JP3354155B2 - 高速液体クロマトグラフィー方法及び装置 - Google Patents

高速液体クロマトグラフィー方法及び装置

Info

Publication number
JP3354155B2
JP3354155B2 JP51750297A JP51750297A JP3354155B2 JP 3354155 B2 JP3354155 B2 JP 3354155B2 JP 51750297 A JP51750297 A JP 51750297A JP 51750297 A JP51750297 A JP 51750297A JP 3354155 B2 JP3354155 B2 JP 3354155B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
particles
solute
eluent
column
flow
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP51750297A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH11514743A (ja
Inventor
クイン，フバート，エム．
タカリュウスキ，ジョセフ，ジェー．，ジュニア
Original Assignee
コヒースィヴ テクノロジーズ，インク．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27069969&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP3354155(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by コヒースィヴ テクノロジーズ，インク． filed Critical コヒースィヴ テクノロジーズ，インク．
Publication of JPH11514743A publication Critical patent/JPH11514743A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3354155B2 publication Critical patent/JP3354155B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/14—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the introduction of the feed to the apparatus
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/16—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the fluid carrier
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
    • B01J20/08—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04 comprising aluminium oxide or hydroxide; comprising bauxite
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
    • B01J20/103—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate comprising silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/20—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising free carbon; comprising carbon obtained by carbonising processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form
    • B01J20/28019—Spherical, ellipsoidal or cylindrical
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28054—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their surface properties or porosity
    • B01J20/28078—Pore diameter
    • B01J20/28083—Pore diameter being in the range 2-50 nm, i.e. mesopores
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28054—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their surface properties or porosity
    • B01J20/28078—Pore diameter
    • B01J20/28085—Pore diameter being more than 50 nm, i.e. macropores
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/283—Porous sorbents based on silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/284—Porous sorbents based on alumina
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
    • G01N2030/324—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed speed, flow rate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N2030/387—Turbulent flow of mobile phase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は広くクロマトグラフィーに関し、より特別
には改良高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行うた
めの方法及び手順に関する。
発明の背景 高速液体クロマトグラフィーによる分離の有用性は、
低分子量から高分子量に及ぶ分子の分析及び精製を含む
広範囲の適用にわたって実際に示されている。液体クロ
マトグラフィーにおいては、ガスクロマトグラフィーに
おけると同様に、分析に要する時間に由来する大きな制
限がある。これらの制限を十分に理解するには、これら
の分離方法が基づいている理論的根拠についての簡単な
説明が有用であるかもしれない。
その分離方法は、固定相として知られる粒子の充填床
を通してろ過される液体の流れ中の多数の溶質分子を互
いに効率よく分離することが出来るという事実に依って
いる。個々の試料成分は、各成分が固定相に対して異な
る親和性を有し、各成分が異なる移行速度及びカラムか
ら出てくる異なる流出時間を生じるために、分離され
る。分離効率は、床又はカラムを通過するときの溶質バ
ンドの展開の量によって決定される。
そのような分離の理論的背景は、いわゆる“クレイグ
機（Craig machine）”（調製用非線形クロマトグラフ
ィーの基礎、アカデミックプレス（1994）（Fundamenta
l of Preparation and Non−Linear Chromatography,Ac
ademic Press）の174頁にグイチョン（Guichon）等によ
って記載されている）に関連して生じたが、そこでは、
分離は、複数の結合された、等しい、別々の、仮想の段
階において行われ、その各体積は固定相及び移動相の両
方を含み、その各々において完全な平衡が成立してい
る、と考えることが出来る。そのような各段階は“理
論”段と呼ばれる。計算理論段当たりのカラムの長さ
は、“理論段相当高さ”またはＨと呼ばれ、バンド幅の
広がりの尺度である。クロマトグラフィーにおいては、
１つの相は固定されており、他の相は比較的速い速度で
最初の相を通過して移動するので、事実上、２つの相の
間で完全な平衡は達成されない。そして、当然、明瞭な
段は観察されない。それでもなお、段理論は、一般的に
クロマトグラフィーを通しての溶質の通過を説明し、多
数の速度ファクターによるバンド幅の広がりを明らかに
するために使用されている。
クロマトグラフィーのカラムへ段理論を適用する場合
に仮定しなければならないことは、すべての溶質はま
ず、カラムの最初の段容積中に存在し、分配係数は出会
う溶質濃度に対して一定であり、そして溶質はそれ自
体、各段容積中の２つの相の間ですばやく分配する、と
いうことである。
個々の試料のバンド幅の最小の広がりを与えるカラム
は分取モダンHPLCシステムの特別重要なものであるの
で、カラムに入れられる充填物の性質及びカラムを充填
する方法のすべてが回収されるべき溶質と関連して非常
に重要である。従って、カラム性能に対して結果的に有
害な影響を有する相対的なバンド幅の広がりを決定する
種々のプロセスは最小限にするのが望ましい。カラム段
高さＨに対するこれらのプロセスの各々の影響は、移動
相速度ｕ、充填物粒径dp、及び移動相中の溶質拡散係数
のような実験的変数に速度理論によって関連付けられる
と考えられる。理論段相当高さＨに寄与するHPLCのバン
ド幅を広げる主なプロセスは一般的に： （３）縦拡散 bD/u＝B/u、及び （４）停滞移動相物質移動 cdp 2u＝Cu （上記式中、ae、am、ｂ及びＣは段高さ係数であり;nは
分数指数であり;A、Ｂ及びＣは一定のカラムについての
定数であり；及びＤは移動相中の溶質の拡散係数であ
る）と考えられている。
これらの種々な寄与を与えると、バンド幅の広がりを
記述するヴァンデームター（Van Deemter）式として周
知の古典的な式が与えられ、それは下記の通り簡単な形
で記述される。
（式１） Ｈ＝Aua＋B/u＋Cu 典型的なＨ対ｕ（cm/秒）のプロットは図１に示す通
りである。
図１において、Ａ領域はカラム充填物に特有の渦拡散
項を表わす。即ち、カラムを通しての流れには粒子間に
様々な長さの曲がりくねった流路が見い出される。この
とき、分子はカラムを横切りながら異なる距離を進むこ
とができ、バンド幅の広がりを生じそして分離効率を与
える。カラムを通しての流れのプロファイルは一定のま
まであると仮定すると、Ａ項もまた、カラムを通しての
流体の流れの線速度のすべての値に対して一定のままに
なると推測される。
図１のＢ領域はカラムを通しての流体の線速度の関数
であり、その速度の値が低い場合には明らかにより顕著
であり、速度が高い場合には溶質分子の軸方向分子拡散
のプロセスによるバンド幅の広がりに寄与するファクタ
ーとしては無視できる。そのような分子拡散は濃度勾配
によって駆動され、従って、バンド幅の広がりへの相対
的な寄与は、カラム中の時間の長さが短くなるにつれ
て、少なくなる。
図１のＣ領域は、Ｂの反対の意味で変化する。すなわ
ち、Ｈへの寄与は、流量の増加と共に増加する。溶質分
子がより速く流れるにつれて、分離効率は、粒子の細孔
内あるいは細孔外へ拡散する試料の成分の能力によって
限定されるようになる。従って、Ｃ項は、この拡散で駆
動されるプロセスの物質移動の限定を表す。この理由
で、図１によって例示されたクロマトグラフィーのプロ
セスは時間的に限定された分析の境界を持っている。従
って、従来の理論の具体例としてのヴァンデームター式
は、最大の分離効率を達成するために、固定分析時間を
定めなければならない、ということを教示する。
図１の曲線に類似の一群の曲線が、カラム径、充填物
粒度、固定相の量等の変数についてＨ対ｕをプロットす
ることによって得られる。ヴァンデームターによって例
示される速度理論にしたがって、そのような一群の曲線
のそれぞれの最小が、バンド幅の広がりを最小にするた
めに、カラムを通しての移動相の最適流量を示す。重要
なことに、曲線は、カラムを通しての流量がＣ領域にお
いて増加するにつれて、カラム段高さＨおよびバンド幅
の広がりも増加する、ということを明確に表している。
図１のようなプロットにおいてHPLCカラムの機能を説
明する場合に、ヴァンデームター曲線を使用した場合と
同様に、カラム段高さＨを移動相の線速度ｕに対してプ
ロットすることが一般的に行われている。HPLCプロセス
は拡散駆動プロセスであるので、そして異なる溶質分子
は異なる拡散係数を有するので、HPLCプロセスを広範囲
の異なる分子量の溶質に適用する場合にこの後者の変数
を考慮することができる。また、カラム中の粒子のサイ
ズはカラム毎に異なることができ、別の変数としても考
えることができる。同様に、溶質のための溶媒の粘度が
考えられるかも知れない。プロットを標準化してこれら
の変数を考慮するために、換算座標を使用するのが有利
である。特に、ギディングス（Giddings）によって教示
されそして最新液体クロマトグラフィー入門（Introduc
tion to Modern Liquid Chromatography）、第２版、22
4乃至235頁に記載されているように、Ｈをｈに代え、ｕ
をｖに代えると、下記の如きヴァンデームター式の換算
形を得る。
（式２） ｈ＝ａ＊＋ｂ＊/v＋ｃ＊ｖ、または （式３） Ｈ＝ａ＊dp＋ｂ＊D/u＋ｃ＊udp/D 上記式中、座標ｈはH/dp（ここで、dpは粒径である）
として定義され、従って、ｈは次元のない座標である。
同様に、次元のない座標ｖはudp/D（ここで、Ｄは移動
相中の溶質の拡散係数である）として定義される。ｖは
またペクレ（Peclet）数としても知られているというこ
とが分かる。しかしながら、本発明の説明において使用
される換算座標またはペクレ数は、カラム中の粒子間の
