TW496898B - A process for introducing nucleic acid/polycation complexes into mammalian cells and medium for transfection of mammalia cells - Google Patents

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Μ濟部中央標準局員工消費合作社印製 496898 A7 ________B7 _ 五、發明説明（彳） 本發明是有關將核酸引入較高等真核細胞的方法。 特別是在基因治療的領域中，需要一種將核酸引入活細 胞的有效系統。該系統係將基因鎖入細胞内，使在活體中 合成具有治療效果的基因產物。 標準的轉染方法特別使用磷酸鈣，陽性脂質或脂質體 (liposome);然而曾有人提出以甘油或二甲亞颯（di-methylsulphoxide)使滲透作用猝變（Osmotic Shock) 來處理細胞’可促進其中某些方法的轉染效果（Cheil and Okayama，1 9 8 8; Parker and Stark，1 9 7 9; 0 k a d a and Rechsteiner， 1982) o 在基因治療領域中，目前最先進的核酸應用技術是利用 逆轉錄病毒系統（retroviral system)，將基因轉移至細 胞内（Wilson et al·，1990; Kasid et al·，1990)。 轉移基因的另一策略是根據細胞轉運大分子的機制。此 策略之貫例係藉受體調節的（r e c e p t 〇 r - m e d i a t e d )細胞 攝粒作用（endocytosis)將基因引入細胞（如，Wu and Wu，1 9 8 7; Wagner et al.，1 9 9 0，及 EP-A 1 0 3 8 8 7 5 8 )° 冒經有人提出一種使用能夠釋放出内胞體（endosome) 内容物的成分，例如腺病毒或能產生融合作用的 (fusogenic)肽，可改進以DNA /聚陽離子複合物藉受體 引導的細胞攝粒作用所進行的基因轉移。使用破壞内胞體 的（endosomiltic)成分可避免内化於細胞内的DNA複合 體被溶酶體分解因而可增進基因轉移的效果（Curiel et -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） ' ' --------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

496898 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) al·，1991; Curiel et al., 1 992 a; Zatloukal et al.5 1 9 9 2; Cotten et al·，1 9 92; Wagner et al·，1 9 92; Curiel et al.，1992b; Wo 93/07283)。曾有人特別 挺出藉由結合聚賴胺酸而修飾腺病毒。該腺病毒-聚賴胺 故接合物可同時與DNA及鐵傳遞蛋白（transferrin) -聚 賴胺酸接合物複合而生成三元的鐵傳遞蛋白-聚賴胺酸/腺 病毒-聚賴胺酸/DNA複合物（Wagner et al.，1 9 92)。 該複合物可結合至鐵傳遞蛋白與靶細胞（target ceu)上 的腺病毒受體。在細胞攝粒作用後，腺病毒打破内胞體。 使内胞體中的物質釋放到細胞質中。此技術比傳統的病毒 技術更可靠（Cotton et al.，1992)。 本發明的目的是提供一種將與聚陽離子複合的核酸引入 細胞内之方法，其進一步改進該方法之簡便性及其信賴 度。 該目標藉由將核酸/聚陽離子複合物引入較高等真核細 胞的方法達成，其中該複合物在乙二醇，甘油及視情況加 入氯奎（Chloroquine)及/或Bafilomycin及/或低碳的 醇類（如，乙醇）存在下被安置於細胞上。 不同於甘油或二甲亞颯之處理方法，建議用磷酸飼沉澱 或DEA-葡聚糖方法’係如後處理（after-treatment)後 引入轉染成分，以引起所欲的滲透性猝變；在本發明方法 中’整個轉染過程’均有多元鮮存在培養液中。多元醇便 利做為一轉染培養液成分。在本發明範圍内，由實驗結果 可假定多元醇無滲透活性，但引起另外的機制。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

