TW400381B - Bidirectional promoter of the pcbAB and pcbC gene of Acremonium chrysogenum and its use - Google Patents

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專利申請案第82107776號 (民國84年8月艿日送呈)-附件二

發明説明（ 年月曰 從8. 25補充 本發明係有關i urn ghrysogenum之DcbAB輿DcbC篡固 之向姜動子及其用於Acreingniuni chrysogenum之製備外來 蛋白質與測定傳達基因之表現。 ^在眞菌中，基因表現之調控主要是在轉錄階段。一般 而έ，轉錄之調控受基因之5，端及3，端非编碼區之⑽六序 列（順式作用成分）、.编碼區内之DNA序列（順式作用成分）、. 及蛋白質(所謂之反式作用成分）之影響。此蛋白質能以序 列特異性之方法經由DNA結合部位與特殊之DNA序列互相作 用。 有趣的是，在絲狀眞菌中之啓動子DNA序列常會改變 。因此，所渭^TATA框在絲狀眞菌中，如以則印们 crassa 之NADP特異之麩胺酸去氫酶基因，能具有TATAAA 一致序 列。不過，它也可以是一富含AT之序列如Aspergi[lus 之aldA基因。還有，如A. nidulans之trDC 基因則無與TATA—致序列同質之序列存在。 在從前已發現CAAT框僅存在少數之眞菌基因中，如[ ulans.之pgK基因’同樣地它亦不存在於a. nidulans之a「gB 基因或trpC基因中。

另外，也發現特異於關連啓動子活性之序列涵蓋相當 長之距離（例如：促進子、上游活化位置及休止子）及與調 控蛋白質互相作用。在轉錄區内及外面之保留DNA序列常 是直接或反向短序列重覆片段，其功能為調控蛋白質之結 合位置》因此，已證明在溫度變化壓迫後，熱衝擊轉錄因 子會與所謂之熱衝擊基因之此型序列相結合。除了依賴DNA —3 本紙張尺度通用宁國國家榡準（CNS ) A4规格（21〇χ297公羡） ---------11^.------ίτ------0 (請先Μ讀背面之注$項再填窝本頁) * 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 專利申請案第82107776號 (民國84年8月艿日送呈)-附件二

發明説明（ 年月曰 從8. 25補充 本發明係有關i urn ghrysogenum之DcbAB輿DcbC篡固 之向姜動子及其用於Acreingniuni chrysogenum之製備外來 蛋白質與測定傳達基因之表現。 ^在眞菌中，基因表現之調控主要是在轉錄階段。一般 而έ，轉錄之調控受基因之5，端及3，端非编碼區之⑽六序 列（順式作用成分）、.编碼區内之DNA序列（順式作用成分）、. 及蛋白質(所謂之反式作用成分）之影響。此蛋白質能以序 列特異性之方法經由DNA結合部位與特殊之DNA序列互相作 用。 有趣的是，在絲狀眞菌中之啓動子DNA序列常會改變 。因此，所渭^TATA框在絲狀眞菌中，如以則印们 crassa 之NADP特異之麩胺酸去氫酶基因，能具有TATAAA 一致序 列。不過，它也可以是一富含AT之序列如Aspergi[lus 之aldA基因。還有，如A. nidulans之trDC 基因則無與TATA—致序列同質之序列存在。 在從前已發現CAAT框僅存在少數之眞菌基因中，如[ ulans.之pgK基因’同樣地它亦不存在於a. nidulans之a「gB 基因或trpC基因中。

另外，也發現特異於關連啓動子活性之序列涵蓋相當 長之距離（例如：促進子、上游活化位置及休止子）及與調 控蛋白質互相作用。在轉錄區内及外面之保留DNA序列常 是直接或反向短序列重覆片段，其功能為調控蛋白質之結 合位置》因此，已證明在溫度變化壓迫後，熱衝擊轉錄因 子會與所謂之熱衝擊基因之此型序列相結合。除了依賴DNA —3 本紙張尺度通用宁國國家榡準（CNS ) A4规格（21〇χ297公羡） ---------11^.------ίτ------0 (請先Μ讀背面之注$項再填窝本頁) * 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 Α7 Β7 五發明Α明（） 專利申請案第82107776號 /<r ROC Patent Appln. No.82107776 參手泰中文説明書第5、11、13、16頁及囷式一附件二 nded Pages 5, 11, 13 and 16 and drawings of the Cl fspr i "f i raf t r\n 一 Wvx^% 1 Ϊ7

Amende

Sec ificat ion — Enel. J ~~/r_ 氏羁85年6月25日迭呈) (Submitted on June 25, 1997)

Chinese 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 因此本發明進一步也關於在宿主細胞，尤其是Acremo-111迎! ^j]「ysogenuin或Aspergi丨丨us niger，中製備所要蛋白質之 方法，方法中本發明所説之啓動子是以功能性方法與一或 二個編碼蛋白質之DN A片段相連接，因此該啓動子 能調控宿主細胞中所要蛋白質之表現。為此理由，本發明 也包括含S啓動子之載體或表現載體，此等載體是僅為了. 再轉殖之目的或是與編碼蛋白質之DNA片段相結合 ;及供這些載體轉形之宿主細胞，特別是Acrern〇nium ^rysogenum^As^ei^jjjus nidulans ;將宿主細胞培養並依一 般已知之方法分離所要之蛋白質。

Acremomum 在二向啓動子控制下之基因表 現尤其更佳。為達此目的所用之載體通常含有下列因素· 一可選擇之標識基因。 -所謂之傳達基gj，其於卿生物巾之表現可被定量地 分析（此也可做為選擇性標識）。 本^所説之啓動子，將此啓動讀_如錢基因之5, 蜈而开^/成轉錄或轉譯融合型式因而可以調控基 因之表現。 一 ΐ止t或任何其他融合到基因之3,端區之腦序列，而 能決定終止轉錄。 一傳指基因產物可容易被檢蚵及定量之基因。 疋使用酵素分析’因此方法可能為簡單且快 二"、w原則上此檢測方法可用於定性及定量地測 疋。 本纸張纽適用中國國家橾準（CNS)A4i^ 21〇x297^' -------.---„i^------IT------.,i (請先閱讀背面之注意事項再i寫本頁) A6 B6 五、發明説明（2 ) 的RNA聚合酶Π外，能與明確之DNA區以序列特異地方式互 相作用之蛋白質乃稱為所謂之轉錄因子。後者參與轉錄之 調控。具有調控作用之基因產物會控制大部份絲狀眞菌基 因之表現。