間隙容積の通路を通しての流体の流れを記述するもので
あって、カラム中の充填ベットを構成する多孔質粒子の
孔内の液体の流を記述するものであると考えるべきでは
ない、ということを強調しておかなければならない。
式３から、渦拡散項ａ＊dpは粒度の関数であることが
わかる。従って、ヴァンデームターの換算式は、粒度が
増加するにつれて、効率が減少しなければならない、と
いうことを予言する。縦拡散項ｂ＊D/uは流体速度と拡
散係数との両方の関数として表わされる。逆の関係は、
非常に低い液体速度での小さな分子について、この項は
より顕著になることを示す。液体速度が増加するにつれ
て、物質移動項が拡散項を支配するようになる。後者の
項Ｃ＊udp/Dは三つの変数すべての、すなわち、粒度、
液体速度及び拡散係数の関数として表わされる。
流体速度が増加するとき、その式は、物質移動項が、
速度と粒子径の積に比例して悪化を伴って効率を支配す
るようになる、と予言する。従って、一定の拡散係数に
ついて、ヴァンデームター式による効率はこの領域の流
体速度の関数として常に減少しなければならない。ヴァ
ンデームター式のこれらの解釈は混乱した様式の流れに
ついては有効ではないということが下記で示される。
分析化学（Analytical Chemistry）、第35巻、1338
（1963）において、ジェイ．シー．ギディングス（J.C.
Giddings）は、式３のａ＊項は移動相の物質移動と結合
して、ａ＊dpまたはｃ＊ｖ単独よりも小さな項を生じ
る、ということを提案している。ギディングスは、この
結合理論は、段高さが一定の値に近づくこと、すなわ
ち、高い流量では、段高さは流の速度に依存すると主張
し、そして液体クロマトグラフィーにおいて2.5の低い
値の証拠をもっていると主張している。同じ著者が、そ
の後クロマトグラフィージャーナル（Journal of Chrom
atography）、第13巻、301（1964）において、「ｈの値
を２よりずっと小さくすることはできない、すなわち、
段高さＨを２つの粒径よりずっと小さく押しやることは
できない。」と書き、最適段高さは１と２の間の低い速
度に見い出されることになるということを予言する曲線
を提示している。
バンド幅の広がりの最小化は、特に分析用クロマトグ
ラフィーにおける、溶質の最適分離、及び特に調製クロ
マトグラフィーにおける生成物純度を得ることを確保す
るに望ましいであろう。工業用酵素、治療及び診断法な
どにおける使用のための種々のタンパク質のような生物
学的巨大分子の分離においてそれらの目標はは特に真実
であるが、しばしば所望の分子は非常に多い用量の流体
中非常に少ない量で生産され、相当する小さな拡散係数
を有する非常に大きなものである。従って、HPLCによる
所望の分子の分離は、ヴァンデームター曲線により最適
として指示された移動相流速に限定されるならば、苦痛
なほど遅くかつ過度に高価なものであろう。さらに、生
物製剤は、調製溶液中熱的あるいはプロテアーゼなどの
存在により時間とともに変性するので、迅速な分離が非
常に望ましい。生物学的巨大分子用液体クロマトグラフ
分離法を使用して達成された生産効率はamount−of−pr
oduct/dollarによって示すことができる。至適生産を達
成するためには生産スピード及び容量が重要であるが、
現在それによく合致するものはない。
分離が容量処理の高分解及び高速の両者で特徴づけら
れるHPLCシステムの創作が研究されている。例えば、米
国特許第5019270号（以下「'270特許」という。）に開
示され及び請求された方法は、とりわけ、２セットの内
部結合した細孔で形成されたマトリックスを通して溶質
の流体混合物を流すことを含み、それぞれのセットは他
のセットと実質的に異なる平均粒径を有するものであ
る。その方法を達成するために、より小さな平均粒径を
有する細孔のセットを通過する明らかに圧力勾配下での
対流的な流体の流れの速度は、より小さな細孔のセット
を通過する溶質の拡散速度を超える限界速度を超えなけ
ればならない。
同様に、'270特許の分割継続出願である、米国特許第
5228989号（以下、「'989特許」という。）は、より大
きな範囲の細孔の平均径に対する粒径が特定な比を有す
る２つの相違する粒径範囲内にある細孔を有する粒子で
ある並数（モード）を２つ持つ細孔構造を有するものと
して特徴づけられる粒子を充填することによるカラムの
形成を教示している。'989特許の分割である、米国特許
第5384042号（以下、「'042特許」という。）は、'989
特許に請求された粒子で本質的に形成されたマトリック
スを開示及び請求している。
'270、'989及び'042特許の教示は、クロマトグラフィ
ーカラムを通過する流体の流速からバンドの拡散現象を
分離すると主張しているにもかかわらず、それらの特許
は、Ｃ項が床速度と完全に無関係ではなく、さらに請求
された改良された特性が２つの関連するセットの細孔の
存在によるものであると言及しているので、ヴァンデー
ムター仮説の有効性はそれらに本質的に問題にされてい
ない点に注目すべきである。
関連ある先行技術の別の例は、Introduction to Liqu
id Chromatography,2nd Ed.,Snyder及びKirkland,John
Wiley ＆ Sons,N.Y.（1979）に記載されており、これは
現在、本主題に関する権威ある本の一つと考えられてお
り、238頁には、「予測できる将来全てのLC分離は99％
であろう」と特徴づけられる表5.25が示されている。こ
の表は、以下の結論が指示されている；「より高い処理
圧力はより大きなＮ値（仮想Ｌが比例して増加する）を
与える・・・しかしながら、Ｐの主な増加（例えば、表
5.25における10倍）の利点はdpの小さな値及び／又はｔ
の大きな値に対してのみ重要なものである。小さな粒子
（５から10μｍ）及び15分から2.5時間の分離時間に対
しては、Ｐにおける10倍増加は、おおまかにＮにおける
２倍増加を与える。より小さな粒子及び長い分離時間に
対しては、Ｐにおける10倍増加は、Ｎにおける10倍増加
に変換できる。しかしながら、含まれている実験条件は
分離時間が非常に長すぎ、さらにdp値が至適値ではない
点で全体的に実用化できないものである。」（ここで、
Ｎは段数であり、Ｐは圧力であり、dpは粒子サイズであ
り、及びＬはカラム長である。）このテキストはさらに
続けて以下のように記載している：「分離時間ｔの増加
に伴い、dpの至適値はより高い値に移動し、例えば、１
日の分離時間では５μｍである。より高い処理圧力で
は、より低いdp値が好ましい・・・・・・なぜならば試
料の分子量の増加に伴いmDは減少し、dpの至適値も減少
するからである。」241頁の表は、分子量300、000を有
する溶質に対する至適dp値は約0.03から0.1μｍであろ
うと主張し、そしてこのテキストは以下のように結論し
ている：「前述のデータから、ミクロン以下の粒子は大
きな分子の分離に決定的に有利であるように見える」及
び「5000psiより高い圧力はLC分離に価値があるように
思えない。」（240頁）。以下の記載から明らかなよう
に、本願発明は先行技術の主張及び結論と実質的に区別
されるものである。
M.Golayにより説明されている理論（Gas Chromatogra
phy,D.H.Desty,ed,p,36.Buttersworths,London,1958）
は、カラムを通過する層流に対してのみ正しい多くの仮
説に基づいている。これはJ.C.Giddings（Advances in
the Theory of Plate Height in Gas Chromatography,A
nalytical Chemistry,Vol.35,No.4,April 1963,pp.439
−448）により確立され、彼は、ヴァンデームター式の
欠点に注目し、この式は有効な膜厚の大きさを固定する
ための条件は含まず、さらに渦拡散、ガス相物質移動及
び液膜移動に関連した誤り及び欠落を含んでいるから、
この式は独立データからクロマトグラフィーカラムにお
ける数値的段高の値を予想することはできないと主張し
ている。
V.Pretorius及びT.Smuts（Turbulent Flow Chromatog
raphy:a New Approach to Faster Analysis,Analytical
Chemistry,Vol.38,No.2,Feb.1966,pp.274−280）は、
所定の一対の溶質を分離させるのに必要な最小時間に関
する以前の全ての研究は、移動相の層流に関するものの
みであったことに注目している。そのPretorius et al.
の文献は、クロマトグラフィーを層流の代わりに乱流を
使用して開放管カラム中で行うと最小分析時間が有効に
換算できることを示している。Pretorius et al.は、乱
流条件下ではGolay式は有効でないことに気づき、そし
てR.Aris,Proc.Roy.Soc,A235,67（1956）；同A252,538
（1959）により提供された乱流条件下でのバンド幅の分
散に関する先行研究を特に引き出して、層流及び乱流の
両者に有効であろうGolay式の一般式であると考えられ
る式を誘導している。Pretorius et al.は、約103のレ
イノルズ数での開放管を通過する層流から乱流への移動
に関し、実験的及び新しい式による計算的な段高を換算
することを示すプロットを提供している。その文献は、
層流よりむしろ乱流を使用することにより、ガスクロマ
トグラフィーのための分析時間がほぼ大きさのオーダー
により改良されると結論している。その著者等は、クロ
マトグラフィーのため、移動相が液体である場合、層流
を使用する従来のガス及び液体クロマトグラフィーにお
ける分析時間との比較の彼らの推定に基づき、分析時間
は約104のファクタで短縮されるべきであると推測して
いる。さらに、Pretorius et al.は、乱流を有する液体
クロマトグラフィーで使用した開放乱流カラムの長さ
が、層流に対する長さとしての約10倍であるべきであ
り、単純な分離は数気圧の圧力添加を必要とし、さらに
より困難な分離は100気圧より高い圧力添加を含むであ
ろうと議論している。高精度及び高速の調製分離を得る
ための乱流液体クロマトグラフィーの使用は、Pretoriu
s et al.、の教示からタブー視されるであろう、なぜな
らばこの文献の280頁、カラム２には、直径0.1cm及び長
さ2000cm（分離ファクタ1.5）の管での分離は明らかに2
4日かかり、そして分離ファクタ.75での分析時間は約６
日にまで短縮されるかもしれないという記載があるから
である。
キャピラリークロマトグラフィーカラムに乱流を利用
することは、数年前に、非常に効率的な分離を達成する
ための魅力ある手段として主張されたが、乱流を得るた
めに必要な圧力損失が実際上の考慮にはあまりに大きす
ぎると考えられたことから、その乱流の使用は充填した
カラムまでには及ばなかった。M.Martinらの、Influenc
e of Retention on Band Broadening In Turbulent Flo
w Liquid and Gas Chromatography,Anal.Chem.54,1533
−1540（1982）を参照。Mass Transfer Ideal and Geom
etrically Deformed Open Tubes−II.Potential Applic
ations of Ideal and Coiled Tubes in Liquid Chromat
ography,J.Chromatogr,173,229−247,（1979）において
I.Halaszは同様な結論に到達した。この文献では、比透
過率が層流におけるよりも少なくとも３倍ないし、ｈ価
が理論上予想されるより十倍高く、また高い圧力損失は
許容されないし、注入は高い入り口圧力では非常に困難
であるので、乱流領域での液体クロマトグラフィーにつ
いて議論することを明確に拒否している。さらに、乱流
条件の下でクロマトグラフ環境における固定相を維持す
ることは、どうみても困難であったし、また高い剪断力
を伴うため実際的ではないように思われた。
D.S.Horneらの、A Comparison of Mobile−Phase Dis
persion in Gas and Liquid Chromatography,Sep.Scien
ce,1（５）、531−554（1966）には、カラムを通過する
流れについての流体力学の研究が提供されており、非常
に高い液体速度では、乱流が流れにおける分散の割合に
影響を与えることが認められた。液体試験で示される最
も高い速度は、大体6,500程度の換算速度であるlog v＝
3.8であった。この文献では、非常な高速度のときで、
そしてレイノルド数が約10を超えるとき、換算段高さは
その速度とは無関係になると述べている。この文献は、
直径が500μｍの非多孔質のガラスビーズが詰め込ま
れ、カラム−対−粒子の直径の比が10対30である準備さ
れたカラムを用いて行った研究に基礎が置かれていた。
ビーズ上に溶質が全く保持されなかったので、クロマト
グラフ的分離は全く行われなかった。同様に、H.Kaizur
maらのEvaluation of Coupling and Turbulence by the
Dynamical Comparison of Gas and Liquid Chromatogr
aphy,J.Chrom.Science,Vol.8,630−534（Nov.1970）に
よると、クロマトグラフィー活性でない、500μｍの非
多孔質の、球状ガラスビーズを詰め込んだカラムを通過
する流れについての流体力学の他の研究では、高い速度
極値を得るための123atmまでの入力カラム圧を使用する
ことに基づいて、カップリング及び乱流が、段高さ対速
度のプロットをヴァンデームター形とは根本的に異なる
ものとすると記載している。後者の文献は、log換算高
さ対log液体についての換算速度プロットが8,000を超え
る換算速度まで延び、また段高さ（およそ10）が低下し
始める前に最大値およそ約5000ぐらいを示すことを示し
ている。この文献は、乱流がLCにおいては重要であるよ
うに思われないと結論づけている。
