TW202405019A - 治療性ｃｄ２４人類化單株抗體及抗腫瘤轉譯應用 - Google Patents
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Abstract
本發明為一特異性結合CD24的分離之抗體。本發明也提供一治療表現CD24的癌症之方法。
Description
本發明涉及一結合CD24的分離抗體及其抗腫瘤的用途。
CD24是一種透過醣基磷脂醯肌醇(glycophosphatidylinositol，GPI)固定的高度醣基化黏蛋白型表面膜蛋白。目前已確定CD24在許多人類惡性腫瘤中高度表現，尤其是轉移性疾病。而乳癌是具有高度CD24表現的癌症之一。
乳癌是台灣最常被診斷出的女性癌症，估計每年有16,000例新病例被診斷出來，預計每年約有2,000名患者死亡。自2020年以來，女性乳癌一直在人類癌症中列居全球第一，估計每年有220萬例新病例，且已成為癌症死亡的第五大原因。就基因表現特徵而言，至少有四種乳癌亞型，其包含管狀A型亞型(luminal A)、管狀B型亞型(luminal B)、HER2陽性型亞型(HER2+)以及類基底細胞型亞型(basal-like)，各個亞型彼此不相同。
依據分子表現來分層，管狀A型亞型腫瘤高度表現雌激素受體(estrogen receptor，ER)和/或黃體素受體(progesterone receptor，PR)，但不表現HER2(ER/PR+，HER2-)；管狀B型亞型腫瘤不僅表現ER和/或PR，也會表現HER2(ER/PR+，HER2+)；HFR2陽性型亞型腫瘤高度表現HER2，
但不表現ER/PR(ER/PR-，HER2+)；而類基底細胞型亞型腫瘤則不表現ER、PR和HER2(ER/PR-，HER2-)，其也被稱為三陰性乳癌(triple-negative breast cancer，TNBC)。
無論分子亞型為何，臺灣早期乳癌患者的5年生存率可高達90%，但一項為期10年的追蹤性研究顯示，管狀A/B型亞型的乳癌患者相較於HER2陽性型亞型或具有TNBC特徵的患者來說，有更高5年的生存率預後。此外，具有TNBC特徵的患者的5年生存率預後最差。除了常規化療以外，具陽性激素受體的管狀A/B型亞型乳癌患者(BC patients)通常接受屬於一線內分泌治療之一的泰莫西芬(tamoxifen)治療以降低31%的死亡率。在具有陽性HER2的管狀B型亞型或HER2陽性型亞型乳癌患者中使用賀癌平(herceptin)可將死亡風險降低約33%。儘管如此，20-30%的管狀A/B型亞型乳癌腫瘤通常對tamoxifen治療具有抗藥性，且HER2陽性型亞型患者大多對herceptin反應不佳。
此外，第四期或轉移性乳癌會擴散至乳房以外的其他身體器官。在轉移過程中，乳癌上皮細胞(epithelial breast cancer cells)在經歷上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)後獲得入侵能力，突破終末線管小葉單位(terminal duct lobular unit，TDLU)的基底膜並擴散至附近的淋巴結，最終定植於遠處的重要器官。其中，乳癌細胞擴散的常見器官包括骨骼、肺、肝和腦。因此，乳癌的擴散會大幅降低患者的生存概率，而轉移依然是與乳癌相關的主要死因。其他癌症如大腸直腸癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌也易發生轉移。
目前的乳癌免疫療法主要集中在增強細胞毒性T細胞的抗
腫瘤活性。主要透過兩種殺死癌細胞的方法：PD-1/PD-L1免疫檢查點阻斷；以及用具有出色腫瘤抗原識別能力的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾患者的T細胞。第一種方法目的在增強細胞毒性T細胞的抗腫瘤活性，以更有效地清除腫瘤細胞。第二種方法則著重於提高細胞毒性T細胞的腫瘤靶向效率以及延長細胞毒性T細胞活化的持續時間。然而上述療效往往有限，尤其是在TNBC患者中。
目前還沒有針對TNBC的有效靶向治療。因此迫切需要開發新的針對TNBC以及其他乳癌亞型的有效療法。
本發明收集臺北榮民總醫院、高雄醫科大學附屬醫院和中國醫藥大學附屬醫院三個醫療中心的370例TNBC病例並進行統計。超過80%的TNBC具高表現CD24，進一步說明CD24在TNBC患者中的臨床意義。
如本文所用「一」、「所述」、「該」、「至少一個」和「一個或多個」可以互換使用。
為了能更容易地理解本發明，首先定義某些術語，且在整個詳細描述中闡述了額外的定義。
術語「CD24」包括由細胞天然表現或由CD24基因轉染的細胞表現之任何變體或異構體。
術語「抗體」於本發明中涵蓋完整抗體及其中任何抗原結合片段或單鏈。每條重鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區。每條輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區。VH和VL區可以進一步細分為高變區，其又稱為互補決定區(CDR)。VH和VL區均包含三個CDR，依照以下順序
從胺基末端到羧基末端排列：CDR1、CDR2和CDR3。VH和VL包含與抗原相互作用的結合域。
本發明提供一種特異性結合CD24的分離抗體，該分離抗體包含：(a)重鏈可變區-互補決定區VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，其中該VH-CDR1包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，該VH-CDR2包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，和該VH-CDR3包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；以及(b)輕鏈可變區-互補決定區VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中該VL-CDR1包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，該VL-CDR2包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，和該VL-CDR3包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
本發明提供一種特異性結合CD24的分離抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18之胺基酸序列，其中該VH-CDR1包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，該VH-CDR2包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，和該VH-CDR3包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
本發明提供一種特異性結合CD24的分離抗體，其中該VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。其中該VL-CDR1包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，該VL-CDR2包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，和該VL-CDR3包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
本發明提供一種特異性結合CD24的分離抗體，該分離抗體為人類CD24的分離抗體。
在一個實施方案中，本發明之分離抗體由重鏈核酸和輕鏈核酸編碼，所述重鏈核酸和輕鏈核酸分別為SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15所示之核苷酸序列。
在另一個實施方案中，本發明之分離抗體由重鏈核酸和輕鏈核酸編碼，所述重鏈核酸和輕鏈核酸分別為SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：15所示之核苷酸序列。
本發明進一步提供一種組合物用於製備治療表現CD24的癌症之藥物的用途，其中該組合物包含上述之分離抗體以及一抗癌藥物。
在本發明之一個實施方案中，表現CD24的癌症為實體瘤。
在本發明之一個實施方案中，表現CD24的癌症為乳癌、肝癌或卵巢癌。在一個較佳實施方案中，其中乳癌指的是三陰性乳癌(triple-negative breast cancer，TNBC)。
在另一個實施方案中，其中該三陰性乳癌為肺轉移型三陰性乳癌。
在本發明的一個實施方案中，抗體可以與抗癌藥物同時使用。其中該抗癌藥物包含多烯紫杉醇(docetaxel)、泰莫西芬(tamoxifen)、賀癌平(herceptin)或其組合。本文中的其它抗癌藥物包括化學治療製劑、放射性藥劑或免疫製劑。本文的化學治療製劑包括艾黴素(doxorubicin hydrochloride)、博來黴素(bleomycin)、絲裂霉素(mitomycin)、依妥普賽(etoposide)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、溫諾平(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、抗癌妥(irinotecan)、拓普替康(topotecan)、羥基尿素(hydroxyurea)、環胺(cyclophosphamide)、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、卡鉑普來錠(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、截瘤
達錠(capecitabine)、伊馬替尼(imatinib)和戈舍瑞林(goserelin acetate)，但不只上述藥物。
本發明還提供一種用於偵測體外樣本中表現CD24之方法，該方法包括：(1)提供一個體的體外樣本；(2)將該體外樣本與一具特異性結合CD24之捕獲抗體接觸，其中該捕獲抗體為本發明之分離抗體；(3)添加一標記偵測抗體，其與該捕獲抗體結合以形成由CD24、捕獲抗體和標記偵測抗體組成的一免疫複合物；以及(4)測定形成該免疫複合物中標記的量，以確定該體外樣本中CD24的存在或水平。
本發明還提供一種用於偵測體外樣本中表現CD24之方法，其中該體外樣本選自血液、淋巴液、組織液、體腔液、口腔黏膜液、循環腫瘤細胞中的至少一種或其組合。
本發明還提供一種用於偵測體外樣本中表現CD24之方法，其中該體外樣本為血液。
本發明還提供一種用於偵測體外樣本中表現CD24之方法，其中該血液為全血、血漿或血清。
本發明中所述之樣本不限於血液、血漿、血清、淋巴液、組織液、體腔液、口腔粘膜液、循環腫瘤細胞中的至少一種或其組合。
鑑於上述技術情況，本發明提供一種靶向乳癌CD24的分離抗體或抗原結合片段。也揭露重鏈多肽和輕鏈多肽。抗體、抗原結合片段和多肽可以以分離和/純化的形式提供，並且可以配製成適合用於研究、治療和診斷的組合物。
本發明之分離抗體可以存於多種抗體的異構型，例如IgG1、
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE。其通常包括IgGl、IgG3、IgG4和IgM之異構型。抗體可以是完整的或可以是僅包括抗原結合的部分。
本發明之分離抗體，其進一步包含一結晶區域片段(fragment- crystallizable，Fc)區。
本發明之分離抗體，其中該Fc區為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE抗體或其任何亞類。
在一個較佳的實施方案中，本發明之分離抗體中的Fc區為IgG。
本發明還提供一種組合物用於製備治療表現CD24的癌症之藥物的用途。這種用途部分歸因於它們獨特的特異性，例如抗原決定位特異性、親和力、結構和功能活性。
另一方面，本發明之分離抗體可以與一種或多種治療劑或其組合共同給藥，例如共同形成一醫藥組合物或分開給藥。此類治療劑可以是一種或多種另外的抗癌藥物、化療藥物、放射性藥物、免疫檢查點抑制劑或其組合。
另一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含一本發明之分離抗體和一醫藥上可接受的載體和賦形劑。該醫藥組合物還可以包含一種或多種治療藥劑或其組合，例如以上所揭露的抗癌藥物。
另一方面，本發明還提供檢測體外樣本中CD24抗原或表現CD24的細胞的試劑盒，其包含本發明之分離抗體和使用說明書。
本發明的其他特徵和優點將從以下非限制性的詳細描述和
實施例中揭露。
圖1顯示用於小鼠免疫的CD24小鼠結晶區域片段(murine fragment- crystallizable，mFc)融合蛋白的設計、表現和純化。圖1A為CD24 mFc融合蛋白的建構圖。圖1B使用考馬斯亮藍染色檢驗CD24 mFc融合蛋白的純化(1=1微克純化CD24 3c mFc；2=空白序列；3=10微克3c蛋白酶水解純化CD24 3c mFc；4=10微克第一流穿液(flow through，FT)蛋白A(poly-A)樹脂；5=10微克第二FT poly-A樹脂；6=1微克3c蛋白酶)。圖1C使用西方墨點法分析抗小鼠Fc抗體和商業用CD24抗體的差異(1=培養基介質；2=FT poly-A樹脂；3=50奈克純化CD24 mFc)。圖1D透過FACS分析P-選擇素Fc融合蛋白與表現重組人類CD24 mFc的293細胞結合的能力。圖1E為P-選擇素Fc融合蛋白可以特異性識別293細胞表現的重組CD24。圖1F為使用純化的重組人類CD2 mFc進行免疫試驗。縮寫：GPI為醣基磷脂醯肌醇(glycophosphatidylinositol)；FACS為流式細胞分選技術(fluorescence-activated cell sorting)。
圖2顯示候選抗CD24單株抗體(monoclonal antibody，mAb)產生融合瘤克隆(hybridoma clones)的篩選和驗證。圖2A以流式細胞技術(flow cytometry，FC)分析9種融合瘤克隆的上清液(SN)。圖2B以ELISA檢測9種融合瘤克隆的上清液。圖2C以SDS-PAGE分析9種融合瘤克隆mAb的純度。圖2D為比較9種mAb的MFI差異。圖2E為比較在不同濃度下的9種mAb之MFI差異。縮寫：MFI為平均螢光強度(mean fluorescence intensities)。
圖3顯示使用表面等離子共振(surface plasmon resonance，
SPR)技術對內部製備的CD24 mAb之結合親和力進行單循環動力學分析(single cycle kinetics analysis)。
圖4為9種mAb的螢光顯微圖。
圖5顯示在體外模型中抗CD24 mAb對具陽性CD24之TNBC的細胞存活率之影響。
圖6顯示使用多肽掃描法對9種抗CD24 mAb進行抗原決定位圖譜，揭露CD24成熟結構域內的共同抗體結合區域。
圖7顯示建立表現CD24的TNBC異種移植小鼠模型，並以FACS對CD24陽性細胞進行分選。
圖8顯示候選抗CD24 mAb的體內抗腫瘤活性。圖8A為測試9種克隆的候選CD24 mAb體內抗腫瘤潛力之試驗流程。圖8B為9種CD24 mAb治療後的小鼠腫瘤體積比較分析圖。
圖9顯示使用MDA-MB-468異種移植小鼠模型研究CD24 mAb H1(H1)的抗腫瘤效力。圖9A為免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠注射MDA-MB-468細胞並注射抗體的流程圖。圖9B為荷瘤小鼠的抗體注射治療流程圖。圖9C為第一周荷瘤小鼠接受不同濃度的H1治療後的腫瘤體積。圖9D為200天內荷瘤小鼠接受不同濃度的H1治療後的腫瘤體積變化量。
圖10顯示H1治療的荷瘤小鼠的體內(in vivo)成像。
圖11顯示H1治療抑制原發性腫瘤切除小鼠模型中的遠端肺轉移(distant lung metastasis)。圖11A為試驗流程圖。圖11B為荷瘤小鼠的腫瘤體積變化圖。圖11C為荷瘤小鼠於第六周的腫瘤體積。圖11D為荷瘤小鼠
的體內成像與光子計數圖。圖11E以HE染色(hematoxylin-eosin staining)分析接受H1治療的荷瘤小鼠的肺組織。圖11F為荷瘤小鼠的存活率。
圖12顯示H1和多烯紫杉醇(docetaxel)聯合治療陽性CD24的TNBC表現出協同抗腫瘤作用。圖12A為實驗設計流程圖。圖12B為接受不同注射處理後的荷瘤小鼠TNBC腫瘤體積變化量。圖12C為接受不同注射處理後的荷瘤小鼠存活率。
圖13為先導H1的生物安全性評估。
圖14為H1對IV2 CD24陽性/陰性模型的TNBC腫瘤生長分析。圖14A為IV2 CD24陽性模型的TNBC腫瘤體積變化量、腫瘤重量以及免疫染色圖。圖14B為IV2 CD24陰性模型的TNBC腫瘤體積變化量、腫瘤重量以及免疫染色圖。
圖15為注射H1後的SCID小鼠身上切除的原發性腫瘤分析。圖15A使用免疫組織化學染色(immunohistochemistry，IHC)分析切除的腫瘤組織中不同細胞的分布。圖15B為注射H1後切除的腫瘤組織中不同細胞的數量。
圖16為一破譯主要H1的抗體結合區(fragment antigen binding，Fab)序列示意圖。
圖17顯示嵌合抗人類CD24 mAb H1(CH-01)的設計、生產、純化及抗腫瘤驗證。圖17A為CH-01的設計圖。圖17B為CH-01生產流程圖。圖17C為荷瘤小鼠在注射CH-01後12周內的體內成像圖。圖17D為荷瘤小鼠在注射CH-01後12周內的光子計數。圖17E為荷瘤小鼠在注射CH-01後的腫瘤體積變化量。圖17F為荷瘤小鼠在注射不同濃度的CH-01後之腫瘤體積變
化量。
圖18顯示先導H1的抗體人類化。圖18A為先導H1的抗體人類化的設計流程圖。圖18B為L1H2與原始小鼠H1的分子疊加圖。圖18C為含有輕鏈或重鏈的載體。
圖19顯示人類化mAb HH-01-46(HH-01-46)的生產和功能驗證。圖19A使用考馬斯亮藍染色檢驗人類化HH-01-46的純化。圖19B為人類化HH-01-46與親本CH-01抗體針對CD24陽性MDA-MB-468的敏感性和特異性。圖19C使用表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)測定人類化HH-01-46的結合親和力。圖19D使用FC分析人類化HH-01-46與親本CH-01抗體分別結合一系列TNBC細胞株的強度。
圖20顯示人類化HH-01-46與CH-01在陽性CD24的TNBC異種移植小鼠模型中的抗腫瘤活性比較。圖20A為TNBC異種移植小鼠注射人類化HH-01-46與CH-01後的體內成像。圖20B為TNBC異種移植小鼠注射人類化HH-01-46與CH-01後的腫瘤體積變化量。圖20C為TNBC異種移植小鼠注射人類化HH-01-46與CH-01後的腫瘤組織比較和腫瘤種量比較。
圖21顯示CH-01與docetaxel組合在人類化的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)高度免疫缺陷(advanced severe immunodeficiency，ASID)小鼠模型中的抗腫瘤功效。圖21A為實驗流程圖。圖21B為不同處理下ASID小鼠的腫瘤體積變化量。
圖22顯示人類化HH-01-46促進抗體依賴性(antibody-dependent)吞噬作用和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。圖22A為免疫染色圖。圖22B為人類化HH-01-46對不同細胞的超過肌動蛋白倍率變化影響。圖
22C用抗體依賴性細胞毒殺作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)測定人類化HH-01-46促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。
圖23顯示用人類化HH-01-46和CH-01預處理的TNBC細胞分析Akt/Erk致癌信號。
下面的實施例為非限制性的，僅代表本發明的各個方面和特徵。
實施例1：人類化CD24小鼠結晶區域片段(murine fragment-crystallizable，mFc)融合蛋白構造。
成熟的人類化CD24僅由35個高度醣基化的胺基酸殘基組成，並且CD24透過醣基磷脂醯肌醇(glycophosphatidylinositol，GPI)錨附著在質膜表面。由IL2信號胜肽、CD24成熟結構域和CD24 mFc融合蛋白組成的融合蛋白構建如以下分子設計所示。Fc代表小鼠免疫球蛋白G(IgG)的恆定片段。
CD24 Fc融合蛋白的分子設計：(IL2信號胜肽)-SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTKAAG-(ASTGS)-Fc(即高效前導胜肽-CD24成熟結構域-連接胜肽-結晶區域片段)。
圖1的結果顯示，設計包含IL2信號胜肽序列的重組人類化CD24 mFc融合蛋白。智人和鼠類物種之間具有較差相似性的獨特成熟結構域，以及包含GPI序列後的3c蛋白酶切割位點的連接子序列(圖1A)。
實施例2：CD24 mFc融合蛋白的分離純化
使用HEK293細胞將CD24 Fc表現構建體瞬間導入Expi293F的表現系統。收集含有CD24 mFc融合蛋白的培養基並進行蛋白A(poly-A)樹脂純化方案。純化的CD24 mFc透過SDS-PAGE結合考馬斯亮藍染色和西方點墨法進一步分析。從上述程序中純化毫克級的CD24 mFc融合蛋白。
得到的人類化CD24 mFc構建體在Expi293哺乳動物細胞表現系統中表現，人類化CD24 mFc融合蛋白使用poly-A樹脂從培養基中純化，然後透過3c蛋白酶水解(圖1B)。所得水解和未水解的CD24 mFc融合蛋白透過SDS-PAGE結合考馬斯亮藍染色(圖1B)進行驗證，CD24 mFc也分別使用抗小鼠Fc抗體和商業用抗CD24抗體-貝克曼(Beckman)以西方點墨法進行分析(圖1C)。
透過ELISA和流式細胞分選技術(fluorescence-activated cell sorting，FACS)測定法檢測使用天然的P-選擇素(P-selectin)配體的CD24 mFc融合蛋白之生物活性。
在活化的血小板和內皮細胞上表現的P-選擇素是眾所周知的CD24配體。首先，將0.1、0.5和1.5微克/毫升的P-選擇素塗在96孔盤上用於ELISA測定。如圖1D所示，CD24 mFc融合蛋白與P-選擇素之間的結合以劑量依賴性方式增加。此外，透過FACS分析證實P-選擇素融合蛋白與表現重組人類CD24蛋白的293細胞結合的能力。為此生成沒有mFc連接到其N末端的CD24表現構建體，並將該新構建體引入293T細胞以表現細胞膜上的CD24。如圖1E所示，P-選擇素Fc融合蛋白可以特異性識別293細胞表現的重組CD24。
實施例3：小鼠免疫
純化的CD24 mFc融合蛋白用於小鼠免疫。簡而言之，將250微克的純化重組CD24 mFc融合蛋白注射至小鼠的腹膜內，收集來自5隻小鼠(例如雌性BALB/c；4至6週齡)的免疫前血液樣本。在免疫實驗當中，每隻小鼠施用適當體積的PBS，其含有25至100微克CD24 mFc抗原。使用22號針頭將含有100微克CD24 mFc的乳膠注射至小鼠腹膜內。免疫後監測潛在毒性。在第一次注射後，會進一步對小鼠每2周用50微克CD24 mFc進行免疫注射兩次，總共注射三次。在兩至三周後，從免疫小鼠中收集血液樣本，使用ELISA或FACS分析測量血液樣本的抗體滴度。
純化的重組人類CD24融合蛋白用於小鼠免疫。收集來自5隻小鼠(雌性BALB/c；4至6週齡)的免疫前血液樣本。首先透過腹膜內注射250微克的純化CD24 mFc融合蛋白對小鼠進行免疫，隨後每2週注射兩次(50微克)，總共注射三次。免疫後監測潛在毒性。第三次注射CD24 Fc的三週後，從5隻小鼠中收集血液樣本並使用西方點墨法或FACS分析法測量抗體活性。如圖1F所示，小鼠免疫是成功的，因為每隻小鼠都能夠使用流式細胞技術(flow cytometry，FC)產生針對人類CD24的抗體。
實施例4：透過FC分析評估免疫效果。
將CD24陽性細胞與5mM乙烯二胺四乙酸(EDTA)孵育10分鐘以從培養皿中分離細胞。然後用5毫升PBS洗滌細胞兩次以去除EDTA。將5x105個細胞與1/20稀釋的小鼠血清在4℃下孵育40分鐘，然後用與PE結合的山羊抗小鼠抗體(goat anti-mouse conjugated)進行處理。在使用Calibre 2軟件進行FC分析前，將樣本進行避光處理。使用Calibur
CellQuest Pro(BD)軟件進行數據採集和分析。
實施例5：融合瘤(hybridoma)的建立
選擇並犧牲具有最佳體液反應的免疫小鼠以從其脾臟中分離B細胞用於後續融合方案。使用聚乙二醇(PEG)進行骨髓瘤細胞株Sp2/0-Ag14和B細胞間的融合，接著進行氨喋呤(aminopterin)選擇以消除未融合的骨髓瘤細胞。PEG充當融合劑，融合相鄰骨髓瘤和/或抗體分泌細胞的細胞質膜，產生具有兩個或更多核的單一細胞。由於缺乏補救途徑，未融合的骨髓瘤細胞會被氨喋呤清除。氨喋呤用於阻斷細胞從頭合成核苷酸的途徑，並迫使它們透過補救途徑合成核苷酸，而骨髓瘤細胞則沒有。具有功能性補救途徑的B細胞在培養中存活時間不長，最終會在兩週後死亡。因此，只有融合種可以在藥物選擇中存活下來，接著針對獲得的融合種群進行抗體生產能力的初步篩選。
從脾臟中分離小鼠B細胞，並用PEG與小鼠骨髓瘤細胞株融合。透過在HAT選擇培養基中培養以消除未融合的細胞。首先分離出共9種陽性融合瘤的克隆(CD24 mAb H1-H9，H1-H9)以進一步分析。接著測試該9種融合瘤的克隆分泌抗CD24 mAb的能力。
實施例6：融合瘤篩選
在融合和藥物選擇一周後，使用ELISA測定檢查融合細胞克隆的上清液中抗CD24 mAb的存在，其中CD24 mFc用作抗原，無關的Fc融合蛋白用作陰性抗原控制組。來自僅結合CD24 mFc抗原的克隆的上清液被認為是潛在的陽性克隆，而那些同時結合CD24 mFc和陰性抗原控制組的克隆被認為是假陽性克隆。初步篩選後，選擇分泌大量抗CD24 mAb
滴度的陽性克隆並擴增至24孔板。將得到的陽性克隆經有限稀釋(limiting dilution)分離，並對單細胞生長的融合瘤細胞進行二輪篩選，獲得具有抗CD24 mAb生產能力的融合瘤克隆。所得融合瘤克隆被用於生產抗CD24 mAb。
如圖2A所示，對9種融合瘤的克隆的上清液(SN)進行FC分析。使用Beekman CD24 mAb作為陽性抗體控制組；測試細胞株分別為BT-549、MDA-MB-468、Hs-578T以及MCF-7；每種細胞株皆浸泡濃度10倍稀釋的融合瘤上清液45分鐘以及濃度250倍稀釋的Alexa-488 α-抗小鼠抗體45分鐘。分析結果顯示，9種融合瘤的克隆皆能夠分泌特異性結合TNBC細胞株表面CD24的抗CD24 mAb。
如圖2B所示，ELISA檢測還顯示9種融合瘤的上清液可以特異性結合CD24抗原。
實施例7：小鼠腹水法(mouse ascites method)製備抗CD24 mAb
為獲得足量的mAb而進行後續抗CD24 mAb的功能性評價。進行體內CD24 mAb的生產，又稱為小鼠腹水法。
在接種產生抗CD24 mAb的融合瘤細胞前一周，BALB/c小鼠首先透過腹膜內注射1毫升姥鮫烷(pristane)。產生抗CD24 mAb的融合瘤在175cm2培養燒瓶中，以完全DMEM-10/HEPES/丙酮酸鹽進行培養，培養溫度為37℃。接著收穫細胞並離心並去除上清液。洗滌細胞並重懸於2.5×106個細胞/毫升的PBS中。透過注射2毫升融合瘤細胞至BALB/c小鼠腹膜內。兩週後，透過將19G針頭插入小鼠腹腔以排出含有高濃度抗CD24
mAb的小鼠腹水液，並將其收集。
每個融合瘤都是以腹膜注射至小鼠體內，注射後三週收集腹水並進行純化。收集的腹水經Protein A-Sepharose Fast Flow(PASFF)過濾和純化，隨後以pH值為3.0的檸檬酸緩衝液洗脫CD24 mAb。將最終緩衝液更換為pH值為7.0的PBS溶液。以SDS-PAGE解析來自每個融合瘤的純化的CD24 mAb純度和量，如圖2C所示。圖2C中9種融合瘤的克隆的CD24 mAb純度參考如表一。
表一、融合瘤的克隆的CD24 mAb純度
實施例8：純化來自小鼠腹水的抗CD24 mAb
使用基於poly-A的捕獲步驟，然後進行額外的層析步驟，進而從小鼠腹水中純化抗CD24 mAb。簡而言之，將腹水加到poly-A柱上，並以PBS洗滌。然後為了CD24 mAb的純化，將洗脫緩衝液用於poly-A柱。純化的CD24 mAb透過0.22微米過濾器以去除潛在的污染物。
實施例9：透過FC評估CD24 mAb H1(H1)的靈敏度。
研究9種純化CD24 mAb的靈敏度。將1x105個MDA-MB-468細胞與濃度為50微克/毫升的單個CD24 mAb一起孵育30分鐘，然後用與Alexa 488偶聯的小鼠二抗處理30分鐘。如圖2D所示，H1在9種CD24 mAb中具有最高的平均螢光強度(mean fluorescence intensities，MFI)。
每個CD24 mAb的靈敏度透過一系列稀釋後進一步評估，然後對CD24 mAb進行FC分析。將1x105個MDA-MB-468細胞與濃度為
5豪微克/毫升、0.5微克/毫升以及50微克/毫升的一系列CD24 mAb一起孵育30分鐘，然後用與Alexa 488偶聯的小鼠二抗處理30分鐘。如圖2E所示，所有濃度為5豪微克/毫升的CD24 mAb皆足以產生顯著的MFI，表明它們與CD24的結合具高靈敏度。
使用Cy5®結合試劑盒(艾博康Abcam，加利福尼亞州CA，美國USA)，並根據製造商說明使用Cy5螢光染料標記純化的H1。
實施例10：體內成像系統(in vivo imaging system，IVIS)的成像
給小鼠靜脈內注射100微升用Cy5螢光染料標記的H1，並在注射後第1天、第3天和第7天記錄螢光信號。接著小鼠被轉移至體內成像系統光譜(IVIS Spectrum)的成像室，以分析波長為647奈米的發射螢光信號(Perkin Elmer Inc.，MA，USA)。使用Living Image Software 4.0(Perkin Elmer Inc.，MA，USA)測量和分析螢光。
實施例11：表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)分析
每個CD24 mAb克隆的結合親和力由SPR測定。使用BiacoreTM 8K，一種高通量與高靈敏度的SPR系統。首先將10nM重組CD24 mFc蛋白溶解在pH值為5.0的NaOAc中，並在測量前透過胺偶聯固定在傳感器芯片的金屬表面上。使用5種不同濃度的CD24 mAb進行單循環動力學(single cycle kinetic，SCK)程序，並測量解離常數Kd和締合常數Ka。CD24 mAb的結合親和力(KD)由Kd和Ka的比率決定。我們測定8種CD24 mAb的結合親和力，KD值在9-10M到10-13M之間，具有
很好的結合親和力。其中H6、H7和H8的結合親和力遠高於H1、H3、H4、H5和H9(圖3)。總之，抗CD24 mAb的所有8個克隆都對CD24具有很強的結合親和力。
CM5系列傳感器芯片首先與BiacoreTM 8K(GE Healthcare Life Sciences，NY，U.S.A.)對接，PBS中含有0.05% P20作為運行緩衝液。pH值為5.0的NaOAc溶液中，10nM CD24小鼠融合蛋白(配體)透過胺偶聯法以10微升/分鐘的流速固定在CM5傳感器芯片上30秒。使用5種濃度的抗CD24 mAb(7.5、15、30、60、120nM)作為分析物進行SCK程序，其流速為50微升/分鐘。檢查8種純化的抗CD24 mAb對CD24小鼠融合蛋白配體的結合親和力。締合常數ka和解離常數kd使用1對1結合模型擬合，結合常數KD由以下公式計算：
實施例12：FACS分析
將CD24陽性細胞與5mM EDTA一起孵育10分鐘以從培養皿中分離細胞。然後用5毫升PBS洗滌細胞兩次以去除EDTA。將5x105個細胞與小鼠血清、融合瘤上清液或純化的CD24 mAb以1/20稀釋度於4℃下孵育40分鐘，然後用與PE結合的山羊抗小鼠抗體處理。樣本會在以Calibre 2進行FACS分析前進行避光處理。使用Calibur CellQuest Pro(BD)軟件進行數據採集和分析。
實施例13：細胞存活率測試(MTS assays)
將5000個細胞接種在96孔板中，並與一系列濃度的CD24 mAb(0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20微克/毫升)一起孵育，培養三天後根據製造商說明使用CellTiter試劑盒(Promega，CA，美國)。
實施例14：抗體介導的受體內化測定
mAb在與腫瘤細胞表面靶標結合後誘導mAb/靶標複合物內化的能力是抗體治療潛力的標誌之一。透過受體內化測定檢測CD24 mAb觸發表面CD24內化的能力。MDA-MB-468細胞分別用9種CD24 mAb於4℃下染色30分鐘，然後用Alexa 488偶聯的抗小鼠抗體染色30分鐘。於4℃下使用螢光顯微鏡觀察CD24的膜定位，在37℃下孵育細胞24小時後進行CD24內化測定。
如圖4所示，所有的CD24 mAb都可以觸發CD24的內化。此外，H1和H9顯示有更佳的CD24染色細胞內化強度。
如圖5所示，所有的CD24 mAb在體外模型並不影響TNBC的細胞生長。
實施例15：抗原決定位作圖
根據CD24胺基酸序列設計並構建掃描多肽庫(scanning peptide library)。重疊的多肽被兩個殘基抵消12-單體(mers)，且每個胜肽被生物素化以用於隨後的ELISA測定。
如圖6所示，發現共享相同胺基酸序列NSGLAP的四個重疊胜肽對所有9種CD24 mAb皆有反應，表示所有9種抗體克隆都對相同
的CD24抗原決定位胺基酸序列(包括NSGLAP)有反應。
實施例16：hCD24表達慢病毒載體的構建及慢病毒顆粒的製備
設計一融合基因，其在5個主要區域中包含小鼠信號胜肽(interlulin-2，mIL-2)的編碼序列，然後是成熟人類CD24多肽的編碼序列。mIL2_hCD24GPI融合基因由MDBio,Inc.合成，並使用特異性限制酶克隆到慢病毒載體pLVX中。使用質粒DNA Maxiprep試劑盒擴增所得pLVX-mIL2_hCD24GPI慢病毒質體(lentiviral plasmid)。
使用臺灣臺北中央研究院RNA技術平台與基因操控核心設施(RNAi core)提供以下方案製備的慢病毒顆粒。簡而言之，在轉染前的18小時，將2.0x106個293T細胞接種在10公分培養皿中。VSV-G-假型慢病毒(pCMVDR 8.91和pMD.G)的包裝質體連同pLVX-mlL2_hCD24GPI慢病毒質體在OPTI-MEM轉染培養基中以預定比例與Mirus TransIT混合。將轉染子加入10公分的培養皿中，轉染細胞8小時。8小時後去除轉染子，加入10毫升1%BSA完全培養基至培養皿中，將轉染細胞孵育24小時。24小時後收集上清液，並以4℃保存。接著於培養皿中加入10毫升1%BSA完全培養基，再培養24小時。然後收穫新的上清液並與先前收穫的上清液混合。將最後20毫升的上清液以1,500rpm離心5分鐘以去除細胞碎片。透過將所得慢病毒上清液與Lenti-X Concentrator溶液混合後進一步濃縮，並將混合物於4℃下孵育過夜以充分沉澱病毒顆粒。將混合物於4℃下以2,000克離心30分鐘以去除上清液。將濃縮的慢病毒顆粒重懸於1毫升完
全培養基中，並以-80℃保存。
包含成熟結構域和GPI錨定結構域的完整人類CD24編碼序列被構建到pLVX病毒載體中。從293T細胞製備pLVX慢病毒顆粒。接著用病毒顆粒感染MDA-MB-231衍生的IV2細胞48小時，然後在含有400微克/毫升G418的培養基中進行藥物選擇。藥物選擇兩週後，使用FC分析細胞表面的CD24表現。
如圖7所示，藥物選擇後，89.4%的IV2細胞顯示CD24陽性。然後進一步對CD24陽性細胞族群進行分選，得到CD24陽性率超過99%的細胞族群。分選後的CD24陽性細胞族群用於表徵(characterization)9種抗CD24 mAb的體內抗腫瘤活性。
實施例17：使用異種移植免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠模型評估CD24 mAb的體內抗腫瘤功效
針對MDA-MB-468異種移植模型，在CD24 mAb的單一療法前三天，將與基質凝膠(matrigel)混合的2.5x106個細胞注射至小鼠的第4乳腺脂肪墊(4th mammary fat pad)中。鑑於MDA-MB-468細胞僅產生生長緩慢的腫瘤，為了評估CD24 mAb注射的長期效果，治療方案設計如下：治療方案一：荷瘤小鼠(tumor-bearing mice)接受CD24 mAb單一療法，進行每周兩次的CD24 mAb靜脈注射，劑量為5毫克/公斤或10毫克/公斤，共注射10次。治療方案二：進行一周兩次的CD24 mAb靜脈注射，劑量為5毫克/公斤或10毫克/公斤，並暫停兩週。治療方案三：荷瘤小鼠進行每周一次的CD24 mAb靜脈注射，劑量為5毫克/公斤或10毫克/公斤，共注射
7次。每三天記錄一次腫瘤的生長，且小鼠最終會以人道方式被犧牲。
針對IV2-CD24異種移植模型，在CD24 mAb的單一療法前三天，將混合有基質凝膠的1x106個細胞注射至小鼠的第4乳腺脂肪墊中。CD24 mAb透過靜脈注射，每週注射一次，劑量為5毫克/公斤，兩個月內總共注射8次。最終小鼠會以人道方式被犧牲，並取出其體內的異種移植腫瘤並固定在福爾馬林溶液中以供進一步檢查。
如圖8A所示，測試9種克隆的候選CD24 mAb體內抗腫瘤潛力。將1x106個IV2-CD24細胞注射到免疫小鼠的第4乳腺脂肪墊中。接著三天後，荷瘤小鼠透過尾巴靜脈注射以進行CD24 mAb治療，劑量為10毫克/公斤，每週1次，在八週內總共注射8次。
在第一輪實驗中，評估H1、H2、H3、H4和H9，將這些CD24 mAb組與同一控制組進行腫瘤體積的比較。在第二輪實驗中，使用第二控制組與H5、H6、H7和H8組進行腫瘤體積的比較。如圖8B所示，H1和H9顯示具有最佳的抗腫瘤功效，而H6顯示中等的抗腫瘤功效。儘管H2、H3、H4、H5、H7和H8對CD24具高結合親和力，但並未顯示有顯著的抗腫瘤潛力。
實施例18：使用異種移植SCID小鼠模型評估CD24 mAb的體內抗腫瘤功效
針對原發性腫瘤切除模型(primary tumor resection model)，將1x106個瑩光素酶標記的IV2-CD24(IV2-CD24-luc)細胞與基質凝膠混
合注射到小鼠的第4乳腺脂肪墊中，當腫瘤直徑達到約1公分時，於第六周切除腫瘤。原發性腫瘤切除後一周，透過靜脈注射進行CD24 mAb單一療法。以10毫克/公斤的劑量每週一次向小鼠注射PBS或CD24 mAb，共注射6次。使用IVIS檢測小鼠肺轉移情況。簡而言之，小鼠靜脈注射0.2毫升5毫克/毫升瑩光素，並進行異氟醚(isoflurane)氣體麻醉。小鼠被放置在IVIS檢測室中以檢測來自小鼠肺部的發光信號。使用活體動物影像軟體(living image software)計算光子信號。
圖9中評估H1在使用MDA-MB-468細胞時的不同TNBC異種移植模型中的抗腫瘤功效。將2.5x106個MDA-MB-468細胞注射至SCID小鼠的第4乳腺脂肪墊中，荷瘤小鼠分別接受5毫克/公斤和10毫克/公斤兩種不同劑量的三輪CD24 mAb治療(圖9A和圖9B)。
如圖9C所示，三組中的荷瘤小鼠在第一周具有相似的腫瘤體積。
如圖9D所示，給予5毫克/公斤和10毫克/公斤的H1皆可以有效抑制MDA-MB-468異種移植小鼠模型的原發腫瘤生長。
綜上所述，顯示測試mAb的抗腫瘤活性。H1表現出最佳的潛力，被選為先導抗體(lead antibody)。
然後，接下來的實驗是為了確認所選CD24 mAb對腫瘤位點的靶向作用可以導致腫瘤萎縮。
使用多肽偶聯試劑盒(amine coupling kit)將1毫克H1共
價偶聯到Cy5瑩光染劑。將1x106個MDA-MB-468細胞原位移植到SCID小鼠以建立異種移植腫瘤。腫瘤接種兩週後，將100微克Cy5標記的H1透過尾巴靜脈注射到荷瘤小鼠體內。兩天後，將小鼠用異氟醚麻醉並置於供氧的IVIS室中，並使用IVIS成像系統測量瑩光信號。
如圖10所示，在IVIS成像的腫瘤部位檢測到Cy5標記的H1，表示H1具有腫瘤靶向能力。
實施例19：原發性腫瘤切除小鼠模型中的遠處肺轉移
如圖11所示，將1x106個IV2-CD24細胞注射到SCID小鼠的第4乳腺脂肪墊中，當原發腫瘤直徑達到1公分時將其切除。如圖11B和圖11C所示，腫瘤生長曲線顯示八隻荷瘤小鼠攜帶相似的腫瘤負荷量。將小鼠的原發性腫瘤切除後，將小鼠隨機分為兩組(每組樣本=4)。原發性腫瘤切除後一周，小鼠每週一次透過尾巴靜脈注射10毫克/公斤H1，共注射四次。使用IVIS在第四次mAb注射後第11週監測肺轉移狀態。
如圖11D所示，與對照小鼠相比，接受CD24 mAb注射的小鼠顯示肺轉移有減少的現象。而且，如圖11E所示，CD24 mAb處理的小鼠在小鼠肺組織的HE染色(hematoxylin-eosin staining)中沒有觀察到有肺轉移的情形。三隻小鼠在實驗結束時接受CD24 mAb注射，且全部存活(圖11F)。
實施例20：細胞培養
MDA-MB-468和IV2細胞維持在含有10%胎牛血清(fetal
bovine serum，FBS)、2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)及1%青黴素/鏈黴素的完全DMEM培養基中。表達CD24的穩定細胞株維持在含有400微克/毫升G418的完全培養基中。在5微克/毫升嘌呤黴素(puromycin)中培養表達GFP-瑩光素酶的穩定細胞株。所有細胞株均保存在37℃、5% CO2的加濕培養箱中。
實施例21：抗CD24 mAb與docetaxel的聯合療法
根據先前的臨床試驗，免疫檢查點抑製劑(immune checkpoint inhibitor，ICIs)經常與標準化療藥物聯合使用，與單獨化療相比，對癌症患者顯示出進一步的改善效果。因此在異種移植小鼠模型中評估H1與docetaxel的聯合療法的協同抗腫瘤作用。
實驗設計如圖12A所示。首先，在治療前一周將2x106個表達CD24的MDA-MB-231-IV2細胞注射至SCID小鼠的第4乳腺脂肪墊中。透過腹胺注射2毫克/公斤H1，每週注射一次，共注射8次。在接受CD24 mAb後一天透過靜脈注射5毫克/公斤docetaxel，共注射4次。
處理組設計如下：荷瘤小鼠以靜脈注射進行每週注射(1)PBS(作為控制組)(樣本數=4)、(2)H1(樣本數=5)、(3)docetaxel(樣本數=5)以及(4)H1加docetaxel(做為聯合療法組)(樣本數=5)，持續注射六週。10毫克/公斤H1和2.5毫克/公斤docetaxel用於聯合療法。在六週內監測和記錄腫瘤生長情形。
如圖12B所示，與H1或docetaxel單一療法相比，H1加
docetaxel處理在治療早期觀察到顯著的協同抗腫瘤作用，並持續到研究終點。本實施例會於第一隻小鼠死亡當天停止記錄腫瘤生長的紀律。此外，如圖12C所示，Kaplan-Meier存活分析顯示，控制組的中位存活期為106.8天，docetaxel組為97.4天。H1組和聯合療法組均未達到中位存活期。與控制組和docetaxel組相比，H1的單藥治療和聯合治療均能顯著延長荷瘤小鼠的存活期。此外，接受聯合療法的小鼠顯示出有最佳的存活益處。
在聯合療法的前三天，將1x106個與基質凝膠混合的IV2-CD24細胞注射至小鼠的第4乳腺脂肪墊中。並評估聯合療法中H1加docetaxel處理與PBS加docetaxel處理的差異。
實施例22：評估H1的潛在毒性
H1的潛在毒性可以透過肝功能、腎功能以及人類紅血球細胞的結合親和力來評估。來自健康捐血者的人類全血以1：100的稀釋倍數，並用H1染色，然後進行抗小鼠異硫氰酸螢光素(fluorescein fluorescent，FITC)染色。
如表二所示，H1處理組的肝功能和腎功能未超過以下指標的正常範圍(ALT(GPT)：肝功能指數(alanine aminotransferase)；BUN：血清尿素氮(blood urea nitrogen)；creatinine：肌酸酐)。
表二、H1的評估分析
如圖13所示，H1均未與人類紅血球細胞結合，說明H1具有高度特異性，與人類紅血球細胞無交叉反應。
為了進一步證實H1的抗腫瘤活性，進一步考慮腫瘤的CD24水平。本實施例評估H1在CD24陰性和CD24陽性TNBC異種移植小鼠模型中的抗腫瘤作用。
如圖14A所示，H1顯著抑制CD24陽性腫瘤的生長。然而圖14B中顯示H1對CD24陰性腫瘤的抗腫瘤作用有限，說明H1的抗腫瘤活性完全依賴於腫瘤的CD24水平。
實施例23：臨床樣本中CD24的免疫組織化學染色(immunohistochemistry，IHC)
為了闡明H1內部抗腫瘤活性作用的可能機制，本實施例檢測來自H1處理或PBS處理的SCID小鼠身上切除的原發性腫瘤的腫瘤增
殖狀態。使用IHC分析骨髓來源的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)、腫瘤相關巨噬細胞(tumor-infiltrating macrophages，TIM)和自然殺手細胞(natural killer，NK)的分佈。
IHC染色的組織樣本中CD24表現的強度由兩名獨立研究人員進行評估和評分，並由委員會認證的病理學家審查。免疫染色評分等級分為三種：0=無；1=弱；2=中度；和3=強。
如圖15A和圖15B所示，以H1處理的小鼠切除腫瘤與PBS處理的小鼠切除腫瘤相比，腫瘤浸潤CD11b陽性MDSC(tumor-infiltrating CD11b-positive MDSCs)的數量顯著減少，F4/80陽性腫瘤浸潤性巨噬細胞顯著增加。此外，H1處理的腫瘤被F4/80陽性巨噬細胞嚴重包圍和侵入。此外，H1處理的腫瘤與PBS處理的腫瘤相比，腫瘤浸潤的CD68+M1巨噬細胞數量顯著增加。同時，如圖15A和15B所示，在PBS處理和H1處理的腫瘤中顯示相似數量的CD206-陽性M2巨噬細胞。此外，在PBS處理和H1處理的腫瘤中觀察到相似數量的CD206陽性M2巨噬細胞。在PBS處理和H1處理的腫瘤中觀察到相似數量的Ki67陽性腫瘤細胞。前述結果皆表明H1對腫瘤細胞增殖沒有影響。且前述結果表明，在H1的抗腫瘤作用中，腫瘤殺傷巨噬細胞(tumor-killing macrophages)的作用比抑制細胞生長更顯著。
實施例24：透過快速擴增cDNA末端(5’ Rapid Amplification of cDNA End，RACE)和次世代定序(next generation sequencing，NGS)對H1的VH和VL進行定序
如圖16所示，定序流程從分泌H1的融合瘤克隆中提取總RNA開始。抗體cDNA文庫是使用改良的RACE和Fc特異性反轉錄引子建立的。透過使用通用正向引子和反向引子進行PCR擴增cDNA以製備抗體cDNA。然後對抗體cDNA文庫進行RNA定序分析。使用線上CDR預測算法AbodyBuilder分析H1克隆的抗體結合區(fragment antigen binding，Fab)域中的CDR特徵。VH和VL的三個單獨CDR的序列鑑定如表三。
表三、VH和VL的三個單獨CDR的序列鑑定
接著對嵌合抗人類CD24 mAb H1(CH-01)的生成、製作和抗腫瘤驗證進行評估。
H1的Fab首先被亞克隆(subcloned)至人類IgG1 Fc序列上游的表達載體中。在100毫升ExpiCHO細胞培養中產生具有人類IgGlFc結構域的CH-01(圖17A和圖17B)，並使用SDS-PAGE結合考馬斯亮藍染
色進行抗體的純化和驗證。然後使用CD24陽性MDA-MB-468原位小鼠模型測試CH-01的抗腫瘤功效。
如圖17C和圖17D所示的IVIS分析，與IgG控制組相比，接受CH-01處理的荷瘤小鼠在CD24 mAb治療過程中顯示光子計數(photon counts)減少。且CD24 mAb處理組中的三隻小鼠在注射CH-01後3個月幾乎檢測不到發光信號。同樣地，在圖17E的腫瘤體積直接測量也顯示CD24 mAb處理組的腫瘤較控制組顯著較小。此外，在使用IV2-CD24TNBC細胞的第二個CD24陽性TNBC異種移植模型中進一步證實CH-01的抗腫瘤活性。如圖17F所示，當CH-01以0.5毫克/公斤或5毫克/公斤的劑量使用時，其可有效抑制腫瘤的生長。
實施例25：抗CD24 mAb人類化
使用基於計算機的模擬來計算小鼠H1的分子動力學(molecular dynamics，MD)軌跡以及預測人類化CD24 mAb的MD軌跡，並計算人類化CD24 mAb結構的均方根偏差(root-mean-square deviation，RMSD)值。
如圖18所示，進一步調整原子RMSD的差異，得到加權RMSD(wRMSD)。與其他預測相比，兩種組合包含2條人類化重鏈(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18)和1條人類化輕鏈(SEQ ID NO：16)的wRMSD值(L1H1：2.111；L1H2：2.056)最接近圖18A中小鼠H1的wRMSD值(H1：1.556)。L1H2與小鼠H1的分子疊加如圖18B所示。分子疊加還表明，CD24 mAb HH-01-46(HH-01-46)(L1H2)的Fab結構域的MD軌跡與
CH-01的Fab結構域的MD軌跡非常相似。最終，選擇人類化輕鏈L1和人類化重鏈H1的組合作為先導人類化HH-01-46，並將抗體序列克隆到表達載體pFUSE-hIgG1Fc中，如圖18C中所示。
在另一個實施例中，將分別含有人類化重鏈和人類化輕鏈的pFUSE-Ig表達質粒轉染到Expi293細胞中以產生重組人類化抗CD24 mAb。使用poly-A柱純化人類化CD24 mAb並透過考馬斯亮藍染色驗證，顯示在圖19A中分別驗證使用CD24陽性MDA-MB-468和CD24陰性MDA-MB-231的HH-01-46的抗原結合敏感性和特異性。
如圖19B所示，HH-01-46與其親本CH-01具有相似的抗原敏感性和特異性。人類化HH-01-46的結合親和力透過表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)測定。多循環動力學(Multiple cycle Kinetics，MCK)分析表明，HH-01-46的KD常數為92.9nM，表明HH-01-46與親本CD24 mAb具有相似的親和力，KD常數為69.5nM(圖19C)。FC分析表明人類化HH-01-46可以結合一系列TNBC細胞株，且其顯示與親本CH-01相似的結合強度(圖19D)
接著評估HH-01-46在CD24陽性TNBC異種移植小鼠模型中的抗腫瘤作用。在SCID小鼠的第4乳腺脂肪墊中接種2x106個GFP-Luc標記的IV2-CD24細胞，然後進行每週一次的靜脈注射HH-01-46治療，持續4週。
如圖20A和圖20B所示，根據IVIS分析，HH-01-46的抗腫瘤功效與親本CH-01一樣好，抑制95%的腫瘤生長，如圖20C所示。
在一個CH-01的實施例中，使用人類外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)建立一模型以重建免疫小鼠模型中顯示的抗腫瘤功效。
實施例26：PBMCs重建免疫小鼠模型
應用高度免疫缺陷(advanced severe immunodeficiency，ASID)小鼠模型(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm 1 Wjl/YckNarl)。首先，從健康捐血者中抽取40毫升全血，並用1X PBS以1：1的比例稀釋。然後使用密度梯度離心法分離PBMC。最後，從40毫升全血中獲得2.5x107個PBMC。接下來，每隻ASID小鼠在腫瘤接種前7天被注入1x107個PBMC。如圖21B所示，使用PBMC進行重建後，ASID小鼠在第7天注射2.5x105個IV2-CD24細胞。PBMC人類化ASID小鼠會於第9天、第14天、第21天和第27天分別接受5毫克/公斤CH-01單一療法、5mg/kg docetaxel單一療法和CH-01加docetaxel聯合療法。PBMC人類化ASID小鼠試驗的流程圖如圖21A所示。試驗過程中會記錄腫瘤生長至第21天。如圖21B所示，CH-01單一療法和docetaxel單一療法均在治療早期誘導荷瘤ASID小鼠的腫瘤消退。將聯合療法的抗腫瘤活性與單一藥物治療進行比較，結果如圖21B所示，CH-01加docetaxel的聯合療法抑制腫瘤的效果最佳。
此外，也評估HH-01-46促進巨噬細胞吞噬作用的作用，包括誘導NK細胞活化和腫瘤殺傷能力。如圖22A所示，CD24陽性TNBC細胞與源自單核細胞的人類巨噬細胞在HH-01-46存在下孵育可有效促進抗體依賴性吞噬作用。如圖22B所示，HH-01-46處理也可以激活NK92MI細胞
以時間依賴性方式分泌腫瘤殺傷細胞因子IFN-γ和IL-12。此外，如圖22C所示，使用人類PBMC和NK92MI的抗體依賴性細胞毒殺作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)測定表明HH-01-46可以有效促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。
此外，在HH-01-46或CH-01中分析Akt/Erk致癌信號。首先，在EGF刺激前24小時，用劑量為5微克/毫升的HH-01-46或CH-01預處理MDA-MB-468細胞。
如圖23所示，用HH-01-46或CH-01抗CD24 mAb預處理TNBC細胞顯著降低EGF誘導的Akt和Erk活化。
雖然本發明已被足夠詳細地描述和舉例說明以供本領域技術人員製造和使用它，但在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，各種替代、修改和改進應該是顯而易見的。
本領域的技術人員很容易理解本發明非常適用於實現上述目的並獲得上述目的和優點，以及其中固有的那些。上述用於生產它們的過程和方法代表優選實施例，是示例性的，且不限制本發明的範圍。本領域熟習此項技術之人士將想到其中的修改和其他用途。這些修改包含在本發明的精神內並由權利要求的範圍限定。
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Claims (17)
- 一種特異性結合CD24的分離抗體，該分離抗體包含：(a)重鏈可變區-互補決定區VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，其中該VH-CDR1包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，該VH-CDR2包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，和該VH-CDR3包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；以及(b)輕鏈可變區-互補決定區VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中該VL-CDR1包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，該VL-CDR2包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，和該VL-CDR3包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
- 如請求項1所述之分離抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18之胺基酸序列。
- 如請求項1所述之分離抗體，其中該VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。
- 如請求項1所述之分離抗體，其進一步包含一Fc區。
- 如請求項4所述之分離抗體，其中該Fc區為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE抗體或其任何亞類。
- 如請求項5所述之分離抗體，其中該Fc區為IgG。
- 一種醫藥組合物，其包含一如請求項1所述之分離抗體和一醫藥上可接受的載體或賦形劑。
- 一種組合物用於製備治療表現CD24的癌症之藥物的用途，其中該組合物包含如請求項1所述之分離抗體以及一抗癌藥物。
- 如請求項8所述之用途，其中該抗癌藥物包含多烯紫杉醇(docetaxel)、泰莫西芬(tamoxifen)、賀癌平(herceptin)或其組合。
- 如請求項8所述之用途，其中該癌症為實體瘤。
- 如請求項8所述之用途，其中該癌症為乳癌、肝癌或卵巢癌。
- 如請求項11所述之用途，其中該乳癌為三陰性乳癌(triple-negative breast eancer，TNBC)。
- 如請求項12所述之用途，其中該三陰性乳癌為肺轉移型三陰性乳癌。
- 一種用於偵測體外樣本中表現CD24之方法，該方法包括：(1)提供一個體的體外樣本；(2)將該體外樣本與一具特異性結合CD24之捕獲抗體接觸，其中該捕獲抗體是如請求項1所述之分離抗體；(3)添加一標記偵測抗體，其與該捕獲抗體結合以形成由CD24、捕獲抗體和標記偵測抗體組成的一免疫複合物；以及(4)測定形成該免疫複合物中標記的量，以確定該體外樣本中CD24的存在或水平。
- 如請求項14所述之方法，其中該體外樣本選自血液、淋巴液、組織液、體腔液、口腔粘膜液、循環腫瘤細胞中的至少一種或其組合。
- 如請求項15所述之方法，其中該體外樣本為血液。
- 如請求項16所述之方法，其中該血液為全血、血漿或血清。
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