496898 A7 B7 五、發明説明（3 ) 甘油及/或乙二醇的最合宜濃度取決於各種因素，特別 是細胞類型。這可由滴定實驗測定。在本發明範圍内，這 一類的滴定結果顯示’約1 〇到1 5 % ;特別為1 〇到1 3 % (以 轉染培養液為止），證實較適宜。 核酸/聚陽離子複合物在技藝界中係已知；就其組合物 來看，複合物成分在製造上之定性、定量要求及複合物之 製作，可參考W0 9 3 / 072 8 3 : DNA和RNA分子；特別 是有治療活性的核酸分子，依其特有的應用加以定義；不 受限於其序列；有關分子大小，可用於很廣的範圍。適合 的聚陽離子包括同系的（homologous)有機聚陽離子，如 聚類胺酸，聚精胺酸，聚烏胺酸，或異系的 (heterologous)，含有二或二種以上不同正價胺基酸之 聚陽離子。這些聚陽離子可含有不同鏈長，且非肽（^on-pep t i d i c ) 合成之 聚陽離 子’例 如聚乙 二亞胺 。所 用該聚 陽離子亦可為球狀的聚陽離子，已知為”星爆狀樹突體

Starburst dendrimeres^Haensler and Sz〇ka 1 9 9 3 )。具有聚陽離子性的天然dn a結合蛋白，例如組 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 糖，和聚乙二醇。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

織蛋白或魚精蛋白或其類似物（anal〇gus)或其片斷而精 胺或亞精胺亦合適。聚陽離子可視情況加以修飾，例如^ 親脂性基，如與天然脂質相似的烴基，（如脂肪酸，膽固 醇）修飾，因而增進該複合物與細胞膜的親合性。另—可 能的㈣方法是用可促進該複合物對乾細胞之專一性的親 水性基。此類基團之實例包括糖，如乳糖，麥芽糖，半乳 私紙張尺度適用中國國家標準W ) A4規格㈤心在 496898 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作、社印裳 發明説明（4) 在本發明範圍内’最好用聚賴胺酸為聚陽離子。 若有需要，聚陽離子或其部分可與靶細胞的内化因子接 合。術語，’内化因子，’係關配體或其片冑，結合至細胞好 、細胞攝粒作用，特別是藉受體引導的細胞攝粒作用，將彼 等内化至細胞中’或者意為，該因子之結合/内化是由於 與細胞膜元素（element)的融合作用所致。合適的内化因 子見述於w〇 9 3 /0 72 8 3。當接受轉染的細胞類型表現 (express)出能夠内化良好的受體（即有受體有活性），則 使用配體特別有利。 在本發明範圍内，較合宜的内化因子是鐵傳遞蛋白。 使用内化因子的必要性或合宜性的問題，可用對照性試 驗來解答。在對照試驗中，可觀察是否在其它條件完全相 同的情況下，一内化因子的存在，可增進及以何種程度增 進基因之表現。 較適宜的方法是，首先將DNA結合部分的聚陽離子（及/ 或聚陽離子-内化因子接合物），由此可造成某種βΝΑ預 濃縮（Pre-condensation)，然後加入大部分的聚陽離子 及/或内化因子/聚陽離子接合物（如，鐵傳遞蛋白/聚賴胺 酸）。 較適宜的方式是，超量使用聚陽離子（如，聚賴胺酸）， 或永陽離子與内化因子的接合物（如，鐵傳遞蛋白_聚賴胺 酸），或其混合物，如此可使DNA複合物帶正電性。在本 發明範圍内進行實驗顯示，約2 5 %莫耳過量的聚賴胺酸過 量可致良好結果。 ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ 據本發明的方法’特別有料應用在初級細胞，如， 纖維母細胞。 根據本發明的另一觀點是有關製備細胞之方法，該細胞 由-安定轉染DNA分子表現異系多肽。接著細胞之轉 染，係在甘油及/或乙二醇存在下，以一具有異系多肤編 碼（coding)的DNA分子與聚陽離子（該聚陽離子全部或 部分與内化因子接合）所成的複合物，培養該細胞，選出 安疋之細胞純系（cell clones)，並由此建立細胞系（“Η line)。 安定之細胞純系的選擇和細胞系的建立，可用傳統方法 進行。這類方法可在相關的手冊中查到（例如，Cuuent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et (Ed.)? Vol.l9 Supplement 14 1987 9.5)〇 可考慮的應用，例如用在對真核細胞之轉染，以生產重 組多肽或生產腫瘤疫苗。 由腫瘤細胞所得來的細胞系，其可由一整合基因 (integrated gene)表現具免疫刺激性的多肽（immun〇_ stimulant polypeptide)，例如，細胞素（cyt〇kine)& /或一或多種腫瘤抗原’適合用於腫瘤疫苗。 根據另一觀點’本發明係關轉染的培養基，含有具有活 性的核酸複合物成分，視情況全部或部分與内化因子接合 的聚陽離子，及甘油及/或乙二醇。除轉染的成分外，該 培養基含一般營養素及適合不同細胞類型之添加物，例如 -8 - 本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-! -i I- I I -1 m 496898 A7 B7 五、發明説明（ 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 商業上可取得的細胞培養基。 在本發明範圍内，本發明在各種細胞系，在初級細胞及 在製備安定地表現異系多肽的細胞純系上的應用，均有實 範。 圖示摘述 圖1 ·對人類黑色素瘤（m e 1 a η 〇 m a)細胞做轉染之甘油滴 定。 在甘油存在下，以各種基因轉移複合物對初級黑色 素瘤細胞做轉染之效果的調查。 在甘油存在下’以蟲勞光素酶（luciferase)追踪才| 為貝體（r e p 〇 r t e r p 1 a s m i d )，對初級人類纖維与 細胞做轉染。 在甘油存在下以！ L - 2 (白細胞介素-2 )編碼質體， 對初級人類纖維母細胞做轉染。 在甘油存在下，對細胞系Ν I Η 3 Τ 3和一黑色素瘤 細胞系做轉染。 在1 5 %甘油存在下，對A 5 4 9 -細胞做轉染。 在不同量甘油存在下，對A 549_細胞做轉染。 在甘油存在下，對H e L a -細胞和B N L C L · 2 -細觸 做轉染。 圖9 ’在甘油或蘇糖醇（t h r e丨t 〇丨）存在下，對初級人類黑 色素瘤細胞做轉染。 圖10 ·在甘油或乙二醇存在下，對初級黑色素瘤細胞或觸 維母細胞做轉染。 圖2 圖3 圖4 圖5 圖6 圖7 圖8 -------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ‘線 -9- 496898 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 圖11 :在各種多元醇或D E A E -葡聚糖存在下，對初級纖 維母細胞做轉染。 圖12 :黑色素瘤細胞之純種系的製備。 實例之具體實施例係描敘本發明；除非另外陳述，否則 均使用以下材料和方法（在一些實例中，聚賴胺酸以抗生 蛋白鏈菌素化（Streptavidinylated)聚賴胺酸取代；與 未加修飾的聚賴胺酸相較，此不同未明顯影響基因表現的 效果）：

i)質體-D N A 質體pCMVL構建如WO 93/07283所述，質體 pGShIL2-fet的構建如 WO 94/21808 所述。 質體 p R S V n e 〇 見述於 G 〇 r m a η，1 9 8 5。 1 i)鐵傳遞蛋白-聚賴胺酸-接合物 該方法依Wagner et al.，1991之描述，用於合成鏈長 290的聚賴胺酸基團（TfpL 290)或250賴胺酸基團 (TfpL 2 5 0 )與鐵傳遞蛋白之接合物。 iii)抗生蛋白鏈菌素（Streptavidin) -聚賴胺酸-接合物 (StpL) 該接合物是以W Ο 9 3 / 0 7 2 8 3描述之方法，以聚賴胺酸 2 5 0製備。 i v ) 人類黑色素瘤細胞Η 2 2 5 初級人類黑色素瘤細胞是由外科手術切除黑色素瘤而得 來。將該腫瘤置於含有5 % FCS，2毫莫耳濃度（mM)麩醯 胺酸及抗生素之RPMI 1 6 40培養液中，以鑷子及外科手 -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -- - - -- - I - - - H-1-— m 1- i HI ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 496898 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) 術刀切成碎片。以針筒的栓塞（P 1 u n g e r )將該組織碎片小 心迫使通過一金屬濾網。然後以離心後再懸浮的方式清洗 濾出的材料數次。釋出的細胞植於T - 2 5培瓶（fl as k )中， 對每一培養槽（w e 11)中的1 〇 〇，〇 〇 〇個細胞做轉染。 ν)人類纖維母細胞 手術切除之皮膚生體物置於4 °C，含1 0 % F C S，2毫莫 弄濃度（mM)麩醯胺酸及健大黴素（gentamycine)之 D Μ E Μ中。將該生體物很小心的以鑷子及手術刀，在一 層流裝置中，於無菌之6公分塑膠皿》((1丨311)中切碎。然後 加入含20 % FCS，2毫莫耳濃度麩醯胺酸及抗生素的 D Μ Ε Μ 3毫升。將其置於3 7 °C的保溫培養箱中。十天後 更換培養液為含1 〇%FC S的DMEM。然後，每週更換培 養液兩次。在開始培養的4週後，將由組織碎片長出的細 胞胰蛋白酶化，然後植於新的培養皿中，用來進行轉染。 此外尚有另一較適宜的方法，包含在切碎皮膚組織後， 將該碎片換到新鮮的培養液中，且視需要洗1或2次。將5 至10片組織碎片均勻分佈在表面，用含1〇 % FCS之 D Μ Ε Μ溼潤過的T 2 5 -培養瓶，然後迴轉該培養瓶。如此 可使生體物倒吊（hang down)[「垂掛配置」（"hanging drop configuration”）；此法為 Jones，1989 所述]° 經1至3小時於保溫培養箱後，再次設定該瓶的位置 (locate the flask)，且注入1至2毫升培養液。24小時 之後’對任何固定的生體物加培養液至5毫升；否則重覆 此方法。6至1 〇天後，第一批纖維母細胞由組織長出，自 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21QX297公董） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

線 496898 A7 _______B7 五、發明説明（9 ) 此時起，每週更換一次培養液。一旦細胞連合將其移至 T75Kflask)。 v i)細胞系 以下細胞系由 ATCC :NIH 3T3 (ATCC CRL 1658)， A5 4 9 (ATCC CCL 185)及 TIB 73(ATCC BNL CL.2) 獲得。 vii) 蟲螢光素酶-分析 細胞淬取物的製備，蛋白質含量的標準化，及蟲螢光素 酶活性測定，是依據W 0 9 3 / 0 7 2 8 3所述進行。 v i i i )間白素-2 -分析 間白素-2(IL-2)的表現’是以其在細胞上澄液中的含 量，用商業上可取得的ELISA測定（Bender MedSystems，Vienna) ° 實例1 人類黑色素瘤細胞轉染之甘油滴定 〇·4微克（eg)抗生蛋白鏈菌素·修飾的聚賴胺酸稀釋於 75微升（/zl)HBS中，與在75微升HBS中的3微克 pCMVL —起保溫30分鐘。然後加入在75微升HBS中的3 微克鐵傳遞蛋白-聚賴胺酸（TfpL 290)，然後繼續保溫 3 0分鐘。在加入如圖1所示之特定量甘油後，再加入7 〇 〇 微升培養液（RPMI 1640，2mM L -麩醯胺酸，ImM丙酮 酸鈉）。整個混合液滴加到細胞上4小時後，將該轉染培養 液在抽吸（s u c t i 〇 η )裝置下濾出，然後將細胞與不含轉染 -12- 本紙张尺度適用中國國家標準（CMS ) Α4規格（210X297公缝)" (請先閲讀背面之注意事 項再填· 裝-- :寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 496898 五、發明説明（1〇) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 10- 成分的新鮮培養液混合。2 4小時後，以標準程序收成細 胞並測定蟲螢光素酶活性該轉染的結果示於圖丨（依據 Bradford所測定的細胞溶胞產物（lysate)之蛋白質本量 亦.示於圖1 )。蟲螢光素酶的活性隨培養液中甘油的濃度辦 加而增加’直到甘油丨辰度為1 0 %。當甘油含量為1 5 %時， 觀察到的表現度下降。 實例2 在甘油存在下，不同之基因轉移複合物，對初級黑色素瘤 細胞的轉染之效果觀察。 在75微升HBS中的0·4微升StpL或PL 300與在75微升 HBS中的3微克pCMVL —起保溫30分鐘，然後加入3微 克TfpL 290或PL於75微升HBS，接著繼續保溫30分 鐘。DNA/PL及DNA/TfpL-複合物可由混合其成分於7 5 微升中，經保溫30分鐘來製備。正電性的 DNA/TfpL/PL-複合物藉著保溫3微克DNA及1.5微克 T f p L 2 9 0 3 0分鐘，然後加入3微克P L來製備。在加入 甘油及培養液後，將該複合物放在初級黑色素瘤細胞上 (定名為Η 2 2 5 )，4小時後更換培養液為新鮮培養液。2 4 小時後，收細胞並測定蟲螢光素酶活性。該轉染之結果示 於圖2 :在百分之1〇甘油存在下，除一例外，其餘轉染之 表現，均明顯高於沒有甘油者（在此實例及以下實例中， 甘油濃度均依據總體積）。 實例3 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

496898 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____ B7五、發明説明（Ή) 在甘油存在下對初級人類纖維母細胞所做的轉染 a) 以蟲營光素酶追踩標兹、質體之轉染 在75微升HBS中0.4微克PL或StpL與在75微升HBS中 3微克pCMVL —起培育30分鐘。然後加入75微升HBS中 3微克TfpL 290或2微克PL，繼續培育30分鐘。於加入 1 3 %甘油至複合物後，置該轉染培養液於細胞（每培養槽 含4 5，0 0 0個細胞）4小時。2 4小時後收成細胞並測定蟲螢 光素酶活性。轉染結果示於圖3。 b) 以IL-2編碼質體做轉染 在75微升HBS中0.9微克聚賴胺酸與在75微升HBS中6 微克pCMVL —起培育30分鐘。然後加入75微升HBS中 TfpL 250。再繼續培育30分鐘。於加入培養基及1〇到 1 5 %甘油後，置該轉染複合物於細胞上（每6公分培養皿中 含2 0 0，0 0 〇個細胞）。4小時後更換培養基，之後每日更 換。依E L I S A商品製造商的說明書指示測定I L - 2的表現 以上澄液中的含量。該轉染之結果示於圖4 ;較深色的長 條圖代表1 5 %甘油存在時的表現，而較淡色的長條圖代表 1 0 %甘油存在時的表現。 實例4 在甘油存在下對細胞系之轉染 a) N 1 Η 3 T 3 -細胞 一種黑色素瘤細胞的細胞 轉染複合物如前述實例，由3微克P C Μ V L，3微克 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ' (請先閱讀背面之注意事 項再填· 裝-- :寫本頁) 、π

線 496898 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（12) T f p L及0.4微克S t p L製備。在加入7 5微升甘油後’加 D Μ E Μ -培養液至總體積1毫升。將該轉染培養液加到含 50,000 個1^1113丁3細胞系（八丁（：(：€111 1658)細胞或 由一黑色素瘤細胞得來的經高數目世代（p a s s a § e s )培養 出的細胞系細胞之培養槽（w e 11)中。4小時後’在該轉染 培養液中加入如前實例中所述之新鮮培養液’轉染之結果 示於圖5。 b )肺癌細胞（1 u n g c a n c e r c e 11 s )細胞系 A 5 4 9 i) 在1 5 %甘油存在下之轉染 轉染複合物是由1.5微克pCMVL和如圖6所示之特定里 的T fp L 2 5 0，如前實例所述的方法製備。在加入培養液 (D Μ E Μ / 1 0 % F C S )及甘油（終濃度1 5 % )後，置該複合物 於含1 0 0，0 0 0個細胞之槽中（使用6槽培養皿）。4小時後 更換培養液。2 4小時後測定蟲勞光素酶活性。結果示於 圖6 〇 ii) 不同量甘油存在下之轉染 本試驗計畫與i)中所述相同。轉染複合物是由1.5微克 pCMVL和1.5微克TfpL 250製備。在加入培養液及不同 量的甘油後（濃度如圖7所示），細胞以i)所述之方法處理 並測定蟲螢光素酶活性（圖7 )。 c ) H e L A -細胞 B N L C L · 2 -細胞 轉染複合物由1.5微克pCMVL和1.5微克TfpL 290如 前實例中所述製備。對H e L a -細胞之轉染，使用D Μ E Μ -15- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝 、1Τ

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 496898 Α7 Β7 五 、發明説明（13) 培養液及1〇%甘油。而對BNL CL2-細胞之轉染，則使 用冋葡萄糖之D Μ E Μ及1 5 %甘油。4小時後於此混合液中 增補新鮮培養液。24小時後測定蟲螢光素酶活性；結果 不於圖8。 實例5 在甘油或蘇糖醇存在下，對人類黑色素瘤細胞的轉染 本實例所使用之轉染複合物製備如實例2。於轉染前， 在培養液中加入丨〇 %甘油或2 〇 %蘇糖醇（5 〇 % )。轉染是 對每1 0 0，0 〇 〇個細胞，如實例2所述進行。 在一類似的實驗中，於細胞與轉染複合物一起保溫培養 4小時後，以抽吸裝置濾出該複合物，然後在1 $分鐘内 2 0 %甘油在細胞上，以使滲透作用猝變。然後甘油亦以抽 吸裝置濾出。轉染結果示於圖9 ;在轉染時使用蘇糖醇， 明顯的比用甘油所得之表現要差。本實驗亦發現，以甘油 引起滲透作用猝變的處理方式，明顯的不如在整個轉染過 程中有甘油存在β 實例6 在甘油或乙二醇存在下，對初級黑色素瘤細胞或纖維母細 胞之轉染 轉染複合物之製備如前實例所述。將丨〇 %甘油或乙二醇 加入培養液後，才將其加於細胞上。每個轉染使用 1 0 0，0 0 0個黑色素瘤細胞或5 〇，〇 〇 〇個纖維母細胞。轉染 -16 - ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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496898 A7 B7 五 、發明説明（14) 結果示於圖1 0 ··在對纖維母細胞的實驗中，若複合物未 加入甘油或乙二醇，則全然沒有表現；在對黑色素瘤細胞 的貫驗中加入乙二醇或甘油，可致表現增加十的三次方 倍。兩種細胞類型在加入多元醇的情況下，絕對表現值 (absolute expressi〇rl vaiues)大致相同。實例7 在各種多元醇存在下，對初級纖維母細胞之轉染 本實例中’轉染複合物的製備如實例3所述。在轉染之 前，於培養液中加入1 3 %甘油，2 0 %聚乙二醇 1，000(50 %)，每毫升250微克DEAE -葡聚糖或甘露醇 (m a η n i t ο 1) 1 7 0毫莫耳濃度或2 0 %蘇糖醇（5 0 % );在沒 有任何添加物的情況下轉染一探針（p r 〇 b e )。每個轉染如 實例3所述對4 0，〇 〇 〇個細胞進行。轉染結果示於圖1 !。 結果發現，在沒有甘油或添加聚乙醇或甘露醇下，則無表 現；添加蘇糖醇只比D E A E -葡聚糖方法所得的表現結果 稍微好一些。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實例8 製備安定的純種系黑色素瘤細胞 為製備轉染複合物，首先將pGShIL-2-tet質體以 XmnI線狀化，然後與xmnz線狀化的PRSVneo質體以 10 比 1(6 微克 pGShIL2-tet / 0.6 微克 PRSVneo)混合於 100微升HBS中。然後與在100微升HBS中的7.5微克 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） '~ 496898 第84105508號專利申請案 中文説明書修正頁(86年1月） A7 B7 五、發明説明（ 15 以 10 比 1(6 微克 pGShIL2-tet / 0.6 微克 PRSVneo)混合 於100微升HBS中。然後與在1〇〇微升HBS中的7.5微克 TfpL 250 — 起在常溫下（at ambient temperature)靜 置30分鐘。將該靜置後的混合液加至培養於Rpjyjl 1640 ，1毫莫耳濃度丙酮酸鈉及1 0 %甘油之培養液中的Η 2 2 5 -細胞（每Τ 2 5 _培養瓶，含3 0 0，0 〇 〇個細胞；瓶製造商爲 Nunc)。60小時後用每愛升'含3毫克geneticin(G418， Sigma)的培養液選擇。5天後G418的濃度會降至每毫升 1毫克。將細胞移至含每毫升含1毫克G418的培養液。每 培養槽含4 0 0,00 0個細胞，[使用6-槽培養平盤（plate)] 以測定I L - 2的表現。2 4小時後，培養液以2毫升新鮮培養 液更換。再保溫培養2 4小時後，取上澄液，用e L I S A依 據製造商的説明書測定其中IL-2含量。在胰蛋白酶化之後 ’細胞數目用計數（c 〇 u n t i n g )方法測定。圖1 2所示的値 ，單位爲每2 4小時内，每1 〇 6個細胞所產生的！ L _ 2 _單位 (請先閱讀背面之注意事項 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