均一な断面と比較的平滑な壁を有する、中空の円筒状
のパイプ又はチューブを流れる非圧縮性の粘性流体の流
れに関していえば、定常的な層流（すなわち、ここでは
圧力低下が速度に比例する）そして流体は不規則的に大
きく変動することのない層状に流体が移動するものを、
不規則的でそして非定常的な又は乱れのある流れ（すな
わち、ここでは圧力低下は速度の２乗にもっと密接に変
化する、そして流体における局部速度及び圧力が不規則
的に変化する）から区別する、臨界又は遷移流速が存在
することが長い間認識されてきた。かかる流れは、 （式４） Re＝ρvd/μ （式中、ρは流体の密度（g/cm3）、ｖは流体の速度（c
m/sec）、ｄはパイプの直径（cm）であり、またμは流
体の粘度（g/cmsec）である）、として定義されるレイ
ノルズ数Reに基づいて説明することができる。レイノル
ズ数は、次元単位を有するものではなく、したがって流
体の流れの類型についての判断基準として利用できる。
例えば、通例、もしレイノルズ数が小さくて、例えば、
約2100未満であるなら、かかる平滑な壁のチューブ内の
流れは層流であり、またそれより高いレイノルズ数であ
るときは、例えば、約3000より大きいときは、その流れ
は乱流となることがよく知られている。約2100と3000と
の間のレイノルズ数での流れは、臨界的な遷移段階を構
成する。レイノルズ数の値は、上述したように、流体が
流れる導管の内部表面の平滑度に、ある程度、依存す
る。導管の内部表面が荒い、すなわち、不規則であると
きには、乱流への変化は幾分か低いレイノルズ数である
とき生ずるものである。少なくとも水性型の流体では、
乱流は、レイノルズ数が約2100を超えるときにのみ、生
ずると広く信じられていたので、クロマトグラフィーカ
ラムの充填床を通過するかかる流れを達成することが不
可能であることは明らかであるようであった。というの
は、大きな圧力容器を必要とし、そしてより大事なこと
には、カラム中の多孔質粒子を崩壊してしまうような圧
力をかける以外には、誰もこのレイノルズ数に到達する
ことができないからである。
発明の目的 本発明の主たる目的は、高速、高分解性の、溶質の分
離を行うための、改良を加えたクロマトグラフィー装置
及び方法を提供することである。本発明のさらに他の目
的は、従来技術による教示内容に反して、HPLCに使用し
て溶質の分離を行うと、バンド幅の広がりが、HPLCカラ
ム中の移動相の速度がＢセグメントからＡセグメントへ
増大するにつれて増大し、カラム中の移動相の速度がＡ
セグメントを超えて増大するにつれて減少するというよ
うなヴァンデームターカーブの実質的に逆である特徴的
なカーブを示す装置及び方法を提供する。本発明の他の
目的は、生物学的薬剤などのような小さい分子及び大き
い分子の両方についての分析用クロマトグラフィー及び
分取クロマトグラフィーの両者の速度及び能力の両方を
劇的に向上させる装置及び方法を提供すること、有意に
改良された結果をもって今まで使用されたどのようなも
のよりもかなり大きい移動相の速度をもって操作しうる
装置及び方法を提供すること、粒子が実質的に一般的に
従来技術で使用されたものより大きい充填粒子床で操作
されるそのような装置及び方法を提供すること、乱流液
体クロマトグラフィーについて従来技術により教示され
たものよりかなり低い圧力で操作できる装置及び方法を
提供することである。
発明の概要 これらを目的とする本発明は、液体クロマトグラフィ
ーを実行する新規な方法であって、クロマトグラフィー
カラムすなわちクロマトグラフ床が、以下に詳述するよ
うに約30μｍ以上代表的には50μｍ以上で場合によって
は（ただしそれに限定されないが）1000μｍのほぼ均一
な平均断面寸法すなわち平均断面径を有する、ほぼ均一
に配置された複数の剛性固体多孔質粒子として形成され
るものに関する。ここで用いている「粒子」という用語
は、その対称性の有無、偏平率、規則性などに拘わら
ず、いかなる形状もしくは形態にも限定されるものでは
ない。ここで用いている「固体（solid）」という用語
は、そのものの物理的状態をいい、多孔質粒子を排除す
るものとは解釈しない。こうした粒子は各種の寸法及び
形態のものから選択され、カラムの全容積の約45％以上
の容積を有する粒子間隙を形成するように、加圧、焼結
などにより床すなわちカラム内に集合させたものであ
る。粒子表面は、その粒子内の細孔表面を含めて、クロ
マトグラフィー固定相となる層でコートすることによ
り、クロマトグラフィー活性化されている。この方法
は、カラムに負荷をかけるために、粒子表面と相互に作
用する少なくとも１種の溶質または懸濁相を含む流体混
合物をカラムを通して流す工程を含む。カラム内の粒子
および充填物の性状のために、カラムを通す流体混合物
の流速を上げることができ、好ましくは平均換算速度
（後記に定義する）を約5000以上、場合によっては後記
するように70000以上に上げることもできる。そのよう
な条件では、間隙容積の少なくとも大部分で混合物の乱
流が生起すると考えられ、そうした乱流が実は物質輸送
速度を上げて、カラムの動的容量を増大させるのだと思
われる。さらに本発明は、非常に大きい平均径を有する
クロマトグラフィー活性粒子（たとえばdp＝500μｍ以
上）と乱流特に換算流速ｖの高い領域（たとえば40000
以上）との組み合わせが、予想に反して換算段高さを１
以下にするということを確立する。
本発明の方法はまた、溶質を含む混合物をカラムに流
した後、やはり好ましくは約5000以上の換算速度で溶離
液をそのカラムに通す工程を含む。後述するように、そ
のような換算速度で溶離液をカラムの間隙容積を通して
流すことにより、カラムから溶離される溶質によって生
ずるバンド幅の広がりは、ヴァンデームターからの予想
に反して、溶離液についてのレイノルズ数の逆数的関
数、そして当該溶離液中における当該溶質の拡散係数の
大きさの直接的関数となり、その場合に溶質の分子量が
上記拡散係数の大きさに大きく影響するのである。
本発明はまた、約30μｍ以上のほぼ均一な平均径を有
する複数の剛性固体粒子を充填して形成したクロマトグ
ラフィーカラムを含んでなる、クロマトグラフィー装置
に体現される。これらの粒子としては種々の寸法および
形状のものが形成もしくは選択され、粒子間に通路ない
しは空間を形成してそうした粒子間の間隙容積がカラム
の全容積の約45％以上となるのに十分な圧力で充填され
る。これらの粒子の表面は、クロマトグラフィー用固定
相となる１以上の層でコートされるなどにより、クロマ
トグラフィー活性である。好適な態様では、特にカラム
の粒子が許容できる断面寸法の下限に近い場合、そうし
た粒子は後述するように不規則である。
カラムを通して少なくとも約5000の換算速度で流体混
合物を流す手段が設けられるが、そのような換算速度は
間隙容積の少なくとも大部分において、固定相となる層
と相互に作用する少なくとも１種の溶質を含む上記混合
物の乱流を生起する。本発明はさらに、溶離液によって
カラムから溶離される溶質のバンド幅の広がりが、溶離
液の流れについてのレイノルズ数と溶離液中の溶質の分
子量の大きさとの逆数的関数になるように選択された速
度で、負荷カラムを通して溶離液を流す手段を含む。こ
のためには、溶離液の流れは約5000以上の換算速度を有
することになる。
本発明のまた別の態様としては、比較的小さい分子量
（たとえば50以下）を有する溶質分子を分離するのに特
に適したものとして、数百μｍ（たとえば500μｍ）以
上の平均径を有する粒子の充填床を設けるものがある。
この態様も試料および溶離液の流体混合物を、必要な乱
流を生起すると考えられる70000以上の高い換算速度
で、カラムを通して流す手段を含む。そのようなdpおよ
びｖの典型的な値を採用するそうしたカラムにおいて
は、換算段高さｈが移動相の速度と逆の相関を示し、従
来考えられていたように速度と無関係ではないという予
想に反する知見が得られたのである。
また、クロマトグラフィー活性粒子の充填床に導入さ
れる溶質が非特異的に結合するようなクロマトグラフィ
ープロセスにおいては、そうした非特異的結合は、単に
液体混合物中のそのような溶質を約5000以上の平均換算
速度でカラムに流し、続いてただちに少なくとも同じ平
均換算速度で溶離液を流すことにより、低減されるとい
う知見も得られた。
本発明の上記および他の目的は、その一部は自ずと明
らかであり、また一部は以下において明らかにされる。
従って本発明は、以下の詳細な説明に例示される構造お
よび部材の配置を有する装置、並びにいくつかの工程お
よびそれらのうちの１ないし２以上の工程と他の工程と
の間の関係および順序を包含する方法からなり、それら
の適用の範囲は特許請求の範囲に示されることになる。
図面の簡単な説明 図１は、従来技術であるヴァンデームター曲線を例示
するものであり、代表的なカラム段高さＨをｕ（cm/se
c）に対してプロットしたものである。
図２は、本発明の原理を体現する装置の模式図であ
る。
図３は、図２のカラムの一態様の一部を理想化かつ拡
大して示す図である。
図４は、異なるコーティングを施した多孔質粒子の選
択されたバッチについて細孔サイズの分布を示すグラフ
であり、粒子細孔の侵入体積を選ばれた溶質の分子量の
対数に対してプロットしたものである。
図５は、公称50μｍの未官能化多孔質アルミナ粒子を
用い本発明に従って作製されたクロマトグラフィーカラ
ムについて測定されたデータを示すものであり、カラム
を流れる流体の流速の関数として、層流から乱流への遷
移領域を含む各種流速におけるカラムの効率を換算座標
上にプロットしたものである。
図６は、図５と同様なプロットであって、公称20μｍ
の粒子からなるカラムの効率を、カラムを流れる流体の
流速の関数として図５と同様な換算座標上にプロットし
たものであり、図５にグラフ化された実施例における圧
力程度では、このサイズの粒子を用いた場合には乱流が
得られないことを示す。
図７は、図５と同様な別のプロットであって、公称10
μｍの粒子を用いた実施例に基づくものであり、このサ
イズの粒子を用いた場合には明らかに乱流が得られない
ことを示す。
図８は、実施例１、２及び３から得られたpsi単位で
測定した圧力損失のデータを流体の線速度に対してプロ
ットしたものであり、図５、６及び７を補完するもので
ある。
図９は、それぞれ異なる高分子量タンパク質である２
種類の試験溶質を、公称平均寸法50μｍの粒子にカチオ
ン交換容量を付与したものを充填した本発明のHPLCカラ
ムから、毎分0.5mL〜10mLの速度で溶出させて分析した
結果を示すグラフであり、得られたデータは換算段高さ
ｈをcm/sec単位で表したμに対してプロットしてある。
図10は、図９に関して用いたものと同じ試験溶質の１
つを、同じ流速で同じ粒子サイズのカラムから溶出させ
て分析した結果を、同じスケールの同じ座標にプロット
したものであるが、粒子にはアニオン交換容量を付与し
ている。
図11は、図９に関して用いたものと同じ試験溶質の１
つを、公称20μｍの粒子にアニオン交換容量を付与した
ものを充填した本発明のクロマトグラフィーカラムか
ら、図９と同様にして溶出させて分析した結果を、図９
と同じ座標にプロットしたものである。
図12は、図11に関して用いたものと同じ試験溶質の１
つを、公称10μｍの粒子にアニオン交換容量を付与した
ものを充填した本発明のクロマトグラフィーカラムか
ら、図11と同様にして溶出させて分析した結果を、図11
と同じ座標にプロットしたものである。
図13は、ヒトトランスフェリンとウシ血清アルブミン
の混合物を本発明の原理を用いて分離する際に得られ
た、分取用クロマトグラフィーのクロマトグラムであ
る。
図14は、非常に大きな粒子の充填床を用いたHPLCカラ
ムに、水中のアセトン試料を種々の非常に高い流速で注
入して得られたデータのプロットである。
図15は、同一の試料を順次HPLCカラムに注入し、最初
は乱流速度、次いで層流速度で溶離したときに得られた
データをプロットしたものであり、試料溶液積算注入量
の関数としての試料の回収率に関し、非特異的結合があ
ることを示している。
図16は、同一の試料を順次HPLCカラムに注入し、最初
は乱流速度、次いで層流速度で溶離したときに得られた
データをプロットしたものであり、試料溶液積算注入量
の関数としての試料の積算非特異的結合量の関数として
の試料の回収率に関し、非特異的結合があることを示し
ている。
発明の詳細な説明 本発明は、液体クロマトグラフィーに関する従来の知
識は徹底しておらずまた完全に正確なものでもないとい
う多くの知見を利用したものである。例を挙げると、上
述したようにVan Deemterの式は移動相の流れが基本的
に層流であるというシチュエーションに限定される。本
発明はヴァンデームターの式が移動相流が乱流である場
合には無効であることを確立するものと考える。
本発明の１つは、図２に図式的に示すように、多数の
剛体の固体粒子22が充填されて形成されるクロマトグラ
フィーカラム20からなるクロマトグラフィー装置として
実体化され、本発明の一態様によれば粒子22は実質的に
均一な約30μｍ以上の平均直径を有する。ここで用いら
れる「平均直径」という用語は、平均した直径すなわち
粒子の形状に係わらず断面の寸法の平均を言うものであ
って、かならず球状あるいは揃った固体粒子に限定する
ものと解釈してはならない。このような平均直径の値は
典型的には信頼係数が約95％における直径分布の内部に
ある。本発明の好ましい面は、以下に叙述するように粒
子の形の不揃いにあるのである。ここで用いる「不揃
い」という用語は、形の一致がないと言うことを定義す
るのみならず、粒子が多様な多面体形状の混合多様性と
して存在してもよいので、一般的に荒くて均一でないで
こぼこな表面を持つ、球体、円錐曲線体、長円形などの
形の粒子のような回転固体や、短い繊維をも包含するも
のである。
本発明の粒子は非圧縮性材料から作るのが好ましい。
非圧縮性と言う用語は少なくとも約５×103psiの圧力を
かけた場合（アウトレットカラムフリットリテーナーを
含む）に粒子の密度と容積が変化する時間速度が実質的
にゼロのままであって高圧下においてさえ塑性変形を起
こさないことを意味するものである。本発明の粒子は成
形したのち、図３に詳しく示すように間隙通路24を有す
ることを特徴とするカラムを作るのに十分な圧力で充填