Gutierrez等（1991)已發現Cephalosporium acremorium-ZLDchAR 基因是與pcbC基因經由一基因間區連在一起。 因此本發明之目的乃是要定此基因間區之序列及描述 其特徵。為達此目的，令人驚異地，現在已發現此基因間 區含一二向啓動子’此乃指該啓動子對5,及3,方向都能作 用。在此角色下，它能同時調控二個分別連接在啓動子之5, 端及3’端之基因之表現。另外也令人驚異地是二方向之起 動子活性強度是不同的。 因此本發明係關於如表二所示之DNA片段，或由其中 得到具有二向啓動子活性之部份片段，及關於在嚴厲條件 下，特別是在68°C6倍濃度之SSC緩衝液（氣化鈉—檸〜檬酸緩

衝液）下，能與如表二所示之DNA雜交，且具有二向啓動子 活性之DNA片段。 W 如表二所示之序列，本發明所説之啓動子可利用化學 方法或利用大豕已知之基因操縱方法予以製備。 本發明所説之啓動子能用於調 外來蛋白質之基因表現。此外，由於U 已經 經濟部中央標準房興工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · —裝· 訂· 發現pcbC基因之5’端區在Aspergillus illg红中也具有活性， 因此’此啓動子也能用於ιπ^中&表現外來 蛋白質。 -4 -------— 另Π 肴象 A6 ' B6 % ¢4. 8. 2¾ 五、發明説明（） 正月 8 本 90 40 65?75CSUS CCS： ^XCZZXCZSS peSXfi f70 30 xrcsAOcxcr to 10 <0at czx^zzxcz to 100 tcxgxccttc cxrrocscc: oxzmsixx 110 130 140 uo

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12fQ 一 10 尺度適用中因國家標準(CNS>甲4規格（210 X 297公釐） Α7 Β7 五發明Α明（） 專利申請案第82107776號 /<r ROC Patent Appln. No.82107776 參手泰中文説明書第5、11、13、16頁及囷式一附件二 nded Pages 5, 11, 13 and 16 and drawings of the Cl fspr i "f i raf t r\n 一 Wvx^% 1 Ϊ7

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Sec ificat ion — Enel. J ~~/r_ 氏羁85年6月25日迭呈) (Submitted on June 25, 1997)

Chinese 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 因此本發明進一步也關於在宿主細胞，尤其是Acremo-111迎! ^j]「ysogenuin或Aspergi丨丨us niger，中製備所要蛋白質之 方法，方法中本發明所説之啓動子是以功能性方法與一或 二個編碼蛋白質之DN A片段相連接，因此該啓動子 能調控宿主細胞中所要蛋白質之表現。為此理由，本發明 也包括含S啓動子之載體或表現載體，此等載體是僅為了. 再轉殖之目的或是與編碼蛋白質之DNA片段相結合 ;及供這些載體轉形之宿主細胞，特別是Acrern〇nium ^rysogenum^As^ei^jjjus nidulans ;將宿主細胞培養並依一 般已知之方法分離所要之蛋白質。

Acremomum 在二向啓動子控制下之基因表 現尤其更佳。為達此目的所用之載體通常含有下列因素· 一可選擇之標識基因。 -所謂之傳達基gj，其於卿生物巾之表現可被定量地 分析（此也可做為選擇性標識）。 本^所説之啓動子，將此啓動讀_如錢基因之5, 蜈而开^/成轉錄或轉譯融合型式因而可以調控基 因之表現。 一 ΐ止t或任何其他融合到基因之3,端區之腦序列，而 能決定終止轉錄。 一傳指基因產物可容易被檢蚵及定量之基因。 疋使用酵素分析’因此方法可能為簡單且快 二"、w原則上此檢測方法可用於定性及定量地測 疋。 本纸張纽適用中國國家橾準（CNS)A4i^ 21〇x297^' -------.---„i^------IT------.,i (請先閱讀背面之注意事項再i寫本頁) 年月Ε» A7 B7 五 經濟部中央橾準局員工消費合作杜印袈 11. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 表二：pCbAB-pcbC基因間區之臟序列。由不同股編成 <二個基因必起始密碼（被框起來者）乃相距約12千鹽基對 。基因之轉錄万向以箭頭表示。用於_定序之寡核芬酸 位置也於序列中標識。 2.用於定量基因表現之載體：pS!8 8 , p漏9及_ 之構築 ’ 載體構築之目的乃是要製備來自^ chrysogemjm之二_ 頭孢菌素c生合成墓因（pcbAB&pcbC基因）及二個傳達基因 (丨acZ及gusA基因）間區之轉錄融合體。然後利用這些轉綠 融合體來定量在棊因間區控制下之傳達基因之同時表現〆 利用我們自己構築之載體pSi8 8(圖二）當做起始载體 。該載體含二個源自大腸菌之傳達基因，分别擁有編碼 厶-D-半乳糖苷酶（MacGregor , 1987)之lacZ基因及編碼 厶-D-葡萄糖苷酸5|(Jefferson等，1986)2gusA基因 之元全開放轉譯架。該二基因能自市售質體中分離，其中 lacZ基因來自載體pSV点（丨TC生技公司，海德堡），而仙以基 因來自質體pB丨1〇1(丨TC生技公司，海德堡）^將來自質體 pB丨101之Sall/EcoR丨片段粘接到已經限制酶EcoRi/xh〇u刀割 過之質體pSV/S上。所得到之質體psi8.8之大小為8.8千鹽基 對。將該二無啓動子之傳達基因配置在載體的丨88上，並 使其轉錄方向相反。為了要確保傳達基因表说之有效終止 ’轉錄終止子乃位於這些基因之3,端（下游）。如同其終止 子 ’ gusA基因含有來自 Agrobacterium tumefaciens Ti 質體之 諾配林合成酶聚腺苷化信號之DNA序列（Bevan，1984)。如同 Λ -------^--··1 裝------、玎-------表 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明（4 )眞菌中常用之傳達基因如下表所述。表一眞菌中常用且其基因產物（酵素）催化容易檢測的反 應之傳達基因（參考Herrera-Estrella等，1988 ; Richard等，1992) 經濟部中央襟準局興工消費合作社印製 基因 基因產物受f 、 lacZ —.点 _])-半乳糖誓酶 Saccharomyces cerevisiae Aspergillus nidulsms Peniclllium chrysogemua gusA 冷-D-葡萄糖苷酸酶 Saccharomyces. caeevisiae Schizosaccaromyces porobe 1 |__U I Aspergillus W lilt».,! Mil MM. - nidulans Aspergillus niger Acremonium typhinum Uetilgomaydis Fulvia fulva cat 氯黴素乙醯轉移酶 Saccharomyces cerevisiae (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝· 訂· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 明 A7 B7 五、發明説明（11) no>^>o>OOOHOO^»>oo»»»o»o^n>oa 20 rco-rl-T —3· 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 {•'——^ceA <---pcbC |>cbA8 l> , 12V3 1221 uo T>A CAT A>soa>CJG>oc>000f+eacag-trtt afto·I u©0 σ·οIKS>ca\occcct99ot«lCL>o000 >-. i OM—---> 搀鳒 PSRM9.9 CGAAA^AJQCCTOCTAAAOCAAAAAAaAACSTCACC ATdTcaTTT —u* TAACAT AAGGGACTGACCA OOP caecae-t caoogoc^oc 丨 11©0 bp b gecaaac°°t:ca0GG°AT -l^czllv 14- 30 122·- jm:h ;!丨边ε"Λ Y—.— pcbA° pob°· 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐〉 雉織 PSIM9· ta：cz----V c°A>>GAnCCT,sc-,AA>GCAA>A>>eA>GTC>cc ATATecaTT —3·

