TW202402789A

TW202402789A - 抗-tnfr2抗體及其使用方法

Info

Publication number: TW202402789A
Application number: TW112119435A
Authority: TW
Inventors: 陶德道格拉斯艾許瓦斯; 越劉; 尼可拉斯安德魯馬茲; 維吉尼麥可瑪納斯
Original assignee: 美商輝瑞大藥廠
Priority date: 2022-05-26
Filing date: 2023-05-25
Publication date: 2024-01-16
Also published as: US20230406951A1; WO2023228082A1

Abstract

本發明提供結合於TNFR2之抗體，以及該等抗體之用途及相關方法。本發明亦提供用於製造、製備及產生會結合於TNFR2之抗體的方法。本發明之抗體適用於由TNFR2活性介導或與TNFR2活性相關之病症或病狀的診斷、預防或治療中之一或多者。

Description

抗-TNFR2抗體及其使用方法

本發明係關於特異性結合TNFR2之抗體及其組合物、方法及用途，包括本發明之抗體治療自體免疫及自體發炎疾病之用途。本發明亦係關於相關分子，例如編碼此類抗體組合物之核酸，及相關方法，例如用於產生及純化此類抗體及雙特異性抗體之方法，及其在診斷及治療中之用途。

TNF為一種多效性細胞介素，其在白血球之細胞表面上表現且隨後經由若干蛋白水解酶之活性釋放。對TNF之細胞反應係由兩種受體介導：TNFR1 (TNFRSF1A)，其廣泛表現且介導促發炎性反應；及TNFR2 (TNFRSF1B)，其更加選擇性地表現於特異性白血球亞型上且似乎主要介導免疫調節作用(Salomon 2021)。可溶性TNF可活化兩種受體，但TNFR2更優先由膜相關TNF活化。在由TNFR2促效作用引起之活性中，與自體免疫性及自體發炎性病狀之療法之相關性最高的係調節性T細胞之擴增、活化誘導之細胞死亡及效應T細胞之耗竭，以及B細胞、間質幹細胞(MSC)及骨髓細胞(諸如骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)及神經膠細胞)中調節性/抗發炎性表型之增強(Faustman及Davis 2010, Salomon 2021)。

本發明提供結合於TNFR2之抗體，以及該等抗體之用途及相關方法。本發明亦提供用於製造、製備及產生結合於TNFR2之抗體的方法。本發明之抗體適用於由TNFR2活性介導或與TNFR2活性相關之病症或病狀之診斷、預防或治療中之一或多者，該等病症或病狀包括(但不限於)類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩式病(Chron's disease；CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)。本發明亦涵蓋抗體之表現，以及包含本發明之抗體之組合物，諸如使用該等抗體之藥劑的製備及製造。

提供編碼抗體之聚核苷酸，該等抗體結合TNFR2。亦提供編碼抗體重鏈或輕鏈或其兩者之聚核苷酸。提供表現抗體之宿主細胞。提供使用抗體之治療方法。該等方法包括(但不限於)一或多種治療或預防與TNFR2表現及/或TNFR2結合相關或由TNFR2表現及/或TNFR2結合介導之疾病的方法，該等疾病包括(但不限於)類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)。

藉由參考以下對本發明之實施例及其中所包括之實例的詳細描述可更容易理解本發明。應理解，本發明不限於特定的製造方法，其當然可有所變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的且並不意欲為限制性的。

本文中所提供的本發明之例示性實施例(E)包括： E1. 一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區及輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 29及SEQ ID NO: 30組成之群的VH序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列；及選自由SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 9組成之群的VL序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。 E2. 一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區及輕鏈可變區包含根據SEQ ID NO: 30之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列，及根據SEQ ID NO: 9之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。 E3. 一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區及輕鏈可變區包含 (i) 根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 7之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 20之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列；或 (ii) 根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 2之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 11之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列。 E4. 一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 7之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，且其中根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 20之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列。 E5. 如E1至E4中任一項之抗體，其包含VH構架序列，該VH構架序列衍生自選自由IGHV1-46、IGHV4-31、IGHV4-30-4及IGHV4-4組成之群的人類生殖系VH序列。 E6. 如E1至E5中任一項之抗體，其包含VH構架序列，該VH構架序列衍生自人類IGHV1-46生殖系序列。 E7. 如E1至E6中任一項之抗體，其包含VL構架序列，該VL構架序列衍生自選自由IGKV1-9、IGKV1-33、IGKV1-27、IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV1-1及IGKV1-11組成之群的人類生殖系VL序列。 E8. 如E1至E7中任一項之抗體，其包含VL構架序列，該VL構架序列衍生自人類生殖系IGKV1-9序列。 E9. 如E1至E8中任一項之抗體，其包含VL構架序列及VH構架序列，其中VL構架序列及VH構架序列中之一者或兩者與衍生其之人類生殖系序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。 E10. 如E1至E9中任一項之抗體，其包含VL構架序列及VH構架序列，且其中VL構架序列或VH構架序列中之一或兩者與衍生其之人類生殖系序列一致。 E11. 如E1至E10中任一項之抗體，其中VL包含根據選自由SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 8組成之群的序列之胺基酸序列，且其中VH包含根據選自由SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 21組成之群的序列之胺基酸序列。 E12. 如E1至E11中任一項之抗體，其包含SEQ ID NO: 13之VH序列及SEQ ID NO: 4之VL。 E13. 如E1至E11中任一項之抗體，其包含與SEQ ID NO: 21至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之VH序列，且包含與SEQ ID NO: 8至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之VL序列。 E14. 如E13中任一項之抗體，其包含SEQ ID NO: 21之VH序列及SEQ ID NO: 8之VL。 E15. 如E14中任一項之抗體，其包含由SEQ ID NO: 32之核酸序列編碼之VH序列。 E16. 如E14中任一項之抗體，其包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼之VH序列。 E17. 如E1至E16中任一項之抗體，其包含由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼之VL序列。 E18. 如E1至E17中任一項之抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127528之質體編碼的VH序列及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127529之質體編碼的VH序列中之一者或兩者。 E19. 如E1至E18中任一項之抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127531之質體編碼的VL序列。 E20. 一種抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127528之質體編碼的VH序列及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127529之質體編碼的VH序列中之一者或兩者；及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127531之質體編碼的VL序列。 E25. 如E1至E24之抗體，其進一步包含恆定重鏈域(CH1)及恆定輕鏈域(CL)。 E26. 如E25之抗體，其中該CH1連接至該VH，且該CL連接至該VL，從而形成Fab域。 E26. 如E25之抗體，其包含第一及第二Fab域。 E27. 如E25至E26中任一項之抗體，其包含抗體Fc域，該抗體Fc域包含第一Fc鏈及第二Fc鏈。 E28. 如E27之抗體，其中該第一Fab域共價融合至該第一Fc鏈，且該第二Fab域共價融合至該第二Fc鏈。 E29. 如E27至E28之抗體，其中該第一Fab域中之CH1域之C端共價融合至該第一Fc鏈之N端，且該第二Fab域中之CH1域之C端共價融合至該第二Fc鏈之N端。 E30. 如E31之抗體，其中該Fc域為IgA (例如IgA ₁或IgA ₂)、IgD、IgE、IgM或IgG (例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃或IgG ₄)之Fc域。 E31. 如E30之抗體，其中該Fc域為IgG ₁之Fc域。 E32. 如E31之抗體，其中該第一Fab域中之CH1域包含根據SEQ ID NO: 23之序列。 E33. 如E31至E32之抗體，其中該第一Fab域中之CL包含根據SEQ ID NO: 5之序列。 E34. 如E31至E33之抗體，其中該抗體包含輕鏈(LC)，該輕鏈包含根據SEQ ID NO: 9之序列。 E35. 如E31至E34之抗體，其中該第一Fab域與該第二Fab域一致。 E36. 如E31至E35之抗體，其中該第一Fc鏈自N端至C端包含：第一鉸鏈區、第一CH2區及第一CH3區，且該第二Fc鏈自N端至C端包含：第二鉸鏈區、第二CH2區及第二CH3區。 E37. 如E36之抗體，其中該第一鉸鏈區及該第二鉸鏈區中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 23之序列。 E38. 如E36至E37之抗體，其中該第一CH2域及第二CH2域中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 25之序列。 E39. 如E36至E38之抗體，其中該第一CH3域及第二CH3域中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 26之序列。 E40. 如E36至E39之抗體，其中該第一Fc鏈及第二Fc鏈中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 37之序列。 E41. 如E36至E40之抗體，其中該第一Fc鏈與該第二Fc鏈一致。 E42. 如E32至E41之抗體，其中該抗體包含重鏈(HC)，該重鏈包含根據SEQ ID NO: 22之序列。 E43. 如E26至E42之抗體，其進一步包含第三Fab及第四Fab。 E44. 如E43之抗體，其中該第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab各自包含根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 7之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 20之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列。 E45. 如E43至E44之抗體，其中該第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab各自包含具有根據SEQ ID NO: 21之序列的VH及具有根據SEQ ID NO: 8之序列的VL。 E46. 如E43至E45之抗體，其中該第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab彼此一致。 E47. 如E43至E46之抗體，其中該第一Fab之N'端連接至該第三Fab之C'端。 E48. 如E43至E47之抗體，其中該第一Fab之N'端經由第一連接子連接至該第三Fab之C'端。 E49. 如E48之抗體，其中該第一連接子包含根據SEQ ID NO: 27之序列。 E50. 如E43至E49之抗體，其中該第二Fab之N'端連接至該第四Fab之C'端。 E51. 如E43至E50之抗體，其中該第二Fab之N'端經由第二連接子連接至該第四Fab之C'端。 E52. 如E51之抗體，其中該第二連接子包含根據SEQ ID NO: 27之序列。 E53. 如E47至E48之抗體，其中該HC包含根據SEQ ID NO: 30之序列。 E54. 一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含有包含根據SEQ ID NO: 30之序列的重鏈(HC)及包含根據SEQ ID NO: 9之序列的輕鏈(LC)。 E55. 如E1至E54中任一項之抗體，其包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼之VH序列。 E56. 如E1至E55中任一項之抗體，其包含由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼之VL序列。 E57. 一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼的重鏈(HC)序列及由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼的輕鏈(LC)序列。 E58. 如E1至E57中任一項之抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127530之質體編碼的HC序列。 E59. 如E1至E58中任一項之抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA127532之質體編碼的LC序列。 E60. 一種抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127530之質體編碼的HC序列，及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127532之質體編碼的LC序列。 E61. 如E30之抗體，其中該Fc域為IgG ₂之Fc域。 E62. 如E61之抗體，其中該第一Fab域中之CH1域包含根據SEQ ID NO: 14之序列。 E63. 如E61至E62之抗體，其中該第一Fab域中之CL包含根據SEQ ID NO: 5之序列。 E64. 如E61至E63之抗體，其中該第一Fab域與該第二Fab域一致。 E65. 如E61至E64之抗體，其中該第一Fc鏈自N端至C端包含：第一鉸鏈區、第一CH2區及第一CH3區，且該第二Fc鏈自N端至C端包含：第二鉸鏈區、第二CH2區及第二CH3區。 E66. 如E65之抗體，其中該第一鉸鏈區及第二鉸鏈區中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 15之序列。 E67. 如E65至E66之抗體，其中該第一CH2域及第二CH2域中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 16之序列。 E68. 如E65至E67之抗體，其中該第一CH3域及第二CH3域中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 17之序列。 E69. 如E65至E68之抗體，其中該第一Fc鏈及第二Fc鏈中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 18之序列。 E70. 如E65至E69之抗體，其中該第一Fc鏈與該第二Fc鏈一致。 E71. 如E75至E70之抗體，其中該抗體包含重鏈(HC)，該重鏈包含根據SEQ ID NO: 19之序列。 E72. 如E65至E71之抗體，其中該抗體包含輕鏈(LC)，該輕鏈包含根據選自由SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 9組成之群之序列的序列。 E73. 如E65至E72之抗體，其中該抗體包含輕鏈(LC)，該輕鏈包含根據SEQ ID NO: 9之序列。 E74. 一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含有包含根據SEQ ID NO: 19之序列的重鏈(HC)及包含根據SEQ ID NO: 9之序列的輕鏈(LC)。 E75. 如E1至E74之抗體，其中該抗體之特徵在於在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中小於5 μM之EC ₅₀。 E76. 如E1至E75之抗體，其中該抗體之特徵在於在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中小於2 μM之EC ₅₀。 E77. 如E1至E76之抗體，其中該抗體之特徵在於在人類外周血液單核球中之人類TNFR2效力分析法中小於10 μM之EC ₅₀。 E78. 如E1至E77之抗體，其中該抗體之特徵在於在人類外周血液單核球中之人類TNFR2效力分析法中小於5 μM之EC ₅₀。 E79. 如E1至E78之抗體，其中該抗體之特徵在於在人類外周血液單核球中之人類TNFR2效力分析法中小於2 μM之EC ₅₀。 E80. 如E1至E79之抗體，其中該抗體之特徵在於在食蟹獼猴(cynomolgus)外周血液單核球中之食蟹獼猴TNFR2效力分析法中小於20 μM之EC ₅₀。 E81. 如E1至E80之抗體，其中該抗體之特徵在於在食蟹獼猴外周血液單核球中之食蟹獼猴TNFR2效力分析法中小於15 μM之EC ₅₀。 E82. 如E1至E81之抗體，其中該抗體之特徵在於在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中小於5 μM之EC ₅₀。 E83. 如E1至E82之抗體，其中該抗體之特徵在於在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中小於1 μM之EC ₅₀。 E84. 如E1至E83之抗體，其中該抗體之特徵在於在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中小於0.5 μM之EC ₅₀。 E85. 如E1至E84之抗體，其中該抗體之特徵在於在來自人類外周血液單核球之表現人類TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC50小於2 mg/ml。 E86. 如E1至E85之抗體，其中該抗體之特徵在於在來自食蟹獼猴外周血液單核球之表現食蟹獼猴TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC50小於15 mg/ml。 E87. 如E1至E86之抗體，其中該抗體之特徵在於在來自人類外周血液單核球之表現人類TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC50小於1 mg/ml。 E88. 如E1至E87之抗體，其中該抗體之特徵在於在來自人類外周血液單核球之表現人類TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC50小於0.2 mg/ml。 E89. 如E1至E88之抗體，其中該抗體之特徵在於在來自食蟹獼猴外周血液單核球之表現食蟹獼猴TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC50小於10 mg/ml。 E90. 如E1至E89之抗體，其中該抗體之特徵在於對人類TNFR2之親和力KD小於1 nM。 E91. 如E1至E90之抗體，其中該抗體之特徵在於對人類TNFR2之親和力KD小於0.5 nM。 E92. 如E1至E91之抗體，其中該抗體之特徵在於對人類TNFR2之親和力KD小於0.1 nM。 E93. 如E1至E92之抗體，其中該抗體之特徵在於對人類TNFR2之親和力KD小於0.07 nM。 E94. 如E1至E93之抗體，其中該抗體之特徵在於對食蟹獼猴TNFR2之親和力KD小於1 nM。 E95. 如E1至E94之抗體，其中該抗體之特徵在於對食蟹獼猴TNFR2之親和力KD小於0.1 nM。 E96. 一種經分離之抗體，其包含選自表35之抗體的VH及VL。 E97. 如E1至E99中任一項之抗體，其係用作藥劑。 E98. 如E97之抗體，其中該用途係用於治療選自由以下組成之群的一或多者：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)。 E99. 如E96至E98中任一項之抗體，其中該用途係用於類風濕性關節炎(RA)。 E100. 一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼如E1至E99中任一項之抗體的一或多個核苷酸序列。 E101. 如E100之聚核苷酸，其中該聚核苷酸為RNA。 E102. 如E100至E101之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含至少一種化學修飾。 E103. 如E102之聚核苷酸，其中該化學修飾係選自假尿苷、1-甲基假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿苷。 E104. 如E100至E101之聚核苷酸，其中該聚核苷酸不包含化學修飾。 E105. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼結合於TNFR2之抗體之HC及LC或其兩者，其中該核酸包含選自由以下組成之群的一或多者：SEQ ID NO: 31之核酸序列、SEQ ID NO: 32之核酸序列、SEQ ID NO: 33之核酸序列。 E106. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，該抗體包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼的重鏈(HC)序列及由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼的輕鏈(LC)序列。 E107. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼經分離之抗體，該抗體包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127530之質體編碼的HC序列，及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127532之質體編碼的LC序列。 E108. 一種載體，其包含E100至E107之聚核苷酸。 E109. 一種經分離之宿主細胞，其包含如E100至E107之聚核苷酸或如E108之載體。 E110. 一種產生經分離之抗體之方法，其包含在引起產生該抗體之條件下培養如E109之宿主細胞及回收該抗體。 E111. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如E1至E99之抗體及醫藥學上可接受之載劑。 E112. 一種治療醫學病狀之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如E1至E99中任一項之抗體、如E101之聚核苷酸或如E111之醫藥組合物。 E113. 如E112之方法，其中該病狀係選自由以下組成之群：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)。 E114. 如E112至E113中任一項之方法，其包含皮下投與該抗體或醫藥組合物。 E115. 如E112至E114中任一項之方法，其中該抗體或其醫藥組合物係約一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、一月兩次、一月一次、每兩個月一次、每三個月一次或每四個月一次投與。

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本文所使用之章節標題係僅出於組織目的而不應理解為限制所描述之標的物。

本文所引用之所有參考文獻(包括專利申請案、專利公開案、UniProtKB寄存編號)均以引用之方式併入本文中，如同特定地且單獨地指出各個參考文獻以全文引用之方式併入本文中一般。

本文中所描述或所提及之技術及程序一般係由熟習此項技術者充分瞭解且通常使用習知方法來使用，諸如描述於以下文獻中之廣泛使用之方法：Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編, (2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames及G. R. Taylor編(1995)), Harlow及Lane編(1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編(1987))；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis編, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather及P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths及D. G. Newell編, 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir及C. C. Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller及M. P. Calos編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999))；The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra,編, Harwood Academic Publishers, 1995)；以及其更新版。

定義除非本文中另外定義，否則結合本發明所使用之科學與技術術語將具有一般熟習此項技術者通常瞭解之含義。

如本文所用，除非另有指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個參考物。舉例而言，「抗體」包括一或多種抗體。

當本發明之態樣或實施例係根據馬庫西組(Markush group)或其他替代分組進行描述時，本發明不僅涵蓋作為整體列出之整個組，而且涵蓋獨立組之各成員以及主組之所有可能的子組，且亦涵蓋缺少一或多名組成員之主組。本發明亦設想明確排除所主張之發明中之任何組成員中之一或多者。

在術語「例如(e.g.)」或「例如(for example)」之後的任何實例並不意謂窮盡性或限制性的。

如本文所用，當用於修改以數值方式定義之參數(例如***之劑量)時，術語「約」意謂參數可比該參數之所陳述數值小或大至多10%。舉例而言，約5 mg之劑量意謂5% ± 10%，亦即，其可在4.5 mg與5.5 mg之間變化。

抗體「抗體」係指能夠經由位於免疫球蛋白分子之可變區中之至少一個抗原結合位而特異性結合於標靶，諸如多肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂質等之免疫球蛋白分子。如本文所用，術語「抗體」可涵蓋任何類型之抗體(例如單特異性、雙特異性)，且包括完整抗體中的保持結合於既定抗原之能力的部分(例如「抗原結合片段」)及免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之包含抗原結合位之組態。

抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM (或其子類)，且抗體無需為任何特定類別。免疫球蛋白可視其重鏈(HC)之恆定區的抗體胺基酸序列而歸為不同類別。免疫球蛋白有五個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干類別可進一步分成子類(同型)，例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁及IgA ₂。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白的次單元結構及三維組態為熟知的。

抗體抗原結合片段及經修飾組態之實例包括(i) Fab片段(由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段)；(ii) F(ab')2片段(包含兩個藉由鉸鏈區處之雙硫鍵連接之Fab片段的二價片段)；及(iii)由抗體之單臂之VL及VH域組成的Fv片段。此外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH係由獨立基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，使得其能夠成為單一蛋白質鏈，其中VL及VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv))；參見例如Bird等人, Science 1988; 242:423-426及Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 1988 USA 85:5879-5883。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。

另外，進一步涵蓋在重鏈多肽上缺失C端離胺酸(K)胺基酸殘基的抗體(例如人類IgG1重鏈包含末端離胺酸)。如此項技術中已知，C端離胺酸有時在抗體產生期間經剪切，產生具有缺乏C端離胺酸之重鏈的抗體。或者，抗體重鏈可使用不包括C端離胺酸之核酸產生。