できるようサイズと形が一定の範囲にはいるものを選別
する。粒子が不揃いなため、そのような通路の内部壁は
必ず形状が相当粗いことがわかる。少なくとも通路24の
大部分は平均断面直径が実質的に約４μｍより小さくて
はならず、間隙容積部分（粒子間の間隙通路24の合計容
積）がカラム20の全容積の約45％より少なくてはならな
い。従来技術の代表的なカラムは間隙容積部分が45％よ
りも少なく、具体的には約35％から42％の範囲にあるこ
とが理解されよう。粒子22の表面はこの分野でよく知ら
れているようにそれ自体がクロマトグラフィー用に活性
であるか、これまたこの分野でよく知られているクロマ
トグラフィー用に活性のある固定相の層で被覆するなど
の処理をすることによって活性があるものである。
粒子22は薄膜であってもよいし、あるいは活性表面面
積を増すために、典型的には例えば約60オングストロー
ムから5000オングストロームの範囲内にある平均直径を
有する粒子内細孔により多孔であることが好ましい。間
隙容積部分が約45％より小さくないことと組み合わされ
た粒子の不揃い性のため、本発明のカラムの間隙通路を
通過する乱流は驚くべきことに10よりかなり小さいレイ
ノルズ数で誘発することができる。
多孔性粒子でできたカラムの間隙容積Viは以下のよう
に定義できる。
（式５） Vi＝Ｖ−Vp−Vs 式中Ｖは空カラムの全容積 Vpは粒子それ自体の細孔の全容積 Vsは粒子の骨格すなわち骨組みの全体積である。
非多孔性粒子でできたカラムの間隙容積Vi配下のよう
に定義できる。
（式６） Vi＝Ｖ−Vx 式中Vxは粒子の全体積である。
よく知られたHg侵入解析を用いて多孔性及び非多孔性
の粒子のカラムの間隙容積を求めることができる。
本発明においては、カラム20の近端に接続したポンプ
26のような手段を用いて流体混合物（液だめ28のような
適当な源から）及び／または溶質（27のような適当なル
ープインジェクターから）を、換算速度で（i.e.すでに
定義したようにudp/D、これは本発明の第１の態様にお
いては実質的に約5000より上である）、流すことができ
る。後者はh/v曲線の傾きが換算座標ｈ（i.e.H/Dp）軸
にそって減少し始める近似値であって、換算速度が増加
するについて効率が向上することを示す。本発明の第１
の態様のカラムにおいて、混合物の乱流は換算速度約50
00に相当する流速で誘発される。本発明は更に、負荷カ
ラム（i.e.初めに溶質混合物をカラムに流した結果、ク
ロマトグラフィー的に活性な表面の少なくともいくらか
に溶質分子が結合しているカラム20）に（通常もう１つ
の適当な液だめすなわち貯蔵タンク30から）溶離液を流
すためポンプ26のような手段を包含する。溶離液で溶出
された溶質分子は、カラム20の遠端に設けられた、この
分野でよく知られた型の検出器31により、この分野でよ
く知られた方法、通常は光学的方法、により検出され
る。カラム20を通過する溶離液流は換算速度−本発明の
第１の態様においては約5000より上−に対応する線速度
でなければならない。そうすることによって溶離液によ
りカラムから溶出される溶質のバンドの広がりは溶離液
のレイノルズ数の逆数的関数で、溶離液中の溶質の拡散
係数の大きさの直接の関数である。溶質の分子量とその
拡散係数との間の関係から見て、本発明のカラムから溶
離液によって溶出される溶質のバンド幅の広がりはまた
溶質の分子量の逆数的関数としても定義されることが理
解されよう。
カラム20は通常中空の、管状の入れ物であって、ステ
ンレス鋼などの堅く強い材料で化学的に不活性すなわち
それに通過させる流体に反応性がない材料からできてい
る。クロマトグラフィー処理するべき液体の体積によ
り、カラムの内径は小さくてもよい（例えば数mm）し、
あるいは非常に大きくてもよい。D.S.Horne et al.「ガ
ス及び液体クロマトグラフィーにおける移動相分散の比
較（A Comparison of Mobile−Phase Dispersin in Gas
and Liquid Chromatography,Sep.Science,1（５）,531
−554（1996）」によれば、少なくとも移動相が中程度
の流速でカラム直径と粒子直径の比が約10と30の間であ
る場合には球状の粒子を詰めたカラム床中のバンドの拡
散は、最も望ましくないものである。しかし本発明は乱
流を達成するための非常に高い流速に関係するものであ
り、カラム直径対粒子直径比は決定的ではない。
本発明の好ましい態様において、カラムは平均直径が
約30μｍ以上の粒子を好ましくは少なくとも約５×103p
siの圧力をかけて充填してつくるが、これはできたカラ
ムに互いに接触している粒子22間にできる間隙通路24以
外にはほとんど空隙がない、すなわちカラム20が実質的
に均質な嵩密度を持つようにするためである。こうして
作られたカラム20は粒子が多孔性であるか否かに係わら
ず、約45％以上の間隙部分を有していなければならな
い。多孔性で非剛性のポリスチレン粒子では、間隙割合
が少ない、たとえば35％付近であると、粒子がつぶれた
り壊れたりしやすい許容できないほど高い圧力をかけな
い限り必要な換算流体速度が得られない。
述べたように、好ましい間隙部分を持った均一な密度
の望ましいカラムを確実に作り、操作圧力下での潰れを
回避するためには、本発明でカラムを充填するために使
用される粒子は、少なくとも約５×103psi、好ましくは
約１×104psiと高い充填圧にもかならず潰れない堅い固
体である。この目的のためには、好ましい粒子はアルミ
ナ、チタニア、シリカ、ジルコニア、バナジア、炭素、
種々の比較的不活性な金属や、それらの組合せを材料と
して作られる。
したがって本発明の方法はクロマトグラフィーカラム
中の少なくとも大部分の間隙通路を通過する流れが乱流
であることを必要とする。クロマトグラフィーカラムを
通過する層流に特徴的な典型的な放物線状の流れのプロ
ファイルとは違って乱流のプロファイルはほとんどフラ
ットであるいう前提にたつ。もっと重要なのは、乱流を
誘発した場合、速度の半径方向成分は通常の拡散プロセ
スと重なって、通常の拡散プロセスとバンド幅の広がり
の動態をカラムの効率にとって好ましいように変える、
と考えられることである。カラムを通過する乱流を誘発
し持続するためには、流れる通路の直径と線流速の間に
決定的な関係があり、それによりこれらの２つのパラメ
ーターの積は線速度が変わっても一定に保たれるという
ことがさらなる前提である。剛体であって圧力が変化し
ても塑性変形が起こらない粒子の必要性は、すでに述べ
たように非常に重要である。
もしクロマトグラフィーカラム中の乱流を測定するの
に普通の基準を使おうと思うなら、すなわちレイノルズ
数が2000より大きい流れを提供しようとするなら、実際
的な見地からはそのような流れは一般的に密に充填した
床を通しては得ることができない、ということに留意し
てほしい。本発明の方法でカラム中に乱流を起こさせる
ための鍵は、粒子の荒さと間隙容積割合が高い（＞45
％）ことである。これらのファクターの結果として、本
発明のクロマトグラフィーカラム中の乱流は10を切るよ
うなレイノルズ数で誘発される。
本発明の方法を初めに述べた図２の態様の装置で実施
するにあたり、充填カラムを作るのに異なる粒子のバッ
チをいくつか使用した。これらのバッチは細孔の直径が
操作されている、すなわち被覆していない粒子のバッチ
をクロマトグラフィー的に活性な材料の層で被覆するこ
とにより被覆していない粒子の細孔径から選択的に変化
させてある、という点でまず異なっている。このような
多孔性粒子のバッチごとの細孔密度分布は、いくつかの
異なる分子量のポリスチレンをそれぞれ塩化メチレンに
溶解したものからなるポリスチレン標準溶液を用いて既
知の方法で求めた。具体的に言うと、２×103〜６×106
にわたる分子量を持つポリスチレンを使用して粒子の排
除限界と侵入のプロファイルを求めた。このような標準
ポリスチレンを含有する溶液をそれぞれ決まったサイズ
及び／または被覆の多孔性粒子の床に注入した。細孔容
積はそのような床のそれぞれにアセトンを完全浸透プロ
ープとして注入し、ついで分子量６×106のポリスチレ
ンを完全排除プロープとして注入した。各標準品につい
て、床の通過あるいは溶離時間を254nmのUV検出により
測定した。侵入％は各プロープの溶離体積から排除プロ
ープの溶離体積を引いて細孔容積で割ったものである。
多孔性を測定するため粒子バッチをいくつか調べた。
まず調べたのは被覆してなくて官能化されていない高度
に不揃いな形の多孔性アルミナ粒子であって、公称直径
50μであるがコールターカウンター分析で求めた実際の
平均直径は95％信頼係数の内部で42.39μであるもので
ある（ここではCT−50Al−002とする）。他の４つの粒
子バッチは、公称直径50μｍの形が不揃いで多孔質のア
ルミナであって、官能性を与える固定化されたポリマー
コーティングの程度がバッチにより様々であるもの（こ
こではそれぞれPS−11−035、PS−９−087、PS−４−09
0、PS−10−024とする）で、同じ手法により調べた。官
能化コーティングしたこれら４つのバッチは熱重量分析
で2.7から6.04パーセントの重量減少となる表面被覆範
囲を代表する。この重量減少は分析中の高温で官能化ポ
リマーコーティングが燃焼したために起こる。
記載した粒子は不揃いで一般的に球状ではないことが
好ましいので、ここで使用される直径という用語は粒子
の断面の寸法の平均を意味するものであることは理解さ
れるであろう。これらの粒子バッチのすべてについて、
上に述べたように一連の異なる分子量のポリスチレンプ
ロープで試験した。得られた結果は累積％侵入に対して
分子量を対数としてプロットして図４に示す。図４の曲
線はすべてほぼ対数直線で、ほぼ同じ傾きを有するので
軽く被覆した粒子では細孔直径がすこし狭くなることは
明らかである。しかし多量に被覆した粒子では粒子の内
部細孔の実質的かつ直線的縮小が起こっていることを示
す。ポリスチレン標準品の拡散係数Dmは、G.Guiochon e
t al.「調製用非線形クロマトグラフィーの基礎（Funda
mentals of Preparative and Non−linear Chromatogra
phy）」（前出）p.142に記載された式にしたがって算出
した。
個々のHPLCは、不揃いで多孔質のアルミナ粒子で公称
直径50μ（CT−50Al）、20μ（CT−20Al−002）、及び1
0μ（CT−07Al−002）のそれぞれのバッチを用いて以下
に述べる充填プロトコールにしたがって作成した。各バ
ッチ約２グラムをそれぞれのマルチ溶媒混合物中でスラ
リーにした。各スラリーは機械的装置に移し、その装置
がそれぞれ空の0.46×10cmの管に５×103の充填圧でス
ラリーを充填した。これらのカラムはカラム−粒子直径
比が少なくとも90であった。できた充填カラムは充填装
置からはずしてふたをし、適当な試験溶媒中で平衡化さ
せた。以下の実施例との関連で使用したこれらの充填床
カラムを評価するのに用いたHPLCはヒューイットパッカ
ード社（カリフォルニア、パロアルト）から市販されて
いる1050型HPLCシステムである。このシステムはカラム
中に流体を送り込むポンプと、カラムから溶出されたバ
ンドを調べるための波長可変のUV検出器とからなる。検
出器から受け取ったデータを加工するシステムは、HPLC
Chemstation Rev.A.02.00としてヒューレットパッカー
ド社（カリフォルニア、パロアルト）から市販されてい
るソフトウェアプログラムを走らせた、Acer America
（カリフォルニア、サノゼ）から市販されている486/33
SXコンピュータである。
以下は本発明の原理を実体化する液体クロマトグラフ
ィーカラムの調製、試験及び使用の例である。
実施例１ 上記のように調製し且つ呼称平均直径50μの所要量の
CT−50Al−002粒子で充填されたHPLCカラムを塩化メチ
レン溶媒中での平衡によって評価した。塩化メチレンに
溶解した種々の分子量のポリスチレンの標準溶液をこの
カラムにそれぞれ注入した。評価を0.2ml/分乃至20ml/
分の範囲の流量で行った。検出ピークの半高さ点のピー
ク幅を測定してそれぞれの注入の効率を算出した。254n
mでの紫外部検出で測定してそれぞれの注入の溶離時間
を記録した。各流量における圧力低下を測定しそして表
にした。得られた効率データを、換算パラメーター座
標、ｈ及びｖ、に基づいてプロットした、図５のグラフ
形式にまとめる。
実施例２ 上記のように調製し且つ未被覆の、官能化していない
高度に不規則な形状の、多孔性アルミナ粒子である呼称
平均直径20μの所要量のCT−20Al−002で充填されたHPL
Cカラムを、塩化メチレンに溶解した種々の分子量のポ
リスチレンの標準溶液をこのカラムにそれぞれ注入し
て、実施例１のように評価した。全て実施例１に記載し
た手順に従って、評価を各流量で行い、各注入の効率を
算出し、溶離時間を記録してそして圧力低下を表にし
た。得られた効率データを、図５に示したものと同様な
座標として図６に示す。
実施例３ 上記のように調製し且つ未被覆の、官能化していない
高度に不規則な形状の、多孔性アルミナ粒子である呼称
平均直径10μの所要量のCT−07Al−002で充填されたHPL
Cカラムを、塩化メチレンに溶解した種々の分子量のポ
リスチレンの標準溶液をこのカラムにそれぞれ注入し
て、実施例１のように評価した。全て実施例１に記載し
た様に、評価を各流量で行い、各注入の効率を算出し、
溶離時間を記録しそして圧力低下を表にした。得られた
効率データを、図５及び６に示したものと同様な座標と
して図７に示す。
実施例４ 実施例１、２及び３で溶離したカラムのそれぞれにつ
いて背圧を測定しそして記録した。得られたデータは図
８に圧力低下（psi）対線速度（cm/秒）としてプロット
されている。
実施例５ 上記の様に調製し且つ呼称平均直径50μの所要量のPS
−10−011粒子で充填されたHPLCカラムを官能性基を含
む表面化学処理で変換して、カチオン交換によって分離
するのに都合良くした。カラムを2MのNaClを含む中性pH
の20mMのtris（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）