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A6 五、發明説明（ 於此，本發明也進一步關於使用本發明所說之啓 ;疋量4££^韭叩chrysogenum中傳達基因之表現。 最後如圖一所示之載體pS18,8，或由此再得丑丨、 =他標識或傳達基因或終止子序狀相等變體，也= 少趣疋Acremonium chrysogenum之啓動子 〇 附圖之説明： 。圖—：PcbAB-pcbC基因區之遺傳圖譜。更精細之浐示 區乃用DNA定序分析。為此目的，乃將Sau3A限制 = 段再轉殖到載體pUC19/BamHI中。 ° 圖二：轉形載體之構築 a) 於二頭孢菌素C基因中普遍存在之丨_2千鹽基對大小DNA區 之基因圖譜。限制酶切割位置乃用BamHI，Bglll，Nc〇I及SalI 等酵素來製圖。得自載體pIpSBl之BamHI/NcoI片段含pcbAB 及PcbC基因之5’端非編碼序列。箭頭表示二個啓動子之轉 錄方向之相反方位。Bamj{丨/Nco丨及nc〇i/Nc〇丨片段之夫小以鹽 基對表示。 b) 轉形載體PSI8.8，pSIM9.9及pSRM9.9之遣傳圖譜。傳達基 因丨acZ及guSA及安匹西林耐性基因之轉錄方向以長箭頭表 示。短箭頭表示於定序中當做引物之寡核苷酸之位置及定 序方向。 縮寫表.

Abbreviations： B, BamHI; Bg# Bglll； E^EcoRI； H, Hindlll N, Notl; Nc# Ncol； P, PstI； S, Sail；/Sc, SacI; Sm, Smal；

Sn, SnaBI; X, Xbal; Anp%安匹西林耐性基因 ； 一 7 一 (請先Η讀背面之注意事項再！m本頁) i裝· 訂· 緩濟部中央鏢率房典工消费合作社印$ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 五 年月.曰、，明.备.補充發明説明（14) A7 B7 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 -紙 本 控，乃構荣一不同傳達基因之轉錄融合體。這些融合體之 好處乃在於可平行地測定由傳達基因所编碼合成酵素之 活性。因此’可定量在Pc_及pcbC啓動子控制下之傳達基 因之表現彳j用載HpS· 9及p·9 9同時分析二相反轉錄 方向之頭孢菌素C生合成基因之表現信號。尤其是，這二 個次級代謝基B)是否以不同之強度進行表現，也就是説， 在L 中PcbAB及pcbC基因之啓動子強度是否有定 量上之差異存在。· 、根據南方氏雜交之結果選擇共同轉形株以供基因表現-之分，。利用定糞分析法檢測各個轉形株。所有共同轉形 株及1菌有相同之撥酵條件及2 5天之培養期。利用敏感 之螢光測足法測定原生質體溶菌液中之酵素活性。使用mug_ Z(4_甲基繳形酮基半乳糖苷）為基質來測定万_d_半乳糖苷 酶活性，此酵素會將該基質分解成螢光產物刖(4甲基饊形 酮在37°C1小時後測定蛋白抽出物中之反應產物。召_D_ 萄糖苷酸酶活性則使用刖G_A(4_甲基繳形酮基葡萄糖誓 酸）為基質，此會被酵素分解成螢光產物刖。在37t：反應4 小時後測定蛋白抽出物中之反應產物量。刖也用於校正螢 光比色計之濃度標準液。利用Bradford(1976)法測定抽出液 中之總蛋白質濃度。 * 定量分析之結果示如表五。 表五：chixsogenmn之不同共同轉形株蛋白抽出液之 酵素比活性。々-D-半乳糖苷酶及;？ _D_葡萄糖苷酸酶之比 活性以MU毫微莫耳數/蛋白質毫克數X小時數（3>rc)(三重 16： 適用中國囷家橾率（CNS > A4規格（210X297公釐）

請 先 閲 背 之 注 項 再 fi 寫 本 頁 装 訂 泉 五、發明説明（ A6 B6 «濟部t央標準局Λ工消費合作社印製 gusA，指令生合成々_D_葡萄糖苷酸酶之基因；lacZ，指令 生合成石-D-半乳糖苷酶之基因；N〇Ster，諾配林（nopaline) 合成酶聚腺苷化信號；pcbc，指令生合成異音黴素-N合成 酶；SVpoly ’ SV40聚腺苷化信號；寡核苷酸^.381(與gusA基 因互補）；寡核苷酸Ν〇·454(與lacZ基因互補）。 正在證明優先權，編號P4309071.0之德國申請案之内 容也包含於本專利申請之揭示内容中。 以下之實例乃更詳細地説明本發明。 實例： 1 · pcbAB-pcbC基因間區之分離與DM定序 Acremonium chrysogenum之pcbAB及 pr.bC某因之排列示如圖 一。箭頭表示基因轉錄之方向。由此可明顯看出二個基因 是由不同之DNA股编成。圖一中也強調了二個起始密碼間 區域，並將其再移殖以製備供DNA定序。DNA定序乃按照已 知分子生物學方法，利用所謂之引物來進行。該等引物乃 由我們自己分別合成，在後面將更詳細説明。所定出之DNA 序列乃以單股狀態示如表一。該序列分別由pcbAB及pcbc 基因之起始密碼所終止。二個基因是由不同之DMA股所編 成，因此轉錄之方向也彼此反向排列。二個起始密碼侧間 有長度為1231個核苷酸之序列，其在基因表現時並不會轉 澤。該基因是來自 Acremonium chryspRenum H780株（Kiick等， 1989) 〇 方法：DNA定序 —8

(定閲讀背面之注意事3填寫本頁) -裝. 訂. 線. A6 B6 五、發明説明（） 7 質體DNA乃以二脱氧鏈終止法（Sanger等，1977)利用T7 聚合酶定序套組（法碼西亞精密化學品公司’亞甫塞拉， 瑞典）.。利用（a-35S)dATP按照廠商之指示方法進行定序。 按照Biggin等（1983)之方法，將樣品於具有緩衝能力之梯度 膠質中電泳分劃。除了可購買到之M13引物外’乃利用下 述我們自己合成之寡核誓酸當做起始分子（與引物同義）供 DNA之定序·· 寡核苷酸No_316(5’-AGGCCAATGCATGCATCC); 寡核苷酸仙.448(5,4'0人01'(^4<^04八6(：1'(：); 寡核苷酸No,225(5,-AAAGGGATATTCAAGTATTCG)。 各個寡核苷酸之位置乃示於表二之序列中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. 訂. .綾 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -------— 另Π 肴象 A6 ' B6 % ¢4. 8. 2¾ 五、發明説明（） 正月 8 本 90 40 65?75CSUS CCS： ^XCZZXCZSS peSXfi f70 30 xrcsAOcxcr to 10 <0at czx^zzxcz to 100 tcxgxccttc cxrrocscc: oxzmsixx 110 130 140 uo

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12fQ 一 10 尺度適用中因國家標準(CNS>甲4規格（210 X 297公釐） 年月Ε» A7 B7 五 經濟部中央橾準局員工消費合作杜印袈 11. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 表二：pCbAB-pcbC基因間區之臟序列。由不同股編成 <二個基因必起始密碼（被框起來者）乃相距約12千鹽基對 。基因之轉錄万向以箭頭表示。用於_定序之寡核芬酸 位置也於序列中標識。 2.用於定量基因表現之載體：pS!8 8 , p漏9及_ 之構築 ’ 載體構築之目的乃是要製備來自^ chrysogemjm之二_ 頭孢菌素c生合成墓因（pcbAB&pcbC基因）及二個傳達基因 (丨acZ及gusA基因）間區之轉錄融合體。然後利用這些轉綠 融合體來定量在棊因間區控制下之傳達基因之同時表現〆 利用我們自己構築之載體pSi8 8(圖二）當做起始载體 。該載體含二個源自大腸菌之傳達基因，分别擁有編碼 厶-D-半乳糖苷酶（MacGregor , 1987)之lacZ基因及編碼 厶-D-葡萄糖苷酸5|(Jefferson等，1986)2gusA基因 之元全開放轉譯架。該二基因能自市售質體中分離，其中 lacZ基因來自載體pSV点（丨TC生技公司，海德堡），而仙以基 因來自質體pB丨1〇1(丨TC生技公司，海德堡）^將來自質體 pB丨101之Sall/EcoR丨片段粘接到已經限制酶EcoRi/xh〇u刀割 過之質體pSV/S上。所得到之質體psi8.8之大小為8.8千鹽基 對。將該二無啓動子之傳達基因配置在載體的丨88上，並 使其轉錄方向相反。為了要確保傳達基因表说之有效終止 ’轉錄終止子乃位於這些基因之3,端（下游）。如同其終止 子 ’ gusA基因含有來自 Agrobacterium tumefaciens Ti 質體之 諾配林合成酶聚腺苷化信號之DNA序列（Bevan，1984)。如同 Λ -------^--··1 裝------、玎-------表 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明（ 其終止序列，UcZ基因有來自SV40病毒之聚腺苷化信號 (McGregor ， 1987)。 質體pIPNSBl含L chrysogenum基因體DNA々3 R千鹽签童子 之BamHI片段（Walz，1992)，將此轉殖到載體puc 9上BamH丨獨 特之切割位置（Yanish-Perron等’ 1985)。用綠豆核酸酶處理 後，可將如圖2a所示之BamHI/NcoI片段自限制酶部份分解之 載體pIPNSBl中分離，將其以傳達基因之二可能方位轉殖到 已用Smal切割（表三）之載體pSI8.8中。所得到之重組質體命 名為PSRM9.9及pSIM9.9。此二載體乃用於根據二不同傳達基 因之表現來檢測pcbAB-pcbC基因間區之啓動子功能。利用 限制酶分析及DNA定序來確證載體中轉錄融合體之正確性 裝· 經濟部中央標準房典工消費合作社印# -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 明 A7 B7 五、發明説明（11) no>^>o>OOOHOO^»>oo»»»o»o^n>oa 20 rco-rl-T —3· 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 {•'——^ceA <---pcbC |>cbA8 l> , 12V3 1221 uo T>A CAT A>soa>CJG>oc>000f+eacag-trtt afto·I u©0 σ·οIKS>ca\occcct99ot«lCL>o000 >-. i OM—---> 搀鳒 PSRM9.9 CGAAA^AJQCCTOCTAAAOCAAAAAAaAACSTCACC ATdTcaTTT —u* TAACAT AAGGGACTGACCA OOP caecae-t caoogoc^oc 丨 11©0 bp b gecaaac°°t:ca0GG°AT -l^czllv 14- 30 122·- jm:h ;!丨边ε"Λ Y—.— pcbA° pob°· 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐〉 雉織 PSIM9· ta：cz----V c°A>>GAnCCT,sc-,AA>GCAA>A>>eA>GTC>cc ATATecaTT —3·

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A6 B6 五、發明説明（） 12 表三：載體PSI8.8，pSIM9.9及PSRM9.9中轉變區之〇NA序 列。起始載體PSI8.8之腦序列乃示於多重轉殖位置（MCS)及 傳達基因之ATG起始密碼之區域。小字母表示來自I chrysogenum之DNA序列。所.標示之核每酸位置乃對應於表一 之序列。表中所示為pcbAB及pcbC基因之5,端非編碼區與轉 形載體PSIM9.9及pSRM9.9中傳達基因丨acZ及gusA之轉錄融合 體區之核苷酸序列。 3丄 chrysogenum輿截體 pS丨M9 Q、PSRM9.9及載體 pMWl之 共同轉形 按照德國專利申請案No.P 43 04 312.7所述之方法進衧1 chrysogenum之共同棘涨。依照此方法，將原生質體化之眞 菌細胞在聚乙二醇及氣化轉之存在下與DNA —起作用。共 同轉形時’使用等量欲轉形之DNA，每次每一載體使用20微 克。要分離k gjirysogenum原生皙體Bf，使用2-2.5天之培養 ’因此菌齡之菌絲能得到最高收率之可再生原生質體。^ ^irysogenum共同轉形之結果如表四所示。 表四之數値乃四次獨立實驗結果之平均値。表中也指 出標準偏差。由此結果可知，在亡chr爾麵中，所使用 之轉形載體與轉形率及相對轉形效率間沒有差異。依定性 分析結果而得之共同轉形率平均為76%。依對黑格落黴素 B(hygr〇ray,Cin B)之耐性來鑑定轉形株。利用DM雜交方法進 一步更詳細地分析轉形株DNA。此適當之方法乃示於德國 專利申清案Ng· p 43 04 312.7中。在臟雜交中使用_基 因為探針。目此，騎並衫讀細細序列。利用此_ (請先閲讀背面之注意事项再填寫本頁) —裝· 訂· 經濟部中央樣竿马霣工消费合作社印製 14- A6 B6 五、發明説明（） 13 探針’能於自動放射顯像上檢測出所有轉形株之7 6%具有 陽性信號。這些轉形株乃再使用於以後之分析上。 表四：kghry.ygemjin與載體pSIM9.9 ' pSRM9.9及載體pMWl 之共同轉形。表中列出再生率，轉形率（單位為轉形株數/ 微克DNA) ’轉形效率（相對轉形效率，單位為轉形株數/微 克DNAX 108原生質體數）及共同轉形率。 &體_再生率_‘形率’· 相·轉形效率 共同轉形率 (請先閲面之注意事項再f*-頁) pMWl 0.25 % 0.42

0.17xl〇-J 77 % 丨裝· + (± 0.04) (± 0.09) pSIM9.9 pMWl (± 0.04xl0'3) (* 7) 訂 0.25 % 0.41 0.18x10·， 75 % + (±0.04) (± 0.09) (± 0.05x10°) (± 6) pSRM9 - 9 經濟部中央標準局員工消費合作社印轚 4_pcbAB-pcbC基因間區啓動子活性之測定：使用傳達基 因之召-D-半乳糖苷酶及々—D-葡萄糖苷酸酶之定 量分析 為了要探討L ί]ΐΙΙ§Μβι中pcbAB及pcbC基因表現之調 15- 五 年月.曰、，明.备.補充發明説明（14) A7 B7 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 -紙 本 控，乃構荣一不同傳達基因之轉錄融合體。這些融合體之 好處乃在於可平行地測定由傳達基因所编碼合成酵素之 活性。因此’可定量在Pc_及pcbC啓動子控制下之傳達基 因之表現彳j用載HpS· 9及p·9 9同時分析二相反轉錄 方向之頭孢菌素C生合成基因之表現信號。尤其是，這二 個次級代謝基B)是否以不同之強度進行表現，也就是説， 在L 中PcbAB及pcbC基因之啓動子強度是否有定 量上之差異存在。· 、根據南方氏雜交之結果選擇共同轉形株以供基因表現-之分，。利用定糞分析法檢測各個轉形株。所有共同轉形 株及1菌有相同之撥酵條件及2 5天之培養期。利用敏感 之螢光測足法測定原生質體溶菌液中之酵素活性。使用mug_ Z(4_甲基繳形酮基半乳糖苷）為基質來測定万_d_半乳糖苷 酶活性，此酵素會將該基質分解成螢光產物刖(4甲基饊形 酮在37°C1小時後測定蛋白抽出物中之反應產物。召_D_ 萄糖苷酸酶活性則使用刖G_A(4_甲基繳形酮基葡萄糖誓 酸）為基質，此會被酵素分解成螢光產物刖。在37t：反應4 小時後測定蛋白抽出物中之反應產物量。刖也用於校正螢 光比色計之濃度標準液。利用Bradford(1976)法測定抽出液 中之總蛋白質濃度。 * 定量分析之結果示如表五。 表五：chixsogenmn之不同共同轉形株蛋白抽出液之 酵素比活性。々-D-半乳糖苷酶及;？ _D_葡萄糖苷酸酶之比 活性以MU毫微莫耳數/蛋白質毫克數X小時數（3>rc)(三重 16： 適用中國囷家橾率（CNS > A4規格（210X297公釐）

請 先 閲 背 之 注 項 再 fi 寫 本 頁 装 訂 泉 A6 B6 五、發明説明（ 15 覆測定）。表中亦指出標準偏差 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央#準房R工消費合作社印髮 17- 本紙張尺度適用中國困家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公釐〉 五、發明説明（ 16 轉綠融合 載體 共同轉形株 pcbAB-lacZ (PSRM9.S) pcbC-ls-cZ (pSIM9.9) TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 Til TI2 TI3 TI4 TX5 TI6 T工7 ΤΙ8 A6 B6 -酵素比活性(Ml)毫微菓耳數/蛋白質毫克數_χ小時數] 汐-D-半乳糖誓酶 b) C) 99 (± 15) 68 (± 18) 112 (± 9) 63 (± 11) 87 (± 8) 100 (±11) 85 (± 8) 76 (±· 9) 356 (± 23) 492 (± 11) 521 (± 22) 298 (± 6) 387 (± 8) 493 (± 21) 329 (± 17) 425 (± 6) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝· 經濟部中央櫺準曷R工消費合作社印製 18. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 五、發明説明（ 17 轉錄融合 載體 共同轉形株 pcbAB-grusA (PSIM9.9) pcbC-gusA (pSRM9.9) 〆

A 酵素比活性a)(MU毫微菓耳數/蛋白質毫克鞞x小時數） 召-D-半乳糖苷酶 泠-D-葡萄糖钻酸酶 (請先閲讀背面之注意事項再堉寫本頁) b) C) TI1 26 <± 9) TI2 0 TI3 31 (± 11) TI4 X4 «± 5) TI5 5 (± 3) TI6 28 (± 3) TI7 23 (± 6) TI8 25 (± 8) TR1 148 (± 21) TR2 130 (± 6) TR3 115 (± 10) TR4 132 (± 9) TR5 80 <± 14) TR6 128 (± 13) TR7 113 (± 8) TR8 102 (± 1) 丨裝- ,17, 4· 經濟部中央標準局8工消費合作杜印製 19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉甲4規格（210 X 297公釐） A6 B6 五、發明説明（） 18 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫衣頁> a) jS-D-半乳糖苷酶及沒-D-葡萄糖苷酸酶之背景活性（ 指在負控制下MUG-Z及MUG-A之自然斷裂及受菌k chrysogenum ATCC 14553原本即有之酵素活性）乃自所得到之測定値中扣 除。 b) 受菌原本即有之-D-半乳糖苷酶活性為1〇.2(±4)。 得自 pcbC-lacZ(pSIM 9.9)及PcbAB-lacZ(pSRM 9.9)轉錄融合之 lacZ傳達基因之表現乃以yS -D-半乳糖苷酶之比活性來表示 〇 C) /3 -D-葡萄糖苷酸酶活性為0.06(±0.01)毫微莫耳MU/ 毫克蛋白質X小時。得自pcbAB-gusA(pSIM 9·9)及pcbC-兒1^〇31^9.9)轉錄融合之81^傳達基因之表現乃以冷-0-葡 萄糖苷酸酶之比活性來表示。 經濟部中央標準扃典工消费合作社印製 L· chrysogenum之其同韓形株很明顯地二個傳逵基因都 會表現。傳達基因之表現是受基因間區之控制。相反地， 受菌在定量分析時展現輕微地原本即有之石-D-葡萄糖苷 酸酶活性及一定程度之々-D-半乳糖苷酶活性。定量分析 結果顯示基因間區以原始pcbC基因方向比以原始pcbAB基因 宅身產生稍微多量之表現。所以，很明顯地，與所使用之 傳達基因無關，由基因間區以原始pcbC基因方向所誘出之 泠-D-半乳糖苷酶活性約為共同轉形株中由基因間區以原 始pcbAB基因方向所誘出酵素活性之5-6倍。接著知道基因 間區為二向啓動子，令人驚異地，此二向啓動子於原始pcbC 基因方向時比其他方向約活潑5-6倍。 方法：傳達基因表現之定量 -20- 本紙張A度適用中國國家標準（CNS>甲4規格（21〇 X 297公:^ ) 嫌濟部中央搮事在貝工消费合作社印$ A6 B6 五、發明説明（） 19 蛋白質抽出物之製備 於含100¾升CCM之500毫升三角瓶中接入5天菌齡之A 生rysogegiLm(共同轉形株）菌絲，培養2.5天後進行原生g 體化。利用顯微鏡觀察控制追蹤原生質體化之情形，將原 生質體經含玻璃棉漏斗與菌絲分離，在每分鐘3〇〇〇轉下離 心5分鐘，每次均用1〇毫升原生質體緩衝液沖洗四次，再 離心，懸浮於2毫升原生質體緩衝液中（原生質體緩衝液：1〇 毫莫耳三經甲基氨基甲烷鹽酸鹽，10毫莫耳硫酸鎂，}莫 耳氣化鉀，pH 7.0)。將原生質體懸浮液平均分配於二衣品 豆夫微量離心管中（lacZ樣品及gUSA樣品）。 , 利用Jefierson(1987)及Murray等（1992)之方法再進—步 修改之方法，將gusA樣品中之原生質體溶解。將gusA樣品 之原生質體懸洋液，在每分鐘3000轉下離心5分鐘，將沈 澱物再溶於1毫升之gusA抽出鍰衝液（GEB)(50毫莫耳磷酸二 氫鈉，ρΗ7·0，10毫莫耳乙二胺四乙酸，0.1%三通χ_1〇〇，〇 1% 月桂醯肌氨酸鈉，10毫莫耳/5-巯乙醇）中。 利用Miller(1972)法再進一步修改之方法來溶解丨acZ樣 品中之原生質體。將lacZ樣品之原生質體懸浮液離心後， 將沈澱物溶於1毫升之jacZ緩衝液（ZB)(25毫莫耳三幾甲基 氨基甲烷鹽酸鹽，pH 7.5，125毫莫耳氣化鈉，2毫莫耳氣 化鎂，12毫莫耳/5-疏基乙醇）中。利用超音波振盪處理使 溶菌作用更為完全。超音波振盪（50瓦特下5秒鐘)打破原生 質體，以顯微鏡觀察檢視。將二樣品置於冰上直到進行酵 素活性之測定，或將其於液態氮中凍結後儲存於-70 °C中 —21 — (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 丨裝. 訂- 本紙張尺度適用中國圉家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）

五、發明説明（） 20 。於進行螢光測定前，將樣品離心5分鐘，自上澄液中取 擬測定之抽出液。 gusA基因表現之螢光測定 gusA基因之表現乃依Jefferson法之修改法，利用螢光 法予以測定。對每一測試樣品（三重覆測定），添加250微升 gusA測試緩衝液（GAB)(2毫莫耳4-甲基繳形酮基A3 D-葡萄糖 誓酸（MUG-A)於GEB中）’ 200微升GEB，及50微升gusA樣品上澄 液之抽出液於一衣品豆夫微量離心管中。以含250微升GAB ’ 200微升GEB，及50微升蒸餾水之試驗當做基質分解之控 制試驗（三重覆測定）。在時間(；為〇及在37〇c反應一段時間 後之另一選擇時間點（如t=4小時），分別自測試樣品及基質 刀解控制試驗中各取50微升加入1.95毫升之gusA終止缓衝 液（G0B)(0.2莫耳碳酸納’ pH 1〇·4)中。由於冷_])_葡萄糖芬 酸酶之作用，分解基質4-甲基繳形酮基石_D_葡萄糖苷酸 (MUG-A)，而致分解物4-甲基繳形酮（腿）之增加，可利用一 已經校正過之螢光比色計予以測定。利用螢光比色計測定· 時激發光波長365毫微米帶寬3毫微米，發射光波長455毫 微米帶寬10毫微米。 1 a c Z基因表現之螢光測定 丨acZ基因表現之螢光測定乃依Miner法（19?2)之修改法 進行。對每一測試樣品（三重覆測定），添加25〇微升丨ad測 4緩衝液（ZAB)(2毫莫耳4—甲基繳形嗣基石_D—半乳糖苷（腿 Z)於ZB中）’ 200微升ZB，及50微升比cZ樣品上澄液之抽出液 於-衣品豆夫微量離心管中。以含25〇微升ΖΑβ，微升烈 一 22 — ▲峨用中國困家標準(CNS> "規^ A6 B6 五、發明説明（） 21 ，及50微升蒸餾水之試驗當做基質分解之控制試驗（三重 覆測定）。在時間t為0及在37。(：反應一段時間後之另一選擇 時間點（如t=l小時），分別自測試樣品及基質分解控制試驗 中各取50微升，於冰上冷卻下加入50微升蒸餾水及50微升25% 三氯醋酸以終止反應。在每分鐘12000轉下離心2分鐘後， 取50微升上澄液加入1 ·95毫升之lacZ終止緩衝液（Ζ0Β)(133毫 莫耳甘胺酸’ 83毫莫耳碳酸鈉，PH 10.7)。由於召-D-半乳 糖苷酶之作用，分解基質4-甲基繳形酮基/5 -D-半乳糖苷 (MUG-Z) ’而致分解物4-甲基繳形酮（MU)之增加，可利用一 已經校正過之螢光比色計予以測定。 總蛋白質濃度之測定 gusA及lacZ樣品中所含之總蛋白質濃度乃利用Bradford 法（1976)測定。自每一測試樣品取5微升到95微升蒸餾水中（ 三重覆測定）。於加入1毫升5倍稀釋之布拉福（Bradford)儲 存液（0.325% Serva Blau G，0.675%之85¾強度磷酸），立刻 利用一已經校正過之光度比色計（吉而福公司製品）測定波 長595毫微米下之消光。 (請先閲讀背面之注意事项再f本頁) .裝. 訂· 經濟部中央揉準扃典工消费合作社印繫 一 23 — 各纸張K度適用中國國家標竿（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） A6 B6 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 22 參考文獻

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Walz M (1992) Molecular analyses in relation to the expression of /3-lactam genes in Acresicnium chryeogenmn· Bibliotheca. Mycologica# J Cramer, Gebruder Borntrager Verlagsbuchhandlung, (Borntrager Brothers Publishing Company), Berlin and Stuttgart, Volume 147 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝_ 訂·

Claims (1)

1. A7 B7 C7 _D7 六、申請專利範園 經濟部中央镖準曷員工消费合作社印t 定序一覽表 一般資料： 申請者：Hoechst AG 65926 Frankfurt am Main 電話：（069 ) 305-603 1 電傳：（ 069 ) 357175 發明名稱·· Acremonium chrysogenum之pcbAB與pcbC基因之二向 啓動子及其用途 序列數：7 電腦謂序規格· 介質型態：3.5吋高密度磁片 電腦：386 SX 操作系統：MS-DOS 軟體：ASCII 第1號序列資料： 序列特徵： 長度：18鹽基對 型式：核苷酸 股性：單 幾何型態：線性 原始來源： 生物：Acremonium chrysogenum 直接來源：合成 -27 — (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂· -線. 泞；*1珀伞闲阈犮棵準（CNS)甲4规樁（210 X 297公螫） 經濟部中央標率曷R工消费合作社印製 A7 B7 C7 _D7 六、申請專利範園 樣式：基因間區 第 1 號序列描述：AGGCCAATGC ATGCATCC 第2號序列資料： 序列特徵： 長度：18鹽基對 型式：核苷酸 股性：單 幾何型態：線性 原始來源： 生物：Acremonium chrysogenum 直接來源：合成 樣式：基因間區 第2號序列描述：AACAGTCTA CGAAGCTC 第3號序列資料： 序列特徵： 長度：21鹽基對 型式：核苷酸 股性：單 幾何型態：線性 原始來源： 生物二 Acremonium chrysogenum 直接來源：合成 樣式：基因間區 第3號序列描述：AAAGGGATAT TCAAGTATTC G -28- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 •線· 太紙银尺疳确用中阈因京櫺準（CNS)甲4規株<210 X 297公驁〉 A7 B7 C7 _D7 六、申請專利範圍 第4號序列資料： 序列特徵： 長度：1 237鹽基對 型式：核苷酸 股性：單 幾何型態：線性 原始來源： 生物：Acremonium chrysogenum 直接來源：基因體 樣式.基因間區 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝- 訂· •線. 經濟部中央螵準曷員工消费合作社印製 -29- 太斛?备疋垮滴玥令岡闻突樣準（CNS>甲4規格（210 X 297公犛） A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 10 20 30 40 50 60 CACG6ACC6S ATCCAGaGT CAG66GCT6C 6GCTGCGAA6 CCGHGCGGT 60AT66CACC 第4號序列描述： 70 80 90 100 110 120 TTTTGSGATA TCAGAGCnC CAnGCGCCT GATGTGGTAA Τ6ΠΑ6ΑδΑΤ AGCTCCCAAC 130 140 150 160 170 180 T6C6CTTTCC AGAGGCT6T6 AA6ACATACC TGTGGTATGA CGAGGC6TC6 TC6GCACCT6 190 200 210 220 230 240 TAAGGATAGT CATGTTGATA TCAAAGSTGT ATGATA6ACT 6GCAGTCCAC TACT6ACT6A 250 260 270 260 29C 300 6TGTGACCGA 6TCCAA6GAG AAATATTTCC 6CCA6TTCn TnC6CACTC TAC6GCCGAT 3X0 320 330 340 350 360 ATTTCCCAAC ACGTCSCTAG ATCTCCCAGC ACGAACGTC了 TATACTCCTS SG6AATCCCS 370 380 390 400 410 420 GACCmGAT ACA6SCCAAT GCAT6CATCC AGCT6GCCAC CCACCCAGAC CA6TSAACTC 430 440 450 460 470 480 CAAAGCCSGC ACCGAACCCA CCAG6ACC6C CTTT6TC6CC ATGGATACCC TTTCTCTCCT 490 500 510 520 530 540 CGGCCAA6CG CGATGGCCCG CGTCHGCAG AAAGCTGGGC AGGCTTCA6A AGTG6GCCAC 550 560 570 SQO SSO 600 GCTGCAGGTC GGTCCCTCGT CTGCGAGm AAAGTGCAAC 6TGAACCAAA 6CCACCCCST 610 620 630 640 650 660 AT5TGT6GTT CCATTG5GTT 6A6AAACTGG ATTGTACGGG GTACCTCTAC CXCGASnCC 670 680 690 700 710 720 TCGTCGATCG GGTACAH3AT ACATTGTACA CCGTA6TAGC AGTGT6TACG 6CCCATCGCC 730 740 750 760 770 780 GTGSTGGCCC GCAGCAGCGC 6A6ATTCCGA C6GAC6CC6T CGACTACC6G T6A6CCGCTC 790 800 810 820 830 840 6ACGGGGCGT CGA6TTGCC6 GGCCAATCCC TGAGCHCGA TAGACTSHC CGGGCCTCAT 650 660 670 S80 890 S00 GGSTGGCSGC GTCTACATGC ACATGCATST AACGGCGTTC CTCATCGCTT 6GCCCCSCCA ; 910 920 930 940 950 960 TGCAGTCTTC A6G6ACCAAA CTCCATCGCC SCTGCTGGAC C6TAT6TAAC CCCCCTC6GC 970 980 990 1000 1010 1020 AGT6TCACCC 6CA6GAGCC6 6ATAATCGA6 ACCnGSTCA 6GCCATAAAS 6C6CSTCGT6 1030 1040 1050 1060 1070 1080 eGGAAGCTCA 了ATCGTATAS CAACGGGAGA CACGAGGTAG 6TACTCAAGT ACACATACAC 裝------.玎------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫衣頁) · 經濟部中央镖率爲HR工消费合作社印Ϊ 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ACACCCAGCC 6CCCGTATAA ACAGCTTCAA 6AG6GGCGAA TACTT6AATA TCCCTTTGGT 1150 1160* # Π70 1180 1190 1200 C6CTCTTCTG AHHCGAGG CHCTCCnC CGCCATCGTC ACTCAC6CAT ATCTCGTCH 1210 1220 1230 1240 12S0 1260 TCACATCT7A CACCAG6CA6 GACAAACC6T CACCATS —30 — W Ψ 4 «Μ- (9A0 V 9.^7 ) A7 B7 C7 D7 六、申請專利範团 經濟部中夹镎攀局R工消費合作社印髮 第5號序列資料： 序列特徵： 長度：76鹽基對 型式：核苷酸 股性：單 幾何型態：線性 原始來源： 生物：Acremonium chrysogenum 直接來源：基因體 樣式：載體pS丨8.8中交叉區之DNA序列 第5號序列描述： TAACATAAGG GACTGACCAC CCGGG.........CCCGGGATCG AAAGAGCCTG CTAAAGCAAA AAAGAAGTCA CCATGTCGTT T 第6號序列資料： 序列特徵： 長度：100鹽基對 型式：核苷酸 股性：單 幾何型態：線性 原始來源： 生物：Acremonium chrysogenum 直接來源：基因體 樣式：載體pS丨8.8中交叉區之DNA序列 第6號序列描述： -31 - (請先閲讀背面之注意項再蟻寫本頁) 衣紙張尺度適用中國國家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 4Q0381 Α7 Β7 C7 D7 申請專利範園 TAACATAAGG GACTGACCAC CCCAGCAGTC GACAAACCGT CACGGGATCG AAAGAGCCTG AAAGAAGTCA CCATGTCGTT T 第7號序列資料： 序列特徵： 長度：69鹽基對 型式：核苷酸 股性：單 幾何型態：線性 原始來源： 生物：Acremonium chrysogenum 直接來源：基因體 樣式：載體PS18.8中交叉區之DNA序列 第7號序列描述： TAACATAAGG GACTGACCAC CCTGACGGTT ACTGCTGGGG GTCACCATGT AGGGGCTGC CTAAAGCAAA (請先ntKSB面之注意事項再ί本頁) -裝_ 訂 GCAGCCCCTG CAAAAAAGAA ATCGAAAGAG CGTTT TGTC...... CCTGCTAAAG '線. t » i L I ! 32·

   400361 Α8 Β8 C8 m 專利申請索第82107776號 D八μ备 A 1 -- ΧΤ_ 今·务 六、申請專利節囹— 補充 八w X awau nppux·节正之申^利&圍， ι^υ.οζιυ///〇 屮又本 附件 Amended Claims in Chinese - Encl.I ~~(氏國88年9月10日送呈)~~ (Submitted on September 10,1999) L_ 一種pcbAB及pcbC基因間區之DNA片段，其具有二向啟動子 活性且其核苷酸序列如下： pc\sA^ A_ 10 20 30 40 so 60 KJDSCACCGS ATCCA6CAGT CAG06GCT6C GGCT6CGAA6 CCGTTGC6GT 6GAT66CACC 70 80 90 100 110 ΠΤΤδδΰΑΤΑ TCAGA6CTTC CAtTGCGCCT 6ArGTGGTAA TGTTASAGAr AGCTCCi 120 ：CMC no M〇 ISO 160 170 180 TGCGCmCC A6AGGCT6TG AAGAaTACC TGTGGTAT6A CGAG6CGTC6 TCGGCACCTG 190 200 2i〇 ΖΖ0 230 240 TAA66ATA6T CAT6TTGATA TCAAAGCTGT ATGATAGACT 6GCAGTCCAC TACTGACTGA ISO 260 2/0 280 290 300 GTGTGACCGA GTCOUGGAG AMTATT7CC GCCAGTTCTT mCGcXCTC TACGGCCGAT 310 320 330 340 350 360 AtnCCCAAC ACGTCGCTAG ATCTCCaGC ACGAAC6TCT TATACTCCTG a6GMTCCCG 270 360 390 420 GACCTTTGAT ACIaGGCCAAT gcatgcatcc! AGCTGGCCAC CCACCCAGAC CAGTGAACTC <30 440 <S〇 460 470 480 CAAAGCCGGC ACCGAACCCA CCA6GACCGC CmGTCGCC AT6GATACCC TTTCTCTCCT 490 ' S00 Sl〇 520 S30 540 CGGCC^AGCG CGATGGCCC6 CGTCrTGCAG AM6CTGGGC A6GCHCAGA AGTGG6CCAC S50 560 S70 5d0 S90 600 GC了(SCAGGTC WKCCTCG了 CTGCGAGTTT AMGTTGCAAC 6TGAACCAAA GCCACCCCGT 610 620 630 640 «50 ' 660 ATGTGTGGH CaTTGGGTT GAGAAACTG6 ΑΠ6ΤΑ0666 STACCTCTAC CCCGAGHCC 870 6〇0 830 700 710 7Z0 TCGTCGATCG GGTACAT6A1T ACArTGUCA CCGTAGTA6C A6TGTGTACG GCCCATCGCC 730 740 7 SO 760 770 780 GTGGT6GCCC 6CA6CA6CGC 6A6ArTCCGA C6GAQ5CCGT CGACTACCGG TGAGCCGCTC 790 620 840 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 6ACGG(5GC6T C6A6TT6CCG 6GCCAATCCC IfeAgcnCGA TAGACTGTTt CG6GCCTCAT . · · 850 860 S70 &80 690 900 G&3TGGCGGC GTCTACATGC ACATGOUGT AACGGCGTTC CTCATCGCPT GGCCCCGCCA 910 920 930 940 250 S60 TGCAGTCTTC AGGiUCOUA CTCCATCGCC GCTGCTGGAC CGTATiiTMC CCCCCTCGGC 970 380 990 L000 1010 1020 AGTGTCACCC GCAGGAGCC6 GATAATCGAG ACCTTGGTCA GGCCATAAA6 6CGCGTCGTG 1030 1040 10S0 1060 1070 1050 GGGAAGCTCA TATCGTXTA6 CMCGGGAGA CACGA66TAG 6TACTCAAGT ACACATACAC 1090 1100 ΠΙΟ GCCCGTATAA AOGCTTCAA IU0 U30 1140 ACACCCAGCC GAGGGCtGAA TACTTGAATA TcccmfeGT L150 1160 U70 1180 U90 izoo cGcrcnrcrG AiTTTCGAGG CnCTCCTTC CGCCATCGTC ACTCACGCAT ATCTCGTCTT 1210 1220 U30 IZ<0 1Z50 1260 TCACATCTTA CACCAGGCAG GACAAACC6T CAcegTg p^bC •26· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） H82320-claim/EC(9HOEDEU) ^---------線、y (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A8B8C8D8 400381 六、申請專利範圍 2. —種重組DNA，其係具有申請專利範圍第i項之DNA片 段與二個編碼蛋白質之DNA片段；此編碼蛋白質係為gusA 及/或lacZ，其DNA片段以一轉錄調節方式連接到上述 啟動子活性DNA片段的下游。 3. —種製備載體pSRM9.9或pSIM9.9之方法，其中係將如 申請專利範圍第1項之DNA結合至一質粒載體中。 4. 一種製備表現載體之方法’其係將如申請專利範圍第2項 之DNA結合至一質粒載體中。 5. —種製備宿主細胞Acremonium chrysogenum之方法，其中 係以如申請專利範圍第3或4項之方法製得之載體將細胞 轉型。 6. —種製備由gusA及/或lacZ基因編碼之蛋白質之方法， 其係培養如申請專利範圍第5項之宿主細胞，並分離所要 蛋白質。 7. 如申請專利範圍第1項之DNA片段，其係用來調控外來 DNA 於 Acremonium chrysogenum 中之轉錄。 -------------裝.！ I---訂— — —--線 I (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) · · 度 尺 張 紙 __一本 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製