實例9 針對其他物質之影響及其於提升甘油基因轉移效率之能 力參數所進行之研究 在此等實驗中（其結果示於中），其針對前述實例所述 之細胞類型進行轉移感染。所用之轉移感染複合物具有下 列組成： A : 1.5 μδ DNA/0.2 μδ pL/1.25 μδ TfpL Β : 1.5 μβ DNA/1.5 μδ TfpL 496898 第84105508號專利申請案 中文説明書修正頁(86年1月） A7 B7: 4 « V修正 補充 五、發明説明（ 15c C : 1.5 pg DNA/0.2 pg pL/1 pg pL (pL 以兩批次加入） D : 1.5 pg DNA/1.2 pg pL 氯奎（Chloroquine)係以1 〇 〇 μ M之濃度使用，巴^ _灿 部羅黴 素（Bafilomycin)之濃度係 2 0 0 η Μ ’而乙醇之濃度係 。 ^ 1 %或 1 · 5 %。轉移感染培養基之總體積各爲1亳升。 此等實驗之結果示於表中。所列之表現値係指相對以複 合物Α於10%甘油存在下所測定者（==1〇〇%)之相對光^ 位。1 0 0 %相當於每1 〇 5個Η 2 2 5 -細胞 X 1 〇 7光單位 (請先閲讀背面之注意事項^^^ ，每1〇5個ΝΤΗ3Τ3-細胞1·5 X 1〇6光單位，每1〇5個 Α549-細胞1〇7光單位，或每1(^個初級人類纖維母細胞 1.2 X 106光單位。 在另一實驗中（其結果未包含於表中），其將轉移感染培 養基之體積由1毫升減至700ml，以提升複合物之、農度（甘 油濃度爲10%，而乙醇濃度爲1.5%)。此種測定造成五倍 之蟲螢光素酶表現。 本百0 裝· 訂 -線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 •18a- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496898 第84105508號專利申請案 中文説明書修正頁(86年1月） A7 B7 15b五、發明説明（） 表 細胞 複合物 甘油 相對 物質 %(v/v) 蟲螢光素酶 表現 (%) 經 濟 部 中 央 標 準 員 工 消 費 合 作 社 印 製 H225 A 0 0.7 - A 0 0.3 1%乙醇 A 0 4 氣奎 A 0 0.8 巴菲羅黴素A1 A 10 100 - A 10 200 1%乙醇 A 10 200 f 1.5%乙醇 A 10 300 氯奎 A 10 240 巴菲羅黴素A1 B 10 200 1.5%乙醇 B 10 50 - C 10 95 - D 10 70 - NIH 3T3 A 0 0 A 12.5 100 - B 0 0 - B 0 0 巴菲羅黴素A1 B 0 35 氣奎 B 12.5 200 - B 12.5 350 巴菲羅黴素A1 B 12.5 80 氣奎 C 0 0 - C 12.5 260 D 0 0，- - - D 12.5 1000 - B 10 200 - B 10 1000 巴菲羅黴素A1 -18b- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請· 先 閱 讀· 背 之 注 意 事 項 Φ 奮 裝 訂

496898 A7 __B7__五、發明説明（16 ) 氯奎（Chloroquine)係以1 〇〇# Μ之濃度使用，巴菲羅黴 素（Bafilomycin)之濃度係2 0 0 η Μ，而乙醇之濃度係1 % 或1 · 5 %。轉染培養基之總體積各為1毫升。 此等實驗之結果示於表中。所列之表現值係指相對以複 合物Α於1 0 %甘油存在下所測定者（=1 〇 0 %)之相對光單 位。100%相當於每105個^1225-細胞1.5乂107光單 位，每1 05個NTH 3T3-細胞l.5xl〇6光單位，每105 個A549-細胞1 0 7光單位，或每1 0 5個初級人類纖維母細 胞1·2 X 106光單位。 在另一實驗中（其結果未包含於表中），其將轉染培養基 之體積由1毫升減至700ml，以提升複合物之濃度（甘油濃 度為1 0 %，而乙醇濃度為1 · 5 % )。此種測定造成五倍之蟲 勞光素酶表現。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -19- 本紙張尺度適用中國國^標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