バッファーで平衡させた。BSA（bovine serum albumin;
ウシ血清アルブミン）及びリゾチーム（両者ともミズー
リ州、セントルイス所在のSigma Chemical Co.から入
手、分子量はそれぞれ約67,000及び13,000）のそれぞれ
60mg/mlの試料を移動相に溶解し、カラムに注入しそし
て0.5ml/分乃至10ml/分の範囲の流量で溶離した。得ら
れたデータをｈ及びｕに換算して図９にプロットした。
実施例６ 上記のように調製し且つ呼称平均直径50μの所要量の
PS−14−037粒子で充填されたHPLCカラムを４級アミン
官能性基を含む表面化学処理で変換して、アニオン交換
で分離可能なようにした。カラムを実施例５に記載のよ
うに平衡させた。実施例５におけるのと同じBSAの60mg/
mlの試料を移動相に溶解し、カラムに注入してそして実
施例５に記載の手順の流量で溶離した。得られたデータ
を図９で使用した同じ座標及びスケールで図10にプロッ
トした。
実施例７ 上記のように調製し且つ所要量のPS−11−090（呼称
平均直径20μ粒子）で充填されたHPLCカラムを４級アミ
ン官能性基を含む表面化学処理で変換して、アニオン交
換で分離可能なようにした。カラムを実施例５に記載の
ように平衡させそしてテストした。得られたデータを図
11にプロットした。
実施例８ 上記のように調製し且つ所要量のPS−11−027（呼称
平均直径10μ粒子）で充填されたHPLCカラムを４級アミ
ン官能性基を含む表面化学処理で変換して、アニオン交
換で分離可能なようにした。カラムを実施例５に記載の
ように平衡させそしてテストした。得られたデータを図
12にプロットした。
実施例９ 特に調製クロマトグラフィーに適用される本発明の方
法の高速及び高解像を説明するために、上記のように調
製し且つ呼称平均直径50μの所要量のCT−50Al−002粒
子で充填されたHPLCカラムを４級アミン官能性基を含む
表面化学処理で変換し、そしてマサチューセッツ州マー
ルボロー所在のBioSepra社で製造されたProsys HPLC機
器を使用して傾斜溶離で評価した。
この機器はポンプ１台あたり最高30ml/分の流量を有
するポンプを４台備えているので、合計最大流量は120m
l/分であった。この機器はまたスタティックミキサー
（static mixer）、280nmで測定する紫外部検出器、5ml
シリンジ注入部（syringe loader）及び注入ループ、検
出器出力及びその他のデータを処理する内部ソフトウエ
アプログラム、及び出力データを表示するスクリーンを
備えていた。このProsys機器に関連して、30ml/分の最
高流量を有する第３のHPLCポンプ（形番号6200A、日本
国、東京所在の日立計器の製品）を備えていて、この２
系列のポンプシステムはProsys機器中の混合機の上流で
共にＴ型連結される構成を取り、最高150ml/分の流量を
得ることが出来る。
カラムを中性pHの50mMのtrisバッファーで平衡させ
た。分子量約80,000のヒトトランスフェリン（Sigma Ch
emical Co.から入手）と分子量約67,000のBSA（Sigma C
hemical Co.から入手）の混合試料をそれぞれ2mg/mlの
濃度でバッファーに溶解し、そして5ml注入ループにこ
の混合物を充填した。このtrisバッファーでカラムを平
衡させた後、この試料を120ml/分の流量でカラムに注入
した。５秒後、移動相を段階傾斜によって2M−NaClを５
％含むバッファーに変えた。更に７秒後に、移動相を段
階傾斜によって20％バッファー/NaCl溶液に変えた。流
量切り替えを両機器とも手動で、蛋白質溶質のイオン的
分離が可能な様に同時に流量を変更して、行った。280n
mでの溶出液の紫外部痕跡として、得られたクロマトグ
ラムは図13に示されており、大凡15秒の全分析時間の間
に得られた解像度及びピークを示している。
図５乃至７を通して示されているプロット及び上記実
施例のデータから、約50μｍ粒子で作成したカラムに対
しては、換算段高さは、ヴァンデームターの予測に対比
して、約5,000の換算速度値以上減少する、事は明らか
である。その様な乱流挙動を示す約50μｍ粒子のカラム
では、換算段高さは約40,000の換算速度で最小に戻り、
そしてこの換算速度に対応する分析時間は同じ量、即
ち、約４×104だけ減少する事は図５から明らかであ
る。10μｍ及び20μｍ粒子で作成したカラムは流れに対
する段高さの同様な関係を示さず、かえって、図６及び
７に示すように、層流によって認められる従来型の関係
に当てはまる。
大量の液体中に非常に少量の目的とする溶質が含まれ
ているとき、分離調製する溶質でクロマトグラフカラム
に負荷を掛けることは時間のロスでありそして従って調
製クロマトグラフィーが高価になる１面である。本発明
ではカラム全体を比較的高速の流量で流せるので、カラ
ムに溶質を負荷するのに必要な時間を顕著に低減できる
だけでなく、その様な高速流れによって引き起こされる
乱れがカラム中の粒子の細孔中の変換された表面上に溶
質分子の負荷を強める、と考えられる。
分子の精製に於いて、商業上の関心の多くは価格であ
り、生産性は単位時間当たりに精製される材料の量とし
て規定されることは認識されている。本発明によって分
析時間を数分の１から数十分の１に減少できるから、特
に実施例９に示したように節約の同じファクターを生産
性にまで広げることは合理的である。本発明の充填カラ
ムの動的能力は質量移動の観点によって影響されるか
ら、この推論は明らかに全く関連している。
本発明の別の実施態様を基礎としている別の発見はま
た液体クロマトグラフィーに関する先行技術の考察は正
確でないことを示している。例えば、ヴァンデームター
の式は、Giddingsのカップリング理論の検討に於いてさ
え、先の述べたように換算段高さｈ値は、高流量に於い
てさえ、約２以下であると期待されないこと及びこの段
高さは移動層の流れ速度に無関係である事を予測してい
る。今や、ヴァンデームターに反して、カップリング係
数（式３に於けるａ＊項）は流量に無関係でなくかつ大
粒子（例えば、平均直径で少なくとも400μｍ）の充填
床を通じて乱流を使用することによって十分に１以下の
値を想定できる事が見出された。この発見の意義は以下
の実施例から明らかである。
実施例10 充填したカラムを使用した本発明の装置の他の実施態
様を図２に示すものと同様の装置を用いて作成した。図
２において、カラム20は、充填された多数の、剛性で固
体の、好ましくは実質的に均一な平均直径、典型的には
数百μｍの平均直径を有する非圧縮性粒子22として形成
した。この実施例では、カラム20は、光学顕微鏡により
約500μｍの平均直径を有することが確認されたDavisil
636 Davison silica（W.R.Grace Co.,Boca Raton,Fl
a.）の粒子を充填した、Upchurch20μｍチタンフリット
を有する、Upchurch（Upchurch Scientific Co.,Seattl
e,Wash.）製の4.6×100mm液体クロマトグラフィーカラ
ムであった。粒子カラム20の先に説明した態様における
のと同様に、各粒子22の表面はクロマトグラフィー的に
活性であった。各粒子22は、先に述べた他の粒子のあら
ゆるものの直径に関するもの以外の諸属性を有するもの
であった。
容器28のような適当な源からの液体混合物の一連の各
試料を、カラムの間隙容積の少なくとも大部分を通して
流すために流量調節ポンプ26（Bran ＆ Luebbe,Chicag
o,III製のModel N−Ｐ）のような手段をカラム20の基部
端に接続した。そのような試料はそれぞれHPLC級水で希
釈したアセトン40μＬであり、それらを適当なループ注
入器27（Rheodyne.L.P.,Cotati,Cal.製のModel 7125）
によって約80mL/minと140mL/minとの間のいくつかの実
験的な流量で注入した。検出手段31（Fisher Scientifi
c,Pittsburg,Pa.製のKipp ＆ Zonen Model BD−112記録
計に接続したThermo Separation Products,San Fransis
co,Cal.製のModel UV−1000を含む）をカラム20の端部
端に配置した。
この、後に説明した液体クロマトグラフィー系を操作
して得られたデータを下記表中に記載する。下記表はま
た、mL/minで表した上記の各実験的流量（水中アセトン
について拡散係数を1.5×10-5cm2/secと仮定）の換算速
度ｖに対する関係をも示すものである。該表は、そのよ
うなカラム20についてのdp及びｖの典型的な値において
換算段高さｈが移動相の速度に逆数的に関連づけられる
ものであって従来技術において考えられていたように該
速度と独立でも一定でもなく、かつ１より十分小さい値
をとり得ることが実証されたことを示している。回収は
アセトンのような小さな分子のものであっても非常に早
く、各試料について、検出器31によって検出されたピー
クの幅及び振幅は一試料当たり15秒以下の時間内に注入
アセトンの実質的に完全な回収があったことを示した。
ここでｕ＝移動相平均線速度； ｖ＝換算線速度； Ｎ＝理論段数； Ｈ＝段高さ；及び ｈ＝換算段高さ である。
μｍで表した段高さＨの測定値に対するmL/minで表し
た流量Ｑの各値のプロットを図14に示す。実施例10によ
り得られたデータから、上述した装置を用いた調整用ク
ロマトグラフィーは、100より十分小さい分子量を有す
る分子に対してさえも非常に高速で高容量の分離を示し
得ることは明かである。
以上説明したように、物質移動は乱流によって増大さ
れ、その機構はクロマトグラフ粒子の表面領域結合部位
への接近の、結果としての減少であると考えられる。従
って、もし想定した機構が正しければ、非特異的結合は
対応して減少するはずである。本明細書において、非特
異的結合とは、クロマトグラフィーにおいてクロマトグ
ラフ粒子の表面結合部位に捕捉された試料分子がそれに
続く溶離による置換に抵抗すること又は溶離により除去
することができない減少をいうものとする。この仮説が
正しいことを立証するために以下の研究を行った。
実施例11 実施例６で上気したように0.46x10cmのHPLCカラムの
一組を調製し、実施例９に記載した器具を用いて評価し
た。BSA（Sigma Chemical Co.）のサンプル混合物を、2
M NaClを用いてpH8.62でトリバッファーから形成した
移動相中に60mg/mlの濃度で溶解することにより、調製
した。バッファーによる平衡の後に、サンプルの複数の
10μｌの注入を、約5000より大きい換算速度での平均流
速で各カラムに連続して行った。サンプルの回収を面積
の関数として測定した。第一に、各カラムを、このサン
プル及びカラム中の粒径に関して30,000を超過した換算
速度に相当する30ml/minの移動相の溶出流速で試験し
た。一度、これらの高い流速での飽和を達成し、同じカ
ラムを使用したが、ヴァンデームターの関係で確立され
ている教示に従って層流のより慣習的な水量の状況に相
当する1ml/mimの流速で研究を続けた。
得られたデータは図15および16に示している。前述の
条件及び使用した移動層の性質においては、サンプル中
のBSAは一般的に保持されないが、下層のアルミナ支持
体を用いてたぶん非特異的結合相互反応を有することを
認識できる。無機基質が、微少量にだけ存在し及び／又
は非常に価値があるサンプルの測定可能量を取るという
傾向にあるかぎりは、HPLCにおいて重大な問題を非特異
的結合は提示しうる。図15に示されるように、乱流条件
下において、注入したサンプル溶液の累積量が5mgに達
した時間までに、回収されたサンプルの百分率は100％
に達した。層流の状況下では、注入したサンプル溶液の
累積量が13mgに達するまで、100％回収は達成されなか
った。これは、サンプルの非特異的結合が乱流条件下よ
りも層流条件下でかなりより多く起こったことを示して
いる。図16では、回収よりむしろ起こった非特異的結合
の累積量によるデータを簡単に再表示している。これ
は、使用したカラムに関して、非特異的結合をしたBSA
の実際の量は、乱流条件下において約1.2mgで安定水準
又は飽和状態に達したが、BSAの約3.8mgが非特異的結合
をするまでに層流条件においては安定水準に達しなかっ
たことを示している。それゆえに、HPLCに乱流条件を使
用することにより、非特異的結合による損失は実質的に
最小限にできることは明らかである。そのために、カラ
ムに導入されたサンプル中の溶質はカラム粒子に非特異
的結合をする傾向があるクロマトグラフィーカラムにお
いて、本発明の教示は、サンプルをカラムに注入する手
段や、サンプル注入の実質的直後に、溶離剤液体をカラ
ムに流す手段を設けることにより、そのような非特異的
結合を減少させるのに有用である。これら両方の注入及
び溶離剤液体の流れは、約5000より大きい平均換算速度
で確立されている。
上記の装置及び方法においては、本発明の範囲から逸
脱することなく変更をしても良いから、上記の記載に含
まれる又は添付の図面に示される全ての事項は例示的な
意味においてかつ限定的な意味でないことと解釈され
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｊ Ｋ (72)発明者 タカリュウスキ，ジョセフ，ジェー．, ジュニア アメリカ合衆国．01801 マサチューセ ッツ，ウォバーン，ウエストゲイト ド ライヴ 10，アパートメント ティー− ４ (56)参考文献 特開 昭60−198458（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−151352（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−505477（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−500726（ＪＰ，Ａ) 米国特許4208284（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 30/56 G01N 30/32 G01N 30/48

