TW509575B - Pure somatostatin antagonist and methods of use thereof - Google Patents

Description

509575 A7 B7 五、發明説明（i 發明背景

2.丨 I |.| Γ! IJ 哺乳動物的生長因素釋放抑制因子係—種十四胺基酸 肤，可抑制生長激素自垂體釋出。此外，其可抑制姨島素 及胰增血糖素自胰島細胞釋出。生長因素釋放抑制因子之 大部分生物學作用係由五種不同亞型的生長因素釋放抑制 因子受器（SSTR)調節。SSTR2及SSTR5是周邊組織的主要亞 型，針對各別亞型的生長因素釋放因子受器，可以只阻斷 一或二種亞型，因而可減少發生不必要副作用的可能。 訂 生長因素釋放抑制因子的興善劑及拮抗劑一直被延用以 幫助説明該激素在控制多重生理學作用的功能。特別引起 極大興趣的是一種純的生長因素釋放抑制因子，其係一種 可成功地與該激素競爭其受器位置的化合物。該化合物可 用以阻斷生長因素釋放抑制因子的抑制作用，換言之，其 可增加生長激素，騰島素及胰增血糖素之釋放。雖然已有 顯不邵分生長激素釋放抑制因子拮抗劑活性的化合物經揭 不，i.e·具有一些興奮劑作用，一些拮抗劑作用，但到目 前爲止尚未有人述及純的生長激素釋放抑制因子的拮抗 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 劑。 本發明目的爲提供一種純的生長激素釋放抑制因子拮抗 劑。 本發明的另一目的爲提供一種減低生長激素釋放抑制因 子作用的方法。 此外，本發明的另一目的爲提供一種増加哺乳動物生長 放素，胰島素及胰増血糖素，釋放及促進哺乳動物生長的 本紙張尺度適财_家縣（CNS ) A4規格（21GX 297公慶） •4 509575 A7 B7 五、發明説明（ 方法。 本發明的又一目的爲提供一種對夸哭；π； ^又态亞型有選擇性的生 長激素釋放抑制因子拮抗劑。 對於那些熟習本技藝者，可由本發 ,^ +氰明以下所述内容，顯 見本發明的其它目的及益處。 發明, 衣發明提供-種減低生長激素釋放抑制因子作用的方 法，其巾包括使生長;敫素釋放抑制目^器位£與有效量 的如下化學式I肽接觸， 一

Ru AA1-D-Cys-AA2-D-Trp-AA3-AA4-Cys-AA5-NH- (I) 其中 心及反2分別各爲Η，Ci-Cs烷基，COR或COOR: 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 ΑΑι爲視情況經一至三個n〇2，CN，Cl，Br，I，F， COR3，COOR3或OR3基團取代的芳香系α-胺基酸之D或 L異構物； AA2爲視情況經一至三個N02，CN，Cl，Br，I，F， COR4 ’ COOR4或OR4基團取代的芳香系α-胺基酸之D或 L異構物； AA3爲Arg，Lys，Orn或Cit之D或L異構物； AA4 爲 Val，Leu，lie，Abu，Nle，Thr，3-R5-Ser，Thr(Bzl) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐 509575 A7 B7 五、發明説明（3 ) 或Ser(Bzl)，附帶條件是：當aA4爲Thr時，八八!必需爲 L異構物； AA5爲視情況經一至三個N〇2，CN，Cl，Br，I，F， COR6，<：00116或〇r6基團取代的芳香系α-胺基酸， N(CH3)Ala，N(R7)_a-胺基酸，Thr 或 Ser 的 D 或 L 異構 物，附帶條件是：該肽環狀部分的D-胺基酸殘基數目 需爲偶數； ^爲^-^烷基，苯基，苯基（Cl-c4)烷基，莕基或莕基（Ci_ C4)烷基； — L，R3，R4，尺6及R7分另]各爲Η或Ci-Cs烷基；且 1爲Η ’ Ci-C8燒基’或視情況經一至三個n〇2，CN，C1， Βι·，I，F，COR6或〇R0基團取代的芳香系…胺基酸之 D或L異構物；或 其在製藥學上可接受的鹽類。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明亦提供可顯示純的生長激素釋放抑制因子拮抗作 用的化學式（I)肽，及增加哺乳類生長激素，騰島素及胰增 血糖素，釋放及促進其生長的方法，該方法包括給與哺乳 類有效量的化學式（I)肽。 發明詳細説明 本發明較佳的具體表現是一種可減低生長激素釋放抑制 因子作用的方法，其中包括使生長激素釋放抑制因子受器 與有效量的化學式I肽接觸， 509575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（4 ) R\ I-Ϊ AAi -D-0y s_ AA2_D-Trp_ AA3 AA4- Cy s-AA5-NH2Rf(I)其中 及1及尺2分別各爲11，（：1-0：8烷基，（：011或（：00尺： AAi爲視情況經一至三個N02，CN，Cl，Br，I，F， COR3，COOR3或OR3基團取代的芳香系α·胺基酸之D或 L異構物： - AA2爲視情況經一至三個N02，CN，Cl，Br，I，F， COR4，COOR4或OR4基團取代的芳香系a-胺基酸之D或 L異構物； AA3爲Arg，Lys，Orn或Cit之D或L異構物； AA4 爲 Val，Leu，lie，Abu，Nle，Thr，3-R5-Ser，Thr(Bzl) 或Ser(Bzl)，附帶條件是：當AA4爲Thr時，則AArA'需 爲L異構物； AA5爲視情況經一至三個N02，CN，Cl，Br，I，F， COR6，（：00116或OR6基團取代的芳香系a-胺基酸， N(CH3)Ala，N(R7)-oc-胺基酸，Thr 或 Ser 的 D 或 L 異構 物，附帶條件是··該肽環狀部分的D-胺基酸殘基數目 需爲偶數； 尺爲心-^烷基，苯基，苯基（CVC4)烷基，莕基或莕基（Cr C4)烷基； R2，R3，R4，尺6及117分另丨J各爲i^CVCs烷基；且 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509575 五、發明説明（5 ) R5爲Η，Ci-Cs烷基，或經一至三個N〇2，CN，α，&，工， F ’ COR6或〇R0基團取代的芳香系心胺基酸之d或[異 構物；或 其在製藥學上可接受的鹽類。 有利地，該化合式I肤對生長激素釋放抑制因子亞型 SSTR2及SSTR5具選擇性。意即，其對SSTR2.及SSTR5之結合 較緊密而顯示對SSTR1及SSTR3之結合較微弱。這種獨一無 二的結合特性，使化學式〗肽可做爲純的生長激素釋放抑 制因子拮抗劑同時減少發生不必要的副作用的可能性。 詞囊"芳香系α-胺基酸，，意指如下化學式11胺基酸殘 ~Ar —ΊΓ- τ-—丨. (請先聞讀背面之注意事項具填寫本頁 ~rc? 訂 c=〇 濟 部 中 k 標 準 局 員 工 消 費 合 if 社 印 製

III 其中X代表在終端胺基酸AAl中的鍵且11在非終端胺基酸 AA2_5中的鍵，且Ar爲包括視情況經芳香系環取代的部分。 Ar的實例包括，但不局限於，如下結構，其中&代表“固 視情況選用的Υ取代基且η爲〇，1，2咬3 ; γ

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ ⑽575 A7 B7 五、發明説明（6 ) 詞彙”製藥學上可接受的鹽類"意指常用於人及獸醫製藥 工業的無毒加酸鹽類或金屬複合物。加酸鹽類的説明實例 爲有機酸鹽，諸如：醋酸，乳酸，帕馬酸（pam〇ic)順丁烯 二酸，擰檬酸，蘋果酸，抗壞血酸，琥珀酸，苯甲酸，棕 招酸，栓酸，柳酸酒石酸，甲磺酸，甲苯磺酸或其類似 物；聚合酸，諸如：單寧酸，羧曱基纖維素或其類似物； 及無機酸，諸如：氫氣酸，氫溴酸，硫酸，磷酸或其類似 物。金屬複合物包括鋅，鐵及其類似物。 所使用的肽胺基酸殘基符號'是常用於本技藝中的縮 寫，包括但不局限於下表中所條列者。 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁〕 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 縮寫 胺基酸 Ala 丙胺酸 Abu 胺基丁酸 Arg 精胺酸 Cit 瓜胺酸 Cys 半胱胺酸 lie 異白胺酸 Leu 白胺酸 Lys 離胺酸 Nal(l) β-(1-蓁基）丙胺酸 Nal(2) β-(2 -奈基）丙胺酸 Phe 苯丙胺酸 Ser 絲胺酸

509575 A7 B7 五、發明説明（7 )

Thr 羥丁胺酸 Trp 色胺酸 Tyr 酪胺酸 Val 纈胺酸 此外，在本專利説明書及專利申請範圍中所使用的專門 名詞及縮寫，包括但不局限於以下所述内容： 寫I 縮 構 結

c A OMnc 3 H c (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Naoc ! 〇 u

IT

Nal (2)

NK—} CH, 〇 丄 N(CH3) Ala

CH, 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

Cit HN—} 〇 "r° 眠 D. H. Coy及J. E. Taylor在WO 94/02163中曾述及某些化學式 -10- 衣纸張尺度適用中g國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509575 A7 B7 五、發明説明（8 ) I肽做爲神經梅定（neuromedin) B受器拮抗劑。該文中亦描 述製備該肽的方法。 意外地，化學式la及化學式lb肽，到目前爲止尚未經揭 示其可表現純的生長激素釋放抑制因子拮抗劑的活性。 1 7 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-N(CH3)Ala-NH2 _(la) 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Tyr-NH2 (lb) 一 有利的’可利用化學式Ia及lb肽減少哺乳動物生長激素 釋放抑制因子的作用，藉以增加哺乳類生長激素，胰島素 及胰增血糖激素產生。此外，本發明的化學式匕及Ib肽是 對SSTR2及SSTR5有選擇的。對受器亞型有選擇性的生長激 素釋放抑制因子拮抗劑，諸如化學式。及比肽，可選擇性 地增加生長激素，胰島素或胰增血糖素產生，並藉以減少 發生不必要副作用的可能性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 万便地本發明之化學式la及lb肽，可根據本技藝中已知 的標準肽合成法製備，例如在1^.4,508,711或\¥〇 94/02163 中所描述的方法。 在實際應用中，可利用化學式m，包括Ia&Ib，阻斷生 長激素釋放抑制因子抑制生長激素釋放的作用，藉以有效 的幫助標的品系生長。例如，當每天給與哺乳動物以劑量 約2 X 1CT6臺吞/八&方_ 見/ a斤至1〇·〇φ克/公斤體重的此處所述化學 本纸張尺度朗㈣ 509575 A7 B7 五、發明説明（ 請 先 閱 讀 背 面 5 I 事 項 再 頁 式肽可增加該哺乳類宿主的生長激素，胰島素及胰增 血糖素水平。可將該肽以飼料添加物形式經口給與或以大 丸劑’植入片，藥丸，錠劑，口服膠漿劑，或與其類似的 形式給與。也預期經由非經腸道的肌肉，皮下，腹腔或靜 脈注射給與，或應用於皮内或當做鼻的噴劑。 爲主現本發明較清晰的意義，故安排以下特別的實例。 這些實例僅用以舉例説明，絕不應視其爲對本發明範圍及 其原理的限制。 的確，除了此處舉例説明及福述外，凡熟習本技藝者， 可由以下實例及前面的描述，顯見本發明的各種經修改形 式。這類經修改的形式亦將落入本文附加的申請專利範圍 訂 的範#壽中。 詞彙HPLC意指高效液相色層分析法。 實例1 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-C+s-N(CH3)Ala-NH2 製備 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 步興丄:製備 H-P-N〇2Phe-S-三苯甲基-D-Cys-0-t-丁基-Tyr-O· Trp-Ns-t- 丁基氧羰基-Lys-Val-S-三苯甲基-Cys-N(CH3)Ala-PAL 樹脂 將 Fmoc-PAL-PEG-樹脂（米里波公司）（Millip〇re)(1.8 g， 0.32¾莫耳）置於米里波9050肽合成器的反應槽中，設定程 式使其進行如下連續的流動反應循環：（a)二甲基甲醯胺 (DMF)沖洗：（b)含20%六氫吡啶之DMF沖洗（2分鐘及5分鐘 各2次）：（c)DMF沖洗。 將Fmoc經分離阻塞物的樹脂曝露於連續流下的含9 -苐基 本纸張尺@用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -12- 509575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（1〇 ) 甲氧羰基-N(CH3)Ala(Fmoc-N_Me-Ala-OH)(高階化技）苯幷三 氮唑-1-烷氧基-參（二甲基胺基）-六氟磷酸化銹 (BOP)( Richelieu生物技術，Inc·)，1-羥苯三唑（HOBT)，及二 異丙基乙基胺之DMF溶液30分鐘，然’後將生成的胺基酸樹 脂循環通過步驟⑷通過（b)置於上述沖洗程式中。以下的胺 基酸（1.3毫莫耳）可經相同程續成功地偶合之：Fmoc-S-三 苯甲基-Cys-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ns-t-丁基氧談基 -Lys-〇H，Fmoc-D-Trp-OH，Fmoc-D-t-丁基，Tyr_OH，Fmoc-S-三苯 甲基-D-Cys-OH，Fmoc-p-N02Phe:OH。該樹脂經以二氯甲烷 沖洗並乾燥後，產物乾重2 g。 步驟 2 ··製備 H-p-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys· N(CH3)Ala-NH2 將得自步驟1的肽樹脂（2 g，0.3毫莫耳）在25°C與乙二硫 醇及三氟醋酸混合，經攪拌3小時之後過濾。將含肽的 濾出液蒸發後以醚沈澱出肽。然後溶解該粗製肽於50 ml二 甲亞颯及200 ml水中，並在25°C攪拌3天。濃縮此溶液並施 加到雷寧管柱（Rainin) 21.4 X 250 mm，十八基-矽烷矽石（12 ju m)初步的高效液相色層分層管柱，接著以線性梯度之乙 腈在0.1%含水三氟醋酸溶液溶析。將含有所需肽的部分蒸 發並以醚沈澱，可產生31 mg非結晶形的灰白色固態的標 題產物，經分析HPLC測定爲均質產物。以電子噴灑質量 光譜分析法分析鑑定該肽。 實例2 製備 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Tyr-NH2 _- - _ 13 - _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509575 A7 _____B7_ 五、發明説明（„ )

基本上利用與實例1中所述相同的程序並以Fmoc-Try-OH 及 Fmoc-Abu-OH 分別取代 Fmoc-N(CH3)Ala-OH 及 Fmoc_Val- OH，可獲得36 mg白色非結晶形的固態標題產物，經分析 HPLC測定爲均質產物。以電子噴麗質量光譜分析法分析 鑑定該肽。 實例3 . 用經修飾的酵母細胞評估測試化合物之生長激素釋放 | 子興奮劑及生長激素釋放抑制因子括抗劑活性。 I . 、 " ~" ~ | 衣評估法利用經特別修飾過而能在細胞表面表達大藏生 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I 長激素釋放抑制因子受器亞型2 (SSTR2)功能的酵母細胞。 將啤酒酵母（S· Cerevisiae) LY 364細胞覆於缺乏組胺酸的標 準合成洋菜培養基。在缺生長激素釋放抑制因子興奮劑 時，該有營養缺陷的（his 3)細胞無法生長。在生長激素釋 放抑制因子或生長激素釋放抑制因子興奮劑存在時，可謗 發一種酶（His 3p :咪唑-甘油磷酸去氫酶）表達，該酶是生 物合成組胺酸所必需。成爲能產生組胺酸的細胞會在施加 測試化合物的四週形成細胞生長環帶。測量該環帶後，給 測試化合物一個1至5級的興奮劑評價，其中丨爲具有最小 的興奮劑活性而5爲具有最大的興奮劑活性。 依上述程序評估測試化合物之生長激素釋放抑制因子拮 抗劑活性，但在施加測試化合物前，於第3曰先加$ I的1 mg/mL生長激素釋放抑制因子，心14至每個培養盤中。若 該測試化合物是生長激素釋放抑制因子括抗劑，則在細Z 生長環帶内會出現一圈無生長的環帶。測量該無生長的環 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（__ 509575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 帶後，給測試化合物一個1至5級的拮抗劑評價，其中1爲 具有最小的拮抗劑活性而5爲具有最大的括抗劑活性。 結果示於表1。未觀察到活性的結果以長晝符號表示。 材料及方法 SCD-ura-trp ： 1) 在500 mL水中加入：

1.7 g不含胺基酸及（NH4)2S04之YNB 5.0 g(NH4)2S〇4 0.7 g CSM-ura-trp 2) 在另500 mL水中加入： 20 g葡萄糖 3) 分別在殺菌斧中殺菌後混合 SCL-ura-trp ： 1) 在500 mL水中加入：

1.7 g不含胺基酸及（NH4)2S04之YNB 5.0 g (NH4)2S04 0.7 g CSM-ura-trp 2) 在另500 mL水中加入： 30 mL乳酸 3) 分別在殺菌斧中殺菌後混合 SCG-ura-trp ： 1) 在500 mL水中加入：

1.7 g不含胺基酸及（NH4)2S04之YNB 5.0 g(NH4)2S〇4 _-_1£-___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

509575 A7 B7 五、發明説明（13 ) 0.7 g CSM-ura-trp 2) 在另500 mL水中加入： 30 gD-半乳糖 3) 分別在殺菌斧殺菌後混合 SCG-ura-trp-his洋菜培養基，pH 6·8 ·· 1) 在500 mL水中加入： 1.7 g不含胺基酸及（NH4)2S04之YNB 5.0 g (NH4)2S04 0.7 g CSM-ura-trp-his 轉子 2) 滴加濃NH4OH以調整pH至6.8-6.9 3) 在另500 mL水中加入 30 gD-半乳糖，20 g洋菜 4) 分別以殺菌斧殺菌 5) 攪拌使充分混合 6) 平衡其溫度至55°C 不含胺基酸及（NH4)2S04 之 YNB，CSM-ura-trp 及 CSM-ura- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) trp-his係由Biolol製造。硫酸銨（(N\H4)2S〇4)，葡萄糖（D-葡萄 糖），D-半乳糖及乳酸係由Sigma製造。 擬作草案： 第1曰： 1) 灌注含單一菌落的2 mL SCD-ura-trp液態培養基至法 肯（Falcon) 2051管中，其中該單一菌落係取自含有 LY364 (MATa ura3-52 leu2 his3 trpl lys2 ade2 farl:: _- 16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 509575 A7 B7 五、發明説明（14 ) LYS2 fusl::FUSl-HIS3 gpal::hisG sst2zADE2具 SSTR2表 達質粒，pJH2，及G蛋白表達質粒，pLP82)細胞之 培養盤 0 第二 曰： 1) 以離心 法收集細胞（3 krpm，5 min - ，室溫） 2) 以5 mL無菌水再次懸浮細胞。 3) 再以離 心法收集細胞。 4) 以5 mL SCL-ura-Ιτρ液態培養基再懸 浮細胞 5) 於桶式 輥機中在30°C培養6小時。 6) 再以離 心法收集細胞。 7) 以5 mL SCG-ura-trp液態培養基再懸 浮細胞 8) 於桶式報機中在30°C培養至隔夜。 第三曰： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509575 Μ Β7五、發明説明（15 ) 於第三曰在每一培養盤中加入5" L之1 mg/mL S-14。 第五日： 開始檢查培養盤中所施加之化合物周圍細胞生長情形。 第七曰： 應易於察見細胞生長對生長激素釋放抑制因子的反應。 恨據本文前述評估等級之方法評估細胞生長向外擴張或抑 制的程度。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -18 - 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509575 A7 B7 五、發明説明（ 16 办-Nofophe tN02phe 办丨N〇2丨D丨sle D-Nal(2) L·丨Nal(2) 4 丨 NONJphe 办丨 N02plle 4 丨 Noiopho) 4丨N〇2phe NMe—办-M〇2phe 办丨N〇2phe 办—N〇2phe L-Nal(2) 办丨 NOrvJphe AC — 4 —N02phe Ac丨4丨N〇2phe Ac丨办 iIPhe

Tyr Tyr Hyr Tyr Tyr Hyr Tyr Tyr TYr Tyr 闩yr Hyr Tyr Tyr Hyr Tyr Hyr

Lys Lys Lycn Lys Lys Lys I」ys Lys orn LyLO Lys Lys Lys Arg Lys Lyco I」ys

Valvav—J· Val Val Val I Hhr Val ser V山一 V卬一 Abu Hhr Thr Thr Thr (Bzl) Tyr Thr ΜΠΗ3) Ala 「ryr TTyr Tyr Tyr Hyr Nal( 2 ) Nal(2) Tyr Tyr Tyr D-Tyr Tyr Tyr D-TyrD-「nlr Tyr -Dlcys —AAo-D-Hrp-AAd —AAsk— CAW I AALn-lsiHio (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —M' 、\st» 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1^1^¾ 3 5 2 2 3 5 2 3 1 5 3 办 1 2 3 1 1 衣紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509575

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Tyr Tyr Tyr Hyr Hyr Tyr ,ryr Tyr Tyr TTyr TYr Tyr Hyr Tye Tyr

Lycn Lys ArCQ Lyw Lym Lyw Lys Lyw Lys Lys Lycn Lys Lys Iwys Lys AA4_ Tlir Thr 闩hr Thr 1 Thr Thr Thr ehr Hhr Thr 闩hr Thr Hyr Hhr- (σζι ) Tyr __ D — Tyr Hyr Tyr Tyr Tyr Hyr DITyr D-Hyr Hyr Tyr DITyr D 丨 Hyr D-Tyr D-"Tyr ^-I」：·>--Y r (荔h-2 AA 丨D 丨 GVSIAA ID 丨HrOIAAJJ'. 丨 Q/s 丨 AALn丨 NHro (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社，印製 • 1 1 2 5 1 3 3 2 办 2 办 3 办 3 _-20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNTS ) A4規格（210X 297公釐） 509575 A7 B7 五、發明説明（18 ) 實例4 評估測試化合物之競爭性結合活性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於本項評估中測定置換50%來自表達於哺乳類細胞SRIF 受器亞型之生長激素釋放抑制因子SRIF所需之測試化合物 濃度，i.e.，抑制50%來自結合於SRIF受器亞型之[125I]Tyh11 S-14 (艾莫生公司Amersham)所需濃度（IC50)。 將經放射性標記的SRIF與垂體細胞混合，加入測試化合 物，培養該混合物且測定並與控制組比較放射活性。放射 活性降低則表示該測試化合物成功的競爭性結合至該垂體 細胞受器。置換50%來自垂體細胞受器之SRIF所需測試化 合物毫微莫耳濃度單位之濃度，經計算後記錄爲表II中的 IC5。値。抑制常數&亦經計算。愈低的1(：5〇及氏値顯示其拮 抗劑活性愈強。 擬作草案： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 所有放射性配體結合分析均是在96-槽微量培養盤中利用 含有蛋白酶抑制劑（5 pg/mL抗纖維蛋白溶酶肽，5 pg/mL抗 蛋白酶肽，100 pg/mL桿菌素，及100 pg/mL爷脒）之結合緩 衝液（50 mM HEPES，pH 7.4, 5 mM MgCl2, 0.25% BSA)。在本 項評估中，利用[125I] TyrnS-14 (艾莫生公司），因爲[125I] S-28在過濾分析中顯示非常高度的非專一性結合（>75%)。所 有組成分經以含蛋白酶抑制劑之結合缓衝液稀釋後，以下 述順序加至微量培養盤的槽内·· 20 μί結合緩衝液（不含競 爭物的槽）或20 μΐ未經放射線標記的S-14或競爭物（1 X 1(Τ 12Μ 至 1 X 10·5Μ 終濃度），然後是 10 μί [125I] TyrnS-14 _-21 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509575 A7 B7 五、發明説明（19 ) (150,000 cpm於2000 Ci/毫莫耳，250 pM終濃度）。藉由加入 2-60pg，體積170 pL之膜蛋白開始該結合反應。終反應體 積爲200 μΐ/槽。所有培養均是於室溫下進行2小時。利用 艾恩特（Inotech)細胞收集器，藉快速濾過玻璃纖維濾紙（ΙΗ-201-HA)分離自由的放射性配體與經結合的配體。然後以 冷的（4 °C )不含BSA及蛋白酶抑制劑之結合緩衝液沖洗濾 紙數次，然後置於LKB伽瑪主要計數器器數放射量（78%效 率）。利用預先浸泡於0.3%聚乙亞胺之Whatman GFC濾紙 (以減少背景干擾）。 利用眾人所熟知並另藉由參考文獻併入此處，由Y. Cheng與 W· H· Prusoff，化學藥理學 21，3099-3108 (1973)所述之 方法計算IC5Q値及値。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消f合作社印¾ _-22- 本纸张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509575 A7 B7 五、發明説明（20 4-N〇2phe 办丨 N02pnre 办 ~N〇2 —a— p^fD D-Nal(2) L丨Nal(2) 办丨 Morophe ' 4 丨M02§e 4 'N022le ie-4-N02phe tNOtophe 4 *IPhe Ac^- IPhe 4 丨 M02 PD-O) 办-N〇2 PD^O) L-Nal(2) Ac-4 — N02phe Ac-Nal(2) 4 丨 Noiophe

Hyr Hyr Hyr Tyr Hyr* Tyr Tyr Hyr Tyr 闩yr Tyr Hyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr I」ys Lys Lys Lycn Lys Lys Lys 〇rn Lys Lys Lycn LyLO Lys Lym Lycn Lys Lys >r;g AA Val Val viljl V卬一 vtljl Hhr Ser V卬一 V卬一 Atru Hhr Thr V卬一 Thr Hhr ΊΠ1Γ Tllr Th r 1- N(CH3)Ala Tyr Hyr Tyr Hyl: Hyr Nal(2) Tyr Tyr Hyr Tyr D-Hyr Nal(2) D-Tyr Hyl: D-Hyr Tyr Tyr aam 55 29 39 2 5 3 10 113 6 办 0.6 6 7 3 〇.VD 〇.7 1 57

II AA「D ί Cy s 丨 AAfot D-Hrp-AAUJ-AA^-c^-s-AALn 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 25.00 2 1 办 5〇 2 1 〇 2 3 1 0 0 〇 22 33 办办 • 22 67 78 26 80 10 50 办〇 30 办8 12 · 89 17 · 33 0.89 scnHn2 •p -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509575 五、發明説明（21 ) iiii 狀 AMP 堆^^ 利用環狀庸堆積分㈣定生長激素釋放㈣因子受器 對效應物之功能性偶聯作用。所有五種經克隆的生長激素 釋放抑制因子受器均抑制環狀AMp堆積及腺菩酸環化作用 (cydone)活性。本項評估利用腎上結合蛋白之方法自完整 細胞測定環狀AMP堆積㈣。生長激素釋放抑制因子之信 唬轉導作用係藉由降低胞内C-AMp水平。本項功能性分 歼，測定測試化合物抑制生表激素釋放抑制因子對受 forskalin刺激後之c-AMP水平的能力。 製備腎上結合蛋白 根據Brown等人6的方法略加修改後製備牛的腎上腺萃取 物。故自Pel Freez購置牛的腎上腺並置於乾冰上運輸。廿 四個％上腺經解滚後在冰上分離皮層：切成小塊；再懸 洋於1.5倍體積之緩衝液，其中該緩衝液含〇 25 μ蔗糖，5〇 mM參-Hcl pH 7.4，25 mM KC1，5 mM MgCl2及蛋白酶抑制劑 (5 pg/ml抗纖維蛋白溶酶肽，5 με/ιη1抗蛋白酶肽，1〇〇叫/㈤ 桿菌素’及100 pg/ml苯脉）；以電動均質器（p〇lytron)均質並 離心5分鐘。保留所得上清液並離心丨5分鐘。保留所得上 清液並以1 mL爲倍率貯於-80°C。通常四個腎上腺足以製備 30-50個1 mL的倍率。在用於以上實驗之前，每一製備均經 以不同稀釋度之標準品測試。 製備測定環狀AMP堆積之細胞 以與二萜烯forskalin (5 μΜ)共同培養的完整細胞測定經生 _______ -24- ____ _ 卜紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉Α4規格（210X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

509575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（22 ) 長激素釋放抑制因子調節的環狀AMP堆積作用，其中二萜 烯forskalin可直接活化腺苷酸·環化酶並刺激環狀AMP在細胞 中堆積。由二個100 mm細胞培養盤中吸出培養基，並在每 一般中加入含2 mM EDTA之經磷酸緩衝的鹽水。將細胞洗 下培養盤、勿刮下。然後沈澱細胞並再懸浮於含2 mM CaCl2(新鮮力口入）之克里布司倫耳（Kreb’s Ringers)騎酸溶液 (KRP)，沖洗一次後再懸浮於含100 μΜ IBMX的力口 CaCl2 KRP 2 ml。開始進行分析前，算細胞並調整細胞濃度爲 50,000/70 μΐ並培養於室溫下15分鐘。 環狀AMP之產生 標記（測試樣品、包括控制組均重覆三次）聚伸丙基管（12 X 75)。製備之測試樣品包括以下··不加肽樣品（基礎的）， 只加forskalin( 1〇 μΜ終濃度），及forskalin加各種劑量S-14 ( 1 X 1(T1QM至1 X 10·6Μ，終濃度）。前二步驟係於實驗枱上進 行。以KRP調整體積並加10 μΐ之1 mM ΙΒΜΧ至每管中。置 管子於37°C之震盪水浴鍋中且每隔15秒加入70 μΐ細胞直到 終體積/管爲100 pL (細胞濃度爲25-100,000管）。將管子培 養於37°C，15分鐘，每隔10秒以10 μΐ之1.0 N HC1處理並移 至冰浴3分鐘（管子可隔夜貯存）。以含250 mM參溶液，pH 7.4之l·0NNaOH10μl中和樣品。 環狀AMP分析 將試管架一半埋入冰中。每管中加入50 μΐ之不同濃度環 狀AMP標準品（希格馬公司Sigma)重覆三管（e.g. 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 16·0 p莫耳/管），然後加70 μΐ KRP至每管標準 ___~ 25 -_ 本紙張尺度適中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 509575 經濟部中央標李局員工消f合作社印製 A7 B7 五、發明説明（23 ) 品中。安置一組含220 μΐ的管子測定背景値用。加5〇 μΐ之 10 ηΜ [3Η]環狀AMP(艾莫生公司）至所有管子中（標準品及 測試樣品）。加100 μΐ腎上結合蛋白（經以冰冷的20 mM ΚΉ2Ρ〇4 pH 6.0溶液以1:15稀釋）至測定背景値之夕卜的管子 中。每管在冰上培養120分鐘，經以100 μ1木炭/bsa溶液（90 mg BSA，180 mg Norit Α，30 ml 20 mM ΚΗ2Ρ〇4 pH 6.0)處理，並 經渦動10秒以冷凍離心機在4 °C以2000Xg離心3分鐘）。將 上清液移至含5 ml艾克辛劑（Ecoscint)之閃爍計數瓶中並以 液體閃爍計數光譜分析法定量i。經以c-AMP標準品濃度 沿\軸及由每一濃度所生成之log cpm沿y軸繪出產生的標準 西線°各別測試樣品的結果可由每次實驗期間產生的標準 西線計算出°數據的數値以pmoles/ΙΟ6細胞表示。 利用此項數據計算並計錄每一測試樣品之實際活性％ (%IA)於表III。星形記號，*，表示未進行該項測試。 下列參考文獻另藉由參考文獻併入此處。 1 K. Yasuda, S. Rens-Damiano, C. D. Breder, S. F. Law, C. B. Saper，T· Reisine and G· I· Bell, J· Biol· Chem.(生物化學期刊） 267, 20422-20428 (1992). 2 J. F. Bruno, Y. Xu, J. Song and M. Berelowitz, Proc. 3 A. M. O'Carrol, S. J. Lolait, M. Konig and L. Mahan, Mol. Pharmacol. 42, 939-946 (1992). 4 J. R. Hadcock, J. Strnad and C. M. Eppler, Mol. Pharmacol. 45, 410-416 (1994). 5 J. Strnad, C. M. Eppler, M. Corbett and J. R. Hadcock, Biochem. ____ -26-__ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

509575 A7 B7 五、發明説明（24 )

Biophys. Res. Commun. 191· 968-976 (1993). 6 B. L. Brown, J. D. M. Albano, R. P. Ekins and A. M. Sgherzi, Biochem. J. 121，561-562 (1971). 7 E. M. Ross,治療學之藥理學基礎，8th Ed., Chapt. 2, Pergamon Press (1990). (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -27- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 509575 A7 B7 五、發明説明（25 )

IM-L--— . 公丨s:〇2phe Li^s 4丨M〇2phe Tyr Lys 办丨M〇2-D-phe Hyr Lys D-Nal(2) Tyr Lys L—Nal(2) Tyr Lys 办丨M〇2phe Tyr Lys 办丨 M〇2phe Tyr L^s 4：丨N〇2phe 〇rrn NMCD-办 i!z;〇2phe Hyr Lys -4 丨2;〇2phe Tyr Lycn 4-IPhe Tyr Lys Actlphe Tyr Lys 4丨N〇2phe Tyr Lys 4-N〇2phe Tyr Lys I」丨Nal{2) - Tyr T-yi3 AC-4IN02phe Tyr Lys >C-Nal(2) 「iYr=:/二 厶--N〇2 Pile N, ArT^—I

AA |^丨 _Al>i 丨 Vail Vail vCLJl V卬一 V卬一 TThr Ser Val Val Abu Hhr Thr νειΐ Hhr Thr Tlir Thr Till' 2(CH3) Ala Tyr Tyr Hyr Hyr Tyr Nal(2) Tyr Tyr Tyr Tyr D-Tvr Nal(2) D-Tyr 「ryr D 丨 Hyl: Ty'r Ty r

III AA「D-cys-AA2 trp-AA「AA「Cys-AA「NH2 經濟部中央標隼局M工消費合作社印製 丨26 SSTH % IA 29 11 p 8 13 5 7 5f 9 21 丨12 •k 00 12 2 -28- 衣纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1. 509575 A8* B8 C8 D8 第86102594號專利申請案 申請專利範圍修正本(89年1月） •申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1. 一種降低生長激素釋放抑制因子作用的方法，其中包 括使生長.激素釋放抑制因子受器位置與有效量的如下 式式I肽接觸， Ri AAj-D-Cys-AA2~D~T rp-AA3· AA4~Cys-ΑΑ5·ΝΗ2 R2 ⑴ 其中 RAR2分另丨J 為 Η，（^-(：8烷基，COR或 COOR; 八八丨為式II芳香系α-胺基酸之D或L異構物 CH 厂 Ar C =〇 (ID 其中X代表一個鍵且Ar代表選自下列的部分 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 V -σ ·

   V Y

   N, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509575 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 其中η為0，1，2或3且各取代基Y分別代表N02，CN， Cl，Br，I，F，COR3，COOR3或 OR3基團； AA2為式II芳香系α-胺基酸之D或L異構物，其中X為 Η，Ar及η如上述定義，且各取代基Y分別代表 N02，CN，Cl，Br，I，F，COR4，COOR4或 OR4基 團； AA3為Arg，Lys，Orn或Cit之D或L異構物； AA4 為 Val，Leu，lie，Ablx，Nle，Thr，3-R5-Ser， Thr(Bzl)或Ser(Bzl)，附帶條件是：當AA4為Thr時， 則AAi必需為L異構物； AA5為式II芳香系α-胺基酸之D或L異構物，其中X為 Η，Ar*及η如上述定義，且各取代基Υ分別代表 N02，CN，Cl，Br，I，F，COR6，COOR6或 OR6基 團。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) N(CH3)Ala，N(R7)-oc-胺基酸，Thr 或 Ser，附帶條件 是：該肽之環狀部分的D-胺基酸殘基數目需為偶 數； R為CrC8烷基，苯基（CrC4)烷基，莕基或莕基（CrC4)烷 基； R2，R3，R4，R6及R7分別為Η或CrCs烷基；且 R5為Η，Ci-Cg烷基，或式II芳香系α-胺基酸之D或L異 構物，其中X為Η，Ar且η如上述定義，且各取代 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 509575 8 8 8 8 ABCD 六、申請專利範圍 基 Y 分別代表 N02，CN，Cl，Br，I，F，COR6 或 or6基團；或‘ 其在製藥學上可接受的鹽類。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中AAi為4-N02Phe ° 3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中AA5為Tyr*或 N(CH3)Ala。 4·根據申請專利範®第1項之方法，其中AA4為Val或 Abu 〇 ’ 5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中AA2為Tyr且AA3 為 Lys 〇 6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該肽為： 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-N(CH3)Ala-NH2。 7. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該肽為： 4_N〇2Phe-D_Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Tyr_NH2。 8. —種式la之肽： 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp_Lys-Val-Cys-N(CH3)Ala-NH2 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (la) 9. 一種式lb之肽： 4-N02Phe-D_Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Tyr-NH2 0 (lb) 10. —種增加哺乳動物體内釋放生長激素的組合物，其中 包括有效量之如申請專利範圍第1項中定義的式I肽。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印¾ '申請專利範圍 根據申5青專利範圍第10項之組合物，其中該肤為： 4-N〇2Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-N(CH3)Ala-NH2 或 4-N〇2Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys_Abu-Cys-Tyr-NH2。 2·根據申凊專利範圍第10項的組合物，其中該有效量為 約2X10·6毫克/公斤至1〇〇毫克/公斤。 13. 種增加哺乳動物體内釋放胰島素的組合物，其中包 括為其投與有效量之如申請專利範圍第1項中定義的式 I月大。 - 14·根據申請專利範圍第13項之組合物，其中該肽為： 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-N(CH3)Ala-NH2 或 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Tyr-NH2。 15·根據申請專利範圍第13項之組合物，其中該有效量為 約2X10·6毫克/公斤至1〇 〇毫克/公斤。 16· —種增加哺乳動物體内釋放胰增血糖素的組合物，其 中包括有效量之如申請專利範圍第i項中定義的式j 肽。 · 17.根據申請專利範圍第16項之組合物，其中該肽為： 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-N(CH3)Ala-NH2 或 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Tyr-NH2。 18·根據申請專利範圍第16項之組合物，其中該有效量為 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I Γ 509575 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 約2Χ1(Γ6毫克/公斤至10.0毫克/公斤。 19. 一種促進哺乳動物生長的組合物，其中包括有效量之 如申請專利範圍第1項中定義的式I肽。 20. 根據申請專利範圍第19項之組合物，其中該肽為： 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-N(CH3)Ala-NH2 或 4-N02Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys_Abu-Cys-Tyr-NH2。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）