496898 A7 B7 五、發明説明（17) 表 細胞 複合物 油 甘 (v/ %( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

H225 A A A A A A A A A B B C D NIH 3T3 A A B B B B B B C C D D B B ooooooooo 1A 11 1X 1X 11 11 11 11 11 5 5 5 2.2 2 f 為 1X rix

5 2 0 0 11 11 1A 相對 蟲螢光素酶 表現 (%) 0.7 0.3 4 0.8 100 200 200 300 240 200 50 95 70 0 100 0 0 35 200 350 80 0 260 0 1000 200 1000 物質 1%乙醇 氯奎 巴菲羅黴素A1 1%乙醇 1.5%乙醇 氯奎 巴菲羅黴素A1 1.5%乙醇 巴菲羅黴素A1 氯奎 巴菲羅黴素A1 氯奎 巴菲羅黴素A1 mu am nn I— mu mu uli tm —·_ϋ m (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

*1T .^線 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐）

Claims (1)

1. 496898 第084105508號專利申請案 中文申請專利範圍修正本(91年5月) A B c D

   4 8 . 9 . 試管内或活體外將核酸/聚賴胺酸複合物引入哺 乳動物細胞的方法，其特徵為在乙二醇及/或甘油，視 需要添加氯奎（Chloroquine)及/或巴菲蘿黴素 (Bafilomycin)及/或如乙醇之低碳醇類，之存在下，將 該複合物施用至該細胞；其中甘油之使用濃度佔轉染 培養基總體積約為10到約15%。 根據申請專利範圍第1項之方法，其特徵為該聚賴胺酸 全部或部分與細胞之内化因子接合。 根據申請專利範圍第1項之方法，其特徵為該内化因子 為鐵傳遞蛋白。 根據申請專利範圍第2項之方法，其特徵為該聚賴胺酸 及/或内化因子/聚賴胺酸接合物超量使用使DNA-聚賴 胺酸複合物帶正電性。 根據申請專利範圍第2項之方法，其特徵為該DNA先與 部分量任意接合的聚賴胺酸混合，然後才加入大部分 的聚賴胺酸及/或内化因子/聚賴胺酸接合物。 根據申請專利範圍第1項之方法，其特徵為甘油的使用 濃度佔轉染培養基總體積約10到約13%。 根據申請專利範圍第1項之方法，其特徵為使用初級細 胞當作該細胞。 根據申請專利範圍第7項之方法，其特徵為使用纖維母 細胞。 一種於試管内或活體外製備可由安定轉染的DNA分子表 O:\39\39871 -910523 DOC\ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 現異系多肽的細胞之方法，其特徵為··在甘油及/或 乙二醇，視需要添加氯奎（Chloroquine)及/或巴菲蘿黴 素（Bafil〇mycin)及/或如乙醇之低碳醇類，之存在下， 以編碼異系多肽之DNA分子及聚賴胺酸之複合物轉染哺 乳動物細胞，該細胞經培養後選出安定的純種系細 胞’其中甘油之使用濃度佔轉染培養基總體積約為1〇 到約15%。 1〇·根據申請專利範圍第9項之方法，其中聚賴胺酸為全部 或部分接合至内化因子及自所得純種細胞系建立細胞 株。 11.根據申請專利範圍第10項之方法，其特徵為該細胞係 腫瘤細胞。 12·根據申請專利範圍第9項之方法，其特徵為該異系多肽 為一免疫刺激物（stimulant)之多肽，明細言之，為一細 胞素（cytokine)。 13·根據申請專利範圍第12項之方法，其特徵為該細胞為 黑色素瘤細胞且該細胞素為間白素_ 2。 14. 一種對哺乳動物細胞做轉染的培養基；其除含必要之 營養素及傳統的添加物外，另加入核酸與視需要全部 或部分與細胞内化因子接合的聚賴胺酸所成的複合物 做為活性成份，其特徵為該培養基含乙二醇及/或甘 油；其中甘油之使用濃度佔轉染培養基總體積約為 到約15%。 O \39\3987!-9I0523 DOO 4 -2 - 496898 8 8 8 8 A BCD 六、申請專利範圍 15.根據_請專利範圍第14項之轉染培養基，其特徵為其 包含佔轉染培養液的總體積為約10到約13%的甘油。 0 \39\39871-910523 DOC\ 4 - 3 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 χ 297公釐）