Claims (32)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】クロマトグラフ活性表面を有する、実質的
    に均一に配置され固定された多数の固定剛性固体多孔質
    粒子の加圧充填床を含むクロマトグラフ本体からなるク
    ロマトグラフィー装置であって、 該粒子が、30μｍから500μｍまでの範囲の実質的に均
    一な平均粒径を有し、該粒子間の間隙容積が該本体の全
    容積の45％以上であり；かつ 該装置が、溶質を含有する液体混合物を、該間隙容積の
    少なくとも実質的部分の中での該液体混合物の流れを50
    00以上の換算速度で生起させるのに十分な速度で該本体
    に流すことにより、該表面と反応する少なくとも一種の
    溶質を該表面に充填するための手段を有することを特徴
    とする装置。
  2. 【請求項２】前記間隙容積が前記粒子間の多数の間隙通
    路からなり、該通路の少なくとも大部分が実質的に５μ
    ｍ以上の平均断面寸法を有する請求項１記載のクロマト
    グラフィー装置。
  3. 【請求項３】前記粒子が、前記表面がクロマトグラフ活
    性を維持するように、固定相の層でコートされている請
    求項１記載のクロマトグラフィー装置。
  4. 【請求項４】前記粒子が、実質的に非圧縮性であって、
    6.9×104kPaまでの充填圧力で実質的に塑性変形を起こ
    さない請求項１記載のクロマトグラフィー装置。
  5. 【請求項５】前記粒子が、アルミナ、シリカ、チタニ
    ア、バナジア、ジルコニア及びカーボンの１種以上から
    形成されている請求項１記載のクロマトグラフィー装
    置。
  6. 【請求項６】前記粒子の細孔が60Åから5000Åの範囲内
    の平均粒径を有する請求項１記載のクロマトグラフィー
    装置。
  7. 【請求項７】前記粒子が、実質的に3.45×104kPa以上の
    圧力下で充填される請求項１記載のクロマトグラフィー
    装置。
  8. 【請求項８】前記溶離液を、前記間隙容積の少なくとも
    実質的部分の中での溶離液の流れを5000以上の換算速度
    で生起させるのに十分な速度で前記本体に流すことによ
    り、充填された溶質を該本体から溶離する手段を含む請
    求項１記載のクロマトグラフィー装置。
  9. 【請求項９】前記溶離液を前記間隙容積に、溶離液によ
    り前記本体から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、
    溶離液の流れについてのレイノルズ数の逆数的関数とな
    り、かつ該溶離液中の溶質の拡散係数の大きさの直接的
    関数となるように選択された速度で流すことにより、充
    填された溶質を該本体から溶離する手段を含む請求項１
    記載のクロマトグラフィー装置。
  10. 【請求項１０】前記溶離液を前記間隙容積に、溶離液に
    より前記本体から溶離された溶質のバンド幅の広がり
    が、溶離液の流れのレイノルズ数の増大とともに減少す
    るように選択された速度で流すことにより、充填された
    溶質を該本体から溶離する手段を含む請求項１記載のク
    ロマトグラフィー装置。
  11. 【請求項１１】前記溶離液を前記間隙容積に、溶離液に
    より前記本体から溶離された溶質のバンド幅の広がり
    が、該溶離液中の該溶質の拡散係数の大きさの直接的関
    数となるように選択された速度で流すことにより、充填
    された溶質を該本体から溶離する手段を含む請求項１記
    載のクロマトグラフィー装置。
  12. 【請求項１２】前記本体がカラムである請求項１記載の
    クロマトグラフィー装置。
  13. 【請求項１３】前記粒子を前記溶質で充填するように、
    5000以上の換算速度で該溶質を前記床へ導入した結果、
    該溶質の該粒子への非特異的結合が減少される請求項１
    記載のクロマトグラフィー装置。
  14. 【請求項１４】液体クロマトグラフィー実行方法であっ
    て、該方法が、 粒子間の間隙容積が本体の全容積の45％以上であるよう
    に、さらに粒子が、30μｍから500μｍまでの範囲の実
    質的に均一な平均粒径を有するように、クロマトグラフ
    活性表面を有する、加圧充填された、実質的に均一に配
    置され固定された多数の固定剛性固体多孔質粒子の本体
    を形成し； 該表面と反応する少なくとも１種の溶質を含む液体混合
    物を、該間隙容積の少なくとも実質的部分の中での該混
    合物の流れを5000以上の換算速度で生起するのに十分な
    速度で該本体に流すことにより、該表面に該溶質を充填
    することを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】前記粒子が不規則な形状である請求項14
    記載の液体クロマトグラフィー実行方法。
  16. 【請求項１６】前記粒子が、前記表面のクロマトグラフ
    活性を維持するように、固定相の層でコートされている
    請求項14記載の液体クロマトグラフィー実行方法。
  17. 【請求項１７】生起された前記混合物の流れが実質的に
    乱流である請求項14記載の液体クロマトグラフィー実行
    方法。
  18. 【請求項１８】少なくとも6.9×104kPaまでの充填圧力
    で変形を起こさないような、実質的に非圧縮性である材
    料から前記粒子を選択する工程を含む請求項14記載の液
    体クロマトグラフィー実行方法。
  19. 【請求項１９】前記粒子が、アルミナ、シリカ、チタニ
    ア、バナジア、ジルコニア及びカーボンの１種以上から
    形成されている請求項14記載の液体クロマトグラフィー
    実行方法。
  20. 【請求項２０】前記粒子が、平均粒径が60Åから5000Å
    の範囲内にある細孔を有するように選択される請求項14
    記載の液体クロマトグラフィー実行方法。
  21. 【請求項２１】前記本体が、管状容器内にクロマトグラ
    フィーカラムを形成するように前記粒子を充填すること
    により形成される請求項14記載の液体クロマトグラフィ
    ー実行方法。
  22. 【請求項２２】前記粒子の充填工程を実質的に3.45×10
    4kPa以上の圧力で行う請求項21記載の液体クロマトグラ
    フィー実行方法。
  23. 【請求項２３】前記粒子の充填工程を、互いに接触する
    該粒子間の間隙容積以外には前記カラム内に実質的に空
    隙を形成しないように行う請求項21記載の液体クロマト
    グラフィー実行方法。
  24. 【請求項２４】前記溶離液を、前記間隙容積の少なくと
    も実質的部分の中での溶離液の流れを5000以上の換算速
    度で生起するのに十分な速度で前記本体に流すことによ
    り、充填された溶質を該本体から溶離する工程を含む請
    求項14記載の液体クロマトグラフィー実行方法。
  25. 【請求項２５】前記溶離工程を、溶離液により前記本体
    から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、溶離液の流
    れのレイノルズ数の増大とともに減少するように選択さ
    れた速度で該溶離液を該本体に流すことにより行う請求
    項24記載の液体クロマトグラフィー実行方法。
  26. 【請求項２６】前記溶離工程を、溶離液により前記本体
    から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、該溶離液中
    の該溶質の拡散係数の大きさの直接的関数となるように
    選択された速度で該溶離液を該本体に流すことにより行
    う請求項24記載の液体クロマトグラフィー実行方法。
  27. 【請求項２７】前記溶離工程を、溶離液により前記本体
    から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、該溶質の分
    子量の大きさの逆数的関数となるように選択された速度
    で該溶離液を該本体に流すことにより行う請求項24記載
    の液体クロマトグラフィー実行方法。
  28. 【請求項２８】前記溶離工程を、溶離液により前記本体
    から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、該溶離液の
    流れについてのレイノルズ数の逆数的関数となり、かつ
    該溶離液中の該溶質の拡散係数の大きさの直接的関数と
    なるように選択された速度で該溶離液を該本体に流すこ
    とにより行う請求項24記載の液体クロマトグラフィー実
    行方法。
  29. 【請求項２９】前記粒子が、少なくとも500μｍの粒径
    を有するように選択され、かつ流れ工程および溶離工程
    を50000以上の換算流速度で行う請求項24記載の液体ク
    ロマトグラフィー実行方法。
  30. 【請求項３０】前記粒子による前記溶質の非特異的結合
    が、5000以上の換算速度で前記液体混合物中の前記溶質
    を前記本体に流すことにより減少する請求項14記載の液
    体クロマトグラフィー実行方法。
  31. 【請求項３１】前記混合物の流れが実質的に乱流であ
    る、非特異的結合を低減させるための請求項30記載の液
    体クロマトグラフィー実行方法。
  32. 【請求項３２】前記流れ工程が、少なくとも前記換算速
    度で前記混合物を前記本体に注入し、次いで実質的にそ
    の直後に、少なくとも該換算速度で溶離液の流れにより
    該混合物中の溶質を該本体から溶出させることからな
    る、非特異的結合を低減させるための請求項30記載の液
    体クロマトグラフィー実行方法。
JP51750297A 1995-11-02 1996-11-01 高速液体クロマトグラフィー方法及び装置 Expired - Fee Related JP3354155B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55219395A 1995-11-02 1995-11-02
US08/661,367 US5772874A (en) 1995-11-02 1996-06-11 High performance liquid chromatography method and apparatus
US08/661,367 1996-06-11
US08/552,193 1996-06-11
PCT/US1996/017376 WO1997016724A2 (en) 1995-11-02 1996-11-01 High performance liquid chromatography method and apparatus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH11514743A JPH11514743A (ja) 1999-12-14
JP3354155B2 true JP3354155B2 (ja) 2002-12-09

