速度呈相反關係 ，而且並非如先前技藝所認爲的與其無關。 亦已在色譜程序中發現，其中被引進具色譜活性微粒子 填充床中之溶質，易於變成非專一性結合，此種非專一性 結合，係簡單地經由使液體混合物中之溶質，在平均對比 速度大於约5,000下流經該管柱而降低，接著至少在相同 平均對比速度下，立即使用溶離劑流動。 本發明之前述及其他目的，有些部份是顯而易見的，而 有些部份將於後文明瞭。因此，本發明係包括具有下文詳 细揭示内容中所舉例配件之構造與排列之裝置，且此方法 包括數個步驟，及一或多個此等步驟相關於其他步驟之關 係與順序，其申請之範圍將示於申請專利範圍中。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 爲更充分明瞭本發明之性質與目的，應在參考下文詳述 時併用附圖，其中一致之數字表示類似配件。 附圖簡谏 圖1爲舉例之先前技藝Van Deemter曲線，其中係將典 型塔板高度Η對u (以公分/秒表示）作圖； 圖2爲具體化表現本發明原理之裝置之示意圖； -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210Χ297公釐） ' " 圖3爲經過圖2管柱具體實施例之一部份之理想化放大 圖； 圖4爲具有不同塗層之多孔性粒子之經選擇批次之孔隙 大小分侔圖，其中係將粒子孔隙之侵入體積對所選定溶質 分子量之對數作圖； 圖5爲根據本發明原理，使用額定5〇微米、未經官能基 化之多孔性氧化鋁粒子所製備之色譜管柱之經度量數據之 圖，説明管柱之效率，作爲在不同流率下經過管柱，經過 屠流與擾流間之轉移之流艘流動速度之函數，以對比坐標 作圖； 圖6爲類似圖5之圖，説明額定2〇微米粒子管柱之效率 ，如圖5以對比坐標作圖，作爲經過管柱之流體流動速度 之函數，其顯示在給予圖5所繪實例中所使用之壓力限制 下，不能夠以具有該大小之粒子獲得擾流； 圖7爲另一個類似圖5之圖，以使用額定1〇微米粒子之 實例爲基礎，其明白地顯示在給予圖5所繪實例中所使用 之壓力限制下，不能夠以具有該大小之粒子獲得擾流； 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖8爲得自實例1、2及3之數據圖，關於對著流體線性 速度所度量之反壓降（psi)，補充圖5、6及7之圖表； 圖9爲兩種試驗溶質之分析圖，該溶質各爲不同高分子 量蛋白質，在0.5毫升/分鐘至10毫升/分鐘之流率下， 自填充具有額定平均尺寸50微米粒子之本發明HPLC管柱溶 離，經衍化以提供陽離子交換能力，將所形成之數據，以 對比塔板高度h爲觀點對u (以公分/秒表示）作圖； -19 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公羡） 518246 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（18 ) 圖10爲相同試驗溶質之一之分析圖’於相同流率下’自 相同大小粒子之管柱溶離，並以相同尺度在相同坐標中作 圖，全部均與圖9相關，但是，其中粒子係經替代地衍化 以提供陰離子交換能力； 圖11爲關於圖9所使用相同試驗溶質之一之分析圖，以 相同方式自填充額定20微米粒子之本發明色譜管柱溶離， 經衍化以提供陰離子交換能力，在與圖9相同之坐標中作 圖； 圖12爲關於圖η所使用相同試驗溶質之分析圖，以相同 方式自填充額定10微米粒子之本發明色譜管柱溶離，經衍 化以提供陰離子交換能力，在與圖11相同之坐標與尺度中 作圖； 圖13爲使用本發明原理在人類鐵傳遞蛋白與牛血清白蛋 白混合物中之分離，所獲得之預備色譜術之色譜圖； 圖14爲在數種不同極高流率下，將丙酮在水中之試樣注 入使用極大粒子填充床之HPLC管柱中，所得之數據圖； 圖15爲順序注射相同試樣至HPLC管柱中，並溶離試樣， 首先在擾流速率下，接著在層流速率下，所得之數據圖， 以試樣回收率作爲試樣溶液累積質量之函數爲觀點，説明 非專一性結合；及 圖16爲順序注射相同試樣至HPLC管柱中，並溶離試樣， 首先在擾流速率下，接著在層流速率下，所得之數據圖， 以試樣之累積非專一性結合作爲試樣溶液累積質量之函數 爲觀點，説明非專一性結合。 -20 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-----~~ __

518246 A7 B7 五、發明説明（19 ) 詳述 本發明係利用多項發現，闞於液相色譜術之習用知識既 不夠徹底亦不完全正確。例如，如上述之Van Deefflter方 程式係受限於其中移動相流動爲基本上層狀之狀況，而咸 認本發明係確立Van Deemter方程式於其中移動相流動爲 擾流時之無效性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明之一方面，如圖2中以圖式所示，係體現在色譜 裝置上，其包括色譜管柱2〇，以填充之多重堅硬、固態粒 子22所形成，此粒子在本發明之第一個具體實施例中具有 不低於約30微米之實質上均勾平均直徑。於本文中使用之 "平均直徑”一詞，係意指粒子之平均直徑或橫截面尺寸， 而與粒子型態無關，故不得將其解釋爲粒子必須受限爲球 形或規則固體，此種平均直徑之數值，典型上係在直徑之 分佈内，於可靠係數爲约95%下。事實上，本發明之較佳 方面係爲粒子形狀之不規則性，其將於後文描述。於本文 中使用之"不規則··一詞，係不僅意欲被定義爲缺乏形式之 一致性，因粒子可以各種多面型態之混合多重性存在，而 且係意欲包括短緘維，以及旋轉之固體，譬如大致上爲球 形、尖圓形、橢圓體形及其類似型式而具有粗糙、不均句 或凹凸表面之粒子。 本發明之粒子較佳係製自不可壓縮材料，應明瞭此術語 係意謂在至少約5 X 103psi之磨力下，粒子之密度與趙積 改變之時間速率（包括出口管柱玻料保持器），仍然保持實 質上爲零，且粒子因此將實質上抵抗塑性變形，即使在此 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） 518246 A7 - " "- B7 五、發明説明（2〇 ) 種同壓力下亦然。本發明之粒子係經成形，並經選擇在某 一範圍之大小與形狀内，以致其可在足以形成管柱之壓力 下填充，該管柱之特徵在於具有在粒子22間所形成之間隙 通道24,如特別在圖3中所示者。由於粒子之不規則性， 故得以明瞭此種通道之内壁於型態上必定十分粗糙。雖然 一般認爲通道24之至少大部份，係具有平均橫截面直徑實 質上不低於約4微米，但間隙體積分率（意即，在粒子間 之間陈通道24之總體積）不應低於管柱2〇總體積之约45% 。應明瞭的是，典型先前技藝管柱係具有間隙體積分率低 於约45% ,更特別是在约35%至42%之範圍内。粒子以之 表面係爲色譜上活性的，其本質上係爲此項技藝所習知， 或者藉由處理，譬如藉由塗覆任何多種已知色譜上活性之 固定相層，其亦爲此項技藝中所習知。 粒子22可爲薄膜狀，或爲增加活性表面積，較佳爲具有 粒子内孔除之多孔性，其典型上具有平均直徑位於例如约 60A至5,000A之範圍内。由於粒子不規則性，且伴随著間 隙體積分率不低於约45%之結果，故咸認經過本發明管柱 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 間陈通道之擾流，可令人驚訝地在雷諾數遠低於10下引致 〇 關於多孔性粒子所形成管柱之間隙體積Vi，可定義爲： (方程式5) Vi = V - Vp - Vs 其中V爲空柱總體積； VP爲在粒子本身中之孔隙之總體積；及 Vs爲粒子骨架或架構之總體積。 -22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 518246 A7 _____ B7 五、發明説明（21 ) 關於非多孔性粒子所形成管柱之間隙體積Vi，可定義爲 雛 (方程式6) Vi = V - Vx 其中Vx爲粒子總體積。

Hg侵入分析爲一種習知技術，其可用以測定非多孔性粒 子管柱以及多孔性粒子管柱中之間隙體積。 於本發明中之設置，譬如經聯結至管柱20基部末端之系 26 ’係提供流體混合物（來自適當來源，譬如儲槽28)及/ 或溶質（來自適當回路注射器，譬如27)，在對比速度（意 即，如上文定義之Udp/D)下，流經間隙體積之至少主要部 份，該對比速度在本發明之第一個具體實施例中，係實質 上高於約5000。應明瞭的是，後者係爲近似値，於此處 h/v曲線之斜率係開始沿著對比坐標h (意即H/dp)軸降 低，這表示效率随著増加對比速度而改良。咸信混合物之 擾流係在本發明第一個具體實施例之管柱中，在相應於對 比速度値约5000之流動速度下引致。本發明進一步包栝譬 如泵26之設置，用以使溶離劑流體（典型上來自另一種適 當儲槽或貯存槽30)流經已加料管柱（意即管柱2〇,其中 至少一部份具色譜活性之表面，具有溶質分子黏結於其上 ，此係由於最初溶質混合物流經管柱之結果所造成）。藉 溶離劑流體所溶離之溶質分子，典型上係以光學方式藉檢 測器31檢測，其型式與方式係爲先前技藝所習知，經配置 在管柱20之末梢端。經過管柱20之溶離劑流動，必須在相 應於對比速度之線性速度下，該對比速度對本發明之第/ -23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1--:----------h 裝----1ί _； I 訂---- 518246 A7 ___ _B7 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 發明説明（22 ) 個具體實施例而言，係高於約5000，以致被來自管柱之溶 離劑流體所溶離之溶質之譜帶擴展，係爲關於溶離劑流動 之雷諾數之反函數，且係爲溶質在溶離劑流體中之擴散係 數量之直接函數。應明瞭的是，蓉於溶質分子量與其擴散 係數間之關係，則被來自本發明管柱之溶離劑流體所溶離 溶質之譜帶擴展，亦可被定義爲溶質分子量之反函數。 管柱20典型上爲中空、管狀容器，由譬如不綉鋼或其類 似物之堅硬強材料所形成，其對於通過其間之流體爲化學 上惰性或非反應性。此管柱可具有小内徑，例如數毫米， 或可具有極大内徑，依欲以色譜方式處理之液體體積而定 。根據D· S· Horne等人，於氣相與液相色譜術中移動相 分散之比較，Sep· Science, 1(5), 531-554 (1966)，在 填充球形粒子之床中之譜帶分散，至少在移動相之中等流 率下，係最不期望在管柱直徑對粒子直徑之比例於約1〇與 30之間。但是，本發明係關切極高流率以達成擾流，因此 管柱對粒子直徑之比例，似乎並不重要。 在本發明之一項較佳具體實施例中，管柱係藉由具有平 均直徑不低於約30微米之填充粒子所形成，較佳係在至少 约5 X 103psi之壓力下，以確保所形成之管柱除了在粒子 22間互相接觸所形成之間隙通道24之外，將實質上不包本 空隙，意即管柱20具有實質上均勻體密度。依此方式所形 成之管柱20，不管粒子是爲多孔性或爲非多孔性，均應顯 示間隙分率爲約45%或較高。較低間隙分率，對多孔性、 非硬質聚苯乙烯粒子而言，典型上爲約35%，將不會顯示 -24 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐 518246 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（23 ) 必要之對比流體速度，除非是在無法令人接受之高壓下， 但其將易使粒子崩潰或破裂。 正如所指出者，爲確保形成具有較佳間隙分率並棑除在 操作壓力下崩潰之所要均勾密度管柱，故用以填充本發明 管柱之粒子係爲堅硬固體，其必須在至少约5 X i〇3psi之 填充壓力下，較佳係在高達約1 x l〇4psi之壓力下，爲不 可壓縮的。因此，較佳粒子係製自下列材料，譬如氧化鋁 、二氧化鈦、矽石、氧化锆、氧化釩、碳、各種相對較惰 性之金屬，及其組合。 因此，本發明之方法需要在色譜管柱中經過至少大部份 間隙通道之流動，必須是擾流。假設擾流剖面是幾乎平坦 的，其係與經過色譜管柱之層流特徵性之典型拋物線流動 剖面有所區別。更重要的是，咸認當擾流被引發時，速度 之徑向分量會重疊在正常擴散程序上，以對於管柱效率有 利之方式，改變正常擴散程序及譜帶擴展動力學。進一步 假設，爲引致及維持經過管柱之擾流，故在流動通道之直 徑與線性流動速度之間有一種重要關係，於是此兩種參數 之乘積，在線性速度改變下，仍然保持常數。對於粒子係 爲堅硬且可抵抗壓力上之改變而不會有塑性變形之需求， 正如上述，因此係爲極重要的。 應注意的是，從實際觀點看來，若吾人尋求採用度量色 譜管柱中擾流之一般標準，意即提供在雷諾數大於2〇〇〇下 之流動，則此種流動通常不能夠經由密緻填充床獲得◦以 本發明方法在管柱中引致擾流之關鍵，在於併用粒子之粗 * 25 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :裝·

1T -1¾ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 518246 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（24 ) 粒度以及高間隙體積分率，意即〉45%。由於此等因素， 故咸信在本發明色譜管柱中之擾流，已在雷諾數遠低於甚 至10之下被引致。 在以上述圖2之第一個具體實施例之裝置進行本發明之 方法時，係使用多種不同批次之粒子，以形成填充管柱。 此等批次之主要差異在於孔隙直徑係經操控，意即選擇性 地改變未經塗覆粒子之孔隙直徑，其方式是以數層色譜活 性物質批次塗覆後述粒子。關於每一個此種批次之多孔性 粒子之孔隙密度分佈，係以已知方式，使用聚苯乙烯標準 溶液測定，該溶液係由數種已知不同分子量之聚苯乙烯所 形成，各溶解於二氣甲烷中。詳言之，係採用具有分子量 範圍從2 X 1〇3至6 X 1〇6之聚苯乙烯，以測定粒子之排隄 極限及侵入分佈形態。將每一個含有此種聚苯乙埽標準物 之溶液，注入具有預定大小及/或塗層之多孔性粒子之相 應床中。度量孔隙體積，其方式是將丙酮注入每一個此種 床中作爲總滲透探測物，及接著注入6 X 1〇6分子量之聚 苯乙烯溶液作爲總排阻探測物。各標準物經過此床之經過 時間或溶離時間，係在254 nM下藉紫外線檢測度量。侵入 百分比係以低於經排阻探測物溶離體積之各探測物溶離體 積，除以孔隙體積，計算而得。 爲度量孔隙度，故檢驗多種粒子批料，第一種批料（於 本文中稱爲CT-50A1-002)爲未經塗覆、未經官能基化之高 度不規則形狀之多孔性氧化鋁粒子，其具有額定直徑爲50 微米，但實際平均直徑，當藉Coulter分析測定時，係爲 -26 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2⑴乂297公釐） (請先閱讀背面之注意事- 寫本頁) •装·

Ttr # -I -- I - 518246 A7 B7 五、發明説明（25 ) 42.39微米，在95%可信度因素内。具有額定5〇微米直徑 、不規則形狀之多孔性氧化鋁之四種其他粒子批料，但各 批料具有不同程度之官能基化固定聚合物塗層（於本文中 個別稱爲PS-11-035、PS-9-087、PS-4-090 及PS-10-024) ，亦藉相同技術檢驗。此四種具有官能基化塗層之批料， 係代表其表面覆蓋率範圍，藉熱重分析之重量損失百分比 表示爲2.7至6.04。發生此重量損失，係由於官能基化之 聚合物塗層在分析期間之提高溫度下之燃燒所致。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 應明瞭的是，由於所述粒子較佳係爲不規則且大致上並 非球形，故於本文中使用之”直徑••一詞，係意欲表示粒子 之平均檢截面尺寸。所有此等粒子批料均接受一系列不同 分子量之聚苯乙烯探測，如上述。所得之數據係示於圖4 中’以對數分子量對侵入累積百分比作圖。顯而易見的是 ，於圖4中之曲線全部爲大約對數線性，具有大約相同斜 率，因此經稍微塗覆之粒子，係顯示孔隙直徑之較小變窄 作用。但是’經濃厚塗覆之粒子則顯示已發生粒子内部孔 隙之大量且線性之降低。聚苯乙烯標準物之擴散係數!^， 係根據G· Guiochon等人在預備與非線性色譜術基礎同 前文出處，第142頁中所提出之公式計算而得。 個別HPLC管柱係使用具有額定平均直徑爲50微米（CT-50 A1-002)、20微米（CT-20A1-002)及 1〇微米（CT-07A1-002) 之不規則多孔性氧化鋁粒子之個別批料，利用下述填充擬 案製備。將約2克之各批料，在個別多溶劑混合物中配成 漿液，各漿液係被轉移至機械裝置，在5 X l〇3pSi填充壓 -27 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518246 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26 ) 力下，將每一種漿液填充至個別之〇 46 χ 1〇公分之中空 管件内。於是，此種管柱顯示管柱對粒子直徑比例爲至少 約90。將所形成之填充管柱移離填充裳置，經封端，及以 適當測試溶劑達成平衡。用以評估使用在與下述實例有關 聯之此等填充床管柱之ΗΡ1Χ系統，係採用_種可市講得自 Hewlett Packard 公司（pai〇, Alt〇, Calif〇rnia)i1〇5〇

型HPIX系統’此系統包括_個用以輪送流體至管柱之系， 及一個具有改變波長能力以檢驗自管柱所溶離譜帶之紫外 線檢測器。用以處理接收自檢測器之數據之系統，爲一種 可市購得自Acer美國公司（San J〇se, CaHf〇rnia)之牝6 /33SX型電腦，以一種經確認爲"Ηριχ Qemstati〇n ··, 修正版A.02.00之軟體程式操作，其可市購得自HeffieU

Packard 公司（Palo Alto, California)。 下述爲具體化表現本發明原理之液相色譜管柱之製備、 測試及用途之實例： 1ΜΛ 將一種按上述製備並填充具有額定平均直徑5〇微米之批 料CT-50A1-002粒子之HPLC管柱，經由在二氣甲垸溶劑中 達成平衡進行評估。將已溶解於二氣甲烷中之不同分子量 I苯乙婦之ί示準i液，個別;主入管柱中。在流率範圍從〇、 毫升/分鐘至高達20毫升/分鐘下達成評估◦每次注射之 效率，係經由在所檢測吸收峰之半高度點處度量吸收峰寬 度計算而得。每次注射之溶離時間，係藉由在254 nM下之 紫外線檢測度量作記錄。在各流率下之壓降係經度量及列 ' 28 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項界填寫本頁) -裝· .I: I I --- 518246 A7 B7 五、發明説明（27 ) 表。所得之效率數據係以圖表形式摘錄於圖5中，以對比 參數坐標h與v爲觀點作圖。 實例2 將一種按上述製備並填充具有額定平均直徑爲2〇微米之 批料CT-20A卜002未經塗覆、未經官能基化之高度不規則 形狀多孔性氧化鋁粒子之HPLC管柱，按實例1進行評估， 將具有不同分子量而經溶解於二氯甲烷中之聚苯乙烯標準 物，個別注入管柱中。在各流率下達成評估，計算每次注 射之效率，記錄溶離時間並將壓降列表，全部均根據實例 1中所提出之程序進行，所得之效率數據均以類似圖5中 所展示之坐標，説明於圖6中。 實例3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將一種按上述製備並填充具有額定平均直徑爲10微米之 批料CT-07A1-002未經塗覆、未經官能基化之高度不规則 形狀多孔性氧化鋁粒子之HPLC管柱，按實例1進行評估， 將具有不同分子量而經溶解於二氣甲烷中之聚苯乙烯標準 物，個別注入管柱中。在各流率下達成評估，計算每次注 射之效率，記錄溶離時間並將壓降列表，全部均按實例1 中所提出者進行，所得之效率數據均以圖5與6中所展示之 相同坐標，説明於圖7中。 實例4 度量並記錄在實例1、2及3中溶離之各管柱之反壓。將 所得之數據以壓降（psi)對線性速度（公分/秒）在圖8中作 圖0 -29 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ‘ 518246 A7 __________ __B7五、發明説明（28 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實例5 將按上述製備朗充具有就平均尺寸爲5()微米之批料 PS”1粒子之ΗΡΐχ管柱，以含有官能基性之表面化學 物質衍化，以適於藉陽離子交換之分離。將此管柱以含有 2M NaCl之20 mM中性PH値tris (三羥甲基胺基甲垸）緩 銜劑達成平衡。60毫克/毫升BSA (牛血清白蛋白）與溶菌 S每之試樣，兩者均得自Sigma化學公司（St L〇uis, Missouri) ， 分子量各爲約 67,〇〇〇與13,〇〇〇 ，將其溶解於移動 相中，注入管柱中並在流率範圍從0.5毫升/分鐘至10毫 升/分鐘下溶離。將所得之數據，以11與11爲觀點，在圖9 中作圖。 實例6 將一種按上述製備並填充具有額定平均尺寸爲5〇微米之 批料PS-14-037粒子之HPLC管柱，以含有四級化胺官能基 性之表面化學物質衍化，以賦予藉陰離子交換之分離能力 。使此管柱按實例5中所述達成平衡，並將60毫克/毫升 與實例5中相同之BSA試樣溶解於移動相中，注入管柱中 及在各流率下溶離，根據實例5中所提出之程序進行。將 所得之數據，以與圖9中所採用者相同之坐標與尺度，在 圖10中作圖。 實例7 將一種按上述製備並填充批料PS-11-〇9〇(額定20微米粒 子）之管柱，以含有四級化胺官能基性之表面化學物質衍 化，以提供藉陰離子交換之分離能力。將此管柱按實例5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I 批衣------ 訂---------------------- 518246 A7 ---·~>_________Β7 五、發明説明（29 ) 達成平衡及測試，並將所得之數據在圖11中作圖。 實例8 將一種按上述製備並填充批料PS-n-〇27(額定10微米粒 子）之管柱，以含有四級化胺官能基性之表面化學物質衍 化’以提供藉陰離子交換之分離能力。將此管柱按實例5 達成平衡及測試，並將所得之數據在圖12中作圖。 實例9 爲説明本發明之方法當應用於特別是預備色譜術時之高 速與解析度，故按上述製備並填充具有額定平均尺寸爲5〇 微米之批料CT-50A1-002粒子之HPLC管柱，將其以含有四 級化胺官能基性之表面化學物質衍化，並使用由Bi〇Sepra (Marlborough，Massachusetts)所製造之Prosys HPLC 儀 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 器，在梯度溶離下評估。此儀器包括四個泵，每個泵具有 最大流率爲30毫升/分鐘，以致全部最大流率爲12〇毫升 /分鐘。此儀器亦包括靜態混合器，在280毫微米下度量 之紫外線檢測器，5亳升注射充填器及注射回路，用以處 理檢測器輸出及其他數據之内部軟體程式，以及顯示輸出 數據之屏幕。提供一種具有最大流率爲30毫升/分鐘之三 級HPLC泵（型號6200A，得自日本東京之Hitachi儀器公司） ，搭配此Prosys儀器，此兩種泵送系統係以位在Pr〇sys儀 器中之混合器前方之T-連接點配置在一起，於是提供最大 流率爲150宅升/分鐘。 使管柱以50 mM中性pH値之tris緩衝液達成平衡。將 分子量約80,000之人類鐵傳遞蛋白（得自Sigma化學公司） -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公慶） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518246 A7 __B7_ 五、發明説明（3〇 ) ^^ 與分子量约67,000之BSA (亦得自Sigma化學公司）之試樣 混合物，於各成份濃度爲2毫克/毫升下溶解於緩銜劑中 ，並以此混合物充填5毫升注射回路。在管柱以tris緩衝 液達成平衡後，於120毫升/分鐘之流率下，使試樣裝填 至管柱。於5秒後，使移動相經由一個步驟梯度改變成5% 緩銜劑與2M NaCl。於另外7秒間隔後，使移動相經由一個 步驟梯度改變成20%緩銜劑/NaCl溶液。流率切換係以手 動方式在兩儀器上施行，其係同時改變流率以允許蛋白質 溶質之離子性分離。所形成之色譜圖，爲在280毫微米下 溶離之紫外線軌跡，顯示在全部分析時間大約15秒期間所 獲得之解析與吸收峰，其係示於圖13中。 從圖5- 7中所示之圖形及在上文實例中之數據，得以顯 見由大約50微米粒子所形成之管柱，在高於對比速度値約 5000下，其對比塔板高度係降低，這與Van Deemter預測 有所區別。在顯示此種擾流行爲之50微米粒子管柱中，自 圖5得以顯見，在對比速度大约40,000下，對比塔板高度 返回最低値，且相應於此對比速度之分析時間，將以約相 同量降低，意即大約4 X 104。所形成之1〇微米與2〇微米 粒子之管柱，並未顯示塔板高度對流動之類似關係，而是 如圖6與7中所示，順應藉由層流所建立之習用關係。 當所要之溶質可能以極小濃度存在於大量液體中時，以 溶質裝填色譜管柱以備分離，可能是耗時的，且因此是預 備色譜術之昂貴方面。由於本發明允許相對較高速度流經 管柱’故不僅裝填溶質至管柱所需要之時間可顯著地降低 -32 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} M衣. Μ訂 ，而且咸信藉由此種高速流動所引起之擾流，會加強溶質 分子之負载在管柱中粒子孔隙内之衍化表面上。 亦應明瞭的是，在分子之純化上，主要之商業關切事項 係爲成本，且生產率可被定義爲每單位時間經純化物質之 量。由於分析時間係藉本發明降低數個數量級，故可合理 地擴大相同節约因數至生產率，如特別是在實例9中所註 實的。由於本發明填充管柱之動態容量，係被質量傳遞考 量所影嚮，故此項推論似乎是十分有關聯的。 本發明之另一項具體實施例賴以爲基礎之另一項發現， 亦顯示液相色譜術之先前技藝觀點是不正確的。例如，Van Deemter方程式，即使是以Giddings之結合理論爲觀點， 如前文所指出者，係預測對比塔板高度h値並不能夠預期 低於约2 ，即使在高流率下亦然，且該塔板高度係與移動 相之流動速度無關。目前已發現，與Van Deemter相反， 結合係數（於方程式3中之a*項）並非與流率無關，並可 利用經過大粒子（例如於平均直徑上至少4〇〇微米）填充床 之擾流速度，而呈現遠低於1之數値。該項發現之重要性 將自下述實例明瞭。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實例10 製作使用填充管柱之本發明裝置之另一項具體實施例， 其係採用類似圖2中所示之裝置，其中管柱2〇係以填充之 多重堅硬固體形成，較佳爲具有實質上均勻平均直徑之不 可壓縮粒子22，其中典型平均直徑爲數百微米。在此實例 中，管柱20爲得自 Upchurch (Upchurch Scientific 公司 -33 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ι〇Χ297公楚） 518246 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __ B7 發明説明（32 ) ,Seattle, Wash·)之4·6 X 100毫米液相色譜管柱，具 有Upchurch 20微米鈦玻料，填充DavisilTM 636 Davison 碎石粒子（W. R· Grace 公司，Boca Raton, Fla·)，當以 光學顯微術確認時，其具有平均直徑約500微米。正如在 前文具體實施例中所述之微粒子管柱20，粒子22之表面爲 色譜上活性的。粒子22具有前文所述任何其他粒子之此等 特質，而非直徑。 將譬如定量泵26(N-P型，得自Bran & Luebbe，Chicago ,111·)之設置，聯結至管柱20之基部末端，以使來自適 當來源譬如儲槽28之一系列流體混合物試樣，流經管柱間 隙體積之至少主要部份。每一份此種試樣係爲4〇微升丙酮 ，經HPLC級水稀釋，藉適當回路注射器27 (7125型，得自

Rheodyne· L/P·，Cotati，Cal·)，在约80與 140 毫升 / 分鐘間之數種流率下注射。檢測器設置31 (包括UV-1000型 檢測器’付自熱分離產物公司（San Francisco，Ca 1.)， 經聯結至Kipp & Zonen BD-112型記錄器，得自Fisher 科學公司（Pittsburg, Pa·))係經配置在管柱20之末梢端 〇 得自此後述液相色譜系統搡作之數據，係在下表中提出 ，其亦説明實驗流率Q (毫升/分鐘）（假設酮在水中之擴 散係數爲1·5 X 10-5平方公分/秒）對於對比速度v之關係 。此表顯示在此種管柱20之dp與v之典型値下，目前已言正 實對比塔板高度h係與移動相之速度呈相反關係，且其並 非如先前技藝所認爲的一樣爲獨立或恆定不變，並可達成 -34 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210XW7公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 518246 A7 _B7 一丨· 1 1一 五、發明説明ί3 ) 遠低於1之數值。對於每一試樣之回收，即使是小分子， 譬如丙酮，係極端地快速’藉由檢測器所檢出吸收峰之 寬度與幅度，顯示每一試樣所注射之丙酮，在低於15秒内 有實質上完全之回收。 盍 Q (毫升/分鐘） u (公分/秒） pj, ' 1 v ==udp/Dm N=5.54(tR/w,/j2 Η (微米） π 80 11.4 38,000 112 893 1.78 100 14.3 48,000 182 549 1.1〇_ 17.2 57,000 220 454 0.91 _ 1 140 20.0 67,000 244 410 0.82 其中u =平均移動相線性速度； V ==對比線性速度； Ν =理論塔板數； Η二塔板高度；及 h =對比塔板高度。 流率Q之値（毫升/分鐘）對塔板高度Η之度量値（微米）之 圖，係示於圖14中。從實例1〇所提供之數據，得以明瞭使 用所述裝置與其搭配之預備色譜術，可造成極端高速度、 高容量分離，即使是對於具有分子量遠低於1〇〇之分子亦 然。 如前文説明，質量傳遞係被擾流所加強，且目前認爲所 涉及之機制，係爲減少接近色譜粒子上表面區域結合位置 之結果。因此，若此假設之機制係爲正確的，則非專一性 -35 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

( CNS ) ( 210 X 297^¾ ) " ^ 518246 A7

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 結合應相應地減少。非專_性結合，當該術語於本文中使 用時，係意指色譜術中之現象，其中被捕獲在色譜粒子上 之表面結合位置處之試樣分子，會抵抗隨後藉溶離之置換 ，或不能夠藉溶離移除。爲確立此假説之眞實性，故進行 下述研究： 實例11 按上述實例6製備一對〇 46 χ 10公分HPLC管柱，並按 實例9中所述，以儀器評估。製備BSA (Sigma化學公司) 之試樣混合物，其方式是在6〇毫克/毫升之濃度下，將其 溶解在移動相中，移動相係由pH值8 62下之tris緩衔劑 與2M NaCl所形成。在管柱以緩銜劑達成平衡後，於各管 柱中，在平均流率下，於對比速度大於约5〇〇〇下，連續進 行多次10微升試樣注射。以面積之函數，度量試樣之回收 率。首先在移動相之溶離流率爲3〇毫升/分鐘下測試各管 柱，對此管柱之試樣與粒子大小而言，該流率係相應於對 比速度超過30,000。一旦在此等高流率下達成飽和，即持 續使用相同管柱進行研究，但係在根據Van Dee社er關係 上所發表之陳述内容中相應於較傳統層流體系之丨毫升/ 分鐘流率下進行。 好所得之數據係以圖形方式表示在圖15與16中。應明瞭的 疋’，在則述條件及所採用移動相之性質下，於試樣中之 通常是未被保持的，但已知具有非專-性結合交互作用， 推測上是與其下方之氧化銘擔體作用。應明瞭的是，非專 -性結合可能會在HPLC中呈現嚴重問題，因爲無機基質有 -36 - 本纸張尺度適财關家辟 (請先閲讀背面之注意事項-S填寫本頁)

518246 A7 B7 五、發明説明（35 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 '吃進有限量試樣之傾向，該試樣可能僅以微小量存在及 /或可能是_價_。如圖15中所示，在擾流條件下， 所回收試樣 分比，雜所轉試樣料之累積質量抵 達5毫克時，達到100%。在層流體系中，儀直到所注射試 樣溶液之累«量已抵賴13亳切，才達卿G%回收 率，這表示與在擾流條件下發生之情況純，頗爲較多之 非專一性試樣結合係發生在層流條件下。圖16僅只是以所 發生非專-性結合之E積量爲無重述數據，*非回收率 ，其顯示對於所採用之管柱而言，BSA非專一性結合之實 際質量，對擾流條件係在约1.2毫克声變平坦或飽和，但 對層流則直到約3·8毫克BSA已被非專一性地結合時才爲 平坦。因此，得以顯見經由在HPLC中採用擾流條件，則由 於非專一性結合之損失，可實質上被降至最低。就此而論 ，在色譜管柱中，其中在被引進管柱中之試樣内之溶質， 可能易於變成非專一性地結合至管柱粒子，本發明之陳述 内容可用以減少此種非專一性結合，其方式是提供用以使 試樣注射至管柱之設置，及實質上立即在試樣注射後，用 以使溶離劑流體流入管柱中之設置，注射及溶離劑流體之 流動，均建立在平均對比速度大於约5000下。 由於可在未偏離本文所涉及之本發明範圍下，在上述裝 置與程序中施行某些改變，故欲將所有在上述說明文中所 包含或在附圖中所示之事項，解釋爲説明性而非限制意義 37 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 518246

   申請專利範圍 ^ Αρρ1η· Νο·85113631 钇正之申請專利範圍中文本-附件㈠ Amended Claims in Chinese ~ End (h …（民國87年9月4曰送呈 ~(Submmed On SepLeiilbet1 4~^1998)~ h—種色譜裝置，其係合併地包括 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一個色譜本體，以具有色譜上活性表面之實質上均勻 分佈之多數個堅硬、固態、多孔性粒子所形成，該粒子具 有平均直徑不低於約30微米，於該粒子間之間隙體積不 低於該本體總體積之約45% ;及 用以使該表面負栽至少一種溶質之設置，該溶質與該 表面具有反應性，其係在足以引致該混合物於至,少大部 份該間隙體積内流動之速度下，於對比速度大於約5,000 下，使含有該溶質之液體混合物流經該本體。 2·根據申請專利範圍第1項之色譜裝置，其中該粒子之平 均直徑係實質上均勻。 3·根據申請專利範圍第1項之色譜裝置，其中該間隙體積 包含夕重間隙通道介於該粒子之間，至少大部份該通道 具有平气橫截面尺寸實質上不低於約5微米。 4·根據申請專利範圍第1項之色譜裝置，其中該粒子係以： 固足相層塗覆，以使得該表面具色譜上活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5·根據申請專利範圍第1項之色譜裝置，其中該粒子係實 質上不可壓縮，以在填充壓力高達約1 X 104psi下實質 上抵抗塑性變形。 6·根據申請專利範圍第1項之色譜裝置，其中該粒子係製 自氧化鋁、矽石、二氧化鈦、氧化釩、氧化锆及碳中之 一或多種。 7·根據申請專利紅圍第1項之色譜裝置，其中在該粒子中 之孔隙’具有平均直徑在於約A至約5,000 A之把園 • 38 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐）

   經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518246 A8 B8 _ —_SI 六、申請專利範圍 内。 &•拫據申請專利範圍第1項之色譜裝置，其中該粒子係在 實質上不低於5 X i〇3psi之壓力下填充在一起。 9·根據申請專利範圍第i項之色譜裝置，其包括用以自該 本體溶離經負栽溶質之設置，其係在足以引致該溶離劑 流體於至少大部份該間隙體積内流動之速度下，於對比 速度大於約5,0〇〇下，使溶離劑流體流經該本體。 10·根據申請專利範圍第丨項之色譜裝置，其包括用以自該 本體落離經負栽溶質之設置，其係在所選定之速度下使 溶離劑流體流經該間隙體積，以致使藉該溶離劑流體自 m本體所溶離溶質之譜帶擴展，係爲溶離劑流體流動之 雷諾數之反函數，且係爲該瑢質在該溶離劑流體中擴散 係數量之直接函數。 11·根據申請專利範圍第1項之色譜裝置，其包括用以自該 本體溶離，負栽溶質之設置，其係在所選定之速度下使 落離劑流體流經該間隙體積，以致使藉該溶離劑流體自 該本體所溶離溶質之譜帶擴展，係隨著增加溶離劑流動 之雷諾數而降低。 12·根據申請專利範圍第丨項之色譜裝置，其包括用以自該 本體溶離經負栽溶質之設置，其係在所選定之速度下使 溶離劑流體流經該間隙體積，以致使藉該溶離劑流體自 該本體所溶離溶質之譜帶擴展，係爲該溶質在該溶離劑 流體中擴散係數量之直接函數。 13·—種色譜裝置，其係合併地包括 >紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) '-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   518246 六、申請專利範園 ABCD

   -個色譜管柱，以具有色譜上活性表面之實質上均勾 分佈、經填充之多數個堅硬、固態、多孔性粒子所形成， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 孩粒子具有實質上均句平均直徑不低於约500微米；及 用以使該表面負载至少一種溶質之設置，該溶質與該 表面具有反應性，其係在足以引致該混合物於該粒子間 之至少大部份間隙體積内流動之速度下，於對比速度大 於约5,000下，使含有該溶質之液體混合物流經該管柱 ° < 14♦根據申請專利範圍第13項之色譜裝置，其包括用以自 該管柱溶離經負栽溶質之設置，其係在對比速度値至少 約50,000下使溶離劑流體流經該管柱。 15·—種色譜裝置，其包括一個色譜管柱，以填充之多數個 堅硬固體粒子床形成，此等粒子具有實質上均句平均直 徑不低於約30微米，該粒子之表面具色譜上活性，且其 中被引進磷床之溶質有變成非專一性結合至該粒子之傾 向，其改良事項包括 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 用以在對比速度大於約5,000下，將包含該溶質之液 體混合物注入該管柱中，以使該粒予負载該溶質之設置 ;及’ 用以自該粒子溶離經負栽溶質之設置，其係在平均對 比速度大於约5〇〇〇下，使溶離劑流體流經該管柱。 16·—種進行液相色譜術之方法，其包括以下步驟： 形成具有色譜上活性表面之實質上均勻分佈之多數個堅 硬、固態、多孔性粒子之本體，以在該粒子之間提供間 -40 - 本紙張尺度適) M規格（^^297公釐厂 " 518246 A8 B8 C8 D8 幻年K日雙正 補充 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 六、申請專利範園 隙體積，該粒子具有平均直徑不低於約30微米；及 使該表面負栽至少一種溶質，該溶質與該表面具有反 應性，其係在足以引致該混合物在至少大部份餘間隙體 積内流動之速度下，在對比速度大於約5,000下，使含 有該溶質之液體混合物流經該本體。 17·根據申請專利範圍第16項進行液相色譜術之方法，其 中該粒子係爲不規則形狀。 18.根據申請專利範圍第16項進行液相色譜術之方法彡其 中該粒子係經成形並經選擇，以致使在該粒子間之間隙 體積不低於該本體總體積之約45%。 19·根據申請專利範圍第16項進行液相色譜術之方法，其 中該粒子係以固定相層塗覆，以使得該表面具色譜上活 性〇 20·根據申請專利範圍第16項進行液相色譜術之方法，其 中所引致之J該混合物之流動係實質上爲擾流。 21·根據申請專利範圍第16項進行液相色譜術之方法，其 包括自實質上不可壓縮之材料中選擇該粒子之步驟，以 使其在高達至少1 X 104psi之填充壓力下抵抗變形。 22·根據申請專利範圍第16項進行液相色譜術之方法，其 中該粒子係製自氧化鋁、矽石、二氧化鈦、氧化釩、氧 化锆及碳中之一或多種。 23·根據申請專利範圍第16項進行液相色譜術之方法，其 中該粒子係經選擇’以使孔隙具有平均直徑在於约60A 至5,000 A之範圍内。 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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   六、申請專利範圍 24·根據申請專利範圍第16項進行液相色譜術之方法，其 中該本體係以下述方式形成，將該粒子填充在管狀容器 中，以形成色譜管柱。 25·根據申請專利範圍第24項進行液相色譜術之方法，其 中填充該粒子之步驟，係在實質上不低於5 x 1〇3psi之 壓力下達成。 26·根據申請專利範圍第24項進行液相色譜術之方法，其 I 中係達成填充該粒子之步驟，以在除了互相接觸之粒子 間之間隙體積外，實質上不在該管柱中形成空隙。 27.根據申請專利範圍第24項進行液相色譜術之方法，其 包括自該本體溶離經負载溶質之步驟，其係在足以引致 該溶離劑流體於至少大部份、該词隙體積内流動之速度下 ，於對比速度大於约5,000下，使溶離劑流體流經該本 體。 I 28♦根據申請專利範圍第27項進行液相色譜術之方法，其 中溶離步驟係以下述方式達成，其係在所選定之速度下 使該溶離劑流體流經該本體，以致使藉該溶離劑流體自 該本體所溶離溶質之譜帶擴展，係隨著增加溶離劑流動 之雷諾數而降低。 29·根據申請專利範圍第27項進行液相色譜術之方法，其 中溶離步驟係以下述方式達成，其係在所選定之速度下 使該溶離劑流體流經該本體，以致使藉該溶離劑流體自 該本體所溶離溶質之譜帶擴展，係爲該溶質在該溶離劑 流體中擴散係數量之直接函數。 -42 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項#填寫本頁) 參· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518246

   經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 30·根據申請專利範圍第27項進行液相色譜術之方法，其 中溶離步驟係以下述方式達成，其係在所選定之速度下 使該溶離劑流體流經該本體，以致使藉該溶離劑流體自 該本體所溶離溶質之譜帶擴展，係爲該溶質分子量之反 函數。 31. 根據申請專利範圍第27項進行液相色譜術之方法，其 中溶離步驟係以下述方式達成，其係在所選定之速度下 使該溶離劑流體流經該本體，以致使藉該溶離劑流體自 該本體所溶離溶質之譜帶擴展，係爲溶離劑流動之雷諾 數之反函數，且係爲該溶質在該溶離劑流體中擴散係數 量之直接函數。 32. 根據申請專利範圍第27項進·行液相色譜術之方法，其 中該粒子係經選擇，以具有至少約500微米之直徑；及 該流動與溶離步驟係在對比流率超過約50,000下達成。 33· —種色譜+法，其中被引進具色譜活性粒子填充床之 溶質，係變成非專一性地結合至該微粒子，一種減少此 種非專一性結合之方法，係包括以下步骤： 使液體混合物中之溶質，在對比速度大於約5,0〇〇下 ，流經該管柱。 34·根據申請專利範圍第33項減少非專一性結合之方法， 其中該混合物之流動係實質上爲擾流。 35·根據申請專利範圍第33項減少非專一性結合之方法， 其中該流動步驟係包括 至少在該對比速度下使該混合物注入該管柱中，及實 -43 - ^紙張ϋί用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ. 518246 A8 B8 C8 D8 柄補无 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 申請專利範圍 質上隨後立即 至少在該對比速度下，以溶離劑流體之流動，自該管 柱溶離該混合物中之溶質。 -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)