TW315367B - - Google Patents

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A6 B6 315367 五、發明説明（/ ) 本發明有關N-醯基化之十字孢黴素衍生物，即N-(四氫哌喃-4-基 氧-院醯基)-十字孢黴素衍生物、其製f;i方法及所用之中問產物、含有 這些化合物之醫藥組成物、藥物上之用途及中間產物之製備方法。 十字黴素是本發明衍生物之最基本元素，於1977年由鏈球菌屬十 字孢子(Streptomyces staurosporeus) AWAYA、TAKAHASHI 及OMURA (sp.nov. AM2282)培養物中分離所得，參看S.Omura等人於J. Antibiot. 30, 275-281 (1977)。迄今只知十字孢黴素之相對立體結構，但不知其絕對立體結 構。其絕對立體結構只有最近由N.Funato等人發表於Tetrahedron Letter's 35: 8, 1251-1254 (1994)，且相當於鏡像結構，至今在文獻上用來表示十 字孢黴素之相對立體結構。所以在Tetrahedron Letter’s上，建議"迄今 一般使用的十字孢黴素之立體化學表示法應加以修正"。雖然其絕對 組態迄今仍未知，但已由"十字孢黴素衍生物〃之命名而明確界定。 因此爲了與先前申請案比較時避免產生錯誤，原始之化學式仍使用於 本申請案中。 十字孢黴素對蛋白催化酵素C具有強烈之抑制活性，但也會同等 程度地抑制其他的蛋白催化酵素，因此對治療上之使用並沒有選擇 性。十字孢黴素之衍生物被醯基（如苯甲醯基）取代後，雖然較有選 擇性，但此Ν-醯基化之十字黴素衍生物通常都不易溶解，因此不易被 作成適當之藥物劑型。 本發明之目的在提供新穎之十字孢黴素衍生物，其能保留對蛋甶 催化酵素C(PKC)$抑制活性，特別是對傳統型cx、β-厂（3-2及γ蛋白催 化酵素，主要是對PKC-oc及PKC-γ，而對其他之蛋白催化酵素及其他 蛋白催化酵素C的同型則較少活性。此外，此處提供之十字孢黴素衍 生物能無任何困難地製成適當之藥物劑型，當口服投與時，仍能充份 溶解並具有高活性。： 本發明係特別有關於化學式I之Ν-(四氫嘁喃-4_基氧-烷醯基)-十字 孢黴素衍生物 ............................................................................................裝：.Λ:—訂，— 绵 (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 '本紙張尺度逋用中國Η家標準（CNS>甲4规格（210X297公釐） 315367 A6 B6 五、發明説明(_>)

{請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (其中R,是氫、羥基、低烷氧基或氧堪，R2 Μ氫或一爷四個碳之院 基，R;是一至四個碳之烷基、較偏好的爲氪），彳ί關其製備方法及所 用之中間產物、含有這些化合物之藥物組成物、作爲藥物之用途及中 間產物之製備方法。 明顯地，化學式I之結構意欲表示相對的而非絕對的立體化學。 根據上述結構，其絕對的立體化學可能如下述化學式la所示，

經濟部t央標準局員工消费合作社印製 在C-R2之原子的立體結構是(D)或(L)，較偏好(D)。低級烷氧基R,是一 至七個碳之烷氧基，較偏好一至四個碳之烷氧基，特別是甲氧基。一 至四個碳之烷基&或R3較偏好於甲基。 化學式I之化合物呈現有價値的藥理特性：例如，能高度選擇性 地抑制蛋白催化酵素C。磷脂質及鈣-依頼的蛋由催化酵素C是以多種 型態存在於細胞中並參與各種基礎過程，如訊息的傅遞、增也、分 化，以及賀爾蒙及神經傳遞物質之釋出。此酵素之活化係受到細胞膜 上由受體調節之磷脂質之水解，或由某些促進腫瘤的活性物質直接作 一本紙張尺度適用中國國家標f-(CNS)甲4规格（210x297公釐） 315367 A6 B6 五、發明説明（$ ) (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 用而活化。而細胞對受體-調節之訊息傅遞的敏感度會因調整蛋白催化 酵素c (爲一訊息傅遞者）之活性而受影響。能影響蛋i'h崔化酵素c 活性之化合物可用爲腫瘤抑制 > 抗發炎、免疫調節以及抗菌之活性成 份，而且甚至可作爲抗動脈粥狀硬化以及心臟血管系統和中樞神經系 統失調之藥物。 豬腦蛋白催化酵素C (根據T. Uchida和C. R. Hlbum於J. Biol. Chem. 259, 12311-4(1984)中之描述純化者），在本專利中是用來決定對蛋白 催化酵素C之抑制活性。而化學式I之化合物對蛋白催化酵素C的抑 制活性之測定是根據 D. Fabbro 等人於 Arch. Biochem. Biophys. 239, 102-111 (1985)發表之步驟。在該試驗中，化學式I之化合物能在低濃度0.01-〇.〇5微莫爾/升之IC5。（百分之五十的抑制濃度）下抑制蛋白催化酵 素C。相比之下，化學式I之化合物抑制其他酵素如蛋白催化酵素A 及酪胺酸袋白催化酵素卻只能在很高濃度，例如，100倍或更高之濃 度，此一事實證明化學式I化合物之選擇性。 在上述之試驗中，豬腦的蛋白催化酵素C是各種同型之蛋白催化 酵素C的混合物。如果在上述試驗中，使用純的重組基因的同型代替 豬腦蛋白催化酵素C，則發現化學式I之化合物能優先抑制 '傳統〃 之同型酵素（X、β-1、β-2及γ，而對"非傳統〃之同型酵素γ、ε及η 和a異型〃之同型酵素ζ之抑制之程度明顯地較小，甚至在某些情形 不被抑制。 '經濟部中央標準局員工消费合作社印製 重組基因的同型蛋白催化酵素以下述方法選殖、表現及純化：各 種蛋白質之生產（藉粒狀病毒），其選殖以及從Sf9昆蟲細胞分離之 進 f了步驟是依據 M. D. Summers 以及 G. E. Smith 於”A manual method for baculovirus vector and insect cell culture procedure", Texas Agricul. Exptl. Station Bull. (19S7)，1555.中描述的方法。用以在昆蟲Sf9細胞中表現蛋白催化 酵素C-(X(牛的）、蛋白催化酵素Οβ1(人類的）、蛋白催化酵素C-β2 (人類的）及蛋白催化酵素C-γ (人類/及牛的混合型）之重組基 因病毒之建造及分離是以Stabel等人在S. Stabel, M. Liyanage及D. Frith," Expression of protein kinase C isozymes in insect cells and isolation of recombinant proteins", Meth. Neurosc. (1933)描述之方法完成。PKC之同型在SF9細胞 中之生產係依Stabel等人之方法（如上）實施，而此酵素之純化方法 是根據 McGlynn 等人發表之文獻[E. McGlynn, J. Liebetanz, S. Reutener, J. —本紙張尺度逋用中國因家標準（CNS>T4规格（210X297公釐) 經濟部中央標準局貝Η消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（ ）