Family

ID=27069969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51750297A Expired - Fee Related JP3354155B2 (ja) 1995-11-02 1996-11-01 高速液体クロマトグラフィー方法及び装置

Country Status (13)

Country Link
US (2) US5772874A (ja)
EP (1) EP0838032B1 (ja)
JP (1) JP3354155B2 (ja)
AT (1) ATE177531T1 (ja)
AU (1) AU706707B2 (ja)
CA (1) CA2236712C (ja)
DE (1) DE69601722T2 (ja)
DK (1) DK0838032T3 (ja)
ES (1) ES2130857T3 (ja)
NZ (1) NZ322280A (ja)
PL (1) PL326484A1 (ja)
TW (1) TW518246B (ja)
WO (1) WO1997016724A2 (ja)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE184702T1 (de) * 1996-01-19 1999-10-15 Cohesive Tech Inc Hochleistungsflüssigchromatographieverfahren und vorrichtung
US6063633A (en) 1996-02-28 2000-05-16 The University Of Houston Catalyst testing process and apparatus
US6720186B1 (en) * 1998-04-03 2004-04-13 Symyx Technologies, Inc. Method of research for creating and testing novel catalysts, reactions and polymers
US6110362A (en) * 1997-11-19 2000-08-29 Cohesive Technologies, Inc. Chemical analysis
US6866786B2 (en) * 1998-04-03 2005-03-15 Symyx Technologies, Inc. Rapid characterization of polymers
US6416663B1 (en) 1998-04-03 2002-07-09 Symyx Technologies, Inc. Chromatographic column for rapid characterizations of polymers
US6406632B1 (en) 1998-04-03 2002-06-18 Symyx Technologies, Inc. Rapid characterization of polymers
US6855258B2 (en) * 1999-04-02 2005-02-15 Symyx Technologies, Inc. Methods for characterization of polymers using multi-dimensional liquid chromatography with parallel second-dimension sampling
US6296771B1 (en) 1999-04-02 2001-10-02 Symyx Technologies, Inc. Parallel high-performance liquid chromatography with serial injection
US6190550B1 (en) * 1999-09-30 2001-02-20 Cohesive Technologies, Inc. Monitoring high performance liquid chromatography
US6460420B1 (en) * 2000-04-13 2002-10-08 Sandia National Laboratories Flowmeter for pressure-driven chromatography systems
US6635173B2 (en) * 2000-12-28 2003-10-21 Cohesive Technologies, Inc. Multi column chromatography system
US6528167B2 (en) 2001-01-31 2003-03-04 Waters Investments Limited Porous hybrid particles with organic groups removed from the surface
US6730228B2 (en) * 2001-08-28 2004-05-04 Symyx Technologies, Inc. Methods and apparatus for characterization of polymers using multi-dimensional liquid chromatography with regular second-dimension sampling
WO2003040166A2 (en) * 2001-11-02 2003-05-15 Millipore Corporation Membrane adsorber device
WO2003104814A2 (en) * 2002-01-01 2003-12-18 Phynexus, Inc. Biomolecule open channel solid phase extraction systems and methods
FI20020592A (fi) * 2002-03-27 2003-09-28 Danisco Sweeteners Oy Menetelmä sokereiden, sokerialkoholien, hiilihydraattien ja niiden seosten erottamiseksi niitä sisältävistä liuoksista
US7879621B2 (en) * 2003-05-08 2011-02-01 Phynexus, Inc. Open channel solid phase extraction systems and methods
US7122640B2 (en) * 2002-06-10 2006-10-17 Phynexus, Inc. Open channel solid phase extraction systems and methods
US7151167B2 (en) * 2002-06-10 2006-12-19 Phynexus, Inc. Open channel solid phase extraction systems and methods
WO2004047981A1 (en) * 2002-11-25 2004-06-10 Varian, Inc. Irregularly-shaped macroporous copolymer particles and methods of using same
AU2003298894A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-18 Prime Separations, Incorporated Chromatographic separation processes and apparatus
US20040241721A1 (en) * 2003-05-08 2004-12-02 Gjerde Douglas T. Open channel solid phase extraction systems and methods
US6962658B2 (en) * 2003-05-20 2005-11-08 Eksigent Technologies, Llc Variable flow rate injector
US6977143B1 (en) * 2003-09-08 2005-12-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Determination of testosterone by mass spectrometry
US7309426B2 (en) * 2004-04-23 2007-12-18 Agilent Technologies, Inc. Composition and method for high efficiency chromatography
US20060169640A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-03 Hubert Quinn High throughput screening, purification and recovery system for large and small molecules
US7972867B2 (en) 2005-04-06 2011-07-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin D metabolites by mass spectrometry
US7745226B2 (en) 2005-04-06 2010-06-29 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin D metabolites
US20070196833A1 (en) * 2005-04-21 2007-08-23 Gjerde Douglas T Open channel solid phase extraction systems and methods
CA2654319C (en) * 2006-05-26 2014-08-12 Laboratory Corporation Of America Holdings Liquid chromatography with tandem mass spectrometry of estrone, estradiol and free thyroxine
US8017015B2 (en) * 2006-10-20 2011-09-13 Quest Diagnostics Investments Incorporated Monolithic column chromatography
US20080181932A1 (en) * 2007-01-30 2008-07-31 Drugtech Corporation Compositions for oral delivery of pharmaceuticals
WO2008112388A1 (en) * 2007-03-14 2008-09-18 Drugtech Corporation Spatial arrangement of particles in a drinking device for oral delivery of pharmaceuticals
WO2008150488A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for quantification of peptides and other analytes
US8017403B2 (en) 2007-06-14 2011-09-13 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry method for measuring vitamin B6 in body fluid
US7767463B2 (en) * 2007-06-15 2010-08-03 Cohesive Technologies, Inc. Method for screening mobile phases in chromatography systems
US20090134325A1 (en) 2007-11-27 2009-05-28 Goldman Mildred M Methods for detecting estradiol by mass spectrometry
US7972868B2 (en) 2007-11-28 2011-07-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry
US8916385B2 (en) 2007-12-13 2014-12-23 Quest Diagnostics Investments, Inc. Methods for detecting estrone by mass spectrometry
WO2009091680A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 Merck & Co., Inc. High performance liquid chromatographic (hplc) purification of proteins using semi-compressible resins
TW200933195A (en) * 2008-01-28 2009-08-01 Ind Tech Res Inst Autostereoscopic display
US7834313B2 (en) 2008-08-08 2010-11-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for plasma-renin
US7893399B2 (en) * 2008-09-09 2011-02-22 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dehydroepiandrosterone by mass spectrometry
US7952067B2 (en) 2008-10-06 2011-05-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin C by mass spectrometry
US7804063B2 (en) 2008-10-06 2010-09-28 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dihydrotestosterone by mass spectrometry
US8039794B2 (en) * 2008-12-16 2011-10-18 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for thiopurine-S-methyl transferase activity and products generated thereby
US7952068B2 (en) 2008-12-16 2011-05-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting catecholamines by mass spectrometry
US8399829B2 (en) 2008-12-18 2013-03-19 Quest Diagnostics Investments Incorporated Vitamin B2 detection by mass spectrometry
EP4079308A1 (en) 2008-12-23 2022-10-26 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for estrogenic compounds
WO2010075449A1 (en) 2008-12-24 2010-07-01 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for congenital adrenal hyperplasia
CN105067698B (zh) 2009-11-05 2018-11-20 奎斯特诊断投资公司 用高分辨率质谱法量化胰岛素样生长因子-i和胰岛素样生长因子-ii
US8034627B2 (en) 2009-12-03 2011-10-11 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry
US7977117B2 (en) 2009-12-03 2011-07-12 Quest Diagnostics Investments Incorprated Vitamin D metabolite determination utilizing mass spectrometry following derivatization
EP2510347B1 (en) 2009-12-11 2019-03-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry of steroidal compounds in multiplex samples
CN102753964A (zh) 2009-12-11 2012-10-24 奎斯特诊断投资公司 非衍生的、非代谢的维生素d的质谱测定
US8497079B2 (en) 2009-12-21 2013-07-30 Quest Diagnostics Investments Incorporated Glucagon detection and quantitation by mass spectrometry
US9504936B2 (en) * 2010-04-05 2016-11-29 Purdue Research Foundation Method of packing chromatographic columns
US10837972B2 (en) 2010-06-09 2020-11-17 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometric determination of derivatized methylmalonic acid
US10215765B2 (en) 2010-09-15 2019-02-26 Quest Diagnostics Investments Incorporated Detection of vitamins A and E by tandem mass spectrometry
US8557593B2 (en) 2010-09-16 2013-10-15 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometric determination of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid
AU2011305254B2 (en) * 2010-09-26 2014-06-05 Da Yu Enterprises, L.L.C. Separation of analytes
EP2633325B1 (en) 2010-10-29 2016-12-28 Cohesive Technologies Inc. Lc-ms separation and detection of vitamin d metabolites
HUE055674T2 (hu) 2010-10-29 2021-12-28 Thermo Fisher Scientific Oy Rendszerelrendezés automatizált mintaelõkészítõ és -elemzõ rendszerhez
WO2012058619A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Cohesive Technologies Inc. Lc-ms configuration for purification and detection of analytes having a broad range of hydrophobicities
WO2012058516A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Thermo Finnigan Llc Method and system for liquid chromatograph with compressibility and viscosity monitoring to identify fluids
CN203577372U (zh) * 2010-10-29 2014-05-07 赛默菲尼根有限责任公司 模块式多柱色谱盒
WO2012087438A1 (en) 2010-11-08 2012-06-28 Georgetown University Methods for simultaneous quantification of thyroid hormones and metabolites thereof by mass spectrometry
EP3091562B1 (en) 2010-12-28 2019-01-30 Quest Diagnostics Investments LLC Quantitation of insulin by mass spectrometry
US9177766B2 (en) 2010-12-30 2015-11-03 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometric quantitation assay for metabolites of leflunomide
US8728824B2 (en) 2011-06-22 2014-05-20 Quest Diagnostics Investments Inc. Mass spectrometric determination of fatty acids
EP3557605B1 (en) 2011-11-23 2021-07-14 Quest Diagnostics Investments Incorporated Kisspeptin-54 detection by tandem mass spectrometry
US8669519B2 (en) 2011-12-05 2014-03-11 Quest Diagnostics Investments, Inc. Methods for detecting reverse triiodothyronine by mass spectrometry
US8779355B2 (en) 2011-12-28 2014-07-15 Quest Diagnostics Investments, Inc. Methods for detecting lacosamide by mass spectrometry
EP2680005A1 (en) 2012-06-28 2014-01-01 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Lipid analysis
US9404900B2 (en) 2012-12-21 2016-08-02 Thermo Finnigan Llc System for analysis of phase-I and phase-II metabolites and parent compounds without hydrolysis
WO2014105858A1 (en) 2012-12-26 2014-07-03 Quest Diagnostics Investments Incorporated C peptide detection by mass spectrometry
US9966243B2 (en) 2013-01-29 2018-05-08 Georgetown University Apparatus and methods for plasma-assisted reaction chemical ionization (PARCI) mass spectrometry
US20160061787A1 (en) * 2013-04-08 2016-03-03 The General Hospital Corporation Automated analysis systems
WO2014190230A1 (en) 2013-05-23 2014-11-27 Iphenotype Llc Phenotypic integrated social search database and method
WO2015011522A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Tubitak Ume Multi-task sample preparation system with reconfigurable modules for on-line dilution, enzymatic digestion and fractionation
US10324082B2 (en) 2015-03-03 2019-06-18 Quest Diagnostics Investments Llc Methods for quantitation of insulin levels by mass spectrometry
US11360098B2 (en) 2015-09-28 2022-06-14 Quest Diagnostics Investments Llc Amyloid beta detection by mass spectrometry
US20190257801A1 (en) * 2016-06-21 2019-08-22 Purdue Research Foundation Uniformly dense stationary phase for chromatography
BR112019020473A2 (pt) 2017-03-31 2020-04-28 Quest Diagnostics Invest Llc métodos para quantificação de insulina e c-peptídeo
US11361953B2 (en) 2017-07-31 2022-06-14 Quest Diagnostics Investments Incoporated Apolipoprotein E isotype detection by mass spectrometry
US11860141B2 (en) 2017-08-14 2024-01-02 Quest Diagnostics Investments Llc Detection and quantitation of guanidinoacetate, creatine, and creatinine by mass spectrometry
GB201802123D0 (en) 2018-02-09 2018-03-28 Metabolomic Diagnostics Ltd A method of processomg a biological sample
CN112424605A (zh) 2018-05-11 2021-02-26 美国控股实验室公司 用于检测肾纤维化的组合物和方法
EP3803414A1 (en) 2018-06-01 2021-04-14 Laboratory Corporation of America Holdings Methods and systems for lc-ms/ms proteomic genotyping
CN113227793A (zh) 2018-10-03 2021-08-06 美国控股实验室公司 用于测量抗坏血酸的方法和系统
US11536733B2 (en) 2019-04-16 2022-12-27 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for the detection of 11-oxo androgens by LC-MS/MS
GB202003835D0 (en) * 2020-03-17 2020-04-29 Johnson Matthey Plc Chromatographic method for separating platinum group metals
WO2022056282A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for detecting prostaglandins by lc-ms/ms
CN115380211A (zh) 2021-03-17 2022-11-22 日本水产株式会社 精制的方法和经精制的产品
CA3232283A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for measuring progesterone metabolites