可變區抗體之「可變區」係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。如此項技術中已知，重鏈及輕鏈之可變區各自由四個構架區(FR)組成，該四個構架區藉由亦稱為高變區之三個互補決定區(CDR)連接，且促進形成抗體之抗原結合位。若需要個體可變區之變異體，尤其在CDR區外部(亦即，在構架區中)之胺基酸殘基取代之情況下，則可藉由比較個體可變區與含有與個體可變區相同規範類別之CDR1及CDR2序列之其他抗體的可變區來鑑別適當胺基酸取代，較佳保守胺基酸取代(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196(4): 901-917, 1987)。

在某些實施例中，CDR之確定性描繪及包含抗體之結合位的殘基之鑑別係藉由分析抗體之結構或分析抗體-配位體複合物之結構來實現。在某些實施例中，其可藉由熟習此項技術者已知之各種技術中之任一者，諸如X射線結晶學來實現。在某些實施例中，可採用各種分析方法以鑑別或估計CDR區。該等方法之實例包括(但不限於) Kabat定義、Chothia定義、AbM定義、接觸定義(contact definition)、延伸定義及構形定義。

Kabat定義為對抗體中之殘基進行編號的標準且通常用於鑑別CDR區。參見例如Johnson及Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8。Chothia定義與Kabat定義類似，但Chothia定義考慮某些結構環形區之位置。參見例如Chothia等人, 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17；Chothia等人, 1989, Nature, 342: 877-83。延伸定義為Kabat定義與Chothia定義之組合。AbM定義使用由Oxford Molecular Group所生產之模擬抗體結構之一套整合的電腦程式。參見例如Martin等人, 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272；「AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies」, Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd。AbM定義使用知識資料庫與全始演算法之組合將來自一級序列之抗體的三級結構模型化，諸如由以下文獻所描述之方法：Samudrala等人, 1999, 「Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach」, PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198。接觸定義係基於對可用複雜晶體結構之分析。參見例如MacCallum等人, 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45。在本文中稱為CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可鑑別為向抗原結合作出焓貢獻之殘基。參見例如Makabe等人, 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166。雖然其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循以上方法中之一者，但仍然將與Kabat CDR之至少一部分重疊，且其可根據以下預測或實驗結果而縮短或延長：特定殘基或殘基組不會顯著影響抗原結合。如本文所用，CDR可指由此項技術中已知之任何方法，包括方法之組合所定義的CDR。本文所用之方法可利用根據此等方法中之任一者定義之CDR。對於含有超過一個CDR之任何既定實施例，CDR可根據Kabat定義、Chothia定義、延伸定義、AbM定義、接觸定義或構形定義中之任一或多者定義。

恆定區抗體之「恆定區」係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。IgG重鏈恆定區含有三個序列免疫球蛋白域(CH1、CH2及CH3)，以及位於CH1域與CH2域之間的鉸鏈區。IgG輕鏈恆定區含有單一免疫球蛋白域(CL)。

Fc 域及 Fc 鏈「Fc域」係指免疫球蛋白(Ig)分子中之與藉由木瓜蛋白酶消化Ig分子所獲得之可結晶片段相關的部分。如本文所用，該術語係關於抗體之2-鏈狀恆定區，各鏈不包括第一恆定區免疫球蛋白域。在Fc域內，存在兩個「Fc鏈」(例如「第一Fc鏈」及「第二Fc鏈」)。「Fc鏈」一般係指抗體重鏈之C端部分。因此，Fc鏈係指IgA、IgD及IgG重鏈之最後兩個恆定區免疫球蛋白域(CH2及CH3)，及IgE及IgM重鏈之最後三個恆定區免疫球蛋白域，以及視情況存在之此等域之可撓性鉸鏈N端。

雖然Fc鏈之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc鏈通常定義為在其羧基端包含殘基C226或P230，其中編號係根據Edelman等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1969; 63(1):78-85之EU索引及如Kabat等人, 1991中所描述。典型地，Fc鏈包含人類IgG1重鏈恆定區之約胺基酸殘基236至約447。「Fc鏈」可指此單獨多肽，或可指更大的分子(例如在抗體重鏈或Fc融合蛋白中)。

「功能性」Fc域係指具有天然序列Fc域之至少一種效應功能的Fc域。例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化等。此類效應功能一般需要Fc域與結合域(例如抗體可變區)組合，且可使用此項技術中已知之用於評測此類抗體效應功能的各種分析法加以評估。

「天然序列」Fc鏈係指包含與在自然界中發現的Fc鏈之胺基酸序列一致的胺基酸序列的Fc鏈。「變異型」Fc鏈包含與天然序列Fc鏈之胺基酸序列的不同之處在於至少一個胺基酸修飾的胺基酸序列。

單株抗體「單株抗體」 (mAb)係指衍生自單一複本或殖株(包括例如任何真核、原核或噬菌體殖株)之抗體。單株抗體為高特異性的，其針對單一抗原部位。此外，與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」指示抗體之特徵為自實質上均質之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明所使用之單株抗體可藉由首先由Kohler及Milstein, 1975, Nature 256:495所描述之融合瘤方法製造，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所描述之重組DNA方法製造。在另一實例中，單株抗體亦可自噬菌體庫中分離，諸如使用McCafferty等人，1990, Nature 348:552-554中所描述之技術所產生之單株抗體。

人類抗體「人類抗體」係指一種抗體，其胺基酸序列對應於由人類產生或使用任何用於製備完全人類抗體之技術製備的抗體的胺基酸序列。舉例而言，完全人類抗體可藉由使用已經工程改造以表現特異性人類免疫球蛋白之可商購的小鼠或藉由用於製備完全人類抗體之庫(例如噬菌體、酵母菌或核糖體)呈現技術獲得。人類抗體之此定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。

嵌合抗體「嵌合抗體」係指其中可變區序列衍生自一個物種而恆定區序列衍生自另一物種之抗體，諸如可變區序列衍生自小鼠抗體而恆定區序列衍生自人類抗體之抗體。

人源化抗體「人源化」抗體係指非人類(例如鼠類)抗體，其為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。較佳地，人源化抗體為具有所需特異性、親和力及能力之人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之CDR的殘基經來自諸如小鼠、大鼠或兔子之非人類物種(供體抗體)之CDR的殘基置換。人源化抗體可包含既不存在於受體抗體中亦不存在於所輸入之CDR或構架序列中之殘基，但包括該等殘基以進一步改進及最佳化抗體效能。

抗原「抗原」係指用於對具有免疫潛能之脊椎動物免疫接種，以產生識別抗原之抗體或篩選表現庫(例如噬菌體、酵母菌或核糖體呈現庫等)以用於抗體選擇的分子實體。在本文中，抗原為較概括之稱呼且一般意欲包括由抗體特異性識別之標靶分子，因此包括該分子之片段或模擬物，其用於產生抗體之免疫過程或用於選擇抗體之庫篩選中。

抗原決定基「抗原決定基」係指抗原中之與抗體特異性結合之區域或區，例如藉由此項技術中熟知的任何方法所測定的包含與抗體相互作用之殘基的區域或區。此項技術中已知多種用於定位及表徵蛋白質上的抗原決定基之位置的方法，包括分析抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭分析法、基因片段表現分析法、抗原決定基定位及基於合成肽之分析法，如例如Harlow及Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999之第11章中所描述。或者或另外，在探索過程期間，抗體之產生及表徵可闡明關於所需抗原決定基之資訊。根據此資訊，隨後有可能競爭性篩選結合於相同抗原決定基之抗體。

另外，可在系統篩選中藉由使用衍生自抗原之重疊肽及測定抗體之結合來測定與抗體結合之抗原決定基。根據基因片段表現分析法，編碼抗原之開放閱讀框架可隨機地或藉由特異性基因構築而片段化，且測定抗原之經表現之片段與待測試之抗體的反應性。基因片段可例如藉由PCR產生，且接著在放射性胺基酸存在下活體外轉錄及轉譯成蛋白質。隨後藉由免疫沈澱及凝膠電泳測定抗體與放射性標記之抗原片段的結合。

某些抗原決定基亦可藉由使用呈現於噬菌體顆粒(噬菌體庫)或酵母菌(酵母菌呈現)之表面上之隨機肽序列的大型庫來鑑別。或者，可在簡單結合分析法中測試重疊肽片段之所定義庫與測試抗體的結合。在另一實例中，可進行抗原之突變誘發、域交換實驗及丙胺酸掃描突變誘發以鑑別對於抗原決定基結合而言所需、足夠及/或必需的殘基。

在其最詳細之程度上，用於抗原與抗體之間的相互作用的抗原決定基可藉由定義存在於抗原-抗體相互作用中之原子接觸的空間座標以及關於其對結合熱力學之相對貢獻的資訊來定義。在不太詳細之程度上，抗原決定基可藉由定義抗原與抗體之間的原子接觸的空間座標來表徵。在更不詳細之程度上，由特定準則所定義，抗原決定基可藉由其所包含之胺基酸殘基表徵，例如藉由抗體與抗原中之原子(例如重原子，亦即，非氫原子)之間的距離表徵。在更不詳細之程度上，抗原決定基可由功能，例如由與其他抗體之競爭結合來表徵。抗原決定基亦可更一般地定義為包含胺基酸殘基，其中該等胺基酸殘基經另一胺基酸取代將改變抗體與抗原之間的相互作用之特徵(例如使用丙胺酸掃描)。

根據視所使用之抗原決定基定位法而定，在不同詳細程度下獲得抗原決定基之描述及定義的事實，由此得出可類似地在不同詳細程度下對同一抗原上之不同抗體之抗原決定基進行比較。

若以例如由X射線結晶學、核磁共振(NMR)光譜法、氫/氘交換質譜分析法(H/D-MS)測定之胺基酸水平所描述之抗原決定基含有相同胺基酸殘基組，則稱該等抗原決定基為一致的。若抗原決定基共用至少一個胺基酸，則將該等抗原決定基稱為重疊的。若抗原決定基不共用胺基酸殘基，則將該等抗原決定基稱為獨立(獨特)的。

可用於表徵抗體之另一方法為使用藉由已知結合至相同抗原之其他抗體進行的競爭分析法，以確定所關注之抗體是否與其他抗體結合至相同之抗原決定基。競爭分析法已為熟習此項技術者所熟知。若相對應抗體之結合為相互獨佔式的，亦即一個抗體之結合排除另一抗體之同時或連續結合，則稱藉由競爭結合表徵之抗原決定基為重疊的。若抗原能夠同時容納兩個相對應抗體之結合，則稱抗原決定基為獨立(獨特)的。

抗原決定基可為線性或構形的。在線性抗原決定基中，蛋白質與相互作用分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿著蛋白質之一級胺基酸序列線性存在。「非線性抗原決定基」或「構形抗原決定基」包含對抗原決定基具有特異性之抗體所結合之抗原蛋白質內之非連續多肽(或胺基酸)。

結合親和力術語「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)之成員之間的1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(K _D)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法來量測親和力。低親和力抗體一般緩慢結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體一般較快結合抗原且傾向於較長時間保持結合狀態。特定言之，術語「結合親和力」意欲指特定抗原-抗體相互作用之解離速率。K _D為解離速率(亦稱為「解離率(k _off)」)或「k _d」與結合速率(或「結合率(k _on)」)或「k _a」之比率。因此，K _D等於k _off/k _on(或k _d/k _a)且表示為莫耳濃度(M)。因此，K _D愈小則結合親和力愈強。因此，與1 nM之K _D相比，1 μM之K _D指示更弱的結合親和力。抗體之K _D值可使用此項技術中沿用已久之方法測定。一種用於測定抗體之K _D的例示性方法為藉由使用表面電漿子共振(SPR)，通常使用諸如BIACORE系統之生物感測器系統。BIACORE動力分析包含分析抗原與在表面上具有固定分子(例如包含抗原決定基結合域之分子)之晶片的結合及解離。另一種用於測定抗體之K _D的方法為藉由使用生物層干涉量測術，通常使用OCTET ^®技術(Octet QK ^e系統，ForteBio)。或者或另外，亦可使用KinExA (動力排除分析法)分析法，其可購自Sapidyne Instruments (Boise, ID)。

單特異性抗體「單特異性抗體」係指每個分子包含一或多個抗原結合位以使得抗體之任何及所有結合位特異性識別抗原上之相同抗原決定基的抗體。因此，在單特異性抗體具有超過一個抗原結合位之情況下，結合位彼此競爭結合至一個抗原分子。

雙特異性抗體「雙特異性抗體」係指對至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性之分子。在一些實施例中，雙特異性抗體可同時結合兩種不同抗原。在其他實施例中，兩種不同抗原決定基可存在於同一抗原上。

四功能 fab四功能fab分子係指包含四個抗原結合位之抗體或其抗原結合部分。抗原結合位可結合一個、兩個、三個或四個不同抗原決定基，且該等抗原決定基可位於一個、兩個、三個或四個不同標靶上。

半數最大有效濃度 (EC ₅₀) 術語「半數最大有效濃度(EC ₅₀)」係指在指定暴露時間之後引起介於基線與最大值之間的一半反應的治療劑之濃度。治療劑可引起抑制或刺激。EC ₅₀值係常用的，且在本文中用作效力之量度。

促效劑「促效劑」係指促進(亦即誘導、引起、增強或增加)另一分子之生物活性或作用的物質。術語促效劑涵蓋結合於分子以促進該分子之活性的物質(諸如抗體)。

拮抗劑「拮抗劑」係指阻止、阻斷、抑制、中和或降低另一分子(諸如受體)之生物活性或作用的物質。術語拮抗劑涵蓋結合於分子以阻止或降低該分子之活性的物質(諸如抗體)。

競爭關於抗體，如本文所用之術語「競爭」意謂第一抗體以足夠類似於第二抗體之結合的方式結合於抗原決定基，使得在存在第一抗體之情況下第二抗體與其同源抗原決定基之結合的結果與在不存在第一抗體之情況下第二抗體之結合相比可偵測地降低。替代方案可能但無需如此：在存在第二抗體之情況下第一抗體與其抗原決定基之結合亦可偵測地降低。亦即，在第二抗體不抑制第一抗體與其相應抗原決定基之結合的情況下，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定基之結合。然而，當各抗體無論在相同、更大或更小的程度上可偵測地抑制另一抗體與其同源抗原決定基或配位體之結合時，該等抗體稱為彼此「交叉競爭」結合其各別一或多個抗原決定基。本發明涵蓋競爭及交叉競爭抗體兩者。無論該競爭或交叉競爭發生之機制(例如位阻、構形變化或結合於共同抗原決定基或其部分)如何，熟習此項技術者基於本文中所提供之教示內容將瞭解，該等競爭或交叉競爭抗體涵蓋於且可適用於本文中所揭示之方法中。

Fc 受體「Fc受體」 (FcR)係指結合於抗體之Fc區的受體。在一些實施例中，FcR為天然人類FcR。在一些實施例中，FcR為結合IgG抗體(γ受體)且包括FcgRI、FcgRII及FcgRIII子類之受體(包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式)的FcR。FcgRII受體包括FcgRIIA (「活化受體」)及FcgRIIB (「抑制受體」)，其具有主要在其細胞質域方面不同之類似胺基酸序列。活化受體FcgRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。抑制受體FcgRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM) (參見例如Daeron, Annu. Rev. Immunol. 1997; 15:203-234)。FcR綜述於例如Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 1991; 9:457-92；Capel等人, Immunomethods 1994; 4:25-34；及de Haas等人, J. Lab. Clin. Med. 1995; 126:330-41中。其他FcR，包括將來鑑別之FcR，由本文中之術語「FcR受體」涵蓋。術語「Fc受體」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人, J. Immunol. 1976; 117:587及Kim等人, J. Immunol. 1994; 24:249)及調節免疫球蛋白之內穩態。量測與FcRn之結合的方法為已知的(參見例如Ghetie及Ward., Immunol. Today 1997; 18(12):592-598；Ghetie等人, Nature Biotechnology, 1997; 15(7):637-640；Hinton等人, J. Biol. Chem. 2004; 279(8):6213-6216；WO 2004/92219)。

效應細胞「效應細胞」係指表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。在某些實施例中，效應細胞至少表現FcgRIII且執行一或多種ADCC效應功能。介導ADCC之白血球的實例包括外周血液單核細胞(PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核球、巨噬球、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球。效應細胞可自天然來源，例如自血液分離。

抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)術語「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中分泌之Ig結合至某些細胞毒性細胞(例如NK細胞、嗜中性白血球及巨噬球)上所存在的Fc受體(FcR)上，使此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至攜有抗原之標靶細胞且隨後用細胞毒素殺傷標靶細胞。用於介導ADCC之初代細胞，即NK細胞僅表現FcgRIII，而單核球表現FcgRI、FcgRII及FcgRIII。為評估所關注分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析法，諸如美國專利第5,500,362號、第5,821,337號或第6,737,056中所描述。適用於該等分析法之效應細胞包括PBMC及NK細胞。或者或另外，可活體內(例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1998; 95:652-656中所揭示之動物模型)評估所關注分子之ADCC活性。具有變化之Fc區胺基酸序列及提高或降低之ADCC活性的額外抗體描述於例如美國專利第7,923,538號及美國專利第7,994,290號中。

增強之 ADCC 活性術語「增強之ADCC活性」係指與親本抗體相比在活體外或活體內更有效介導ADCC之抗體，其中該抗體與親本抗體在至少一個結構態樣中不同，且當分析法中所使用之該抗體及親本抗體的量基本上相同時。在一些實施例中，抗體及親本抗體具有相同胺基酸序列，但抗體經去岩藻糖基化而親本抗體經岩藻糖基化。在一些實施例中，將使用活體外ADCC分析法測定ADCC活性，但涵蓋用於測定ADCC活性之其他分析法或方法，例如在動物模型中等。在一些實施例中，具有增強之ADCC活性的抗體對FcgRIIIA具有增強之親和力。

變化之 FcR 結合或 ADCC 活性術語「變化之」FcR結合親和力或ADCC活性係指與親本抗體相比，對FcR結合活性及/或ADCC活性中之一或多者具有增強或減弱之活性的抗體，其中該抗體與親本抗體在至少一個結構態樣中不同。「呈現增加之與FcR之結合」的抗體以比親本抗體更高之親和力結合至少一種FcR。「呈現降低之與FcR之結合」的抗體以比親本抗體更低之親和力結合至少一種FcR。相比於天然序列IgG Fc區，呈現降低之與FcR之結合的該等抗體與FcR之結合可極少或無明顯結合，例如0-20%之與FcR之結合。

補體依賴性細胞毒性 (CDC)術語「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下標靶細胞之溶解。經典補體路徑之活化係藉由補體系統(Clq)之第一組分結合於(適當子類之)抗體起始，該等抗體結合於其同源抗原。為評估補體活化，可進行CDC分析法，例如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol. Methods 1996; 202: 163中所描述。具有變化之Fc區胺基酸序列及提高或降低之Clq結合能力的抗體描述於例如美國專利第6,194,551號、美國專利第7,923,538號、美國專利第7,994,290號及WO 1999/51642中。

宿主細胞「宿主細胞」係指可為或已成為用於併入聚核苷酸嵌段之一或多個載體之受體的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代，且後代可能歸因於自然、偶然或故意突變而未必與原始母細胞完全一致(在形態或基因體DNA補體方面)。宿主細胞包括經本發明之一或多個聚核苷酸活體內轉染之細胞。

載體「載體」係指構築體，其能夠在宿主細胞中遞送且較佳表現一或多種所關注基因或序列(例如抗體編碼基因)。載體之實例包括(但不限於)質體及病毒載體，且可包括裸核酸，或可包括與遞送輔助物質(例如陽離子縮合劑、脂質體等)相關之核酸。載體可包括DNA或RNA。如本文所用之「表現載體」係指包括至少一種多肽編碼基因、至少一種與基因之轉錄或轉譯相關的調節元件(例如啟動子序列、poly(A)序列)的載體。通常，本文所用之載體含有至少一種抗體編碼基因，以及調節元件或可選標記中之一或多者。載體組分可包括例如以下中之一或多者：信號序列；複製起點；一或多種標記基因；適合之轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於轉譯，亦可包括一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位、轉譯起始位及終止密碼子。

經分離「經分離」之分子(例如抗體)係指如下分子：藉助於其來源或衍生源而(1)不與在其天然狀態下伴隨其之天然相關組分相關聯；(2)實質上不含來自同一來源(例如物種、表現其之細胞、集合庫等)之其他分子；(3)由來自不同物種之細胞表現；或(4)在自然界中不存在。因此，經化學合成或在與天然來源之系統不同之細胞系統中表現的分子將從其天然相關組分中「分離」。使用此項技術中熟知之純化技術，藉由分離亦可使分子實質上不含天然相關組分。

多肽 / 蛋白質「多肽」或「蛋白質」 (在本文中可互換使用)係指任何長度之胺基酸鏈。鏈可為直鏈或分支鏈。鏈可包含一或多個經修飾之胺基酸。該等術語亦涵蓋已經過天然修飾或藉由干預修飾之胺基酸鏈；例如形成雙硫鍵、醣基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或諸如與標記組分結合之任何其他操縱或修飾。該定義內亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應理解，多肽可呈單鏈或相聯鏈形式存在。

聚核苷酸 / 核酸「聚核苷酸」或「核酸」(在本文中可互換使用)係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基或其等之類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其等之類似物。若存在，則可在鏈組裝之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合之後，諸如藉由與標記組分結合而進一步修飾。其他類型之修飾包括例如：「端帽」；由一或多個天然存在之核苷酸經類似物取代；核苷酸間修飾，諸如彼等經無電荷鍵聯(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及經帶電荷鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之修飾、含有側位部分(諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等))之修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)之修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)之修飾、含有烷基化劑之修飾、具有經修飾之鍵聯(例如α變旋異構核酸等)之修飾，以及一或多種聚核苷酸之未經修飾形式。此外，一般存在於糖中之任何羥基可例如由膦酸酯基、磷酸酯基置換；由標準保護基保護；或經活化以製備與額外核苷酸之額外鍵聯，或可結合至固體支撐物。5'及3'端OH可經磷酸化或經胺或具有1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之類似形式之核糖或去氧核糖，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)或來蘇糖(lyxose))；哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、非環類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核苷)。

保守性取代「保守性取代」係指由生物學上、化學上或結構上類似之殘基置換一個胺基酸。生物學上類似意謂取代不會破壞生物活性。結構上類似意謂胺基酸之側鏈具有類似長度(諸如丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸)或類似尺寸。化學上類似意謂殘基具有相同電荷或均為親水性或疏水性的。特定實例包括一種疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一種，或一種極性殘基取代另一種，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸或麩醯胺酸取代天冬醯胺酸、絲胺酸取代蘇胺酸及其類似取代。保守性取代之特定實例包括一種疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一種、一種極性殘基取代另一種，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸或麩醯胺酸取代天冬醯胺酸及其類似取代。保守性胺基酸取代通常包括例如以下基團內之取代：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸；天冬醯胺酸、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。

一致性術語「一致性」或「與……一致」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子或RNA分子)之間或多肽分子之間的總體相關性。「一致性」量測兩個或更多個序列之間的一致匹配百分比，其中由此項技術中熟知之電腦程式之特定數學模型(例如演算法)解決間隙比對。

術語「增加」、「提高」、「降低」或「減少」係指相對於基線量測值之值，諸如在起始本文所描述之治療之前相同個體之量測值，或在不存在本文所描述之治療情況下對照個體或個體(或多個對照個體或個體)之量測值。在一些實施例中，「對照個體」為罹患與所治療之個體相同形式的疾病或損傷之個體。在一些實施例中，「對照個體」為未罹患與所治療之個體相同形式之疾病或損傷的個體。

賦形劑術語『賦形劑』係指與所關注活性成分(例如抗體)組合，允許活性成分保留生物活性之任何物質。賦形劑之選擇在很大程度上將視諸如投與模式、賦形劑對溶解性及穩定性之影響及劑型性質的因素而定。如本文所用，「賦形劑」包括生理學上相容的任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑、載劑、稀釋劑及其類似物。賦形劑之實例包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物中之一或多者以及其組合，且在組合物中可包括等張劑，例如糖、氯化鈉或多元醇(諸如甘露醇或山梨醇)。

治療術語「治療(treating)」、「治療(treat)」或「治療(treatment)」係指任何類型之治療，諸如用於緩解、減輕或減緩患者之疾病、病症或病狀或與疾病相關之任何組織損傷之進展。在一些實施例中，疾病、病症或病狀為X。

預防術語「預防(prevent)」或「預防(prevention)」係指特定疾病、病症或病狀(例如***)之至少一種病徵或症狀(例如對特定應用具有特異性之***)發作延緩、發生率降低或嚴重程度降低中之一或多者。在一些實施例中，在群體基礎上評估預防以使得若在易患疾病、病症或病狀之群體中觀測到疾病、病症或病狀之一或多種症狀之發展、發生率或強度之統計學上顯著降低，則藥劑被視為「預防」特定疾病、病症或病狀。當疾病、病症或病狀之發作已延緩預定時段時，預防可視為完成。

個體術語「個體」(subject)、「個體」(individual)或「患者」 (在本文中可互換使用)係指任何動物，包括哺乳動物。根據本發明之哺乳動物包括犬、貓、牛、山羊、馬、綿羊、豬、嚙齒類動物、兔類動物、靈長類動物、人類以及類似動物，且涵蓋未出生之哺乳動物。在一個實施例中，人類為適合之個體。人類個體可為任何性別且處於任何發育階段。在一些實施例中，個體為患有以下疾病之患者：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)。

治療有效量術語「治療有效量」係指在組織、系統、動物、個體或人類中引發由研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫師所尋求之生物或醫學反應之活性成分的量，該反應可包括以下中之一或多者： (1)預防疾病；舉例而言，預防可能易患疾病、病狀或病症，但尚未經歷或顯示該疾病之病理學或症狀學之個體中的疾病、病狀或病症； (2)抑制疾病；舉例而言，抑制正經歷或顯示疾病、病狀或病症之病理學或症狀學之個體中的疾病、病狀或病症(亦即，遏制或減緩病理學或症狀學進一步發展)；及 (3)改善疾病；舉例而言，改善正經歷或顯示疾病、病狀或病症之病理學或症狀學之個體中的疾病、病狀或病症(亦即，逆轉病理學或症狀學)。

針對 TNFR2 之抗體本發明提供結合於TNFR2之抗體，TNFR2亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員1B (TNFRSF1B)、CD120b或p75。TNFR2為結合腫瘤壞死因子-α (TNFα)之兩種膜受體中之一者，另一種為TNFR1。TNFR2為I型跨膜受體，其具有由4個富含半胱胺酸之域CRD構成之細胞外域。TNFα與TNFR2之結合觸發細胞內信號傳導級聯，引起NF-KB活化以及隨後的細胞增殖、活化及存活。

如本文所用，術語TNFR2包括TNFR2之變異體、同功異型物、同系物、異種同源物及同種同源物。在一些實施例中，本文所揭示之抗體與來自除人類以外之物種之TNFR2 (諸如食蟹獼猴之TNFR2)以及不同形式之TNFR2交叉反應。在一些實施例中，抗體可完全對人類TNFR2具有特異性且可不展現物種交叉反應性(例如不結合小鼠TNFR2)或其他類型之交叉反應性。如本文所用，除非上下文另外規定，否則TNFR2係指天然存在之人類TNFR2。因此，「TNFR2抗體」、「抗-TNFR2抗體」或其他類似名稱意謂與TNFR2、其同功異型物、片段或衍生物結合或反應之任何抗體(如本文所定義)。如由UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P20333表示之TNFR2的全長、成熟形式在本文中作為SEQ ID NO: 34提供。如由UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P25119表示之小鼠TNFR2的全長、成熟形式在本文中作為SEQ ID NO: 35提供。如由NCBI資料庫寄存編號XP_005544817表示之食蟹獼猴TNFR2的全長、成熟形式在本文中作為SEQ ID NO: 36提供。

在一些態樣中，本發明之抗體促效TNFR2。在一些態樣中，本發明之抗體不抑制TNFα與抗體所結合之TNFR2分子的結合。

在一些實施例中，本發明之抗-TNFR2抗體涵蓋滿足以下條件中之一者或兩者的抗體：與具有如SEQ ID NO: 21所闡述之重鏈可變區之胺基酸序列及如SEQ ID NO: 8所闡述之輕鏈可變區之胺基酸序列的抗體i)競爭結合於人類TNFR2或ii)結合於相同的抗原決定基。

本發明之抗-TNFR2抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異結合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體片段之融合蛋白(例如單域抗體)、人源化抗體及包含具有所需特異性之抗原結合位的免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之組態，包括抗體之醣基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及經共價修飾之抗體。抗體可為小鼠、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合或人源化抗體)。在一些實施例中，抗-TNFR2抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗-TNFR2抗體為人類或人源化抗體。在一些實施例中，抗-TNFR2抗體為嵌合抗體。

在一些實施例中，本發明提供一種抗體，其具有如本文序列表中所發現之輕鏈可變區(VL)序列及重鏈可變區(VH)序列或其變異體。

本發明亦提供針對TNFR2之抗體的CDR部分。CDR區之測定完全在此項技術之技能範疇內。應瞭解，在一些實施例中，CDR可為Kabat與Chothia CDR之組合(亦稱為「組合CDR」或「延伸CDR」)。在本文中稱為CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可鑑別為向抗原結合作出焓貢獻之殘基。參見例如Makabe等人, 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166。一般而言，「構形CDR」包括Kabat CDR及游標區(Vernier zone)中之殘基位置，其受到約束以保持適當環形結構用於抗體結合特異性抗原。構形CDR之測定完全在此項技術之技能範疇內。在一些實施例中，CDR為Kabat CDR。在其他實施例中，CDR為Chothia CDR。在其他實施例中，CDR為延伸、AbM、構形或接觸CDR。換言之，在具有超過一個CDR之實施例中，CDR可為Kabat、Chothia、延伸、AbM、構形、接觸CDR中之任一者或其組合。

在一些實施例中，抗體包含以下中之一者或兩者：i)具有或不具有C端離胺酸之全長重鏈，或ii)抗-TNFR2抗體TF-2053之全長輕鏈。

在某些實施例中，本文所描述之抗體包含Fc域。Fc域可衍生自IgA (例如IgA ₁或IgA ₂)、IgG、IgE或IgG (例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃或IgG ₄)。在一些實施例中，抗-TNFR2抗體為IgG1抗體。

本發明涵蓋對展示於表5中之CDR及可變區之修飾。舉例而言，本發明包括包含不顯著影響特性之功能上等效的可變區及CDR的抗體以及具有增強或降低之活性或親和力的變異體。舉例而言，胺基酸序列可經突變以獲得具有對TNFR2之所需結合親和力的抗體。多肽修飾為此項技術中之常規實務且無需在本文中詳細描述。經修飾多肽之實例包括具有胺基酸殘基之保守性取代、胺基酸之一或多個缺失或添加(其不會使功能活性產生顯著有害變化，或其使多肽對其配位體之親和力成熟(增強))或使用化學類似物的多肽。

修飾或突變亦可在構架區或恆定區中進行以增加本文所提供之抗體的半衰期。參見例如PCT公開案第WO 00/09560號。亦可在構架區或恆定區中進行突變以改變抗體之免疫原性、提供共價或非共價結合於另一分子之部位，或改變諸如補體結合、FcR結合及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性的特性。在一些實施例中，在構架區或恆定區內進行不超過一至五個保守性胺基酸取代。在其他實施例中，在構架區或恆定區內進行不超過一至三個保守性胺基酸取代。根據本發明，單一抗體可在可變域之任一或多個CDR或構架區中或在恆定區中具有突變。

在一些實施例中，抗體包含經修飾之恆定區，其對人類Fc γ受體具有增加或減少之結合親和力且為免疫學上惰性或部分惰性的，例如不觸發補體介導之溶解，不刺激抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或不活化微膠質細胞；或在以下中之任一或多個方面具有降低之活性(相比於未經修飾之抗體)：觸發補體介導之溶解、刺激ADCC或活化微膠質細胞。恆定區之不同修飾可用以達成效應功能之最佳水平或組合。參見例如Morgan等人，Immunology 86:319-324, 1995；Lund等人，J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996；Idusogie等人，J. Immunology 164:4178-4184, 2000；Tao等人，J. Immunology 143: 2595-2601, 1989；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163:59-76, 1998。在一些實施例中，恆定區如Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624；PCT公開案第WO99/058572號中所描述經修飾。

修飾亦包括醣基化及非醣基化多肽，以及具有其他轉譯後修飾的多肽，諸如利用不同糖之醣基化、乙醯化及磷酸化。抗體在其恆定區中之保守位置發生醣基化(Jefferis及Lund，1997, Chem. Immunol. 65:111-128；Wright及Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能(Boyd等人，1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318；Wittwe及Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180)及醣蛋白之各部分之間的分子內相互作用，其可影響醣蛋白之構形及所呈現之三維表面(Jefferis及Lund, 見上文；Wyss及Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416)。寡醣亦可用於使指定醣蛋白基於特異性識別結構而靶向某些分子。亦已報導抗體之醣基化影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。特定言之，據報導在四環素調節之β(1,4)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III (GnTIII) (一種催化形成二等分GlcNAc之醣基轉移酶)之表現存在下，由CHO細胞所產生的抗體提高ADCC活性(Umana等人，1999, Nature Biotech. 17:176-180)。

在一些態樣中，本發明提供一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區及輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 29及SEQ ID NO: 30組成之群的VH序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列；及選自由SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 9組成之群的VL序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。

在一些態樣中，本發明提供一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區及輕鏈可變區包含根據SEQ ID NO: 30之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列，及根據SEQ ID NO: 9之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。

在一些態樣中，本發明提供一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區及輕鏈可變區包含 (i) 根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 7之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 20之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列；或 (ii) 根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 2之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 11之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列。

在一些態樣中，本發明提供一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 7之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，且其中根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 20之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列。

VH構架序列可衍生自選自由IGHV1-46、IGHV4-31、IGHV4-30-4及IGHV4-4組成之群的人類生殖系VH序列。在一些態樣中，VH構架序列可衍生自人類IGHV1-46生殖系序列。

VL構架序列可衍生自選自由IGKV1-9、IGKV1-33、IGKV1-27、IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV1-1及IGKV1-11組成之群的人類生殖系VL序列。在一些態樣中，VL構架序列係衍生自人類生殖系IGKV1-9序列。

在一些態樣中，本發明提供一種如所描述之抗體，其包含VL構架序列及VH構架序列，其中VL構架序列及VH構架序列中之一者或兩者與衍生其之人類生殖系序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。

在一些態樣中，本發明提供一種如所描述之抗體，其包含VL構架序列及VH構架序列，且其中VL構架序列或VH構架序列中之一者或兩者與衍生其之人類生殖系序列一致。

在一些態樣中，本發明提供一種抗體，其中VL包含根據選自由SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 8組成之群的序列之胺基酸序列，且其中VH包含根據選自由SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 21組成之群的序列之胺基酸序列。

在一些態樣中，本發明提供一種抗體，其包含SEQ ID NO: 13之VH序列及SEQ ID NO: 4之VL。

在一些態樣中，本發明提供一種抗體，其包含與SEQ ID NO: 21至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之VH序列，且包含與SEQ ID NO: 8至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之VL序列。

在一些態樣中，本發明提供一種抗體，其包含SEQ ID NO: 21之VH序列及SEQ ID NO: 8之VL。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其含有序列表中所展示之可變區的變化形式、序列表中所展示之CDR，其中此類變異型多肽與序列表中所揭示之任何胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。此等量不意謂為限制性的，且特定地設想所敍述百分比之間的增量為本發明之一部分。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由SEQ ID NO: 32之核酸序列編碼之VH序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼之VH序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼之VL序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含恆定重鏈域(CH1)及恆定輕鏈域(CL)。CH1可連接至VH，且CL可連接至VL，形成Fab域。抗體可包含第一及第二Fab域。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含抗體Fc域，該抗體Fc域包含第一Fc鏈及第二Fc鏈。第一Fab域可共價融合至第一Fc鏈，且第二Fab域可共價融合至第二Fc鏈。第一Fab域中之CH1域之C端可共價融合至第一Fc鏈之N端，且第二Fab域中之CH1域之C端可共價融合至第二Fc鏈之N端。Fc域可為IgA (例如IgA ₁或IgA ₂)、IgD、IgE、IgM或IgG (例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃或IgG ₄)之Fc域。Fc域可為IgG ₁之Fc域。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab域中之CH1域包含根據SEQ ID NO: 23之序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab域中之CL包含根據SEQ ID NO: 5之序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含輕鏈(LC)，該輕鏈包含根據SEQ ID NO: 9之序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab域與第二Fab域一致。第一Fc鏈自N端至C端可包含：第一鉸鏈區、第一CH2區及第一CH3區，且第二Fc鏈自N端至C端可包含：第二鉸鏈區、第二CH2區及第二CH3區。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一鉸鏈區及第二鉸鏈區中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 23之序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一CH2域及第二CH2域中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 25之序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一CH3域及第二CH3域中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 26之序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fc鏈及第二Fc鏈中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 37之序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fc鏈與第二Fc鏈一致。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含重鏈(HC)，該重鏈包含根據SEQ ID NO: 22之序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其進一步包含第三Fab及第四Fab。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab各自包含根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 7之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 20之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab各自包含具有根據SEQ ID NO: 21之序列的VH及具有根據SEQ ID NO: 8之序列的VL。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab彼此一致。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab之N'端連接至第三Fab之C'端。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab之N'端經由第一連接子連接至第三Fab之C'端。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一連接子包含根據SEQ ID NO: 27之序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第二Fab之N'端連接至第四Fab之C'端。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第二Fab之N'端經由第二連接子連接至第四Fab之C'端。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中第二連接子包含根據SEQ ID NO: 27之序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其中HC包含根據SEQ ID NO: 30之序列。 E54. 一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含有包含根據SEQ ID NO: 30之序列的重鏈(HC)及包含根據SEQ ID NO: 9之序列的輕鏈(LC)。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼之VH序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼之VL序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼的重鏈(HC)序列及由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼的輕鏈(LC)序列。

在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127530之質體編碼的HC序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA127532之質體編碼的LC序列。在一些實施例中，本發明提供一種抗-TNFR2抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127530之質體編碼的HC序列，及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127532之質體編碼的LC序列。

在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其包含重鏈及輕鏈，其中抗體重鏈具有由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127530之質體之嵌段之核酸序列編碼的胺基酸序列，且抗體輕鏈具有由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127532之質體之嵌段之核酸序列編碼的胺基酸序列。

在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中Fc域為IgG ₂之Fc域。在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab域中之CH1域包含根據SEQ ID NO: 14之序列。在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab域中之CL包含根據SEQ ID NO: 5之序列。

在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fab域與第二Fab域一致。

在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fc鏈自N端至C端包含：第一鉸鏈區、第一CH2區及第一CH3區，且第二Fc鏈自N端至C端包含：第二鉸鏈區、第二CH2區及第二CH3區。

在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一鉸鏈區及第二鉸鏈區中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 15之序列。在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一CH2域及第二CH2域中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 16之序列。在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一CH3域及第二CH3域中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 17之序列。在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fc鏈及第二Fc鏈中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 18之序列。

在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中第一Fc鏈與第二Fc鏈一致。在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中該抗體包含重鏈(HC)，該重鏈包含根據SEQ ID NO: 19之序列。在一些實施例中，本文提供一種抗-TNFR2抗體，其中該抗體包含輕鏈(LC)，該輕鏈包含根據選自由SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 9組成之群之序列的序列。

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體包含輕鏈(LC)，該輕鏈包含根據SEQ ID NO: 9之序列。

在一些實施例中，本文提供一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含有包含根據SEQ ID NO: 19之序列的重鏈(HC)及包含根據SEQ ID NO: 9之序列的輕鏈(LC)。

本發明亦涵蓋融合蛋白，其包含本文所揭示之抗體之一或多種組分。在一些實施例中，可製備融合蛋白，其包含與另一多肽連接的本發明之抗-TNFR2抗體的全部或一部分。在另一實施例中，僅抗-TNFR2抗體之可變域連接至多肽。在另一實施例中，抗-TNFR2抗體之VH域連接至第一多肽，而抗-TNFR2抗體之VL域連接至第二多肽，該第二多肽以使得VH及VL域可彼此相互作用以形成抗原結合位之方式與第一多肽結合。在另一實施例中，藉由連接子使VH域與VL域分隔，從而使得VH與VL域可彼此相互作用。VH-連接子-VL抗體隨後連接至所關注多肽。另外，可產生融合抗體，其中兩種(或更多種)單鏈抗體彼此連接。此在想要在單一多肽鏈上產生二價或多價抗體或想要產生雙特異性抗體之情況下係適用的。

抗 -TNFR2 抗體之生物活性 除結合TNFR2上之抗原決定基以外，本發明之抗體可介導生物活性。亦即，本發明包括一種特異性結合TNFR2且介導至少一種選自以下之可偵測活性的經分離之抗體： (i) 特異性結合於人類TNFR2； (ii) 特異性結合於食蟹獼猴TNFR2； (iii) 刺激TNFR2 (例如人類、食蟹獼猴)之活性；及/或 (iv) 當與TNFR2結合時准許TNFR2之TNFα活化

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體之特徵在於在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中EC ₅₀小於選自由5 μM及2 μM組成之群的數。

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體之特徵在於在人類外周血液單核球中之人類TNFR2效力分析法中EC ₅₀小於選自由10 μM、5 μM及2 μM組成之群的數。

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體之特徵在於在食蟹獼猴外周血液單核球中之食蟹獼猴TNFR2效力分析法中EC ₅₀小於選自由20 μM及15 μM組成之群的數。

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體之特徵在於在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中EC ₅₀小於選自由5 μM、1 μM及0.5 μM組成之群的數。

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體之特徵在於在來自人類外周血液單核球之表現人類TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC ₅₀小於選自由10 mg/ml、5 mg/ml及2 mg/ml組成之群的數。

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體之特徵在於在來自食蟹獼猴外周血液單核球之表現食蟹獼猴TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC ₅₀小於選自由50 mg/ml、20 mg/ml及15 mg/ml以及10 mg/ml組成之群的數。

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體之特徵在於對人類TNFR2之親和力KD小於選自由1 nM、0.5 nM、0.1 nM及0.07 nM組成之群的數。

在一些實施例中，本文提供一種經分離之抗-TNFR2抗體，其中該抗體之特徵在於對食蟹獼猴TNFR2之親和力KD小於選自由1 nM及0.1 nM組成之群的數。

在一些態樣中，藉由表面電漿子共振(SPR)來量測親和力。在一些態樣中，使用BIAcore來量測SPR。在一些態樣中，藉由SPR量測親和力，其中以10毫升/分鐘之流速在鏈黴抗生物素蛋白條帶表面上捕捉生物素化TNFR2持續60秒，且在所捕捉之TNFR2上以80毫升/分鐘，以用於50秒之結合階段之範圍內的濃度注射抗體，且隨後藉由以80毫升/分鐘注射HBS-EP+操作緩衝液持續600秒來起始解離階段。在一些態樣中，以10至0.625 nM之範圍內的濃度注射抗體。在一些態樣中，尤其對於包含兩個抗原結合域之標準IgG形式，以10至1.25 nM之範圍內的濃度注射抗體。在一些態樣中，尤其包含四個抗原結合域之四功能fab形式，以5至1.25 nM之範圍內的濃度注射抗體。在一些態樣中，使用Biacore評測軟體分析SPR資料。

編碼抗 -TNFR2 抗體之聚核苷酸及製造方法本發明亦提供編碼本發明之任何抗體，包括本文所描述之抗體部分及經修飾之抗體的聚核苷酸。本發明亦提供製造本文所描述之抗體及聚核苷酸中之任一者的方法。可藉由此項技術中已知之程序製造聚核苷酸及表現蛋白質。

若需要，可對所關注之抗-TNFR2抗體(單株或多株)進行定序且隨後可將聚核苷酸序列選殖至載體中用於表現或繁殖。編碼所關注抗體的序列可在宿主細胞中在載體中維持且宿主細胞隨後可擴增及冷凍供將來使用。細胞培養物中重組單株抗體之產生可經由利用此項技術中已知之手段自B細胞選殖抗體基因來進行。參見例如Tiller等人, 2008, J. Immunol. Methods 329, 112；美國專利案第7,314,622號。

在一些實施例中，本文提供一種聚核苷酸，其包含編碼本文所提供之抗-TFR2抗體之重鏈或輕鏈可變區中之一者或兩者的序列。編碼所關注抗體的序列可在宿主細胞中在載體中維持且宿主細胞隨後可擴增及冷凍供將來使用。本文中進一步描述載體(包括表現載體)及宿主細胞。

在一些實施例中，本發明提供編碼以下抗-TNFR2抗體IgG2-854、IgG2-1765及IgG1中之任一者之胺基酸序列的聚核苷酸。在一個實施例中，本發明提供編碼抗-TNFR2抗體TF-2053之胺基酸序列的聚核苷酸。

在一些實施例中，本發明提供編碼一或多種抗-TNFR2抗體重鏈多肽之聚核苷酸，該一或多種抗-TNFR2抗體重鏈多肽包含選自由SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 30組成之群的胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供編碼一或多種抗-TNFR2抗體輕鏈多肽之聚核苷酸，該一或多種抗-TNFR2抗體輕鏈多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 9。

在一些實施例中，本發明提供編碼一或多種抗-TNFR2抗體VH多肽之聚核苷酸，該一或多種抗-TNFR2抗體VH多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 29。

在一些實施例中，本發明提供編碼一或多種抗-TNFR2抗體VL多肽之聚核苷酸，該一或多種抗-TNFR2抗體VL多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 8。

本發明提供一種編碼抗體四功能fab 2053之重鏈的聚核苷酸，其包含寄存於ATCC且具有寄存編號PTA-127530之質體之嵌段的核酸序列。本發明亦提供一種編碼抗體四功能fab-2053之輕鏈的聚核苷酸，其包含寄存於ATCC且具有寄存編號PTA-127532之質體之嵌段的核酸序列。另外，本發明提供一種編碼抗體四功能fab-2053之VH域的多肽，其包含由寄存於ATCC且具有寄存編號PTA-127528之質體之DNA嵌段編碼的胺基酸序列。本發明進一步提供一種編碼抗體四功能fab-2053之VH域的多肽，其包含由寄存於ATCC且具有寄存編號PTA-127529之質體之DNA嵌段編碼的胺基酸序列。本發明進一步提供一種編碼抗體四功能fab-2053之VL域的多肽，其包含由寄存於ATCC且具有寄存編號PTA-127531之質體之嵌段編碼的胺基酸序列。

一般熟習此項技術者應瞭解，由於基因密碼之簡併，存在許多編碼如本文所描述之多肽的核苷酸序列。一些此等聚核苷酸攜帶與任何天然基因之核苷酸序列的最小同源性。儘管如此，本發明尤其預期因密碼子使用差異而改變之聚核苷酸。另外，包含本文所提供之聚核苷酸序列之基因的對偶基因係在本發明之範疇內。對偶基因為由於核苷酸之一或多個突變(諸如缺失、添加或取代)而變化的內源基因。所得mRNA及蛋白質可(但未必)具有變化之結構或功能。對偶基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增或資料庫序列比較)來鑑別。

在一個實施例中，VH及VL域或全長HC或LC由獨立聚核苷酸編碼。或者，VH及VL或HC及LC均由單一聚核苷酸編碼。

本發明亦涵蓋與任何該等序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股的，且可為DNA (基因體、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子；及mRNA分子，其不含內含子。其他編碼或非編碼序列可能(但未必)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可能(但未必)連接至其他分子或支撐物質。

本發明之聚核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學聚核苷酸合成方法為此項技術中所熟知且無需詳細描述於本文中。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商用DNA合成器以產生所需DNA序列。

對於使用重組方法製備聚核苷酸，包含所需序列之聚核苷酸可插入適合載體中，且載體又可引入適合宿主細胞中進行複製及擴增，如本文中進一步論述。聚核苷酸可藉由此項技術中已知的任何方式插入宿主細胞中。藉由利用直接吸收、內吞作用、轉染、F-配對或電穿孔將外源性聚核苷酸引入來使細胞轉形。一旦引入，外源性聚核苷酸可作為非整合型載體(諸如質體)保持在細胞內或整合至宿主細胞基因體中。

適合之選殖載體可根據標準技術構築，或可選自大量此項技術中可用之選殖載體。雖然所選的選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞而變化，但適用選殖載體一般將具有一或多種特徵，諸如i)自我複製之能力，ii)特定限制性核酸內切酶之單一標靶，或iii)可攜帶標記物之基因，其可用於選擇含有載體之殖株。適合之實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript (例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體(諸如pSA3及pAT28)。此等及許多其他選殖載體可購自諸如BioRad、Strategene及Invitrogen之商業供應商。

進一步提供表現載體。表現載體通常為含有根據本發明之聚核苷酸的可複製聚核苷酸構築體。此意味著表現載體作為游離基因體或作為染色體DNA之整體部分在宿主細胞中必須為可複製的。適合之表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之一或多種表現載體。載體組分通常可包括(但不限於)以下中之一或多者：信號序列；複製起點；一或多種標記基因；適合之轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(亦即轉譯)，亦通常需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位、轉譯啟動位及終止密碼子。

含有所關注聚核苷酸之載體可藉由許多適當手段中之任一者引入宿主細胞中，該等手段包括電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖苷或其他物質之轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(例如其中載體為諸如痘瘡病毒之傳染原)。引入載體或聚核苷酸之選擇將通常視宿主細胞之特徵而定。

本發明亦提供包含任何本文所描述之聚核苷酸的宿主細胞。能夠過表現異源DNA之任何宿主細胞可用於分離編碼所關注之抗體、多肽或蛋白質的基因之目的。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括(但不限於) COS、HeLa及CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。適合之非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌( E. coli)或枯草芽胞桿菌( B. subtillis))及酵母菌(諸如釀酒酵母( S. cerevisae)、裂殖酵母( S. pombe)或乳酸克魯維酵母( K. lactis))。

另外，可根據本發明使用任何數量之可商購及不可商購的表現多肽或蛋白質之細胞株。熟習此項技術者應瞭解，不同細胞株可具有不同營養需求或可需要不同培養條件以實現最佳生長及多肽或蛋白質表現，且將能夠視需要改變條件。

醫藥組合物在另一實施例中，本發明包含醫藥組合物。

「醫藥組合物」係指本發明抗體與一或多種賦形劑之混合物。

本發明之醫藥組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液及冷凍乾燥粉末。該等形式視預期投與模式及治療應用而定。

亦可使用醫藥技術中已知之其他賦形劑及投與模式。本發明之醫藥組合物可藉由任何熟知之藥劑學技術，諸如有效調配及投與程序製備。上文關於有效調配及投與程序之考慮因素在此項技術中已熟知且描述於標準教科書中。藥物之調配論述於例如Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1975；Liberman等人編, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；及Kibbe等人編, Handbook of Pharmaceutical Excipients(第3版), American Pharmaceutical Association, Washington, 1999中。

可接受之賦形劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒，且可包含緩衝液，諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六甲季銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；或非離子型界面活性劑，諸如TWEEN ^TM、PLURONICS ^TM或聚乙二醇(PEG)。

治療方法、診斷方法及其他方法本發明之抗體及抗體結合物適用於各種應用，包括(但不限於)治療性治療方法及診斷性治療方法。

在一些實施例中，本發明之抗體可刺激TNFR2之活性且可適用於治療、預防、抑制及改善以下一或多種疾病：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)或由刺激TNFR2引起之疾病、病症及病狀。

在一個態樣中，本發明提供一種用於治療選自由以下組成之群的一或多者的方法：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)。在一些實施例中，治療個體中之選自由類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)組成之群的一或多者的方法包含向有需要之個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含任何如本文所描述之TNFR2抗體。在一些實施例中，提供一種減少個體中之發炎及/或活化或擴增免疫調節細胞類型之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之包含本文所提供之抗體的組合物。

在另一態樣中，本發明進一步提供一種如本文所描述之抗體或醫藥組合物，其係用於所描述的治療以下疾病之方法中：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)或其他自體免疫性及發炎性病狀。本發明亦提供如本文所描述之抗體之用途，其係用於製造用以治療選自由以下組成之群之一或多者的藥劑：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)或其他自體免疫性及發炎性病狀。

在另一態樣中，提供一種用於以下一或多種目的之方法：偵測、診斷或監測選自由以下組成之群的一或多者：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)或其他自體免疫性及發炎性病狀。舉例而言，如本文所描述之抗-TNFR2抗體可用諸如造影劑及酶-受質標記之可偵測部分標記。如本文所述之抗體亦可用於活體內診斷分析法，諸如活體內造影(例如PET或SPECT)，或染色試劑。

關於本文所描述之所有方法，所提及的抗-TNFR2抗體亦包括醫藥組合物，該等醫藥組合物包含抗-TNFR2抗體及一或多種額外藥劑。

投與及給藥通常，本發明之抗體係以有效治療如本文所描述之病狀的量投與。本發明之抗體可以抗體本身形式投與，或者以含有該抗體之醫藥組合物形式投與。

本發明之抗體藉由任何適合途徑以適於此類途徑之醫藥組合物形式且以對預期治療有效的劑量投與。

在一些實施例中，抗體可非經腸投與，例如直接投與至血流、肌肉或內臟中。適用於非經腸投與之方式包括靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、心室內、尿道內、胸骨內、顱內、肌肉內及皮下。適用於非經腸投與之裝置包括針(包括微針)注射器、無針注射器及輸注技術。

在另一實施例中，本發明之化合物亦可局部投與至皮膚或黏膜，即經皮或透皮。在另一實施例中，本發明之化合物亦可經鼻內或藉由吸入投與。在另一實施例中，本發明之化合物亦可經直腸或經陰道投與。在另一實施例中，本發明之化合物亦可直接投與至眼或耳。

本發明之抗體或含有該等抗體之組合物的給藥方案係基於多種因素，包括個體之類型、年齡、體重、性別及醫學病狀；病狀之嚴重程度；投與途徑；及所採用特定抗體之活性。因此，給藥方案可廣泛變化。在一個實施例中，本發明之抗體的每日總劑量通常為約0.01至約100 mg/kg (亦即，毫克本發明之抗體/公斤體重)以用於治療本文所論述之指定病狀。在另一實施例中，本發明之抗體的每日總劑量為約0.1至約50 mg/kg，且在另一實施例中為約0.5至約30 mg/kg。

共投與本發明之抗體可單獨或與一或多種其他治療劑組合使用。本發明提供任何如本文所定義之用途、方法或組合物，其中本發明之抗體與一或多種本文所論述之其他治療劑組合使用。

「組合」投與兩種或更多種藥劑意謂所有藥劑在時間上足夠近地投與以實現對個體之治療。兩種或更多種藥劑可同時或依序投與。另外，同時投與可藉由在投與之前混合藥劑或藉由在同一時間點但在相同或不同投與部位以單獨劑型投與藥劑來進行。

套組本發明之另一態樣提供一種套組，其包含本發明之抗體或包含該抗體之醫藥組合物。除本發明之抗體或其醫藥組合物以外，套組亦可包括診斷劑或治療劑。套組亦可包括診斷性或治療性方法中之使用說明書。在一些實施例中，套組包括抗體或其醫藥組合物及診斷劑。

在另一實施例中，本發明包含適用於進行本文所描述之治療方法的套組。在一個實施例中，套組含有第一劑型，該第一劑型包含一或多種本發明之抗體，其量足以進行本發明之方法。在另一實施例中，套組包含足以進行本發明之方法之量的一或多種發明之抗體以及至少用於第一劑量之第一容器及用於第二劑量之第二容器。

生物寄存本發明之代表性材料於2023年3月3日寄存於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA。

抗體	描述	ATCC 寄存編號
2053_outerVH	TF2053外部VH域	PTA-127528
2053_InnerVH	TF2053內部VH域	PTA-127529
2053_FullVH	TF2053完全HC	PTA-127530
2053_VL	TF2053 VL	PTA-127531
2053_FullVL	TF2053完全LC	PTA-127532

按照國際承認用於專利程序的微生物寄存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)及其下條例(布達佩斯條約(Budapest Treaty))之規定進行寄存。此確保自寄存之日起維持寄存物之活培養物達30年。寄存將由ATCC依據布達佩斯條約之條款進行，且受制於Pfizer Inc.與ATCC之間的協定，該協定確保在相關美國專利發佈後或在任何美國或外國專利申請案對公眾公佈後(以先者為準)，公眾可永久且無限制地利用寄存培養物之後代，且確保可利用由經授權之美國專利及商標局委員(U.S. Commissioner of Patents and Trademarks)根據35 U.S.C.第122章節及依據其之委員規則(包括特定參考886 OG 638之37 C.F.R.第1.14章節)所確定之寄存培養物之後代。

本申請案之受讓人已同意，若處於寄存之物質的培養物在適合條件下培養時死亡或丟失或毀壞；則將在通知後將該等物質即時用另一相同物質置換。寄存物質之可供使用性不應解釋為許可在違反由任何政府部門根據其專利法授予之權利的情況下實踐本發明。

實例用於實行本發明之特定態樣的以下實例僅出於說明之目的提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。

前述描述及以下實例詳述本發明之某些特定實施例，且描述本發明人所預期之最佳模式。然而，應瞭解，無論以文字呈現之前述內容如何詳細，本發明可以許多方式實踐，且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何等效物解釋。

雖然已參考不同申請案、方法、套組及組合物描述所揭示之教示內容，但應瞭解在不背離本文中之教示內容及下文所主張之本發明的情況下可進行各種變化及修改。提供以下實例以更好地說明本發明之教示內容，且並不意欲限制本文中所呈現之教示內容的範疇。儘管已在此等例示性實施例方面描述本發明之教示內容，但熟習此項技術者將容易理解在無不當實驗情況下此等例示性實施例之大量變化及修改為可能的。所有此類變化及修改皆在本教示內容之範疇內。縮寫含義AUC 曲線下面積 CDR 互補決定區 CH 恆定重鏈 CHO 中國倉鼠卵巢 CRD 富含半胱胺酸之域 Cyno 食蟹獼猴 DAPI EC50 半數最大有效濃度 F 雌性 Fab 抗原結合片段 FBS 胎牛血清 Fc 可結晶片段 FW 構架 G4S 甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸 GFP 綠色螢光蛋白 ICAM-1 細胞間黏附分子-1 IKBa B細胞抑制劑α中之κ輕多肽基因強化子之核因子 IL-2 介白素-2 IP 腹膜內 IV 靜脈內 M 雄性 MFI 平均螢光強度 NF-KB 核因子κB OX40 OX40受體，亦稱為TNFRSF4或CD134 PBMC 外周血液單核細胞 Pen/Strep 青黴素/鏈黴素 PFA 多聚甲醛 PMA 佛波醇(Phorbol) 12-十四酸酯13-乙酸酯 SDR 特異性決定殘基 SEC 尺寸排阻管柱 SPR 表面電漿子共振 TIGIT 具有免疫球蛋白及ITIM域之T細胞免疫受體 TNFa 腫瘤壞死因子α TNFR2 腫瘤壞死因子受體-2 Treg 調節性T細胞

實例 1 分離結合於人類及食蟹獼猴 TNFR2 之小鼠單株抗體SJL小鼠藉由數次IP注射Enbrel (HuTNFR2-IgG1-Fc)及作為佐劑之ribi進行免疫。針對與CHO細胞表面上過表現之人類及食蟹獼猴(Cyno) TNFR2之結合來篩選血清。將展示CHO細胞上之強結合的小鼠處死，且藉由電融合將經分離之B細胞與P3X骨髓瘤融合。

在融合瘤上清液篩選之後，使用TNFR2 CHO結合，選擇14種殖株且再格式化成HuIgG1及HuIgG2 (參見實例2)。在此等28種HuIgG1及HuIgG2中，在針對CHO細胞過表現人類及cyno TNFR2之確認篩選之後(參見表1)，選擇16種用於進一步表徵(殖株813、殖株817、殖株836、殖株846、殖株851、殖株854、殖株1201、殖株1070、殖株1211、殖株1215、殖株1296、殖株1302、殖株1304、殖株1310、殖株1327及殖株1329)，展示一系列與人類及cyno TNFR2之結合。

IgG1 殖株	Hu CHO EC50 (ng/ml)	Cy CHO EC50 (ng/ml)	IgG2 殖株	Hu CHO EC50 (ng/ml)	Cy CHO EC50 (ng/ml)
813	7557	nd	842	2379	nd
807	147.1	144.4	836	50.9	162
817	89.9	105.3	846	135	233
822	96.91	nd	851	363.1	nd
825	69.8	nd	854	106.2	130
899	35.2	149	1334	85.70	210.4
957	中度結合	弱結合	1201	163.2	33
1070	356.0	748.1	1209	2644	18500
1072	nd	nd	1211	245.0	nd
1076	79.2	279.4	1215	216.3	271
1296	160.2	412.3	1321	4250	5537
1304	234.0	弱結合	1329	163.4	強結合
1285	nd	nd	1310	151.4	nd
1302	154.6	257.4	1327	337.5	486

Nd ： 未經測定 ( 一些殖株為不佳表現者且測試物質之量受限制 ) 表 1：所選殖株之HuIgG1及HuIgG2對的人類及cyno TNFR2 CHO細胞EC50值。

實例 2 選殖小鼠抗 -TNFR2 抗體重鏈及輕鏈可變區使用SMART® cDNA合成系統(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)來選殖抗-TNFR2抗體之重鏈及輕鏈可變區，接著進行PCR擴增。使用RNEasy套組(Qiagen)及具有SuperscriptIV ^TM逆轉錄酶(Invitrogen)之模板轉換寡核苷酸，由自約500,000個融合瘤細胞中分離的總共1 μg RNA合成cDNA。接著使用黏接至SMART® IIA寡核苷酸序列之引子及小鼠恆定區特異性引子(以小鼠κ用於輕鏈，及以小鼠IgG用於重鏈)以及Q5高保真2倍主混合物(High-Fidelity 2X Master Mix) (New England Biolabs)，藉由PCR來擴增cDNA。使用輸注選殖方法(Takara Bio)將可變重鏈及輕鏈區分別選殖入含有小鼠IgG2a恆定區及κ恆定區的小鼠pTT5哺乳動物表現載體中，且測定核酸序列。

隨後將可變重鏈區選殖入含有經突變以消除效應功能(Leu234Ala、Leu235Ala及Gly237Ala，Eu編號；美國專利案第5,624,821號)之人類IgG1恆定區的pTT5表現載體中，產生嵌合重鏈。將可變輕鏈區選殖入含有恆定人類κ區之pTT5哺乳動物表現載體中，產生嵌合輕鏈。

實例 3 一些抗 -TNFR2 抗體在 NF-KB-GFP Jurkat 報導細胞分析法中促效人類 TNFR2使用含有全長人類TNFR2嵌段之慢病毒載體(pLVX-puro，Takara Bio US)藉由轉導來穩定轉染NF-KB-GFP Jurkat細胞(System Biosciences, Palo Alto, CA)。對於分析法，以100000個細胞/孔塗佈於96孔盤中之補充有10% FBS、1×丙酮酸鈉、1×Glutamax及Pen/Strep之RPMI1640培養基中。接下來將細胞與抗-TNFR2抗體之連續稀釋液一起在37℃下培育隔夜。第二天，將細胞如下準備進行流動式細胞量測術分析：在離心移除上清液之後，用0.25%胰蛋白酶處理細胞以分解凝塊。最後，將細胞再次離心，再懸浮於75 ml含有DAPI試劑之1/1000稀釋液的流動緩衝液中且在流動式細胞儀上分析GFP表現。

表2概述前述TNFR2 CHO細胞分析法之結果及在Jurkat細胞報導分析法中之效力。基於關於Jurkat分析法之一系列EC50及序列多樣性，吾人選擇9種殖株(均為IgG2)進行進一步表徵。

殖株	同型	Hu CHO (ng/ml)	Cy CHO (ng/ml)	Jurkat (ng/ml)
813	IgG1	7557	nd	1122
836	IgG2	50.9	162	598
846	IgG2	135	233	142
817	IgG1	89.9	105.3	170.1
851	IgG2	363.1	nd	263
854	IgG2	106.2	130	711
1201	IgG2	163.2	33	11.6
1070	IgG1	356.0	748.1	112.9
1211	IgG2	245.0	nd	130
1215	IgG2	216.3	271	492
1296	IgG1	160.2	412.3	3169
1304	IgG1	234.0	不良	未促效
1329	IgG2	163.4	強結合	60
1310	IgG2	151.4	nd	667
1302	IgG1	154.6	257.4	660.9
1327	IgG2	337.5	486	未促效

Nd ： 未經測定 ( 一些殖株為不佳表現者且測試物質之量受限制 ) 表 2：一系列所選殖株之CHO結合及Jurkat報導分析法EC50

實例 4 所選促效劑殖株在初代細胞中之生物物理學特徵及促效作用 ( 人類 PBMC 活化分析法 )接下來測試9種先前所選殖株誘導ICAM-1在CD3+CD4+TIGIT+人類PBMC中上調的能力(方法參見實例11)。吾人亦評估一些生物物理學特性，諸如序列可靠性及非特異性(AC-SINS及多反應性)。

殖株	序列可靠性	AC-SINS	多反應性	人類 PBMC 中之促效作用
836	N連接之醣基化部位	低	低	中度促效
846	氧化部位	低	高	中度促效
851	異構化及脫醯胺部位	中度	高	弱促效
854	氧化及脫醯胺部位	中度	低	強促效
1201	氧化部位	低	低	弱促效
1211	異構化及脫醯胺部位	低	高	弱促效
1215	CDR中之游離半胱胺酸氧化部位	低	高	弱促效
1310	氧化部位	中度	低	中等促效
1329	N連接之醣基化部位	高	高	未促效

表 3：人類初代細胞中之序列可靠性、非特異性水平及促效作用。

如表3中所見，吾人在人類PBMC中觀測到一系列促效作用，且決定繼續研究對初代細胞展示一些效力的殖株(殖株836、殖株846、殖株854、殖株1201及殖株1310)，且可視需要藉由稍後的最佳化來管理非特異性水平。

實例 6 抗 -TNFR2 抗體之抗原決定基分組亦使用表現人類TNFR1/TNFR2域嵌合體之酵母菌進行抗原決定基分組。用各種構築體穩定轉染酵母菌細胞，其中TNFR2之一個或兩個CRD交換為相應人類TNFR1 CRD。類似地，亦測試反向構築體，其中TNFR1之一個或兩個CRD交換為相應TNFR2 CRD。結合損失或增加分別指示特定CRD對於結合於TNFR2係必需的及含有抗原決定基。

如表4中所見，除殖株836 (CRD1)及殖株1310 (CRD1-3-4)以外，大多數殖株結合於CRD3-4。

殖株	抗原決定基
836	CRD1
846	CRD3-4
854	CRD3-4
1201	CRD-3-4
1310	CRD1-3-4
1329	CRD3-4

表 4：評估與酵母菌上表現之人類TNFR1/TNFR2嵌合體之結合以測定TNFR2上之結合域

實例 7 小鼠抗 -TNFR2 抗體之人源化選擇殖株854用於進一步人源化，因為其為較強促效抗體。藉由將鼠類高變區移植至各種人類構架中來進行殖株854之人源化。

重鏈之高變區使用SDR定義(特異性決定殘基)來定義，而輕鏈之高變區使用CDR定義(互補決定區)來定義。

重鏈 (SEQ ID NO: 13)	FW1	SDR1	FW2	SDR2	WF3	SDR3	FW4
SEQ ID NO: 13之殘基1-25	GFSFPSSGVD (SEQ ID NO: 10)	SEQ ID NO: 13之殘基36-49	VTWGVGSTHYNSALKS (SEQ ID NO: 11)	SEQ ID NO: 13之殘基66-97	GEW DEGFVYWGQG (SEQ ID NO: 12)	SEQ ID NO: 13之殘基107-117
輕鏈 (SEQ ID NO: 4)	FW1	CDR1	FW2	CDR2	WF3	CDR3	FW4
SEQ ID NO: 4之殘基1-23	KASQNVGTAVA (SEQ ID NO: 1)	SEQ ID NO:4之殘基35-49	SASNRYT (SEQ ID NO: 2)	SEQ ID NO: 4之殘基57-88	QQYSSYPLT (SEQ ID NO: 3)	SEQ ID NO: 4之殘基97-107

表 5：殖株854之重鏈及輕鏈的胺基酸序列。

SDR定義而非CDR用於移植，因此對於結合及親和力至關重要之鼠類胺基酸在人源化過程期間具有保守性。

選擇用於移植854鼠類重鏈SDR之人類重鏈構架如下：IGHV4-31*02、IGHV4-30-4*07、IGHV4-4*08 (與殖株854最接近之3個生殖系家族)、IGHV3-23*01、IGHV1-46*01及IGHV3-7*01 (3種常用的人類構架)以及IGHJ4*01 J-基因。選擇用於移植854鼠類輕鏈CDR之人類輕鏈構架如下：IGKV3-11*01、IGKV1-9*01、IGKV1-33*01、IGKV1-27*01、IGKV1-39*01及IGKV4-1*01以及IGKJ4*01 J-基因。

實例 8 人源化 TNFR2 抗體與人類 TNFR2 CHO 細胞之結合表現重鏈及輕鏈之所有組合且測試與人類TNFR2 CHO細胞之結合：

VH	VK	名稱	EC50 nM	854 之最大信號百分比	AC-SINS
		GBT-TNFR2-854 (親本)	1.131	100
IGHV4-31	IGKV1-9	GBT-TNFR2-0854_移植物1	31.71	48	中等
IGHV4-31	IGKV1-33	GBT-TNFR2-0854_移植物2	43.77	34	中等
IGHV4-31	IGKV1-27	GBT-TNFR2-0854_移植物3	90.01	22	中等
IGHV4-31	IGKV1-39	GBT-TNFR2-0854_移植物4	38.23	31	中等
IGHV4-31	IGKV3-11	GBT-TNFR2-0854_移植物5	42.95	41	低
IGHV4-31	IGKV4-1	GBT-TNFR2-0854_移植物6	65.38	27	低
IGHV4-30-4	IGKV1-9	GBT-TNFR2-0854_移植物7	271.2	51	中等
IGHV4-30-4	IGKV1-33	GBT-TNFR2-0854_移植物8	87.91	29	中等
IGHV4-30-4	IGKV1-27	GBT-TNFR2-0854_移植物9	125.2	22	中等
IGHV4-30-4	IGKV1-39	GBT-TNFR2-0854_移植物10	53.69	33	中等
IGHV4-30-4	IGKV3-11	GBT-TNFR2-0854_移植物11	41.04	34	低
IGHV4-30-4	IGKV4-1	GBT-TNFR2-0854_移植物12	50.96	27	低
IGHV4-4	IGKV1-9	GBT-TNFR2-0854_移植物13	28.44	29	中等
IGHV4-4	IGKV1-33	GBT-TNFR2-0854_移植物14	120.6	24	中等
IGHV4-4	IGKV1-27	GBT-TNFR2-0854_移植物15	143.3	15	中等
IGHV4-4	IGKV1-39	GBT-TNFR2-0854_移植物16	42.91	34	中等
IGHV4-4	IGKV3-11	GBT-TNFR2-0854_移植物17	47.82	36	低
IGHV4-4	IGKV4-1	GBT-TNFR2-0854_移植物18	59.48	28	低
IGHV3-23	IGKV1-9	GBT-TNFR2-0854_移植物19	9.437	56	低
IGHV3-23	IGKV1-33	GBT-TNFR2-0854_移植物20	13.75	52	中等
IGHV3-23	IGKV1-27	GBT-TNFR2-0854_移植物21	27.55	50	低
IGHV3-23	IGKV1-39	GBT-TNFR2-0854_移植物22	17.99	58	低
IGHV3-23	IGKV3-11	GBT-TNFR2-0854_移植物23	26.35	51	低
IGHV3-23	IGKV4-1	GBT-TNFR2-0854_移植物24	27.99	47	低
IGHV3-7	IGKV1-9	GBT-TNFR2-0854_移植物25	10.96	56	低
IGHV3-7	IGKV1-33	GBT-TNFR2-0854_移植物26	15.58	45	低
IGHV3-7	IGKV1-27	GBT-TNFR2-0854_移植物27	13.48	64	低
IGHV3-7	IGKV1-39	GBT-TNFR2-0854_移植物28	19.52	62	低
IGHV3-7	IGKV3-11	GBT-TNFR2-0854_移植物29	26.07	46	低
IGHV3-7	IGKV4-1	GBT-TNFR2-0854_移植物30	15.92	55	低
IGHV1-46	IGKV1-9	GBT-TNFR2-0854_移植物31	1.873	79	高
IGHV1-46	IGKV1-33	GBT-TNFR2-0854_移植物32	4.995	74	高
IGHV1-46	IGKV1-27	GBT-TNFR2-0854_移植物33	2.97	72	高
IGHV1-46	IGKV1-39	GBT-TNFR2-0854_移植物34	2.579	78	高
IGHV1-46	IGKV3-11	GBT-TNFR2-0854_移植物35	1.579	78	高
IGHV1-46	IGKV4-1	GBT-TNFR2-0854_移植物36	5.436	66	中等

表 6：人類移植物結合資料-重鏈及輕鏈之組合經純化且測試與人類TNFR2 CHO細胞之結合。結果表示為EC50及與親本854之最大信號相比的結合百分比。

在移植至各種人類構架中之後，觀測到顯著結合損失，如表6中所概述。一些殖株，諸如移植物31、33、34及35顯示接近854之EC50值，但最大信號顯著較低，且其AC-SINS評分高。所有DNA/胰島素多反應性評分均較低(資料未展示)。

實例 9 引入回復突變以恢復與 TNFR2 之結合為使與TNFR2之結合恢復至親本854殖株之水平，將各種回復突變引入所選數量之重鏈移植構築體中：

FW	所引入之突變 (Kabat 編號 )
VH1-46	A24V
VH1-46	M69I、R71K
VH1-46	A24V、M69I、R71K
VH1-46	A24V、M69I、R71K、T75K
VH1-46	A24V、M69I、R71K、T73N、T75K
VH1-46	A24V、Q61S、M69I、R71K
VH3-7	L78V
VH3-7	R71K、L78V
VH3-7	A24V、L78V
VH3-7	A24V、R71K
VH4-30	V71K
VH4-30	F78V
VH4-30	V71K、F78V
VH4-30	V71K、T73N、F78V
VH4-30	V71K、N76S、F78V
VH4-30	V71K、F78V、V89I
VH4-30	I37V、V71K、F78V

表 7：引入人類重鏈構架VH1-46、VH3-7及VH4-30中之回復突變。

各重鏈如實例7中所描述與以下人源化輕鏈配對：VK4-1、VK3-11、VK1-39及VK1-9，且亦與CDR2-L2經生殖系化之相同人源化輕鏈配對。

實例 10 人源化 TNFR2 抗體與人類 TNFR2 之結合表現且純化總共114種殖株，且將其與人類TNFR2 CHO細胞之結合與親本854殖株進行比較。如下表8中所見，大部分殖株顯示EC50接近或優於親本殖株854。選擇殖株1847、殖株1765、殖株1753及殖株1747用於進一步表徵。

殖株名稱	重鏈	輕鏈	CHO EC50 nM	AC-SINS
親本854			1.131
1848	VH4-30_I37V_V71K_F78V	VK1-9親本	2.541	低
1847	VH4-30_I37V_V71K_F78V	VK1-9_GL CDR2	1.309	低
1846	VH4-30_I37V_V71K_F78V	VK3-11親本	1.851	低
1845	VH4-30_I37V_V71K_F78V	VK3-11_GL CDR2	1.277	低
1844	VH4-30_I37V_V71K_F78V	VK1-39親本	2.471	低
1843	VH4-30_I37V_V71K_F78V	VK1-39_GL CDR2	4.407	低
1842	VH4-30_V71K_F78V_V89I	VK1-9親本	3.543	低
1841	VH4-30_V71K_F78V_V89I	VK1-9_GL CDR2	3.311	低
1840	VH4-30_V71K_F78V_V89I	VK3-11親本	1.638	低
1839	VH4-30_V71K_F78V_V89I	VK3-11_GL CDR2	1.547	低
1838	VH4-30_V71K_F78V_V89I	VK1-39親本	1.886	低
1837	VH4-30_V71K_F78V_V89I	VK1-39_GL CDR2	3.024	低
1836	VH4-30_V71K_N76S_F78V	VK1-9親本	2.968	低
1835	VH4-30_V71K_N76S_F78V	VK1-9_GL CDR2	2.988	低
1834	VH4-30_V71K_N76S_F78V	VK3-11親本	2.931	低
1833	VH4-30_V71K_N76S_F78V	VK3-11_GL CDR2	2.263	低
1832	VH4-30_V71K_N76S_F78V	VK1-39親本	2.113	低
1831	VH4-30_V71K_N76S_F78V	VK1-39_GL CDR2	1.888	低
1830	VH4-30_V71K_T73N_F78V	VK1-9親本	2.851	低
1829	VH4-30_V71K_T73N_F78V	VK1-9_GL CDR2	2.53	低
1828	VH4-30_V71K_T73N_F78V	VK3-11親本	2.769	低
1827	VH4-30_V71K_T73N_F78V	VK3-11_GL CDR2	2.403	低
1826	VH4-30_V71K_T73N_F78V	VK1-39親本	3.853	低
1825	VH4-30_V71K_T73N_F78V	VK1-39_GL CDR2	4.494	低
1824	VH4-30_V71K_F78V	VK1-9親本	1.612	低
1823	VH4-30_V71K_F78V	VK1-9_GL CDR2	2.149	低
1822	VH4-30_V71K_F78V	VK3-11親本	1.942	低
1821	VH4-30_V71K_F78V	VK3-11_GL CDR2	1.64	低
1820	VH4-30_V71K_F78V	VK1-39親本	2.458	低
1819	VH4-30_V71K_F78V	VK1-39_GL CDR2	3.228	低
1818	VH4-30_F78V	VK1-9親本	350.7	低
1817	VH4-30_F78V	VK1-9_GL CDR2	771	低
1816	VH4-30_F78V	VK3-11親本	617.8	低
1815	VH4-30_F78V	VK3-11_GL CDR2	215.1	低
1814	VH4-30_F78V	VK1-39親本	無結合	低
1813	VH4-30_F78V	VK1-39_GL CDR2	35.59	低
1812	VH4-30_V71K	VK1-9親本	8.323	高
1811	VH4-30_V71K	VK1-9_GL CDR2	9.518	低
1810	VH4-30_V71K	VK3-11親本	17.83	低
1809	VH4-30_V71K	VK3-11_GL CDR2	7.181	低
1808	VH4-30_V71K	VK1-39親本	24.48	高
1807	VH4-30_V71K	VK1-39_GL CDR2	181.1	高
1806	VH3-7_A24V_R71K	VK1-9親本	12.07	低
1805	VH3-7_A24V_R71K	VK1-9_GL CDR2	1.173	低
1804	VH3-7_A24V_R71K	VK3-11親本	55.61	低
1803	VH3-7_A24V_R71K	VK3-11_GL CDR2	12.59	低
1802	VH3-7_A24V_R71K	VK1-39親本	19.81	低
1801	VH3-7_A24V_R71K	VK1-39_GL CDR2	33.97	低
1800	VH3-7_A24V_L78V	VK1-9親本	1.151	低
1799	VH3-7_A24V_L78V	VK1-9_GL CDR2	2.001	低
1798	VH3-7_A24V_L78V	VK3-11親本	0.5211	低
1797	VH3-7_A24V_L78V	VK3-11_GL CDR2	0.6889	低
1796	VH3-7_A24V_L78V	VK1-39親本	4.543	低
1795	VH3-7_A24V_L78V	VK1-39_GL CDR2	3.963	低
1794	VH3-7_R71K_L78V	VK1-9親本	11.41	低
1793	VH3-7_R71K_L78V	VK1-9_GL CDR2	13.47	低
1792	VH3-7_R71K_L78V	VK3-11親本	14.71	低
1791	VH3-7_R71K_L78V	VK3-11_GL CDR2	19.12	低
1790	VH3-7_R71K_L78V	VK1-39親本	14.64	低
1789	VH3-7_R71K_L78V	VK1-39_GL CDR2	24.37	低
1788	VH3-7_L78V	VK1-9親本	36.45	低
1787	VH3-7_L78V	VK1-9_GL CDR2	32.53	低
1786	VH3-7_L78V	VK3-11親本	87.75	低
1785	VH3-7_L78V	VK3-11_GL CDR2	80.24	低
1784	VH3-7_L78V	VK1-39親本	76.35	低
1783	VH3-7_L78V	VK1-39_GL CDR2	96.87	低
1782	VH1-46_A24V_Q61S_M69I_R71K	VK1-9親本	1.55	低
1781	VH1-46_A24V_Q61S_M69I_R71K	VK1-9_GL CDR2	1.618	低
1780	VH1-46_A24V_Q61S_M69I_R71K	VK3-11親本	1.713	低
1779	VH1-46_A24V_Q61S_M69I_R71K	VK3-11_GL CDR2	1.428	低
1778	VH1-46_A24V_Q61S_M69I_R71K	VK1-39親本	1.292	低
1777	VH1-46_A24V_Q61S_M69I_R71K	VK1-39_GL CDR2	1.588	低
1776	VH1-46_A24V_Q61S_M69I_R71K	VK4-1親本	1.476	低
1775	VH1-46_A24V_Q61S_M69I_R71K	VK4-1_GL CDR2	2.27	低
1774	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T73N_T75K	VK1-9親本	1.559	高
1773	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T73N_T75K	VK1-9_GL CDR2	1.13	高
1772	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T73N_T75K	VK3-11親本	1.398	高
1771	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T73N_T75K	VK3-11_GL CDR2	1.456	高
1770	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T73N_T75K	VK1-39親本	1.535	高
1769	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T73N_T75K	VK1-39_GL CDR2	0.9681	高
1768	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T73N_T75K	VK4-1親本	1.573	低
1767	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T73N_T75K	VK4-1_GL CDR2	1.233	低
1766	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T75K	VK1-9親本	1.193	高
1765	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T75K	VK1-9_GL CDR2	1.205	低
1764	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T75K	VK3-11親本	1.002	低
1763	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T75K	VK3-11_GL CDR2	1.317	高
1762	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T75K	VK1-39親本	1.683	高
1761	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T75K	VK1-39_GL CDR2	1.372	高
1760	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T75K	VK4-1親本	1.586	低
1759	VH1-46_A24V_M69I_R71K_T75K	VK4-1_GL CDR2	2.725	低
1758	VH1-46_A24V_M69I_R71K	VK1-9親本	1.584	高
1757	VH1-46_A24V_M69I_R71K	VK1-9_GL CDR2	1.307	低
1756	VH1-46_A24V_M69I_R71K	VK3-11親本	1.037	高
1755	VH1-46_A24V_M69I_R71K	VK3-11_GL CDR2	2.026	低
1754	VH1-46_A24V_M69I_R71K	VK1-39親本	1.389	低
1753	VH1-46_A24V_M69I_R71K	VK1-39_GL CDR2	0.9743	低
1752	VH1-46_A24V_M69I_R71K	VK4-1親本	1.41	低
1751	VH1-46_A24V_M69I_R71K	VK4-1_GL CDR2	1.649	低
1750	VH1-46_M69I_R71K	VK1-9親本	2.283	高
1749	VH1-46_M69I_R71K	VK1-9_GL CDR2	1.54	低
1748	VH1-46_M69I_R71K	VK3-11親本	2.271	低
1747	VH1-46_M69I_R71K	VK3-11_GL CDR2	1.263	低
1746	VH1-46_M69I_R71K	VK1-39親本	1.96	低
1745	VH1-46_M69I_R71K	VK1-39_GL CDR2	1.759	低
1744	VH1-46_M69I_R71K	VK4-1親本	2.291	低
1743	VH1-46_M69I_R71K	VK4-1_GL CDR2	3.014	低
1742	VH1-46_A24V	VK1-9親本	1.883	低
1741	VH1-46_A24V	VK1-9_GL CDR2	1.592	低
1740	VH1-46_A24V	VK3-11親本	1.108	高
1739	VH1-46_A24V	VK3-11_GL CDR2	1.818	低
1738	VH1-46_A24V	VK1-39親本	0.8624	低
1737	VH1-46_A24V	VK1-39_GL CDR2	1.634	低
1736	VH1-46_A24V	VK4-1親本	0.7444	低
1735	VH1-46_A24V	VK4-1_GL CDR2	1.731	低

表 8：攜帶回復突變之人源化殖株之結合及AC-SINS資料。

實例 11 人源化變異體在人類及 cyno PBMC 分析法中呈現一系列效力。首先在人類TNFR2 Jurkat報導細胞分析法中測試所選人源化殖株。表9中之結果展示殖株1765呈現與親本殖株854類似的EC50。殖株1847及殖株1753均損失效力，但有趣的是，儘管殖株1747在人類TNFR2 CHO結合分析法中為最強結合物，但在Jurkat報導細胞分析法中卻不為促效劑。

根據此結果，在人類及cyno PBMC分析法中測試殖株1847、殖株1765及殖株1753。

簡言之，將來自各種供體之250000個人類PBMC塗佈於96孔盤之各孔中之Optimizer CST培養基中。各孔在37℃下用50 ml之5 ng/ml IL-2及50 ml之4×抗-TNFR2抗體或四功能Fab處理72小時。隨後，將細胞準備進行流動式細胞量測術分析。在PBS中洗滌2次之後，首先使細胞在4℃下再懸浮於100 ml活近IR染色緩衝液中30分鐘。在流動緩衝液中再洗滌2次之後，將細胞與以1/40稀釋之CD3 BV421、ICAM APC CD4 PE及TIGIT BUV395一起在4℃下培育1小時，隨後在室溫下用1% PFA固定15分鐘。在流動緩衝液中再洗滌2次之後，最終藉由流動式細胞量測術分析細胞。使用光散射排除二重峰，且低近IR染色作為活力之指示。針對CD3+/CD4+/TIGIT+群體來圈選單一活細胞且量測ICAM-1之ICAM-1平均螢光強度(MFI)。使用Graph Pad Prism中之4-參數曲線擬合來計算TNFR2促效劑針對ICAM-1誘導之EC50。選擇ICAM-1，因為已知其由NF-KB (急性T細胞活化之標記物)調節且在Treg介導之抑制中具有已知作用。使用TIGIT鑑別富含TNFR2表現及Treg之成熟T細胞群體而無需進行針對細胞內標記物FoxP3之染色。使用類似策略來測定cyno PBMC中之T細胞活化，但由於人類與cyno之間活化標記物表現及抗體交叉反應性之差異，將T細胞活化量測為CD25+/Ki67+之雙陽性CD4+細胞的百分比。

表9中之結果證實在人類PBMC分析法中，人源化殖株1765呈現與親本殖株854類似之效力，其中EC50分別為1.308及1.402 nM。兩種殖株對cyno細胞之效力降低10倍，其中EC50分別為13.63及15.02 nM。殖株1753展現較低效力，尤其對cyno PBMC細胞(56 nM)，且殖株1847對兩種細胞類型未呈現任何效力。選擇殖株1765 (重鏈序列SEQ 22及輕鏈序列SEC 21)用於進一步研究。

殖株名稱	Jurkat EC50， μg/ml	EC50 (HuPBMC)，nM	EC50 (CyPBMC)，nM
GBT-TNFR2-0854	1.74	1.402	15.02
GBT-TNFR2-1847	5.97	未促效	未促效
GBT-TNFR2-1765	1.01	1.308	13.63
GBT-TNFR2-1753	13.5	4.845	56
GBT-TNFR2-1747	未促效	未測試	未測試

表 9：在Jurkat報導細胞分析法中及在人類及cyno PBMC分析法中測試人源化殖株之效力。

實例 12 聚集之抗 -TNFR2 抗體在 Jurkat NF-KB-GFP 報導細胞分析法中呈現增加之效力為了評估聚集體對TNFR2促效作用之影響，吾人將經1-步驟方法(僅ProA純化，含有平均15至20%聚集體)純化之抗-TNFR2抗體與經2-步驟方法(ProA接著進行SEC純化，無聚集體)純化之相同抗體在Jurkat NFKB-GFP報導細胞分析法中進行比較。

簡言之，以100000個細胞/孔塗佈96孔盤中之補充有10% FBS、1×丙酮酸鈉、1×Glutamax及Pen/Strep之RPMI1640培養基中。接著將細胞與抗-TNFR2抗體之連續稀釋液一起在37℃下培育隔夜。第二天，將細胞如下準備進行流動式細胞量測術分析：在離心以移除上清液之後，用0.25%胰蛋白酶處理細胞以分解凝塊。最後，將細胞再次離心，再懸浮於75 ml含有DAPI試劑之1/1000稀釋液的流動緩衝液中且在流動式細胞儀上分析GFP表現。

殖株	EC50 Jurkat分析法，ng/ml 有聚集體	EC50 Jurkat分析法，ng/ml 無聚集體	效力損失
MR2-1	119.6	5748	50倍
殖株162	347.3	7021	20倍

表 10：有或無聚集體之殖株之Jurkat報導細胞分析法效力。將選擇作為代表性結果之殖株162與市售TNFR2促效劑MR2-1 (Hycult Biotech，參考號HM2007)進行比較。當在ProA管柱上純化時，殖株162呈現與MR2-1類似之效力(EC50分別為347.3及119.6 ng/ml)。引起關注的是，吾人發現殖株162及MR2-1均含有大量聚集體，如在以下圖1中之分析型SEC概況中所見。

當殖株162及MR2-1不含聚集體時，在SEC上純化之後，其在Jurkat細胞分析法中促效TNFR2之能力顯著受損，其中殖株162展示20倍效力損失(EC50=7.02 mg/ml)且MR2-1展示50倍損失(EC50=5.75 mg/ml)，表明聚集體可人工增加抗-TNFR2抗體效力。

此結果促使吾人研究提高價數是否可引起效力增加。

實例 13 再格式化成四功能 Fab為了測試吾人之假設，吾人尋求藉由將額外互補位添加至殖株1765之現有IgG骨架上，將其再格式化成四功能Fab 2053來增加殖株1765之價數(參見圖2)。如示意圖中所描述，四功能Fab包含雙Fab重鏈，其中外部Fab域由可變域及恆定CH1域構成，藉由短G4S連接子連接至內部Fab，該內部Fab由相同可變域以及隨後的相同恆定CH1及典型人類IgG1之CH2及CH3構成。此更長重鏈能夠與4條輕鏈而非2條結合，產生包含4個互補位之分子，且理論上能夠結合4個TNFR2分子。分別參見四功能Fab 2053重鏈及輕鏈之SEQ 30及SEQ 9。

再格式化成四功能Fab所依據之基本原理係藉由膜結合TNFa來模仿TNFR2寡聚合。實際上，膜結合TNFa形成三聚體，該等三聚體能夠藉由同時結合多個TNFR2分子而在Treg之表面上強烈促效TNFR2。

使用BIAcore藉由表面電漿子共振(SPR)證實增加之親合力。簡言之，以10毫升/分鐘之流速在鏈黴抗生物素蛋白晶片之表面上捕捉生物素化人類或cyno-TNFR2持續60秒。接著，針對50秒之結合階段，以80毫升/分鐘將抗體或四功能Fab以10至1.25 nM (對於抗體)及5至0.625 nM (對於四功能Fab)之範圍內的濃度注射至所捕捉之TNFR2上。隨後藉由以80毫升/分鐘注射操作緩衝液(HBS-EP+)持續600秒來起始解離階段。使用Biacore評測軟體分析資料。

分析物	配位體	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (nM)
IgG2 - 854	HuTNFR2	1.13E+07	1.25E-03	0.11
IgG2 - 1765	HuTNFR2	4.20E+06	1.36E-03	0.32 ± 0.1
IgG1 TF-2053	HuTNFR2	8.10E+06	4.73E-04	0.06 ± 0.00
IgG2 - 854	CyTNFR2	1.12E+07	9.96E-03	0.89
IgG2 - 1765	CyTNFR2	4.09E+06	9.77E-03	2.39 ± 0.03
IgG1 TF-2053	CyTNFR2	1.15E+07	7.06E-03	0.61

表 11：SRP資料-使用BIACore計算之親本殖株854、其人源化對應物殖株1765及相應四功能Fab 2053對人類及cyno TNFR2之結合速率(ka)、解離速率(kd)及親和力(KD)。

表11中之資料展示親本854殖株及人源化1765殖株均對人類TNFR2具有類似表觀親和力，其中KD分別為0.11及0.32 nM。四功能Fab呈現更強表觀親和力，其中KD為0.06 nM，與其IgG對應物854或1765相比改良5倍。

可觀測到針對cyno TNFR2之親和力的類似改良(儘管不大)。四功能Fab對cyno TNFR2之親和力比對人類TNFR2之親和力小10倍(KD分別為0.61及0.06 nM)。

實例 14 在 Jurkat NF-KB- 報導細胞分析法中抗 -TNFR2 抗體及 四功能 Fab 促效 TNFR2首先在先前所使用之表現TNFR2之Jurkat細胞報導分析法中測試四功能Fab誘導NF-KB-GFP表現的能力。類似地，以100000個細胞/孔塗佈於96孔盤中之補充有10% FBS、1×丙酮酸鈉、1×Glutamax及Pen/Strep之RPMI1640培養基中，且與抗-TNFR2抗體或四功能Fab之連續稀釋液一起在37℃下培育隔夜。第二天，如先前所描述將細胞準備進行流動式細胞量測術分析且在流動式細胞儀上分析GFP表現。

表12中所概述之結果展示親本殖株854及其人源化變異體1765分別具有0.526 mg/ml及1.009 mg/ml之類似EC50。另一方面，與854及1765相比，四功能Fab 2053之EC50展示超過10倍之改良，其中EC50為0.037 mg/ml。此結果表明增加之價數促進更強效力。

殖株	EC50 Jurkat，μg/ml
854	0.526
1765	1.009
2053	0.037

表12：親本854、其人源化對應物1765及相應四功能Fab 2053在TNFR2 Jurkat報導細胞分析法中之效力

實例 15 抗 -TNFR2 抗體及 四功能 Fab 誘導 CD3+CD4+TIGIT+ 人類 PBMC 中之 ICAM-1 上調及 cyno PBMC 中 CD4+ 細胞上之 Ki67/CD25 共表現如下文所描述，接著測試四功能Fab在表現TNFR2之初代T細胞群體(CD3+CD4+TIGIT+)中上調ICAM-1的能力。選擇ICAM-1，因為其由NF-KB (已知為急性T細胞活化之標記物)調節且在Treg介導之抑制中具有已知作用。使用TIGIT鑑別富含TNFR2表現及Treg之成熟T細胞群體而無需進行針對細胞內標記物FoxP3之染色。

簡言之，將來自各種供體之250000個人類PBMC塗佈於96孔盤之各孔中的Optimizer CST培養基中。各孔在37℃下用50 ml之5 ng/ml IL-2及50 ml之4×抗-TNFR2抗體或四功能Fab處理72小時。隨後，將細胞準備進行流動式細胞量測術分析。在PBS中洗滌2次之後，首先使細胞在4℃下再懸浮於100 ml活近IR染色緩衝液中30分鐘。在流動緩衝液中再洗滌2次之後，將細胞與以1/40稀釋之CD3 BV421、ICAM APC CD4 PE及TIGIT BUV395一起在4℃下培育1小時，隨後在室溫下用1% PFA固定15分鐘(所有試劑概述於表13中)。在流動緩衝液中再洗滌2次之後，最終藉由流動式細胞量測術分析細胞。使用光散射排除二重峰，且低近IR染色作為活力之指示。針對CD3+/CD4+/TIGIT+群體來圈選單一活細胞且量測ICAM-1之ICAM-1 MFI。使用Graph Pad Prism中之4-參數曲線擬合來計算TNFR2促效劑針對ICAM-1誘導之EC50。使用類似策略來測定cyno PBMC中之T細胞活化，但由於人類與cyno之間活化標記物表現及抗體交叉反應性之差異，將T細胞活化量測為CD25+/Ki67+之雙陽性CD4+細胞的百分比。

人類流動式細胞量測術抗體	供應商	目錄號	殖株
CD3 BV421	BD Pharmingen	562426	UCHT1
ICAM APC	BD Pharmingen	559771	HA58 (RUO)
CD4 PE	BD Pharmingen	555347	RPA-T4
TIGIT BUV395	BD OptiBuild	747845	741182

Cyno 流動式細胞量測術抗體	供應商	目錄號	殖株
CD3 BUV395	BD Pharmingen	564088	SP-34
CD25 APC	eBioscience	17-0257-42	CD25-4E3
CD4 FITC	BD Pharmingen	550628	L200
Ki-67 PE-eFluor710	Invitrogen	46-5698-82	SOLA15

表 13：用於人類及cyno PBMC分析法之試劑

如表14中所見且與NF-KB-GFP Jurkat分析法結果類似，人類CD3+CD4+TIGIT+細胞表面上之針對人類ICAM-1上調之EC50在親本854抗體與人源化1765抗體之間類似(分別為1.402及1.308 mg/ml)。針對ICAM-1上調之EC50在藉由四功能Fab 2053處理後改良10倍，證實即使當TNFR2細胞表面受體數量較低(在Jurkat中11 000個，在人類Treg中＜500個)時，價數增加仍將改良效力。

殖株	EC50 HuPBMC，μg/ml	EC50 CyPBMC，μg/ml
854	1.402	27.22
1765	1.308	13.63
2053	0.116	5.950

表 14：親本854、其人源化對應物1765及相應四功能Fab 2053在人類及cyno PBMC分析法中之效力

實例 16 四功能 Fab 2053 在經培養之人類及 cyno Treg 中引發 TNFR2 促效作用誘導之 IKBa 降解以下分析用作由TNFR2促效作用引起之NF-KB活化之替代物。其亦允許使用同一終點在人類與cyno Treg之間直接比較抗-TNFR2抗體藥理學。

簡言之，自各種供體之PBMC分選且經由多輪抗-CD3/28刺激而在IL-2及雷帕黴素(rapamycin)存在下擴增的人類或cyno天然Treg在37℃下，在分別含有10 ng/ml重組人類或cyno IL2之培養基中刺激隔夜。次日，將細胞接種於96深孔盤中(＞50 000個細胞/孔)且用各種濃度之四功能Fab 2053、PMA/離子黴素(ionomycin)(40 ng/ml PMA；2 mM離子黴素，IKBa之陽性對照)或培養基(未刺激對照)在37℃下處理20分鐘。在培育之後，將細胞洗滌、固定、滲透且在4℃下用抗-IKBa-PE抗體染色30分鐘。最終，在流動式細胞儀上分析細胞且藉由MFI來評估IKBa之降解水平。

人類供體號	人類 EC50	Cyno 供體號	Cyno EC50
人類 D28	20 pM	Cyno 16-873	53.8 pM
人類 D32	37.3 pM	Cyno3	2.248 nM
人類 D23	47.79 pM	Cyno 16-477	117.7 pM
人類 D24	5.75 pM	Cyno 18-7469	400 pM
人類 D28	17.9 pM	Cyno 18-7473	155 pM

表 15：四功能Fab 2053在人類及cyno IKBa降解分析法中之效力。

如上表15中所詳述，IKBa在人類擴增之Treg中之平均EC50為26 +/- 17 pM (n=5)，而在cyno擴增之Treg中的平均EC50為145 +/- 154 pM (n=5)。儘管自Treg之個別人類及cyno供體擴增的Treg的結果之間存在顯著變化，但此等資料展示Treg中NF-KB路徑之活化一致且cyno中之效力與人類相比損失超過5倍。

實例 17 抗 -TNFR2 四功能 Fab 在無 IL-2 存在下誘導人類及 cyno 脾細胞中之 OX-40 上調因為cyno中之藥理學研究揭露了由TNF超家族成員OX-40之上調所指示之在活體內投與之後的組織Treg之活化，所以設定離體分析法以使用TeraFab 2053產生組織駐留Treg活化之EC50值。在此分析法中，將來自各種供體之冷凍人類或cyno脾細胞解凍且在37℃下用各種濃度之四功能Fab 2053處理22小時。隨後，將樣品固定、滲透且用以下抗體染色：CD4-BV786、FoxP3-AF647、OX40-BV421、CD3-BV605、Tigit-A488、CD25-PE-Cy5及CD45-PE-Cy7，隨後藉由流動式細胞量測術分析。組織駐留Treg鑑別為單一/活/CD45+/CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+且OX-40之MFI用於使用4-參數曲線擬合在GraphPad Prism中生成EC50曲線。針對人類或cyno冷凍脾細胞之各供體所產生之個別EC50值呈現於此表中。表16概述所獲得之結果。

人類供體號	人類 EC50	Cyno 供體號	Cyno EC50
ZenBio #072518	47 pM	TA1	642 pM
BioIVT #BRH1515663	18 pM	17-5215	1752 pM
		TA2	692 pM
		#31	799 pM
		#34	905 pM

表 16：四功能Fab 2053在不存在IL-2之情況下誘導人類及cyno脾細胞中之OX-40上調方面之效力。

人類脾Treg上針對OX-40上調之平均EC50為33 +/- 21 pM (n=2)，與經擴增之人類血液Treg中針對IKBa降解之EC50類似，而cyno脾Treg中針對OX-40上調之平均EC50為958 +/- 455 pM (n=5)。

實例 18 食蟹獼猴中之 四功能 Fab 2053 之活體內藥理學在開始給藥之前，使年齡大於2.5歲之來自毛里求斯的雄性及雌性食蟹獼猴最少適應30天。含有一隻雄性(M)及一隻雌性(F)動物之劑量組在第1天、第4天、第8天、第11天及第15天藉由靜脈內(IV)注射投與媒劑對照物或20 mg/kg、60 mg/kg或180 mg/kg之四功能Fab 2053。在第11天投與四功能Fab 2053之後，歷經96小時在不同時間點收集血液用於毒理動力學分析。在第16天，將所有動物處死，且收集各脾臟之一部分用於Treg表型分析。藉由常規方法製備單一細胞脾細胞懸浮液且隨後用一組經螢光標記之單株抗體對白血球進行染色，該等單株抗體識別用於鑑別及表徵Treg之表面及細胞內標記。藉由流動式細胞量測術分析經染色之細胞的以下表型： ● 表現OX40之Treg： CD45+CD3+CD4+FoxP3+OX40+ ● 表現TIGIT之Treg： CD45+CD3+CD4+FoxP3+TIGIT+ ● 增殖Treg： CD45+CD3+CD4+FoxP3+Ki-67+

使用流動式細胞量測分析軟體測定表現OX40或TIGIT之Treg的百分比及平均螢光強度(MFI)以及增殖Treg之百分比。與性別匹配之媒劑對照物相比，經四功能Fab 2053處理之動物中Treg參數之倍數增加展示於下表17中。使用配位體結合分析法測定血清中之總四功能Fab 2053濃度，且評估各個動物之第11至15天曲線下面積(AUC)濃度，如下表17中所展示。

活體內量測	性別	與媒劑對照物相比之倍數增加
群體	參數	20 mg/kg	60 mg/kg	180 mg/kg
表現OX40之Treg	FoxP3+Treg之百分比	M	1.66	1.83	1.68
F	1.93	3.00	3.14
OX40 MFI	M	1.43	1.32	1.08
F	2.23	2.46	1.90
表現TIGIT之Treg	FoxP3+Treg之百分比	M	1.64	1.27	1.76
F	1.67	1.63	1.75
TIGIT MFI	M	1.26	1.45	1.36
F	2.09	2.44	1.88
增殖Treg	FoxP3+Treg之百分比	M	2.25	1.53	2.27
F	1.94	1.86	2.07
血清暴露 ( 第 11-15 天 )	性別	AUC _0-96 _小時 ( μ g×h/mL)
20 mg/kg	60 mg/kg	180 mg/kg
總四功能Fab 2053	M	5260	14100	64000
F	11800	52500	175000

表 17：注射各種劑量之四功能Fab 2053之食蟹獼猴中進行之活體內量測的概述

與經媒劑處理之對照相比，以20至180毫克/公斤/劑量之劑量向雄性及雌性食蟹獼猴IV投與四功能Fab 2053持續16天使脾Treg上之OX-40及TIGIT表現分別增加高達3.14倍及2.44倍，且經受增殖之脾Treg的比例增加多達2.27倍。在雄性動物及雌性動物中在所有劑量水平下觀測到Treg活化之此等標記的增加，且一般並不遵循劑量-反應關係，其最可能反映最大藥理學活性。

在雄性食蟹獼猴中，全身暴露量隨劑量增加而增加，其中自20至60 mg/kg以大致與劑量成比例之方式增加且自60至180 mg/kg以大於與劑量成比例之方式增加。在雌性食蟹獼猴中，自20至180 mg/kg，全身暴露量通常以大於與劑量成比例之方式隨劑量增加而增加。

實例 19 四功能 Fab 2053 展示可接受之可展性為證實四功能Fab 2053係作為生物治療劑進一步研發之適合候選物，完成一系列生物分析檢定(參見表18)。

可展性評估分類	GBT-TNFR2-2053 ( 四功能 fab)
非特異性清除/PK	AC-SINS	可接受
DNA ELISA評分	可接受
胰島素ELISA評分	可接受
HuFcRn管柱rET	可接受
物理化學特性	熱穩定性	可接受
低pH保持	在pH 3.4 (甘胺酸)下可接受
黏度	高但可用緩衝液調配物進行管控
高濃度穩定性在4℃及25℃下6週	4℃下之可接受穩定性在25℃下%HMMS增加＜5%
強制降解研究在40℃下4週	可接受

表 18：對四功能Fab 2053進行生物物理學分析以評估其可展性之概述

概述於上表中之結果證實四功能Fab 2053呈現可接受之非特異性特性。另外，分子在高濃度下，在4℃下測試6週及在40℃下測試4週時為穩定的。最終，四功能Fab 2053在高濃度下展現一些黏度，但此不合需要之特徵可用緩衝液調配物管控。總之，此等結果表明四功能Fab 2053適於製造為生物治療劑。

實例 16 四功能 Fab 2053 之最佳化將以下表19中所展示之胺基酸作為目標進行最佳化，以移除序列傾向性(DE脫醯胺部位、W氧化部位、所預測之T細胞抗原決定基)及降低疏水性。

突變 (Kabat 編號 )	目的
重鏈- W52K、V54Q	疏水性區塊及氧化部位
重鏈- W52R、V54E
重鏈- W52F、G53Q、V54E
重鏈- W52L、V54H
重鏈- W52H、V54S
重鏈- W97S、D98T	氧化部位及脫醯胺部位
重鏈- W97H	氧化部位
重鏈- W97R
重鏈- W97Q
輕鏈- S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	所預測之T細胞抗原決定基
輕鏈- S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P
輕鏈- Q89L、Y91K
輕鏈- Q89L

表 19：引入四功能Fab 2053中以移除一系列序列傾向性及降低疏水性之胺基酸突變

最佳化構築體以IgG及四功能Fab形式製得，且單獨或以組合形式測試上文所描述之各種突變與人類TNFR2 CHO之結合，如表20中所概述：

四功能 Fab	IgG	重鏈	輕鏈	IgG CHO 結合	四功能 Fab CHO 結合
2083	1917	W52K、V54Q	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2112	1926	W52K、V54Q	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2141	1935	W52K、V54Q	Q89L、Y91K	無	無
2170	1944	W52K、V54Q	Q89L	無	無
2054	1908	W52K、V54Q	親本	無	無
2092	1973	W52K、V54Q、W97S、D98T	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2121	1993	W52K、V54Q、W97S、D98T	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2150	2013	W52K、V54Q、W97S、D98T	Q89L、Y91K	無	無
2179	2033	W52K、V54Q、W97S、D98T	Q89L	無	無
2063	1953	W52K、V54Q、W97S、D98T	親本	無	無
2093	1974	W52K、V54Q、W97H	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2122	1994	W52K、V54Q、W97H	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2151	2014	W52K、V54Q、W97H	Q89L、Y91K	無	無
2180	2034	W52K、V54Q、W97H	Q89L	無	無
2064	1954	W52K、V54Q、W97H	親本	無	無
2094	1975	W52K、V54Q、W97R	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2123	1995	W52K、V54Q、W97R	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2152	2015	W52K、V54Q、W97R	Q89L、Y91K	無	無
2181	2035	W52K、V54Q、W97R	Q89L	無	無
2065	1955	W52K、V54Q、W97R	親本	無	無
2095	1976	W52K、V54Q、W97Q	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2124	1996	W52K、V54Q、W97Q	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2153	2016	W52K、V54Q、W97Q	Q89L、Y91K	無	無
2182	2036	W52K、V54Q、W97Q	Q89L	無	無
2066	1956	W52K、V54Q、W97Q	親本	無	無
2084	1918	W52R、V54E	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2113	1927	W52R、V54E	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2142	1936	W52R、V54E	Q89L、Y91K	無	無
2171	1945	W52R、V54E	Q89L	無	無
2055	1909	W52R、V54E	親本	無	無
2096	1977	W52R、V54E、W97S、D98T	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2125	1997	W52R、V54E、W97S、D98T	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2154	2017	W52R、V54E、W97S、D98T	Q89L、Y91K	無	無
2183	2037	W52R、V54E、W97S、D98T	Q89L	無	無
2067	1957	W52R、V54E、W97S、D98T	親本	無	無
2097	1978	W52R、V54E、W97H	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2126	1998	W52R、V54E、W97H	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2155	2018	W52R、V54E、W97H	Q89L、Y91K	無	無
2184	2038	W52R、V54E、W97H	Q89L	無	無
2068	1958	W52R、V54E、W97H	親本	無	無
2098	1979	W52R、V54E、W97R	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2127	1999	W52R、V54E、W97R	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2156	2019	W52R、V54E、W97R	Q89L、Y91K	無	無
2185	2039	W52R、V54E、W97R	Q89L	無	無
2069	1959	W52R、V54E、W97R	親本	無	無
2099	1980	W52R、V54E、W97Q	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2128	2000	W52R、V54E、W97Q	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2157	2020	W52R、V54E、W97Q	Q89L、Y91K	無	無
2186	2040	W52R、V54E、W97Q	Q89L	無	無
2070	1960	W52R、V54E、W97Q	親本	無	無
2085	1919	W52F、G53Q、V54E	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2114	1928	W52F、G53Q、V54E	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2143	1937	W52F、G53Q、V54E	Q89L、Y91K	無	無
2172	1946	W52F、G53Q、V54E	Q89L	無	無
2056	1910	W52F、G53Q、V54E	親本	無	無
2100	1981	W52F、G53Q、V54E、W97S、D98T	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2129	2001	W52F、G53Q、V54E、W97S、D98T	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2158	2021	W52F、G53Q、V54E、W97S、D98T	Q89L、Y91K	無	無
2187	2041	W52F、G53Q、V54E、W97S、D98T	Q89L	無	無
2071	1961	W52F、G53Q、V54E、W97S、D98T	親本	無	無
2101	1982	W52F、G53Q、V54E、W97H	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2130	2002	W52F、G53Q、V54E、W97H	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2159	2022	W52F、G53Q、V54E、W97H	Q89L、Y91K	無	無
2188	2042	W52F、G53Q、V54E、W97H	Q89L	無	無
2072	1962	W52F、G53Q、V54E、W97H	親本	無	無
2102	1983	W52F、G53Q、V54E、W97R	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2131	2003	W52F、G53Q、V54E、W97R	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2160	2023	W52F、G53Q、V54E、W97R	Q89L、Y91K	無	無
2189	2043	W52F、G53Q、V54E、W97R	Q89L	無	無
2073	1963	W52F、G53Q、V54E、W97R	親本	無	無
2103	1984	W52F、G53Q、V54E、W97Q	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2132	2004	W52F、G53Q、V54E、W97Q	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2161	2024	W52F、G53Q、V54E、W97Q	Q89L、Y91K	無	無
2190	2044	W52F、G53Q、V54E、W97Q	Q89L	無	無
2074	1964	W52F、G53Q、V54E、W97Q	親本	無	無
2086	1920	W52L、V54H	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2115	1929	W52L、V54H	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2144	1938	W52L、V54H	Q89L、Y91K	無	無
2173	1947	W52L、V54H	Q89L	無	無
2057	1911	W52L、V54H	親本	無	無
2104	1985	W52L、V54H、W97S、D98T	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2133	2005	W52L、V54H、W97S、D98T	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2162	2025	W52L、V54H、W97S、D98T	Q89L、Y91K	無	無
2191	2045	W52L、V54H、W97S、D98T	Q89L	無	無
2075	1965	W52L、V54H、W97S、D98T	親本	無	無
2105	1986	W52L、V54H、W97H	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2134	2006	W52L、V54H、W97H	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2163	2026	W52L、V54H、W97H	Q89L、Y91K	無	無
2192	2046	W52L、V54H、W97H	Q89L	無	無
2076	1966	W52L、V54H、W97H	親本	無	無
2106	1987	W52L、V54H、W97R	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2135	2007	W52L、V54H、W97R	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2164	2027	W52L、V54H、W97R	Q89L、Y91K	無	無
2193	2047	W52L、V54H、W97R	Q89L	無	無
2077	1967	W52L、V54H、W97R	親本	無	無
2107	1988	W52L、V54H、W97Q	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2136	2008	W52L、V54H、W97Q	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2165	2028	W52L、V54H、W97Q	Q89L、Y91K	無	無
2194	2048	W52L、V54H、W97Q	Q89L	無	無
2078	1968	W52L、V54H、W97Q	親本	無	無
2087	1921	W52H、V54S	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2116	1930	W52H、V54S	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2145	1939	W52H、V54S	Q89L、Y91K	無	無
2174	1948	W52H、V54S	Q89L	無	無
2058	1912	W52H、V54S	親本	無	無
2108	1989	W52H、V54S、W97S、D98T	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2137	2009	W52H、V54S、W97S、D98T	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2166	2029	W52H、V54S、W97S、D98T	Q89L、Y91K	無	無
2195	2049	W52H、V54S、W97S、D98T	Q89L	無	無
2079	1969	W52H、V54S、W97S、D98T	親本	無	無
2109	1990	W52H、V54S、W97H	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2138	2010	W52H、V54S、W97H	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2167	2030	W52H、V54S、W97H	Q89L、Y91K	無	無
2196	2050	W52H、V54S、W97H	Q89L	無	無
2080	1970	W52H、V54S、W97H	親本	無	無
2110	1991	W52H、V54S、W97R	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2139	2011	W52H、V54S、W97R	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2168	2031	W52H、V54S、W97R	Q89L、Y91K	無	無
2197	2051	W52H、V54S、W97R	Q89L	無	無
2081	1971	W52H、V54S、W97R	親本	無	無
2111	1992	W52H、V54S、W97Q	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2140	2012	W52H、V54S、W97Q	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2169	2032	W52H、V54S、W97Q	Q89L、Y91K	無	無
2198	2052	W52H、V54S、W97Q	Q89L	無	無
2082	1972	W52H、V54S、W97Q	親本	無	無
2088	1922	W97S、D98T	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2117	1931	W97S、D98T	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2146	1940	W97S、D98T	Q89L、Y91K	無	無
2175	1949	W97S、D98T	Q89L	無	無
2059	1913	W97S、D98T	親本	無	無
2089	1923	W97H	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2118	1932	W97H	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2147	1941	W97H	Q89L、Y91K	無	無
2176	1950	W97H	Q89L	無	無
2060	1914	W97H	親本	無	無
2090	1924	W97R	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2119	1933	W97R	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2148	1942	W97R	Q89L、Y91K	無	無
2177	1951	W97R	Q89L	無	無
2061	1915	W97R	親本	無	無
2091	1925	W97Q	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2120	1934	W97Q	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2149	1943	W97Q	Q89L、Y91K	無	無
2178	1952	W97Q	Q89L	無	無
2062	1916	W97Q	親本	無	無
2206	2202	親本	S92N、Y94del、P95del、L96Y、T97P	無	無
2207	2203	親本	S92Y、Y94del、P95del、L96T、T97P	無	無
2208	2204	親本	Q89L、Y91K	1.63nM	2.30nM
2209	2205	親本	Q89L	0.43nM	0.15nM
2053	1765	親本	親本	0.67nM	0.70nM

表 20：IgG及四功能Fab形式之最佳化殖株與人類TNFR2 CHO細胞之結合。

出人意料地，除2對IgG及四功能Fab以外，所有殖株完全喪失其結合於CHO細胞表面上表現之人類TNFR2的能力。殖株四功能Fab 2208/IgG 2204及四功能Fab 2209/IgG 2205仍能夠以IgG及四功能Fab形式結合於TNFR2，但Emax與親本殖株2053/1765相比顯著減少。此等殖株僅在CDR3-VL中突變，移除所預測之T細胞抗原決定基。活體外分析(圖中未展示)表明四功能Fab 2053之所預測之T細胞抗原決定基未在抗原呈現細胞之表面上呈現，且與所預測之T細胞抗原決定基重疊之肽不活化CD4+ T細胞，表明該所預測之T細胞抗原決定基引起免疫原性之風險較低，且因此未顯示此等最佳化變異體。

實例 17 TF-2053 在 NSG-GVHD 模型中提供長期存活率益處 目標： 測試人類 四功能 Fab-2053 預防異種移植 GvHD 之預防功效將人類外周血液單核細胞(PBMC)轉移至不含內源性淋巴細胞分化之免疫缺乏小鼠(NOD-SCID γ共鏈基因剔除，NSG)中使得移植物抗宿主病(GVHD)主要由經移轉之人類CD4+及CD8+淋巴球介導[1]。經移轉之人類淋巴球在受體小鼠中不經歷胸腺馴育，且因此不對小鼠主要組織相容性基因座(MHC) I類及II類分子之情況下所呈現之小鼠蛋白質耐受[2]。小鼠反應性人類CD4+及CD8+細胞在數週過程內成熟及增殖至效應記憶細胞中，該等效應記憶細胞釋放大量發炎性細胞介素，如腫瘤壞死因子α (TNFa)及干擾素γ (IFNg)，其引起大量組織發炎性浸潤以及器官功能異常、體重減輕及死亡[1]。此項技術中通常使用NSG GVHD模型以證明由人類淋巴球表現之蛋白質在介導T細胞活化、擴增及效應功能中之作用。選擇此模型以證明促效TNFR2在與人類調節性T細胞(Treg)存活無關之模型中減少人類效應T細胞之擴增、活化及病理生理學功能的作用。先前已在活體外證明經由TNFR2促效作用發生之效應T細胞活化誘導之細胞死亡[3]，但未在活體內針對人類T細胞得到證明，但已在小鼠中證明TNFR2負責限制一些自體反應性CD8 T細胞活性[4]。

方法：概述：8至9週齡NSG小鼠係購自傑克遜實驗室(Jackson Labs)且在Pfizer飼養室中適應。所有動物使用及處理均根據經IACUC批准之方案進行。在整個實驗中，在人類PBMC投與之前1天開始以3 mg/kg、10 ml/kg兩週一次投與四功能Fab-2053或同型對照四功能Fab。先前低溫保存之人類PBMC在實驗之第0天解凍，在PBS中洗滌且以每隻小鼠10×10 ⁶/0.1 ml PBS IV投與，n=20隻小鼠/組。基於研究前體重之隨機化形成群組。每週2次量測體重直至在第78天處死為止。每隔2週收集血液以藉由流動式細胞量測術量測人類細胞移植/擴增、CD4/CD8分佈以及T細胞無反應性、耗竭及衰老之標記，且藉由電化學發光MSD分析法量測循環人類細胞介素水平。根據IACUC方案將損失超過20% BW之小鼠處死且在第78天處死所有剩餘小鼠。在處死時，記錄脾臟及肝臟重量且對脾細胞以及血液進行流動式細胞量測分析。

結果：TF2053在NSG-GVHD模型中提供長期存活率益處(圖3，表21)。TF2053減少NSG-GVHD模型中之體重減輕(圖4，表22)。此外，在NSG GVHD模型中，TF2053減少循環人類細胞介素IFNγ、IL10、IL17A、TNFα (圖5至圖8，及表23至表26)。TF2053減少NSG GVHD模型中在處死時之肝臟及脾臟重量(圖9及圖10，表27及表28)。藉由CD45+、CD4+及CD8+所量測，TF2053減少NSG GVHD模型過程內人類細胞之移植(圖11至圖13，表27至表29)。TF2053在NSG GVHD模型過程內減少無反應性且增加衰老及耗竭CD8+細胞(圖14至圖16，表32至表34)。TF2053改變CD4:CD8移植比率(圖12，表30)。

PBS (無PBMC)	對照Ig	四功能Fab-2053
100	30	75

表21：在第78天之存活率(起始群體之百分比)。統計：對數秩(芒泰爾-考克斯)測試。資料亦展示於圖3中。

PBS (無PBMC)	對照Ig	TF2053
10.0	-7.8	5.6

表22：相對於基線之體重變化百分比。資料亦展示於圖4中。

	PBS	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	0	2719	11734	***
第28天	0	67924	12201	***
第42天	0	89370	14523	***
第53天	0	80091	13457	***

表23：平均血漿人類IFNγ (pg/ml)。TF2053與對照Ig相比***p＜0.001。資料亦展示於圖5中。

	PBS	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	0.1	1.7	1.0
第28天	0.1	13.8	0.6	***
第42天	0.0	9.9	0.9	***
第53天	0.0	8.2	0.8	***

表24：平均血漿人類IL10 (pg/ml)。TF2053與對照Ig相比***p＜0.001。資料亦展示於圖6中。

	PBS	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	0	3	6
第28天	0	132	26	**
第42天	0	636	30	***
第53天	1	707	34	***

表25：平均血漿人類IL17A (pg/ml)。TF2053與對照Ig相比**p＜0.01。TF2053與對照Ig相比***p＜0.001。資料亦展示於圖7中。

	PBS	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	0.0	1.2	4.2	***
第28天	0.0	26.7	5.0	***
第42天	0.2	17.6	4.0	***
第53天	0.0	16.0	3.9	***

表26：平均血漿人類TNFα (pg/ml)。TF2053與對照Ig相比***p＜0.001。統計：未配對雙尾司徒頓t檢定。資料亦展示於圖8中。

	PBS	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第11至78天	0.0395	0.0620	0.0465	***

表27：在處死時平均肝臟重量/體重(mg/kg)。TF2053與對照Ig相比***p＜0.001。資料亦展示於圖9中。

	PBS	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第11至78天	0.0009	0.0061	0.0027	***

表28：在處死時平均肝臟重量/體重(mg/kg)。TF2053與對照Ig相比***p＜0.001。統計：未配對雙尾司徒頓t檢定。資料亦展示於圖10中。

	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	1.2	4.2	***
第28天	26.7	4.9	**
第42天	17.6	4.0	****
第53天	16.0	3.9	***

表29：全血白血球中之平均人類CD45+細胞百分比。** p＜0.01。*** p＜0.001。**** p＜0.0001。資料亦展示於圖11中。

	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	51.3	28.9	****
第28天	63.6	11.6	****
第42天	47.2	9.3	****
第53天	81.9	9.4	****

表30：人類CD45+/CD3+全血淋巴球之平均人類CD4+百分比。**** p＜0.0001。資料亦展示於圖12中。

	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	44.4	66.0	****
第28天	35.5	87.6	****
第42天	23.9	74.6	****
第53天	16.1	72.1	****

表31：人類CD45+/CD3+全血淋巴球之平均人類CD8+百分比。**** p＜0.0001。資料亦展示於圖13中。

	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	44.4	66.0
第28天	35.5	87.6	****
第42天	23.9	74.6	****
第53天	16.1	72.1	****

表32：人類CD8+/CD3+/CD45+血液淋巴球之平均無反應性(PD1+KLRG1-CD57-)細胞百分比。**** p＜0.0001。資料亦展示於圖14中。

	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	30.4	43.7	**
第28天	41.7	43.5
第42天	33.8	45.2	**
第53天	31.9	44.5	**

表33：人類CD8+/CD3+/CD45+血液淋巴球之平均耗竭(PD1+KLRG1+CD57-)細胞百分比。** p＜0.01。資料亦展示於圖15中。

	對照Ig 3 mpk	TF2053 3mpk
第14天	13.6	1.0	*
第28天	0.5	4.2	****
第42天	1.0	5.7	****
第53天	0.7	9.0	**

表34：人類CD8+/CD3+/CD45+血液淋巴球之平均衰老(PD1-KLRG1+CD57+)細胞百分比。* p＜0.05。** p＜0.01。**** p＜0.0001。統計：在各時間點之各組之間的未配對雙尾T測試。資料亦展示於圖16中。

結論：在轉移10 ⁷個人類PBMC之前一天開始用3 mg/kg TF2053治療NSG小鼠提供針對GVHD之顯著保護。存活率得到改良，同時體重減輕得到減少。另外，肝臟及脾臟重量之增加減少。在第14天，循環人類發炎性細胞介素及人類CD45細胞移植顯著更高，但在所有較晚時間點在使用TF2053時顯著更低。TF2053亦改變CD4與CD8比率，有助於CD8+細胞，且增加隨時間推移耗竭且衰老之此等CD8+細胞百分比，同時降低無反應性百分比。總而言之，證實以下假設：在不存在調節性T細胞擴增之情況下，TNFR2之促效作用可經由對效應T細胞之影響，在人源化NSG-GVHD活體內模型中提供益處。

參考文獻 ：1. Pino, S.,等人, Development of novel major histocompatibility complex class I and class II-deficient NOD-SCID IL2R gamma chain knockout mice for modeling human xenogeneic graft-versus-host disease.Methods Mol Biol, 2010. 602: p. 105-17。 2. Brehm, M.A.,等人, Lack of acute xenogeneic graft- versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.Faseb j, 2019. 33(3): p. 3137-3151。 3. Ban, L.,等人, Selective death of autoreactive T cells in human diabetes by TNF or TNF receptor 2 agonism.Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(36): p. 13644-9。 4. Punit, S.,等人, Tumor Necrosis Factor Receptor 2 Restricts the Pathogenicity of CD8(+) T Cells in Mice With Colitis.Gastroenterology, 2015. 149(4): p. 993-1005.e2。表 35 序列表

SEQ	描述	序列
1	GBT-0854 VL CDR-L1 GBT-1765 VL CDR-L1 GBT-2053 VL CDR-L1	KASQNVGTAVA
2	GBT-0854 VL CDR-L2	SASNRYT
3	GBT-0854 VL CDR-L3 GBT-1765 VL CDR-L3 GBT-2053 VL CDR-L3	QQYSSYPLT
4	GBT-0854 VL	DIVMTQSQKF MSTTVGDRVS ITC KASQNVG TAVAWYQQKP GQSPKLLIY S ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNMQS EDLADYFC QQ YSSYPLTFGG GTKLEIK
5	HuKappa之恆定域輕鏈	RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
6	GBT-0854 LC	DIVMTQSQKF MSTTVGDRVS ITC KASQNVG TAVAWYQQKP GQSPKLLIY S ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNMQS EDLADYFC QQ YSSYPLTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
7	GBT-1765 VL CDR-L2 GBT-2053 VL CDR-L2	AASTLQS
8	GBT-1765 VL	DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIY A ASTLQSGVPS RFSGSGSGTE FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSSYPLTFGG GTKVEIK
9	GBT-1765 LC GBT-2053 LC	DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIY A ASTLQSGVPS RFSGSGSGTE FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSSYPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGvT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC
10	GBT-0854 VH CDR-H1 GBT-1765 VH CDR-H1 GBT-2053 VH CDR-H1	GFSFPSSGVD
11	GBT-0854 VH CDR-H2	VTWGVGSTHY NSALKS
12	GBT-0854 VH CDR-H3 GBT-1765 VH CDR-H3 GBT-2053 VH CDR-H3	GEWDEGFVY
13	GBT-0854 VH	QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVS GFSFP SSGVDWVRQS PGKGLEWLG V TWGVGSTHYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTEDT AIYYCAS GEW DEGFVYWGQG TLVTVSA
14	IgG2 CH1	ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
15	IgG2 Hinge	ERKCCVECPPCP
16	IgG2 CH2	APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVV A VSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLP SS IEKTISKTK
17	IgG2 CH3	GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
18	HuIgG2效應功能無效之Fc鏈鉸鏈為斜體	ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVV A VSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SS IEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
19	GBT-0854 HC	QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVS GFSFP SSGVDWVRQS PGKGLEWLG V TWGVGSTHYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTEDT AIYYCAS GEW DEGFVYWGQG TLVTVSAAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV A VSHEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTFRVVS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS NKGLP SS IEK TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
20	GBT-1765 VH CDR-H2 GBT-2053 VH CDR-H2	VTWGVGSTHY NQKFQG
21	GBT-1765 VH	QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKVS GFSFP SSGVDWVRQA PGQGLEWLG V TWGVGSTHYN QKFQGRVTIT KDTSKSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCAS GEW DEGFVYWGQG TLVTVSS
22	GBT-1765 HC	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVS GFSFPSSGVDWVRQA PGQGLEWLG V TWGVGSTHYNQKFQGRVTITKDTSKSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCAS GEW DEGFVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV A VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SS IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
23	IgG1 CH1	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
24	IgG1鉸鏈	DKTHTCPPCP
25	IgG1 CH2效應突變為粗體及加底線的	APE AA G A PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
26	IgG1 CH3	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
27	連接子	*GGGGS*
28	IgG1 CH1及連接子	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC GGGGS
29	GBT-2053 V _H	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVS GFSFPSSGVDWVRQAPGQGLEWLG VTWGVGSTHYNQKFQGRVTITKDTSKSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAS GEWDEGFVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC *GGGGS* QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVS GFSFPSSGVDWVRQAPGQGLEWLG VTWGVGSTHYNQKFQGRVTITKDTSKSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAS GEWDEGFVYWGQGTLVTVSS
30	GBT-2053雙功能Fab HC	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVS GFSFPSSGVDWVRQAPGQGLEWLG VTWGVGSTHYNQKFQGRVTITKDTSKSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAS GEWDEGFVYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC *GGGGS* QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVS GFSFPSSGVDWVRQAPGQGLEWLG VTWGVGSTHYNQKFQGRVTITKDTSKSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAS GEWDEGFVYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
31	DNA GBT-1765 LC GBT-2053 LC	GATATTCAGCTGACCCAGAGCCCATCCTTCCTCAGCGCCTCCGTGGGGGATAGAGTGACCATTACATGT AAGGCCTCACAGAATGTAGGGACTGCCGTCGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCACCAAAGCTCCTGATTTAT GCCGCTTCCACTCTGCAGAGTGGTGTCCCCAGCAGATTCTCAGGTTCTGGCTCTGGAACGGAATTCACCCTGACCATCTCTTCTCTGCAACCCGAAGACTTTGCTACCTACTATTGT CAACAGTATAGCTCATACCCACTGACCTTCGGTGGAGGAACGAAAGTTGAGATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
32	DNA GBT-1765 HC	CAGGTTCAGCTTGTGCAAAGCGGCGCAGAGGTCAAGAAGCCAGGGGCCTCCGTCAAGGTGTCCTGTAAAGTCTCT GGCTTTTCCTTCCCATCCTCTGGGGTGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGCAAGGGCTCGAGTGGTTGGGC GTTACATGGGGAGTGGGCTCCACCCACTACAATCAAAAGTTCCAGGGCCGTGTTACAATCACCAAAGATACCTCTAAAAGCACTGTGTACATGGAGCTGTCATCATTGAGGTCCGAAGATACCGCCGTTTATTACTGTGCATCA GGGGAGTGGGACGAGGGCTTTGTTTATTGGGGGCAGGGAACCTTGGTAACAGTCTCAAGCGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGAAAA
33	DNA GBT-2053雙功能Fab HC	CAAGTCCAGCTTGTGCAGAGCGGTGCTGAGGTTAAAAAGCCTGGGGCAAGTGTCAAAGTCAGCTGTAAAGTCAGC GGTTTTAGCTTTCCGTCCTCAGGCGTGGACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGTCAAGGCCTCGAATGGCTCGGT GTGACATGGGGTGTGGGCTCCACCCATTACAATCAGAAATTTCAGGGAAGAGTTACAATCACGAAGGACACTAGTAAATCAACAGTGTACATGGAGTTGAGTAGCCTTCGCAGCGAGGACACGGCCGTCTACTACTGCGCCAGT GGAGAGTGGGACGAGGGTTTTGTATATTGGGGACAGGGAACTCTCGTGACTGTGAGTTCCGCCTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT *GGCGGTGGCGGGTCC* CAGGTTCAGCTTGTGCAAAGCGGCGCAGAGGTCAAGAAGCCAGGGGCCTCCGTCAAGGTGTCCTGTAAAGTCTCT GGCTTTTCCTTCCCATCCTCTGGGGTGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGCAAGGGCTCGAGTGGTTGGGC GTTACATGGGGAGTGGGCTCCACCCACTACAATCAAAAGTTCCAGGGCCGTGTTACAATCACCAAAGATACCTCTAAAAGCACTGTGTACATGGAGCTGTCATCATTGAGGTCCGAAGATACCGCCGTTTATTACTGTGCATCA GGGGAGTGGGACGAGGGCTTTGTTTATTGGGGGCAGGGAACCTTGGTAACAGTCTCAAGCGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGAAAA
34	人類TNFR2	MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDFALPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQREAKVPHLPADKARGTQGPEQQHLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDSSPSESPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS
35	鼠類TNFR2	MAPAALWVALVFELQLWATGHTVPAQVVLTPYKPEPGYECQISQEYYDRKAQMCCAKCPPGQYVKHFCNKTSDTVCADCEASMYTQVWNQFRTCLSCSSSCTTDQVEIRACTKQQNRVCACEAGRYCALKTHSGSCRQCMRLSKCGPGFGVASSRAPNGNVLCKACAPGTFSDTTSSTDVCRPHRICSILAIPGNASTDAVCAPESPTLSAIPRTLYVSQPEPTRSQPLDQEPGPSQTPSILTSLGSTPIIEQSTKGGISLPIGLIVGVTSLGLLMLGLVNCIILVQRKKKPSCLQRDAKVPHVPDEKSQDAVGLEQQHLLTTAPSSSSSSLESSASAGDRRAPPGGHPQARVMAEAQGFQEARASSRISDSSHGSHGTHVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASATVGDPDAKPSASPKDEQVPFSQEECPSQSPCETTETLQSHEKPLPLGVPDMGMKPSQAGWFDQIAVKVA
36	食蟹獼猴TNFR2	MAPAAVWAALAVGLELWAAGHALPAQVAFTPYAPEPGGTCRLREYYDQTAQMCCSKCPPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAQLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICHVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPAPSTAPGTSFLLPVGPSPPAEGSTGDIVLPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQRETKVPHLPADKARGAQGPEQQHLLTTVPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGAEKASGAGEARASTGSSADSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDASPSGSPKDEQVPFSKEESAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS
37	2053之Fc鏈	DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

圖1：市售MR2-1殖株及1-步驟純化殖株162之分析型SEC概況。圖2：四功能Fab (TetraFab)之結構的代表圖，其展示添加在內部VH (經標記之內部VH-內部CH1)上之額外Fab域(經標記之外部VH-外部CH1)。外部VH及內部VH藉由G4S域連接。圖3：四功能Fab-2053與對照Ig之存活率曲線。統計：對數秩(芒泰爾-考克斯(Mantel-Cox))測試。資料亦展示於表21中。圖4：相對於基線之體重變化百分比。資料亦展示於表22中。圖5：平均血漿人類IFNγ (pg/ml)。TF2053與對照Ig相比，***p＜0.001。資料亦展示於表23中。圖6：平均血漿人類IL10 (pg/ml)。TF2053與對照Ig相比，***p＜0.001。資料亦展示於表24中。圖7：平均血漿人類IL17A (pg/ml)。TF2053與對照Ig相比，**p＜0.01。TF2053與對照Ig相比***，p＜0.001。資料亦展示於表25中。圖8：平均血漿人類TNFα (pg/ml)。TF2053與對照Ig相比，***p＜0.001。統計：未配對雙尾司徒頓t檢定(2-tailed Student's t-Test)。資料亦展示於表26中。圖9：在處死時的平均肝臟重量/體重(mg/kg)。TF2053與對照Ig相比，***p＜0.001。資料亦展示於表27中。圖10：在處死時的平均脾臟重量/體重(mg/kg)。TF2053與對照Ig相比，***p＜0.001。統計：未配對雙尾司徒頓t檢定。資料亦展示於表28中。圖11：全血白血球中之平均人類CD45+細胞百分比。**p＜0.01。***p＜0.001。****p＜0.0001。資料亦展示於表29中。圖12：人類CD45+/CD3+全血淋巴球之平均人類CD4+百分比。****p＜0.0001。資料亦展示於表30中。圖13：人類CD45+/CD3+全血淋巴球之平均人類CD8+百分比。****p＜0.0001。資料亦展示於表31中。圖14：人類CD8+/CD3+/CD45+血液淋巴球之平均無反應性(PD1+KLRG1-CD57-)細胞百分比。**** p＜0.0001。資料亦展示於表32中。圖15：人類CD8+/CD3+/CD45+血液淋巴球之平均耗竭(PD1+KLRG1+CD57-)細胞百分比。** p＜0.01。資料亦展示於表33中。圖16：人類CD8+/CD3+/CD45+血液淋巴球之平均衰老(PD1-KLRG1+CD57+)細胞百分比。* p＜0.05。** p＜0.01。**** p＜0.0001。統計：在各時間點之各組之間的未配對雙尾T測試。資料亦展示於表34中。

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Claims

一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區及輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 29組成之群的VH序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列；及選自由SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 4組成之群的VL序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
一種特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區及輕鏈可變區包含 (i) 根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 7之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 20之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列；或 (ii) 根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 2之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 11之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列。
如請求項1至2中任一項之抗體，其包含以下中之一者或兩者： (i) VH構架序列，其衍生自選自由IGHV1-46、IGHV4-31、IGHV4-30-4及IGHV4-4組成之群的人類生殖系VH序列；及 (ii) VL構架序列，其衍生自選自由IGKV1-9、IGKV1-33、IGKV1-27、IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV1-1及IGKV1-11組成之群的人類生殖系VL序列。
如請求項1至2中任一項之抗體，其中該VL包含根據選自由SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 4組成之群的序列之胺基酸序列，且其中該VH包含根據選自由SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 13組成之群的序列之胺基酸序列。
如請求項1至2中任一項之抗體，其包含該SEQ ID NO: 21之VH序列及該SEQ ID NO: 8之VL。
一種抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127528之質體編碼的VH序列及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127529之質體編碼的VH序列中之一者或兩者；及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127531之質體編碼的VL序列。
如請求項1、2及6中任一項之抗體，其進一步包含Fc域，其中該Fc域為IgA、IgD、IgE、IgM或IgG之Fc域。
如請求項1、2及6中任一項之抗體，其進一步包含重鏈(HC)，該重鏈包含根據SEQ ID NO: 22之序列。
如請求項1、2及6中任一項之抗體，其進一步包含輕鏈(LC)，該輕鏈包含根據SEQ ID NO: 9之序列。
如請求項1、2及6中任一項之抗體，其包含第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab，其中該第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab各自包含根據SEQ ID NO: 1之CDR-L1序列；根據SEQ ID NO: 7之CDR-L2序列，及根據SEQ ID NO: 3之CDR-L3序列，以及根據SEQ ID NO: 10之CDR-H1序列；根據SEQ ID NO: 20之CDR-H2序列；根據SEQ ID NO: 12之CDR-H3序列。
如請求項10之抗體，其中該第一Fab、第二Fab、第三Fab及第四Fab各自包含具有根據SEQ ID NO: 21之序列的VH及具有根據SEQ ID NO: 8之序列的VL。
如請求項10之抗體，其中該第一Fab之N'端經由第一連接子連接至該第三Fab之C'端，且該第二Fab之N'端經由第二連接子連接至該第四Fab之C'端，且其中視情況地，該第一連接子及該第二連接子中之一者或兩者包含根據SEQ ID NO: 27之序列。
如請求項1、2及6中任一項之抗體，其包含有包含根據SEQ ID NO: 30之序列的重鏈(HC)及包含根據SEQ ID NO: 9之序列的輕鏈(LC)。
如請求項1、2及6中任一項之抗體，其包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼的重鏈(HC)序列及由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼的輕鏈(LC)序列。
一種抗體，其包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127530之質體編碼的HC序列，及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127532之質體編碼的LC序列。
如請求項1、2、6及15中任一項之抗體，其中該抗體之特徵在於選自由以下組成之群的一或多者： (i) 在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中小於5 μM之EC ₅₀； (ii) 在人類外周血液單核球中之人類TNFR2效力分析法中小於10 μM之EC ₅₀； (iii) 在Jurkat報導細胞中之人類TNFR2效力分析法中小於5 μM之EC ₅₀； (iv) 在來自人類外周血液單核球之表現人類TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC50小於2 mg/ml； (v) 在來自人類外周血液單核球之表現人類TNFR2之初代T細胞群體中，針對ICAM-1上調之EC50小於1 mg/ml；及 (vi) 對人類TNFR2之親和力KD小於1 nM。
一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至16中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
一種如請求項1至16中任一項之抗體或如請求項17之醫藥組合物之用途，其係用於製造用以治療醫學病狀之藥劑。
如請求項18之用途，其中該病狀係選自由以下組成之群：類風濕性關節炎(RA)、關節黏連性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(Chron's disease；CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、移植物抗宿主病(GVHD)、移植、牛皮癬(PSO)、牛皮癬性關節炎(PSA)、異位性皮膚炎(AD)、白斑病、斑禿(AA)、1型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、大腸急躁症(IBD)、自體免疫性肝炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)。
一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至16中任一項之抗體的一或多個核苷酸序列。
一種經分離之聚核苷酸，其編碼結合於TNFR2之抗體之HC及LC或其兩者，其中該核酸包含選自由以下組成之群的一或多者：SEQ ID NO: 31之核酸序列、SEQ ID NO: 32之核酸序列、SEQ ID NO: 33之核酸序列。
一種經分離之聚核苷酸，其編碼特異性結合於TNFR2之經分離之抗體，該抗體包含由SEQ ID NO: 33之核酸序列編碼的重鏈(HC)序列及由SEQ ID NO: 31之核酸序列編碼的輕鏈(LC)序列。
一種經分離之聚核苷酸，其編碼經分離之抗體，該抗體包含由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127530之質體編碼的HC序列，及由寄存於ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-127532之質體編碼的LC序列。
一種載體，其包含如請求項20至23中任一項之聚核苷酸。
一種經分離之宿主細胞，其包含如請求項20至23中任一項之聚核苷酸或如請求項24之載體。
一種產生經分離之抗體之方法，其包含在引起產生該抗體之條件下培養如請求項25之宿主細胞，及回收該抗體。