Wood, Ν· B. Lydon，H. Hofstetter, M Vanek，T. Meyer 及 D. Fabbro, "Expression and partial characterization of rat protein kinase C-δ and protein kinase C-ζ in insect cells using recombinant baculovirus", J. Cell. Biochem, 49, 239-250 (1992)]中之方 法完成。重組基因蛋白催化酵素C-δ (大老鼠的）、重組基因蛋甶催 化酵素C-ε (大老鼠的）、重組基因蛋白催化酵素c-ζ (大老鼠的）以 及重組基因蛋白催化酵素C-η (小老鼠的）之產生、表現及純化是依 照 Li.yanage 等人所描述之方法：["Protein kinase C group B members KPC-δ，-ε, -ζ and PKC-λ: Comparison of properties of recombinant proteins in vitro and in vivo", Biochem. J. 283, 781-787 (1992)]以及 McGlynn 等人（見上所述）之方法， 不過另外特點是使用pAc 360載體來表現蛋白催化酵素C-r\[V. Luckow and M. D. Summers. MTrends in the developement of baculo-virus expression", Bio-technology 6, 47-55 (1988)]。 如上獲得的重組基因蛋白催化酵素同型的活性測定是在沒有脂質 及鈣（輔因子）情況下進行。而在沒有補因子存在下，磷酸化之魚精 蛋白硫酸鹽是用作受質。酵素之活性反映32P由γ-[32Ρ]-ΑΤΡ到魚精蛋白 硫酸鹽之轉移。魚精蛋白硫酸鹽是一含有四個碳-精氨酸殘餘之多肽混 合物，磷酸鹽之結合是在以下條件下測得：100微升之反應混合物含 (在最後之濃度下）：20 mM TRIS-HCL pH 7.4, 10 mM Mg[N03]2, 0.5 mg/ml 之魚精蛋白硫酸鹽，l〇 ATP (0· 1 μ(Ιϋ γ-[32Ρ]-ΑΤΡ ; 10 Ci/mol; Amersham, Little Chalfont, United Kingdom)，不同濃度之抑制化合物以及0.5-2.5單位 (U)之酵素〔U爲一單位：U爲在一分鐘之內，每毫克蛋白質將InM 的32P自上述之Τ·[32Ρ]-ΑΤΡ轉移至組織蛋甶HI (Sigma, type V-S)之酵素 量]。此反應在酵素加入時間開始並在32°C下轉移。反應時間爲20分 鐘，然後此反應因將50微升之反應物滴入P81之層析紙而停止 (Whatman, Maidstone, United Kingdom)。將未鍵結之 γ-[32Ρ】-ΑΤΡ 以及核甘酸 片斷依照 J· J. Witt 以及 R. Roskoski 於."Rapid protein kinase assay using phospho-cellulose-paper absorption", Anal. Biochem. 66, 253-258 (1975)所描述的 方法沖洗去除後，受質之磷酸化則可藉閃爍計數法來測定。在上述測 試中，化學式I之化合物在低濃度之IC5Q下抑制各種蛋甴催化酵素C 之同型，其百分之五十抑制濃度（IC5。)在蛋白催化酵素C-α及蛋白摧 催化酵素C-γ之例子中，約爲0.001-0.1微莫爾/升；在蛋白催化酵素 c-β-ΐ及蛋白催化酵素Οβ-2之例子中，約爲0.01-0.08微莫爾/升；在 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 .訂 -6 - 315367 A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（ ） 蛋白催化酵素C-δ、蛋白催化酵素C-ε以及蛋白催化酵素c_rj之例子 中，約爲0.03-10微莫爾/升；在蛋白催化酵素c-ζ的例子中，大於4 微莫爾/升。 、 基於上述對蛋白催化酵素C的抑制活性，可預期化學式I之化合 物有抗增生性質，可直接於如下所示的測試中證實（化學式I之化合 物對人類T24膀胱癌之生長的抑制活性在試驗中被測定）。那些癌細 胞在加有5% (ν/ν)小牛胚胎血淸之Eagle's最低必須培養基中於37°C及 含有5%二氧化碳的溼潤保溫箱中培養。這些癌細胞（丨〇〇〇_15〇〇)於96-井微培養盤中，在上述條件下，整夜培養。於第一天，將測試之化合 物以系列稀釋濃度加入培養盤中，再將此盤於上述條件下培養5天， 在此期間，控制培養組至少經過四次細胞之分化。經過培養後，這些 細胞以3.3% (v/v)之戊二醋(glutaraldehyde)水溶液固定，並以水沖洗， 再以0.05% (w/v)之甲基藍水溶液染色。經過沖洗，染料可以3% (w/v) 之鹽溶液洗出。每個井中的光學密度（OD)(和細胞之數目直接成正 比）是以光學計量儀（Titertek multiskan)在的5 nm下測得。百分之五十 的抑制濃度（IC5。)是用下列方程式以電腦系統訃算之， 〇d665 (試驗）-od665 (起始） OD665 (控制）-OD665 (起始） 百分之五十的抑制濃度（IC5〇)的定義是，在培養終點時每個井之細胞 數爲控制組細胞數之百分之五十時之活性成份的濃度。在化學式I之 化合物，此百分之五十的抑制濃度（IC5C))約爲αοι-ο.9微莫爾/升，特 別是在0.03-0.9微莫爾/升。 化學式I化合物之抗腫瘤活性也在動物體內獲得證實： 此實驗中，是以人類膀胱腫瘤癌Τ24植入雌性Balb/C無毛小鼠之皮 下來決定抗腫瘤活性。在藥零天時，動物在經口麻醉下，於其左腰腹 植入約25毫克的塊狀腫瘤，並將小傷口以縫鉗縫合。在植入六曰 後，小老鼠隨機以六隻動物分爲一組，並開始治療。此治療係經由口 服或腹膜內給藥，持續十五日，每日一次投與溶於二甲基亞砜/ TweetiSO/氯化鈉溶液中不同濃度之化學式I之化合物，每週二次以玻 片測量計測定腫瘤，並計算其體積。在此試驗中，經口服或腹膜內每 曰投與3毫克/公斤之化學式I之化合物，較之無治療的控制組’平 均可減少1〇%~15%腫瘤體積。 '本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐） ....:................................................................................^...........一..........町.....................線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ ） 基於上述之特性，化學式I之化合物可特別作爲腫瘤抑制之活性 成份，例如用於治療膀胱及皮膚之腫瘤。當化學式I之化合物與其他 化學治療劑併用於腫瘤的治療時，可防止抗藥性之產生（多種藥物之 抗藥性）或去除對其他化學治療藥物已產生之抗藥性。他們也適用於 上述蛋白催化酵素C調節劑之其他用途，且特別是可使川於治療對抑 制蛋白催化酵素C有反應之疾病。 化學式I之化合物也可抑制某些酪胺酸催化酵素，例如PDGF受 體催化酵素，甚至在低於〇.〇8微莫爾/升的50%抑制濃度下IC5„亦可 被抑制。 PDGF (血小板衍生之生長因子）爲一常見的生長因子，其對正常 的生長及病理細胞之增殖（例如：癌之生長及血管平滑肌的疾病，如 動脈粥狀硬化及血栓）皆扮演著重要的角色。 蛋白催化酵素C及PDGF受體催化酵素之抑制是以似協合的方式 調節細胞之生長。 受PDGF刺激的受體酪胺酸催化酵素體外活性之抑制是以類似於 由 E. Andre jauskas-Buchdunger 及 U. Regenass 於 Cancer Reserch 52, 5353-5358 (1992)所述方法，於Balb/c3T3細胞之PDGF受體免疫複合物上測定。 上面曾詳述過之化學式I之化合物，在低於〇.〇8微莫爾/升之濃度即 能抑制依賴PDGF細胞外受體的磷酸化。 PDGF受體酪胺酸催化酵素於完整細胞的抑制也丨f ]两方吸溃法分 析獲得證實，同樣以 E. Andrejauskas-Buchdunger 及 U. Regenass 於 Cancer Reserch 52,5353-5358(1992)描述之方法。在該試驗中，是藉著抗-磷酸酪 胺酸抗體來量度在Balb/c小鼠細胞內配位子刺激的PDGF受體自動磷 酸化的抑制作用。化學式I之化合物能在0.005-0.08微莫爾/升之濃度 下抑制PDGF受體的酪胺酸催化酵素之活性。那些化合物也能在低於 1 .〇微莫爾/升之濃度下抑制依賴PDGF細胞系（即BALB/c 3T3鼠纖維 母細胞）的生長。 基於以上所述之特性，化學式I之化合物不只可作爲肫瘤抑制的 活性成份，也可作爲抗非惡性增殖疾病之藥物，例如動脈粥狀硬化、 血栓、牛皮癖、硬皮病、纖維化。此化合物亦作爲上文中所提之蛋白 催化酵素C之調節劑，且特別適用於對PDGF受體催化酵素抑制有反 應之疾病。 .....................................................................................^...........一...........ΤΓ.....................^ <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐） B6 五、發明説明（ ） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其&爲氫或氧基、R2爲氫或一至四個碳之烷甚及R3爲氫之化學 式I之化合物較佳。 其R!爲氫或氧基、R2爲氫或甲基、R3爲氫之分子式I之化合物較 佳。 上述之化學式I之化合物以在C-R2原子爲（D)-組態者較佳。 於上例所提化學式I之化合物中，特別是以N-[0-(四氫哌喃-4-基)-D-乳醯基 > 十字孢黴素之衍生物較佳。 化學式I之化合物係依據已知之方法製備，本發明之方法包括化 學式II胺之醯化 Η

(Π) (化學式II中R!如前所定義，但條件是，由R,所代表之羥基在必要 時需以一易於移除的羥基-保護基團來保護），用一化學式III之酸醯 化， H0>< 〇 r3 r2

(III) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 化學式III中R2及R3定義如上，或是用一具反應性的羧酸衍生物醯 化，而後再移除希望的化學式I最終產物中不存在之保護基團，若希 望，分離異構物之混合物。 上述方法之實施更詳細之解釋於後：保護基團，其引進及移除於 下面文章中描述："Protective Groups In Organic Chemistry", Plenum Press, London, New York 1973，茂"Methoden der organischen Chemie"，Houben-Weyl， 4th edition» Vol. 15/1，Georg-Thieme-Verla^ Stuttgart 1974 以及 Theodora W. Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公梦） -9- 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 $1536*7 A6 _ B6 五、發明説明（ ） 1981。保護基團的特性是要能容易地被移除’也就是說，不會發生不 想要的二次反應，例如：用溶劑解、還原、光解法或在生理條件下移 除。 趨基保護基團例如無取代或有取代之醯根，如被鹵素取代者、低 ^烷醯基’如2,2-雙氯乙醯基，或碳酸半酯之乙醯基，尤其是三級_丁 氧^基 '無取代或有取代之苯甲氧羰基如‘硝基苯甲氧羰基，或雙苯 甲氧羯基，或2-鹵代-低級烷氧羰基，如2,2,2-三氯乙氧羰基及三苯印 基或甲酿基二或有機甲矽烷基或甲錫烷基，以及可立刻被移除的酸化 ^團，例如三級-低烷基，如三級-丁基、2-氧雜-或2-硫雜-脂肪族或環 脂族之碳氫根，尤其是1-低級烷氧-低級烷基或1-低級烷硫-低級烷基， 例如甲氧甲基、1-甲氧乙基、1-乙氧乙基、甲硫甲基、1-甲硫乙基或^ 乙硫乙基，或有五或六環原子之2-氧雜-或2-硫雜-環烷基，例如四氫 咲喃，或2-四氫哌喃基或相對應之硫雜相似體，以及有取代或無取代 苯基·低級烷基，如有取代或無取代之苯甲基或雙苯甲基，苯環之 適當取代物爲’例如鹵素如氯、低級烷氧基如甲氧基，及/或硝基。 不是希望要的化學式I之最終產物組成的保護基團之移除，是以 已知的方法實施，例如藉著溶劑解，特別是水解、醇解或酸解，或藉 著還原’特別是氫解或化學還原。被無取代或有取代之1-苯基-低級烷 基（例如苯甲基）保護的羥基.，可以藉著觸媒的氫化而窃由化，例如 ，銷-碳（Palladium-on-carbon)觸媒之存在下進行。被2,2-雙氯乙醯基保 護的羥基自由化可以藉著例如：鹼性水解而自由化，被三級_低級烷基 或2-氧雜-或2-硫雜-脂族或-環脂族碳氫根醚化的羥基，其_由化可以 藉著酸解，例如以無機酸或強羧酸（如三氟乙酸）處理。被有機甲砂 院基（例如三甲基矽烷基）醚化的羥基也能藉著氫氟酸鹽（例如四丁 基氟化銨）產生的氟離子而自由化。 化學式III化合物之易反應酸性衍生物，特別是易反應（活化）之 酯、易反應的酐或易反應的環狀醯胺。 化學式III的酸之易反應（活化）的酯，尤其是在酯化基的聯結碳 原子爲一不飽和酯，特別是乙烯酯類，例如乙烯酯本身（例如，利用 乙酸乙烯酯將一相對應的酯藉由轉酯化而獲得；活化之乙烯酯法）， 胺甲醯基乙烯酯（例如，利用異螬唑劑處理一相關的酸而獲得；1，2-異0f哩法或Woodward法），或1-低級烷氧乙烯酯（例如，利用一低級 本紙張尺度逋用t國國家標準（CNS)肀4规格（210X297公釐) ......................................................................................^...........k...........玎.....................^ {請先閲讀背面之注意事項再5?寫本頁} -10- A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（ ） 之烷氧乙炔處理一相關的酸而獲得；乙氧乙炔法），或脒基類的酯如 N，N'-雙取代之脒基_ 例如，利用適當之ν,ν’—雙取代之碳化二亞胺處 理一相關的酸，如N，N’-一環己基碳化二亞胺或]^乙基_N，_(3_二甲基胺 丙基)-碳化二亞胺氫氯化物而獲得；碳化二亞胺法），或NN_雙取代 之甲脒酯、（例如，利用適當之N，N-雙取代之氰胺處理一相關’的酸而獲 b，氰肢法），適當的方香酯，尤其是被適當之吸電子取代物所取代 的苯酯（例如’於適當之縮合劑如N，M，-二環己基碳化二亞胺的存在 下，利用以一被適當取代之酚處理一相關的酸，如t硝基苯酚、4_甲 基磺醯酚、2,4,5-二氯般、2,3,4,5，<3-五氯附或‘苯基_二偶氮酣而獲得； 活化之芳香酯法）’氰甲酯（於適當之鹼的存在下，利用氯乙腈處理 一相關的酸而獲得；氰甲酯法），特別是無取代或有取代（如硝基_ 取代）之硫酯，苯硫酯（例如，利用無取代或有取代如硝基_取代之 硫酚處理一相關的酸而獲得；特別是藉著酐或碳化二亞胺法;活化之 硫醇酯法），胺酯或醯胺醋（例如，利用N-經基-胺基或N-經基-_胺 基化合物’如N-經基-號拍醯亜胺、N-經基-六氬n比陡、N-羥基-駄醯亞 胺或1-羥基-苯幷三哩等處理一相關的酸而獲得，例如是藉著酐或碳化 二亞胺法；活化之N-經基酯法），或甲矽烷酯（例如，利用容易和羥 基基團反應而不與胺基團反應的甲矽烷化劑，如六甲基二砂氣院處理 〜相對應的酸）。 ^ 化學式III之酸的酐類可能是對稱的或者是這些酸的混合肝類，例 如和無機酸混合之酐，如醯鹵特別是醯氯（例如，利用亞硫醯氯、五 氯化磷或草醯氯處理相關的酸而獲得；醯氯法），疊氮化合物（例 如，可由相當的酸酯經由相當之醯肼以亞硝酸處理而得；疊氮法）， 和碳酸半酯衍生物混合之酐，例如相當的酯，如碳酸低烷半醋（例 如’利用鹵甲酸低烷酯如氯甲酸低烷酯，或利用1-低級烷氧羰基_2_低 級烷氧-U-二氫喹啉如1-低級烷氧羰基-2-乙氧基-i，2_二氫喹啉來處理相 關的酸而得；混合的氧-院基碳酸酐法），或雙鹵化的，特別是雙氯化 的和磷酸混合的酐（例如’利用磷醯氯處理相關的酸而得；磷醯氯 法），或和有機酸如有機羧酸混合的酐類（例如，利用無取代或有取 代的低級鏈烷-或苯基-低級鏈烷-羧醯鹵，如苯基乙醯氯、特戊乙醯氯 或三氟乙醯氯處理相關的酸而獲得，混合的羧酸酐法），或與有機磺 酸混合者（例如，利用一適當的有機磺醯鹵如低鏈烷-或芳香基-磺醯 ..............................................................................裝...........」...........玎.....................線 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 本轼張尺度適用中a國家標準（CNS)甲4规格{210X297公釐） -11 - A6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（ ） 氯、甲烷或對-甲苯磺醯氯來處理相關酸之鹽^，如鹼金屬鹽而獲得； 混合之擴酸化合物法）以及對稱之酐化合物（例如，於碳化二亞胺 或1-二乙基-胺丙炔存在之下，縮合其相關之酸而獲得：對稱之酐化合 物法）。 適當之環狀酿胺’尤其是有五員芳香族特性之二重氮環（diazacy_ cles)的醯胺，例如有咪唑化合物之醯胺類，如咪唑（例如，利用NN，_ 羰基二咪唑處理相關之酸而獲得：咪唑化物法）或吡唑化合物如;,5_ 二甲基吡唑（例如，利用乙醯丙酮處理醯肼而獲得；吡哗化物法）。 可作爲醯化劑的化學式ΠΙ之酸衍免物亦可於原處形成。例如，藉 由化學式V之起始物質與一酸（醯化劑）的混合物反應後，於原處可 形成Ν，Ν’-雙取代之甲脒基酯（在一適當的ν，Ν’-雙取代之碳化二亞胺 如Ν，Ν’-二環己基-碳化二亞胺存在之下）。此外，作爲醯化劑的酸之 胺酯或醯胺醋也能於被醯化的化學式V的存在下形成（是藉著於 Ν，Ν'·雙取代之碳化二亞胺’如Ν，Ν’-二環己基碳化二亞胺以及Ν_羥基_ 胺基或Ν-羥基-醯胺基’如Ν-羥基-琥珀醯亞胺的存在下，最好是一適 驗的存在下’如4-一甲基卩比陡存在卜，與一相常酸及胺起始物質之 混合物反應而成）。 一 此反應之進行可以已知的方法進行，反應條件特別是視是否及如 何將化學式III之醯化劑的羧基團活化，通常是在一適當溶劑或稀釋劑 或二者的混合物之存在下’如果需要的話，在縮合劑存在下（例如參 與反應之羧基是以酐或酸結合劑的型式存在），冷卻或加熱，例如溫 度範圍約在-30°c到+150°C，尤其是從0°c到+100°c，最好是從室溫 (約+20°C)到+70°C，於一開放或緊閉及/或通入氣體（如氮氣）的 反應容器內反應。一般常用之縮合劑如碳化二亞胺，例如Ν,Ν’-::乙 基-、Ν，Ν’-二丙基-或Ν,Ν’-二環己基-碳化二亞胺，適常的羰基化合物， 例如羰基二咪唑，或U-哼唑化合物，如2_乙基_5_苯基磺 酸酯及2-三級-丁基-5-Ψ基-異卩f唑過氯酸酯，或適當的醯基胺基化合 物，如2-乙氧-1-乙氣羰基-1，2-二氫喹啉。何水溶性的碳化：亞胺如N_ 乙基·Ν’-(3-二甲基胺丙基）-碳化二亞胺是較好的選擇。一般常用的酸結 合縮合劑如鹼金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽，例如鈉或鉀碳酸鹽或碳酸氫鹽 (通常與一硫酸鹽一起使用），或有機鹼，例如具立體阻礙的三·低級 烷胺如Ν,Ν-二異丙基-Ν-乙胺。 (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) .裝 -線· _—本紙張尺度適用中囤國家標準（CNS)TM规格（210x297公釐） -12- 315367 經濟部中*標準居員工消費含作社印製 A6 B6 五、發明説明（） 藉著分晶法、層析法等已知的方法可以將異構物的混合物分成個 別的異構物。 化學式Π之起始物質爲已知或可根據已知的步驟製備。化學式II 之起始物質（其中R,是氫者），也就是說十字孢黴素，可以購得或 藉著將十字孢鏈黴菌（Streptomyces staurosporin)發酵得來。此菌系是存放 於日本發酵硏究學會，號碼FERMP-3725，其日本專利Kokoku，No. 57-53 〇76，發表於 I982 年 11 月 11 曰，可參考 S. Oxnura et a丨·，J. Antibiot, 30, 275-281 (1977)。化學式II的十字孢黴素衍生物（其中R,爲氫以外者） 已被描述，例如 I. Takahashi etal.，J. Pharmacol. Exp. Ther. 255 (3), 1218-1221 (1990)以及 WO-A-8907-105-A (申請者：Kyowa Hakkom Kogyo KK，日本優 先權024 571，1988年2月4號）。&是羥基或氧基的分子式I之化合物 可於艮是氫的化學式I之化合物之合成中以二次產物得到。 化學式Π1之起始物質是新穎的。化學式III的酸藉著四氫哌喃-4-醇和化學式IV的酸反應得到

H〇>7<rX 0 r3 R2 其中X是親核離去基團，112及R3的定義如上所述。親核離去基團χ 尤其是以一適當無機酸如氫鹵酸，或以磺酸如4-甲苯磺酸或氯酯化的 羥基。四氫哌喃-4-醇於一適當的非質子溶劑（例如非環的或環醚，如 二喟烷）中首先和一適當的鹼（例如鈉氫化合物）反應。將所得到的 懸浮液逐滴加入溶於一適當惰性非質子溶劑（例如非環的或環醚，如 二噚烷）的化學式IV之化合物的溶液。此反應於0°C到150°C進行， 尤其是從20°C到100°C，例如在所使用溶劑的回流溫度。 本發明也有關化學式III之新穎化合物以及其作爲製備化學式I之 化合物的中間產物的鹽類。化學式III之化合物在水及有機溶劑中有令 人驚奇的溶解度。其在22°C下之水的溶解度爲100克至500克/升。 因此，化學式III之化合物相當的醯根是使溶解度增加者，例如，化學 式I之化合物與其他N-醯基-十字孢黴素的衍生物如N-苯甲氧-十字孢 黴素比較起來，其在水及其它溶劑中的溶解度大量增加（如增加十倍 以上）。 本Μ张尺度適用中國國家標準（CNS)甲·4现格（210 X 297公釐）.]3 6,()( —裝-------訂 - > (請先Μ讀背面之注意事項再塡寫本頁) 315367 A6 B6 ·«濟部中央棣準屬Λ工消费合作杜印製 五、發明説明（） 較偏好的化學式m之化合物爲其中r2是氫或甲基且化是氫或甲 基者，尤其是於範例中描述的化學式III之化合物及其鹽類。 化學式III之化合物的鹽類，特別是金屬或敍鹽，例如鹼金屬或鹸 土金屬鹽，如鈉、鉀、鎂或鈣鹽，或含有氨或適當有機胺的銨鹽例如 三級的單胺，如三乙基胺或三-(2-經基乙基)-胺，或是雜環鹸，例如N-乙基-六氫吡啶或Ν，Ν·-二甲基-D比嗪。 本發明也有關上文所描述化學式III之新穎化合物的製備。 上文所描述的方法，包括移除保護基團及額外之方法，如非另有 說明，係以已知方式實施，例如，在偏好的惰性溶劑或稀釋劑的存在 或缺乏下，如果需要，在縮合劑或觸媒存在下，在降低或提升溫度 下，例如溫度範圍在-20°C到150°C，尤其是從0°C到+70°C，但較偏好 +10°C到+50°C，原則上是在室溫下，於適當的容器中，需要時可通入 氣體，如氮氣β 因考慮分子中所有的取代物，例如，如有容易水解的根存在時， 需使用特別溫和的反應條件，例如短反應時間、或低化學劑量比、低 濃度之溫和酸或鹼劑以及適當觸媒、溶劑、溫度條件和/或壓力條 件。本發明也有關化學式1之化合物的用途，尤其是醫藥組成物型式 的用途，用於治療人或動物體之上述疾病。本發明也有關對需要以抑 制蛋白催化酵素C來治療的溫血動物之方法，包括於此溫血動物，投 與化學式I之化合物有效抑制蛋白催化酵素C的劑量。此活性成份與 疾病性質、被治療動物的大小、種類、生物的抗藥性以及投藥方式有 關。例如，一約70公斤的溫血動物，每天接受化學式丨之化合物〗毫 克到1500毫克的劑量，原則上是100毫克到1000毫克，最好是200毫 克到800毫克，例如500毫克。每天投與的總量最好每天分二至三次 投與。口服投與的劑量較注射給藥的劑量高二到三倍，也就是說，其 治療劑量將在上述劑量的上限。 本發明也有關其藥劑組成物，其包含一有效劑量的有效成份，特 別是用於預防或治療上述一種疾病的有效活性成份劑量，以及適合作 爲局部給藥、腸道如口服或肛門給藥或注射給藥之藥劑所能接受的載 體，此載體可是無機或有機、固體或液體。口服劑例如錠劑或明膠膠 囊，其包含有活性成份及稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露 醇、山梨醇、纖維素及/或甘油，及/或潤滑劑，例如矽石、滑石 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁)

• J -—裝. 訂· 冬紙張尺度適用中國國家樣箏（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） ΛΑ Η2. f). (i,(t〇〇 A6 B6 經濟邾中央樣準局MC工消费合作社印製· 五、發明説明（） 粉、硬脂酸或其鹽類如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣，及/或聚乙烯甘醇。錠 劑也可含結合劑，例如鎂鋁矽酸鹽、澱粉，如玉米、小麥或米澱粉、 明膠、甲基纖維素、羧基甲基纖維素化鈉及/或聚乙烯吡咯酮，需要 時加入崩散劑，例如澱粉、洋菜、褐藻酸或其鹽類如褐藻酸鈉，及/ 或發泡混合劑，或吸附劑、染料、芳齊劑及甜味劑。也可以注射給藥 之組成劑型或靜脈輸注溶液的劑型使用本發明的藥理活性化合物。而 此種溶液較偏好等張溶液或可能於使用前才製備的懸浮液，例如其只 包含活性成份或和一載饈（如甘露醇）如在冷凍乾燥組成物情況。此 藥劑組成物可予滅菌及/或包含輔劑，例如，防腐劑、安定劑、濕潤 劑和/或乳化劑、助溶劑、用以調節滲透壓的鹽類和/或緩衝劑。需 要時，此藥劑組成物也可包含其他的藥理活性成份，如抗生素，其製 備亦是已知的，例如，藉著傳統的混合 '造粒、加糖、溶解或冷凍乾 燥過程，以及包含0.01%到90%，特別是從〇· 1%到50%，尤其是1% 到30%的活性成份，在冷凍乾燥的例子中更高達100%，而於局部使 用時，活性成份的濃度小於1%是較適當的。 下面的範例用來描述本發明但並不僅限於下述方法。仏値是於矽 膠薄層片（Merck，Darmstadt Germany)上測定。溶析混合液中之溶析液的 比値是以體積比（V/V)表示，而溫度是採用攝氏溫度。在旋光性的情 況中，化合物於溶劑或溶劑混合物的濃度c是以百分比表示（重量/ 體積）。 範例1 :於〇°C卞，將1.17克（7·8毫莫爾）的ί-經基苯幷三唑及1.61 克（7.8毫莫爾）的Ν,Ν’-二環己基碳化二亞胺加入含U3克（6.5毫莫 爾）Ο-四氫哌喃-4-基-D-乳酸於75毫升絕對Ν，Ν'-二甲基甲醯胺的溶液 中，將所得到澄淸、無色的溶液在0°C下攪拌三個小時。之後將2.33 克（5.01毫莫爾）的十字孢黴素加入，將所得到無色的懸浮液在〇»c 下攪拌一個小時，然後於室溫攪拌二十小時。爲了確定所使用的十字 孢黴素完全反應，再將一含有0.38克（2.18毫莫爾）的Ο-四氫哌喃_4_ 基-D-乳酸、0.39克（2.6〇毫莫爾）的丨·經基苯幷三唑以及0 54克（2 6〇 毫莫爾）的N，N’-二環己基碳化二亞胺溶於總量爲25毫升的絕對N，N，_ 二甲基甲醯胺的活性酯溶液加入其中，並在〇°C下攪拌-個小時，然 後於室溫下攪拌十八小時。將所得的黃色懸浮液加入300毫升水中並 ------Γ---.-------1 -------裝------訂----- 一 ♦ (請先閲^:面之注意事項蒋填寫本頁) 本紙張尺度適用中s因馭標準（CNS)甲4現格（210 X 297公釐> _ 15 - H2. 9. 6,000 A6 B6

«濟部中夬標準局BK工消费合作杜印W 五、發明説明（） 於室溫攪拌一個小時，然後以抽氣過濾法過濾沉澱出來的結晶，並以 水沖洗。將水相部份丟棄。將過濾的物質懸浮於130毫升的二氯帀烷 中，並於室温攪拌1.5小時。將沉澱的N，：NP-二環己基尿素以抽氣過濾 法濾掉’並以二氯甲烷沖洗，再將濾液在30°C眞空下藉著蒸發濃縮至 乾。此殘餘物（黃色結晶）以300克的矽膠（型式Si60, Merck 9385, 0·040-0.〇63厘米）管柱層析法以氯仿爲溶出液（25毫升爲-收集职 位；一份）純化之。合併220到305份之純化物，並於30°C高眞空下 藉著蒸發濃縮至乾。其殘餘物（黃色結晶）從乙酸乙酯中再結晶兩 次’得到微黃結晶的N-[0-(四氫哌喃-4-基)-D-乳醯基】-十字孢黴素，此 結晶仍含有0.19莫爾的水，熔點爲222-223°C (從220°C燒結），[ot]D2() =+166.9±2.0° (濃度=0.498 ;甲醇）。 起始物質可由下述方法得到： 步驟1.1 :在65°C，將4.8克（120毫莫爾）百分之六十氫化鈉油溶液 (Fluki pract.)加入3.06克（2.85毫升，密度=1.074 ; 29.96毫莫爾）四氫 -2H-哌喃斗醇（Fluka，pract.)於100毫克絕對1，4-二喟烷的溶液中。將所 得到灰白色懸浮液迴流下攪拌兩小時，然後冷卻至65°C，於八分鐘之 時間內逐滴加入3.25克（2.59毫升，密度= 1.25; 29.5>5毫莫爾）S(-)-2-氯丙酸（Fluta^puriss.)於60毫升絕對1，4-二Df烷的溶液。所得到褐色的 懸浮液，再以100毫升絕對1，‘二哼烷稀釋，然後在迴流下加熱攪拌 三小時。之後，再於室溫攪拌十四小時。於兩分鐘之時間內，逐滴加 入40毫升的水於所得到之黃褐色懸浮液中，然後將得到的黃色溶液 於眞空下藉著蒸發濃縮至乾。將殘餘物加入200毫升的水，以250毫 升以及150毫升的乙酸乙酯各萃取一次，再將乙酸乙酯萃取物以100 毫升的水沖洗一次。所有的水相收集後，以4N的氫氯酸（pH 1)酸 化。所得到的溶液以氯化鈉飽和，再各以300毫升的乙酸乙酯萃取兩 次。將有機相各以150毫升飽和的氯化鈉溶液沖洗三次。收集所有乙 酸乙酯萃取液，以硫酸鎂乾燥，過濾，然後在30°C下，於高眞空下藉 著蒸發濃縮至乾。此殘餘物（黃色的油）藉著球狀試管蒸餾加以純化 (沸點在0.6厘米汞柱下約爲160°C)。因此得到微黃色油狀的〇-(四 氫哌喃基)-D-乳酸；[a]D2° = +46.7±0·9。（濃度=1.〇58 ;氯仿）。從乙酸 (請先«讀背面之注意事項再項寫本頁) -裝· 訂. 本紙張尺A適用中國國家標準（CMS) T 4規格（210 X 297公釐） 82.9.6,000 A6 ________B6_ 五、發明説明（） 乙酯/己烷（1:1)得到的黃色結晶其熔點爲687_695»c ; [a]D2〇 = +488士 0.8° (濃度=1 ;氯仿）。 藍例2J從範例1的最終產物的再結晶母液可以藉著快速層析法單離 (於二氯甲烷/甲醇（98:2 ; 1〇毫升爲一部份），〇4巴（bar)下，於9〇 克的砂膝（型式Si60, Merck 9385, 0.040-0.063厘米）層析），於眞空下 藉著蒸發將23-27部份濃縮至乾後，如此可得到黃色結晶的N_【〇_(四 氫哌喃~4-基)-D·乳醯基】-7-氧-十字孢黴素，熔點爲206_2〇8°c (不用再結 晶），（+)FAB，MS: (M+H)+ = 637, [ot]D20 = +138.7±10.8。（濃度=0,185 ;甲 醇：氯仿=1:1)。 簏例3 :在〇°C、氬氣下，將9_16克（61.0毫莫爾）的1-經基苯幷三唑 及11.7克（61.0毫莫爾）的N-乙基-N，-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亞胺. 鹽酸鹽（EDC)，加入8.16克（板9毫莫爾）〇四氫哌喃-4-基-D-乳酸於 4〇〇毫升絕對Ν,Ν’-二甲基甲醯胺溶液中’再將所得的澄淸無色的溶液 在0°C下攪拌三小時。然後將17.50克（37.5毫莫爾）的十字孢黴素加 入，將所得黃色的溶液在0°C下攪拌兩小時，再於室溫下攪拌十九小 時。此黃色溶液隨後於高眞空下藉著蒸發濃縮至乾。將殘餘物和250 毫升的水攪拌十五分鐘’再以抽氣過濾法過濾，所得米色結晶再以水 沖洗。此結晶藉著快速層析法在二氯甲烷/甲醇（98:2; 25毫升爲一部 份），0.4巴（bar)下，於500克矽膠上純化（型式Si60, Merck9385,0.040-0.063厘米）。將70-140部份收集起來，在30°C，高眞空下藉著蒸發濃 縮。再將殘餘物由400毫升的乙酸乙酯中結晶出來，根據薄層層析 法，可以得到幾近純的N-[0-(四氫哌喃-4-基)乳醯基]-十字孢黴素的 米色結晶。將上述所提快速層析法的45-09部份及141-170部份收集起 來，並於高眞空下藉著蒸發濃縮。將所得到的黃色結晶以及從第一次 再結晶的母液所得到的..黃色結晶，再次於相同條件下，於500克矽膠 Si60上接受快速層析。藉著蒸發將二次快速層析的薄層層析-純化部份 濃縮後，合併產物及首先得到的米色結晶，再由800毫升乙酸乙酯再 結晶得到仍有莫爾水的N-[ 0-(四氫哌喃-4-基)-D-乳醯基]-十字孢 黴素的米色結晶，熔點爲220-222°C (從214eC開始燒結）；[tx】D2° = +166·6±2.5° (濃度=0.404 ;甲醇）。 本紙张又度適用中國國家標準（CN'S)甲4规格（210 X 297公釐）_ J7 - 82. 9. 6.000 (諳先Μ讀背面之注項再堉寫本頁) -丨裝. 訂. «濟部中夫標準居Λ工消费合作社印製·. 經濟部中央樣準居R工消费含作社印製 A6 B6 五、發明説明（） 範例4 :類似範例3，由310毫克（1.78毫莫爾）的〇-四氫哌喃冰基-L-乳酸、347毫克（2.31毫莫爾）的1-羥基苯幷三唑、443毫克（2.31毫 莫爾）的N-乙基-Ν·-3·<3·*二甲基胺丙基)-碳化二亞胺.鹽酸鹽（EDC)以 及664毫克（1.42毫莫爾）的十字孢黴素（於15毫升絕對Ν，Ν，-二甲基 甲醯胺溶液中），在氬氣下，於0°C，五小時及室溫十六小時的反應 時間後，以快速層析法得到米色結晶的N-[0-(四氫哌喃-4-基)-L-乳醯 基]-十字孢黴素，熔點爲302-304°C (從28(TC開始燒結；從乙酸乙 酯）；[a]D2。= +145.6±1.8。（濃度=0.544 ;氯仿）。 起始物質可由下述方法得到： 步驟4.1 ：類似步驟U，在65°C，由1.021克（0.951毫升，密度= 1.074，10毫吴爾）的四氫-2H-嗽喃-4-醇（Fluka^pract.)、1.60克的氫化鈉 (以60%溶於油中，Fluka, pract.)以及1.08克（0.863毫升，密度= 1.258; 10毫莫爾）的R(+)-2-氯丙酸（Fluka^puriss.)(於總溶積爲55毫升 的I，4-二喟烷中），然後藉著蒸發濃縮乙酸乙酯萃取液，再以球狀試 管蒸餾所得到的殘餘物（在0.8厘米汞柱下，沸點約160°C)，得到無 色油狀的〇-(四氫哌喃冬基)-L-乳酸，將其靜置，會固化爲仍含有an 莫爾（1.3〇%)的含水無色結晶，熔點爲 33.7_67.6°C ; [a]D2° = -46.7±1.0。 (濃度=1.035 ;氯仿）。 範例5 :類似範例3，由200毫克（U5毫莫爾）的0-四氫哌喃-4-基-乙 醇酸、244毫克（1.62毫莫爾）的1·羥基苯幷三唑、31丨毫克〇.62毫 莫爾）的N-乙基-N’-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亞胺.鹽酸鹽（EDC)以及 466毫克（1.0毫莫爾）的十字孢黴素（溶於10毫升絕對N，N’-二甲基 甲醯胺溶液中），於〇°C兩小時及室溫十八小時的反應時間後，以快 速層析法層析（與範例3相似，但以20毫升爲·部份，產物爲15-20 部份），並將產物用乙酸乙酯/E烷（1:1)中再結晶加以純化，得到仍 含有0·29莫爾含水米色結晶之N-[2-(四氫哌喃-4-基氧)-乙醯基]•十字孢 黴素，熔點爲 222-224°C (從 215°C 開始燒結）；[〇t]D2° = +180±2.0° (濃 度=0,510;氯仿），Rf値=0.26(二氯甲烷：乙醇=95:5) ;Rf値=0_48 (丙酮）；Rf値=0.64(二氯甲烷：甲醇=9:1)。 本紙張度適用中國因家標準（CNS)甲4规格（21〇 X 297公釐）-18 * B2. 9. 6,〇〇〇 (請先閲讀背面之：注意事項再塡寫本頁) 裝· 訂. 315367 A6 B6 經濟邾中喪镖準居R工消費合作社印製1 五、發明説明（） 起始物質可由下述方法得到：. 步驟5.1 ：在65°C，將3.20克（80毫莫爾）百分之六十氫化鈉油溶液 (Fluka» pract.)加入 2.042 克（1.902 毫升，密度=1.074 ; 20.0 毫莫爾）四 氫-2H-哌喃·4-醇（Fluka^pract.)於70毫升絕對1，4-二Pf烷的溶液中。將所 得到灰白色懸浮液迴流下攪拌三小時，然後冷卻至65°C，於二十分鐘 之時間內，逐滴加入1.89克（20.0毫莫爾）氯乙酸（FlU(H，pmiSS.)溶於 40毫升絕對1,4-二Df烷的溶液。將所得灰褐色的懸浮液加熱至迴流， 並於此溫度攪拌三小時，再於室溫攪拌十六小時。於五分鐘之時間 內，逐滴加入10毫升的水，然後將得到的黃色懸浮液於高眞空下藉 著蒸發濃縮至乾。將殘餘物加入20毫升的水，此溶液再各以20毫升 的乙酸乙酯萃取兩次，再將乙酸乙酯萃取物以10毫升的水沖洗一 次。合倂所有的水相後，以4N的鹽酸（pH 1)酸化。所得到的溶液以 氯化鈉飽和，再各以50毫升的乙酸萃取兩次。將乙酸乙酯層各以20 毫升飽和的氯化鈉溶液沖洗兩次。收集所有乙酸乙酯萃取物，以硫酸 鎂乾燥’過濾，然後在30°C下，於高眞空下藉著蒸發濃縮至乾。此殘 餘物（黃色的油）藉著球狀試管蒸餾加以純化（沸點在0.4厘米汞柱 下約爲130°C)。因此得到無色油狀的0-(四氫哌喃_4_基)-乙醇酸；使 其靜置’可固化爲仍含有0.08毫莫爾（0.91%)水的無色結晶，熔點爲 63.9-7〇.6°C (從 6〇.2°C 開始燒結）。 範艇:將範例5中快速層析之9-11部份，由乙酸乙酯/己烷（1:1)中 再結晶’可得一二次產物：黃色結晶的，仍含有0 35莫爾的水的N_[2-(四氫哌喃·4-基氧）乙醯基]氧基-十字孢黴素，熔點爲190.7_192.4°C (從 187°c開始燒結）；[a]D2G = +l57.4db2.0。（濃度=0.491 ;氯仿），Rf 値=0.35 (二氯甲烷：乙醇=95:5);心値=〇64 (二氯甲烷：甲醇 =9:1)。 範伊 11:由範例5快速層析之26-36部份得到於溶液不安定的二次產 物：米色結晶的N-[2-(,四氫哌喃-4-基氧）乙醯基]_7·氧基-十字孢黴素 (非鏡像異構物之混合物），其仍含有0 69莫爾的水，熔點爲235_237 本紙張尺度適用中®囷家樣準（CNS)肀4觇恪（210 χ 29?公藿）_ _ η·λ 9. (i.niin ---------------^-------裝------# (請先面之注意事項再塡寫本頁) _ β ‘ Α6 Β6 濟 部 中 央 樣 ,.φ. 局 Ά X. 消 费 合 作 杜 印 製 五、發明説明（） °C (從227°C開始燒結；從乙酸乙酯/己烷1:1);网〇2° = +209.6±2.0。 (濃度=0.125;氯仿），心値=0.24(二氯甲烷：乙醇=95:5) ;&値 = 0.55(丙酮）；IU® =0.55(二氯甲烷：乙醇=9:1)。 範例8 :類似範例3，由1.327克（7.05毫莫爾）的2-甲基-2-(四氫哌喃-4-基氧)-丙酸、1.376克（9.16毫莫爾）的1-經基苯幷三唑、1.757克（9.16 毫莫爾）的N-乙基-NH3-二甲基胺丙基)·碳化二亞胺.鹽酸鹽（EDC)以 及2.63克（5.64毫莫爾）的十字孢黴素（加於50毫升絕對N，N’_二甲基 甲醯胺溶液中），在氬氣下，於室溫二十四小時反應時間後，於二氯 甲烷/丙酮（9:1 ; 1-100部份）以及二氯甲烷/丙_ (丨:100-200部 份）下，在0.4巴（bat·) (20毫升爲一部份）500克的矽膠（型式Si60, Merck9385, 0.040-0.0063厘米）上快速層析，得到N-[2-甲基-2-(四氫哌喃 -4-基氧)-丙醯基]-十字孢黴素。爲了進一步的純化，將134-Π0部份收 集，在30°C下於高眞空下藉著蒸發濃縮至乾。殘餘物藉著於二氯甲烷 /甲醇（98:2 ; 25毫升爲一部份）下，在〇.4巴（bar)(20毫升爲一部份> 100克的矽膠（型式Si60, Merck 9385, 0.040-0.0063厘米）上快速層析再 次純化。收集21-28部份，在30°C下於高眞空下藉著蒸發濃縮至乾。 將殘餘物從13毫升的乙酸乙酯/環己烷（1:4)中再結晶，得到微米色 結晶的N-[2-甲基-2-(四氫嘁喃-4-基氧）丙醯基】-十字孢黴素，其中仍含 有0.38莫爾的水，熔點爲209-211°C (從204°C開始燒結）；[a]D2G = +154·7±2·0° (濃度=0.497 ;氯仿）。 起始物質可由下述方法得到： 步驟8.1a :在〇_9°C下，將3.48克（20毫莫爾）〇-(四氫哌喃-4-基)-D-乳 酸於20毫升絕對四氳呋喃的溶液，在I5分鐘以內，氬氣存在下，逐 滴加入20毫升（40毫莫爾）二異丙胺化鋰（2莫爾於四氫呋喃/瓌己 烷的溶液）於2〇毫升絕對四氫呋喃的溶液中。將所得的紅色溶液在0 °C下攪拌一小時，隨後冷卻至-75°C。在兩分鐘以內，將2.84克（1.25 毫升，密度=2.280; 20毫莫爾）甲基碘於10毫升絕對四氫呋喃的溶 液在兩分鐘內逐滴加入，在此其間，溫度會上升至，且溶液之 顔色會轉變爲黃色。將此黃色溶液攪拌十四小時並逐漸溫熱至室溫， (請先面之注意事項再填寫本頁) —裝. 訂‘ .線· 本紙張尺度適用中國因家標準（cns)甲4规格（2ΐο X 297公釐）_ 2〇 _ 82. 9. 6,000 A6 B6 五、發明説明（） 將所得到的黃色懸浮液倒於100毫升的冰水中，再各以100毫升的乙 酸乙酯萃取兩次。將乙酸乙酯相以50毫升的水沖洗一次。將水相收 集起來並以4N的鹽酸酸化，然後各以100毫升的乙酸乙酯萃取兩 次。將乙酸乙酯相各以50毫升的水沖洗兩次，收集水相，以硫酸鈉 吸水，在30°C於高眞空下藉著蒸發濃縮至乾。將粗產物溶於30毫升 的乙酸乙酯，並在室溫下，將2.73毫升的二環己醯胺（Fluka^puriss)加 入。將慢慢沉澱的結晶以抽氣法過濾，並以小量的乙酸乙酯沖洗，各 以3〇毫升的乙酸乙酯再結晶兩次，得到無色的2-甲基-2-(四氫哌喃冰 基氧)-丙酸的二環己銨鹽，熔點爲131.7-137.8°C (從128°C開始燒 結）。 此鹽可直接作更進一步的合成，或如下反應以形成自由的2-甲基-2-(四氫哌喃-4-基氧>丙酸。將3.8克（0.01莫爾）的二環己銨鹽溶於50 毫升的水中，再以4 N的鹽酸調整至PH=1。將沉澱的氯化二環己銨 以抽氣法過濾，並以少量的水沖洗。將水相各以100毫升的乙酸乙酯 萃取兩次。將萃取物各以50毫升的水沖洗兩次，收集起來，以硫酸 鈉吸水，在30°C於高眞空下藉著蒸發濃縮至乾。將殘餘物於環己烷中 再結晶’得到無色結晶的2·甲基-2-(四氫哌喃-4-基氧)-丙酸，熔點爲 90.2-93.8°C (從 79.5°C 開始燒結）。 或者，2-甲基-2-(四氫哌喃-4-基氧)-丙酸也可根據H. Gilman及G.R. Wilder於J. Am. Chem. Soc. 77, 6644 (1955)所描述之方法得到，如下面步 驟： 步驟8.1b :將5.10克（50毫莫爾）的四氫_2H-峨喃-4-醇（Fluka，pract.)溶 於48.0克（60毫升’密度=0.79 ; 826毫莫爾）的絕對丙酮（Fluka， praiss.)中，再將8.11克（5·45毫升，密度=1.49 ; 68毫莫爾）的氯仿 (Fluka^ puriss.)以及9.6〇克（240毫莫爾）的氫氧化鈉（merck，p.a.)，於室 溫下，在十分鐘內逐漸加入此溶液中，並攪拌，反應混合物的溫度會 由23°C上升至58°C (迴流）。於58°C三十分鐘後，所得到無色的懸 浮液自然緩慢地冷卻。再加熱到迴流溫度，並攪拌5小時。在30°C 於高眞空下藉著蒸發濃縮至乾。將殘餘物加於50毫升的水中，並以4 N的鹽酸酸化（pH=l)，再各以1〇〇毫升的乙酸乙酯萃取兩次。萃取液 各以50毫升的飽和氯化鈉溶液沖洗兩次《將乙酸乙酯相收集起來， (猜先閲讀背面之注意事項#項寫本頁) •裝， 訂. 經濟部中央標苹局R工消费合作杜印製j 本紙張尺度適用中國國家棵準(CNS)肀4規格（210 X 297公釐> 21 - 82. 9. 6,000 A6 B6 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 以硫酸鈉乾燥並過濾，再藉著蒸發濃縮。殘餘物用二氯中烷/甲醇/ 水70:30:5 ( 20毫升爲一部份），在500克的矽膠（型式Si60, Merck 9385, 0.040-0.0063厘米）上藉著管柱層析法純化。將47-48部份合倂， 在3〇°C下於眞空中蒸發濃縮。將此殘餘物（3.1克；油脂性結晶）懸浮 在30毫升的乙醚中。將此懸浮液在室溫下攪拌半小時。再將所得到 的結晶以抽氣法過濾，並以乙醚沖洗。將過濾的物質加於有15毫升 的水及20毫升的乙酸乙酯混合液中，並以4N的鹽酸調整pH至1，再 將乙酸乙酯相分離出。將乙酸乙酯相以總量20毫升的水沖洗後，將 所有的乙酸乙酯相收集，以硫酸鈉乾燥並過濾，在30°C於高眞空下藉 著蒸發濃縮。將殘餘物（0.41克）溶於10毫升的乙酸乙酯中，將0.437 毫升的二環己胺(Fluka^puriss)加於此溶液中，得到無色結晶的2-甲基-2-(四氫哌喃-4-基氧)-丙酸的二環己銨鹽，熔點爲136.6-138.8°C (從130 °(：開始燒結），此產物亦可如上所述被活化以形成g由的2-甲基-2-(四 氫峨喃-4-基氧)-丙酸。 1 或者，甲基-2-(四氫哌喃-4-基氧)-丙酸的：環己銨鹽也可根據下· 面描述之方法得到： 步驟8.1C :將10.21克（100毫莫爾）的四氫-2H-哌喃-4-醇（Fhiki pract.) 溶於350毫升的Μ-二Of烷（Fluka，prniss.)中。將所得到的溶液加熱到 65°C。隨後在65°C下將12.0克（ 300毫莫爾）的氫化鈉（以60%溶於 油中，Flukipract)加入。將所得灰色懸浮液於迴流下攪拌三小時， 隨後冷卻至65°C，然後在25分鐘的時間內，將16.70克（100毫莫 爾）α-溴異丁酸溶於150毫升絕對二Df烷的溶液逐滴加入。將所得到 的懸浮液於迴流下再攪拌三小時，然後在室溫下攪拌十七小時。然後 將25毫升的水小心地逐滴加入，再將此黃色懸浮液於高眞空下藉著蒸 發濃縮至乾。將殘餘物加入於50毫升的水中，並各以100毫升的乙酸 乙酯萃取兩次。萃取物以50毫升的水沖洗一次。將水相收集，並以4 N的鹽酸調整pH至1，再以氯化鈉飽和，以及各以50毫升的乙酸乙酯 萃取兩次。萃取物各以5〇毫升飽和的氯化鈉溶液沖洗兩次。將所有 的乙酸乙酯相收集，以硫酸鈉乾燥並過濾之，在30°C於高眞空下藉著 蒸發濃縮。殘餘物（5.22克，黃色油）在0.4巴（bar)、500克的矽膠 (型式Si60, Merck 9385, 0.040-0.0063厘米）上，用二氯甲烷/甲醇 本紙張尺度適用中0 S家標準（CNS)甲4規_格（210 X 297公釐）-22- H2. 9. 6,000 A6 B6 五、發明説明（） (9:1 ; 1-5〇部份）、二氯甲烷/甲醇（4:1 ; 51-150部份）及二氯甲烷/甲 醇（7:3 ; 151-225部份）爲溶出液，以快速層析（均爲25毫升爲一收集 部份）再次純化。收集16-200部份，並於高眞空下藉著蒸發濃縮。殘 餘物在室溫下和25毫升的乙醚攪拌1/4小時。將所得到的結晶以抽氣 法過濾，並以乙醚沖洗。將此無色結晶加入於十毫升之水中，並以4 N的鹽酸調整pH至I ’再各以20毫升之乙酸乙酯萃取二次。將乙酸 乙酯相各以10毫升之水沖洗二次，並收集水相，以硫酸鈉乾燥並過 濾，於眞空下蒸發濃縮。將殘餘物溶於10毫升的乙酸乙酯中，再加 入(U17毫升的二環己胺，得到無色結晶的2-甲基-2-(四氫哌喃基氧> 丙酸的二環己銨鹽，熔點爲136.5-138.8°C (從130°C開始燒結）。 範例9 :每顆含有20毫克活性成份（如前所述化學式I之一化合物） 的錠劑，以一般常用的方式製備，其處方組成如下： H^ 活性成份 小麥澱粉 乳糖 膠態矽 滑石粉 硬脂酸鎂 (請先閲讀背面之注意事項再續寫本頁) 丨裝- 經濟部中央標準居S工消費合作社印製 20毫克 60毫克 5〇毫克 5毫克 9毫克 1毫克 M5毫克 製備：將活性成份和部份的小麥澱粉混合，再和乳糖以及膠態矽混 合，將此混合物過篩。另一部份的小麥澱粉再和五倍的水於水浴上製 成糊狀物，將粉狀混合物和糊狀物搓揉直到形成有塑性的塊狀。 將此塑性的團塊壓擠過一網格大小約爲三厘米的篩子並乾燥之’ 將所得到的乾燥顆粒再次過篩。剩下的小麥澱粉、滑石粉以及硬脂酸 鎂再摻入並將此混合物壓擠成錠，每錠重145毫克並製有斷裂凹 槽。 範例10 : N-[0-(四氫哌喃_4_基氧乳醯基]-十字孢黴素於體內抗腫瘤 的活性： 訂.

本紙張尺度適用中國國家棵準$CNS) T4規格（210 X 297公釐）.23 - 82. 9. ii.fHIO S15367 A6 、B6 五、發明説明（） 此物質的組成如下： 將12.5克的活性成份溶於0.25毫升的二甲基亞砜中，再和50微 升（μΐ)的Tween 80混合。加入4.7毫升0.9%的氯化鈉溶液，並將其混 合均勻。 在實驗中，用人類膀胱腫瘤癌T24植入雌性Balb/c無毛老鼠皮下 來決定抗腫瘤活性。在第零天時，動物在經口的麻醉下，於其左腰腹 植入約25毫克的塊狀腫瘤。並將小傷口以縫鉗縫合。在植入六曰 後’老鼠以隨機方式六隻動物分爲一組，並開始治療。此治療持續十· 五曰，每曰一次投與不同劑量，每週二次以玻片測量計測定腫瘤，並 計算其體積。將所得到的結果綜列於下面的表中，其中是指 每曰劑量，'^admin/是指投與方式，\xpei·/是指實驗，、τ/C%， 是指治療組老鼠與非治療控制組老鼠的商値百分比。商値愈小，所投 與的劑量就愈有效。 绶濟部中兴標準局貝工消费含作社印製 每曰劑量 投與方式 平均腫瘤體積 (dose) (admin.) [T/C %] [mg/kg] 實驗.l(exper.l) 實驗.2 6.25 口服 15 12 3.13 口_服 17 14 1.56 口服. 31 0.78 口服 58 3.00 腹膜內注射 9 11 1.50 腹膜內注射 14 19 0.75 腹膜內注射 32 0.38 腹膜內注射 62 0.19 腹膜內注射 74 範例11 : N-[0-(四氫哌喃-4-基)-D-乳醯基]-十字孢黴素的最大耐受劑量 (TMD)之測定 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）-24- sn β,οοο ---------------- -------裝 I!'1— — 訂------% (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) A6 B6 五、發明説明（） 三隻雌性Balb/c無毛老鼠以腹膜內或口服投與n-[ 0-(四氫哌喃-4-基)-D·乳醯基十字孢黴素溶於二甲基亞砜/Tween 80/氯化鈉溶液 (此處方見範例10)。在七天內劑量一直增加直到動物死亡。 最大耐受劑量（口服投與）：62.50毫克/公斤 最大耐受劑量（腹膜內注射）：31.25毫克/公斤 (以下23-24頁用於日本、韓國以及臺灣中請） 範例.12 :化學式I之化合物對不同同型之蛋由催化酵素C活性的抑制 化合物 A: N-[ 0-(四氫哌喃斗基)-D-乳醯基]-十字孢黴素 Β: Ν·[0-(四氫哌喃-4-基)-D-乳醯基]-7-氧基-十字孢黴素 C: Ν-[ 0-(四氫哌喃-4-基)-L-乳醯基]-十字孢黴素 D: Ν-[ 0-(四氫哌喃-4-基氧)-乙醯基]-十字孢黴素 Ε: Ν-[ 0(四氫哌喃-4-基氧)-乙醯基]-7-氧基-十字孢黴素 F: Ν-[ 0-(四氫哌喃4·基氧)-乙醯基]-7-經基-十字孢黴素 G: Ν-[2-甲基-2-(四氫哌喃-4-基氧)-丙醯基卜丨字孢黴素 根據專利說明書內所描述的各生物試驗，上述化合物中得到之百 分之五十抑制濃度（IC5。）（微莫爾/升）如下所示： (請先閱讀背面之注意事項再堉寫本頁) 訂. 經 濟 部 中 楳 準 肩 Ά X. 消 作 社 印 製 化合物 α 1 δ ε ί η A: 0.004 0.023 0.014 0.008 0.15 0.25 54 0.47 B: 0.005 0.014 0.012 0.008 0.085 0.29 >100 0.032 C: 0.03 0.90 D: 0.022 0.08 0.016 0.017 0.46 0.42 4.1 0.21 E: 0.007 0.14 F: 0.033 0.45 G: 0.10 10 範例13 :化學式I之化合物對人類T24膀胱癌細胞的抑制活性 本紙掁八及通用中因國家標準（CNS)肀4规格（2i0 X四7公货）.25 82. 9. (),000 315367 A6 __ B6 五、發明説明（）' (請先閲讀背面之注意事項存塡寫本頁) 根據專利說明書內所描述的各生物試驗，上述A到G化合物中得 到之百分之五十抑制濃度（ICW (微莫爾/升）如下所示： 化合物 A 0.12 B 0.41 C 0.12 D 0.035 E 0.26 F 0.91 G 0.53 範例14 ：化學式I之化合物對PDGF-刺激的受體酪胺酸催化酵素活性 的抑制 根據專利說明書內所描述的各生物試驗，上述A到G化合物中得 到之百分之五十抑制濃度（IC5„)(微莫爾/升）如下所示： 化合物 A <0.08 C <0.08 經濟部中央標準局R工消费合作杜印製 本纸張又度適用中圉國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）.26 H2. 9. fi,(){)()

Claims (1)

1. _ ' 部m . . . . A8 $15367 ?s 二」 D8六、申請專利範圍 1. 一種化學式（1)的>1>(四氫哌哺4·基氧-垸醯基>十字孢黴素衍生物

   經濟部中央梯準局貝工消費合作社印褽 其中所描述的組態欲僅說明相對的立體化學，然而絕對的立體化 學與十字孢黴素的立體化學相當，並且其中 K是氫、羥基、crc4院氧基或氧基， r2是氫或一至四個碳之烷基* r3是氫或一至四個碳之烷基〇 2·如申請專利範圍第1項的化學式（I)化合物，其中R3是氫。 3. 如申請專利範圍第I項的化學式（I)化合物，其中R,是氫、羥基 或氧基，r2是氫或一至四個碳之烷基，113是氫或一至四個碳之烷 基。 4. 如申請專利範圖第1項的化學式（I)化合物，其中&是氫或氧 基，r2是氫或一至四個碳之烷基，R3是氫。 5. 如申請專利範圍第1項的化學式（I)化合物，其中馬是氫或氧 基，R2是氫或甲基，R3是氫。 6. 如申請專利範圍第I到5項中任何一項的化學式（I)化合物，當R2 與R3不同時，其在C-R2位置是（D>組態》 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27- A8 315367 Ιϊ 六、申請專利範圍 7.如申請專利範圍第1項的化學式(I)化合物，其係Ν_[〇^(四氫哌喃-4_基>0-乳醯基】-十字孢徽素。 &如申請專利範圍第1項的化學式（I)化合物，其係Ν_[2·(四氫哝喃-4-基氧>乙醯基十字孢撤素。 9·如申請專利範圍第1項的化學式（I)化合物，其係選自 ΝΗ〇"(四氫哌喃》4«基>1>乳酾基I»7·氧基_十字孢撤素， N-[CK四氫哌喃冰基>L·乳醯基】·十字孢撤素， Ν-ί2>(四氫哌喃冰基氧 > 乙醯基ρ·氧基·十字孢徽素， Ν·ΐ2·(四氫_喃*4邊氧>·乙醸基>7趨基-十字孢撤素，及 Ν·【2-甲基-2·(四氫哌喃+基氧 > 丙醢基]»十字孢撤素》 10. —種抑制蛋白催化酵素C的藥學組成物，包含有效抑制蛋白催化 酵素C劑量的申請專利範圍第1項的化學式（I)化合物以及一藥物 載體。 11. 一種化學式（DD的四氫哌喃*4雀氧-焼酸，

   其中R2是氫或一至四個碳之烷基，^是氫或一至四個碳之烷 基。 (請先聞讀背面之注意事項再壤寫本頁) 訂· •Η ! 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印簟 本紙張尺度埴用中國國家揉率（CNS ) A4规格（210X297公釐} -XO