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1148662A (en) * 1965-05-11 1969-04-16 Pretorius Victor Chromatographic process and apparatus therefor
US4208284A (en) * 1965-05-11 1980-06-17 Hahn Hans H Apparatus for distribution separation processes
GB1452896A (en) * 1972-12-21 1976-10-20 Nat Res Dev Packing materials
FR2328508A1 (fr) * 1975-10-22 1977-05-20 Atomic Energy Authority Uk Gels poreux, leur procede d'obtention et applications
US4512897A (en) * 1981-07-28 1985-04-23 Amf Incorporated Molecular separation column and use thereof
SE464816B (sv) * 1985-10-15 1991-06-17 Nilsson Kjell Makroporoesa partiklar, foerfarande foer dess framstaellning och dess anvaendning
JPH0669521B2 (ja) * 1986-12-23 1994-09-07 三菱化成エンジニアリング株式会社 クロマト分離法
US5228989A (en) * 1989-07-06 1993-07-20 Perseptive Biosystems, Inc. Perfusive chromatography
US5019270A (en) * 1989-07-06 1991-05-28 Perseptive Biosystems, Inc. Perfusive chromatography
US5164090A (en) * 1989-11-06 1992-11-17 E. R. Squibb & Sons, Inc. Process for the direct chromatographic analysis of drugs and metabolites in whole blood samples using internal surface reverse phase technology
US5328603A (en) * 1990-03-20 1994-07-12 The Center For Innovative Technology Lignocellulosic and cellulosic beads for use in affinity and immunoaffinity chromatography of high molecular weight proteins
DE4018778A1 (de) * 1990-06-12 1991-12-19 Braun Melsungen Ag Adsorptionsmaterial zur selektiven entfernung von ldl- oder/und vldl
WO1993020449A1 (en) * 1992-03-27 1993-10-14 Perseptive Biosystems, Inc. Rapid hypersensitive flowthrough immunodetection system
US5256298A (en) * 1992-04-22 1993-10-26 Powell Paul E Continuous-belt separator/reactor and method
US5268097A (en) * 1992-06-19 1993-12-07 Sepracor Inc. Passivated and stabilized porous mineral oxide supports and method for the preparation and use of same
US5387347A (en) * 1993-09-15 1995-02-07 Rothchild; Ronald D. Method and apparatus for continuous chromatographic separation
US5503933A (en) * 1994-02-25 1996-04-02 Purdue Research Foundation Covalently bonded coatings

Also Published As

Publication number Publication date
US5772874A (en) 1998-06-30
DK0838032T3 (da) 1999-09-27
AU7599596A (en) 1997-05-22
PL326484A1 (en) 1998-09-28
DE69601722T2 (de) 1999-07-29
CA2236712C (en) 2003-09-16
ES2130857T3 (es) 1999-07-01
EP0838032A2 (en) 1998-04-29
CA2236712A1 (en) 1997-05-09
TW518246B (en) 2003-01-21
AU706707B2 (en) 1999-06-24
WO1997016724A3 (en) 1997-06-05
DE69601722D1 (de) 1999-04-15
JPH11514743A (ja) 1999-12-14
WO1997016724A2 (en) 1997-05-09
ATE177531T1 (de) 1999-03-15
US5919368A (en) 1999-07-06
EP0838032B1 (en) 1999-03-10
NZ322280A (en) 1999-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3354155B2 (ja) 高速液体クロマトグラフィー方法及び装置
Ismail et al. Pirkle-type chiral stationary phase on core–shell and fully porous particles: are superficially porous particles always the better choice toward ultrafast high-performance enantioseparations?
McCalley Comparison of conventional microparticulate and a monolithic reversed-phase column for high-efficiency fast liquid chromatography of basic compounds
Knox Band dispersion in chromatography–a new view of A-term dispersion
Kirkland et al. The art and science of forming packed analytical high-performance liquid chromatography columns
Belenkii et al. Modern liquid chromatography of macromolecules
Gritti et al. The rationale for the optimum efficiency of columns packed with new 1.9 μm fully porous Titan-C18 particles—A detailed investigation of the intra-particle diffusivity
Gritti et al. Particle size distribution and column efficiency. An ongoing debate revived with 1.9 μm Titan-C18 particles
Podgornik et al. Large-scale methacrylate monolithic columns: design and properties
Stegeman et al. Hydrodynamic chromatography of polymers in packed columns
Kirkland et al. High-performance size-exclusion chromatography of small molecules with columns of porous silica microspheres
Stanelle et al. Capillary-channeled polymer (C-CP) fibers as a stationary phase in microbore high-performance liquid chromatography columns
Snyder Peer Reviewed: HPLC: Past and Present.
Issaeva et al. Super-high-speed liquid chromatography of proteins and peptides on non-porous Micra NPS-RP packings
Miyabe Moment analysis of chromatographic behavior in reversed‐phase liquid chromatography
Wang et al. Dynamic evaluation of a trilobal capillary‐channeled polymer fiber shape for reversed phase protein separations and comparison to the eight‐channeled form
Gu et al. A general rate model approach for the optimization of the core radius fraction for multicomponent isocratic elution in preparative nonlinear liquid chromatography using cored beads
Aydoğan et al. Nano-liquid chromatography with monolithic stationary phase based on naphthyl monomer for proteomics analysis
Zhang et al. Uniform polysaccharide composite microspheres with controllable network by microporous membrane emulsification technique
Zimina et al. Effects of kinematic viscosity of the slurry on the packing efficiency of peek microbore columns for liquid chromatography
Knox High speed liquid chromatography
Blumberg Basic structure-independent equations of kinetic performance of columns in liquid chromatography
Dittmann et al. New materials for stationary phases in liquid chromatography/mass spectrometry
JP4564842B2 (ja) 高分子の分子位相的分別
Ahmed et al. Column technology for liquid chromatography

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080927

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080927

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090927

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100927

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100927

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110927

Year of fee payment: 9

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees