TW202346595A - 編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的５＇—非轉譯區突變序列及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種包括突變5′-非轉譯區（5′UTR）之編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的突變基因、一種包括該基因的生產聚羥基烷酸酯（PHA）的微生物，以及一種使用該微生物生產PHA的方法。

Description

編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的5′-非轉譯區突變序列及其用途
本發明係關於一種包括突變5′-非轉譯區（5′UTR）之編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase）的突變基因、一種包括該基因的生產聚羥基烷酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）的微生物，以及一種使用該微生物生產PHA的方法。
隨著因石油系生物難分解塑膠積累而出現的環境污染問題，替代其的生物可降解生質塑膠(biodegradable bioplastics)正受到關注。聚羥基烷酸酯（PHA）是一種生質塑膠材料，是一種在微生物中積累的聚酯基天然聚合物。PHA是一種生物可降解(biodegradable)的材料，不會產生有毒廢物，已知為具有熱塑性和彈性等特性的環保聚合物。在PHA中，已知最具代表性的材料是使用3-羥基丁酸（3HB）單體聚合的聚-3-羥基丁酸酯（P3HB）。P3HB具有與聚丙烯相似的物理特性，聚丙烯是用於汽車零件、家用電器零件等的合成樹脂。由於P3HB可以相對容易地由微生物合成，因此已進行許多關於其商業化生產的研究。然而， P3HB具有因結晶度高而具有脆性，並且由於其在其熔點附近分解而難以加工等限制。因此，已進行通過與新材料共混、或單體共聚來生產PHA共聚物的研究。在這些研究之中，聚（3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸酯）（（poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate） ；P（3HB-co-4HB））的共聚物為因添加4-羥基丁酸酯（4HB）單體而具有彈性體特性的材料。PHA的物理特性隨4HB單體的添加比例而變化，且PHA可使用於生產各種產品。因此，其作為一種有前景的生物可降解聚合物材料而備受關注。
[技術課題]
本發明之一目的在於，提供編碼突變5′-非轉譯區（5′UTR）的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變。
本發明之另一個目的在於，提供一種包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變。
本發明之又一個目的在於，提供一種生產聚羥基烷酸酯（PHA）的微生物，該微生物包括：編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1 的鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列。
本發明之又一個目在於，提供一種生產PHA的方法，該方法包括在培養基中培養生產PHA (PHA-producing)的微生物的步驟，該微生物包括：編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼該突變5′UTR的鹼基序列。 [技術方案]
以下將詳細描述本發明。同時，本文中揭露的每段描述和具體實施例也可以應用於其它描述和具體實施例。也就是說，本文中揭露的各種元件的所有組合都屬於本發明的範圍。此外，本發明的範圍不受下面描述的具體揭露内容的限制。此外，本技術領域中具通常知識者將認識到，或者能使用不超過常規實驗來確定本文描述的揭露内容的特定具體實施例的許多均等内容。此外，這些均等内容應被解釋為屬於本發明的範圍。
本發明的一個態樣提供一種編碼突變5′-非轉譯區（5′UTR）的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變。
如本文所使用，術語“5′-非轉譯區（5′-untranslated region；5′UTR）”是指存在於mRNA轉錄體的5′末端，但未轉譯成胺基酸的區域。mRNA至蛋白質的轉譯開始於30S核糖體亞基與5′UTR的結合。具體而言，當30S核糖體亞基中的16S rRNA（16S核糖體RNA）與5′UTR內的RBS結合，並且tRNA識別並結合到mRNA的起始密碼子（AUG）時，開始轉譯成蛋白質。已知 5′UTR 的核糖體結合位點和起始密碼子存在大約 6 到 8 個核苷酸之距離。
在本發明中，5′UTR包括一序列，其中與16S rRNA的3′末端之序列互補的序列，意即Shine-Dalgarno序列，係被保留，並且在Shine-Dalgarno序列之前及之後的序列被修飾。
“5′UTR序列經修飾(5′UTR sequence modified)”或“經修飾的5′UTR(modified 5′UTR)”是指構成5′UTR的鹼基序列中的一個或多個鹼基受到修飾，並且這種修飾可包括鹼基的取代(substitutions)、添加(additions)、刪除(deletions)或反轉(inversions)。代表性例子舉例如，5′UTR可包括一序列：其中Shine-Dalgarno序列係被保留，並且存在於Shine-Dalgarno序列前後的鹼基序列中的一個或多個鹼基藉由取代、添加、刪除或反轉加以修飾。
5′UTR可包括核糖體結合位點（RBS）。
如本文所使用，術語“核糖體結合位點（RBS）”是指核糖體直接與其結合並且能夠啟動轉譯的存在於mRNA鏈內之區域（結構），或導致其區域被轉錄的DNA鏈的區域（結構）。大多數原核生(prokaryotes)物具有短序列的RBS，該RBS使核醣體能夠輕鬆識別並結合至mRNA，並在mRNA上的啟動密碼子（通常為“ AUG”）的5'上游附近含有開放式閱讀框（ORF）。RBS包括與16S rRNA的3'末端之序列互補的序列，該序列稱為Shine-Dalgarno序列。
本發明的突變5′UTR可為其中野生種5′UTR的SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變的突變5′UTR。
在本發明中，SEQ ID NO： 1之鹼基序列可為編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之基因的5′-非轉譯區（5′UTR）。本發明的5′UTR可包括SEQ ID NO: 1的鹼基序列、可具有SEQ ID NO: 1的鹼基序列、可由SEQ ID NO: 1的鹼基序列組成，或基本上由SEQ ID NO: 1的鹼基序列組成。
SEQ ID NO： 1 的鹼基序列可包括與 SEQ ID NO： 1 描述的鹼基序列具有至少 70%、75%、76%、80%、84%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%、或99.9%或更多的同源性(homology)或相等性(identity)之鹼基序列。此外，顯見的是，任何在部分序列中具有刪除、修飾、取代、保留取代(conservative substitution)或添加的鹼基序列也可包括在本發明的範圍內，只要該鹼基序列具有這樣的同源性或相等性並表現出對應於5′UTR 的效能。
具體而言，本發明的5′UTR（其中一個或多個鹼基發生突變）可與“突變5′UTR”或“突變的含RBS序列”互換使用，其中5′UTR中的RBS序列發生突變。
更具體而言，本發明的突變5′UTR可在對應於SEQ ID NO: 1的鹼基序列中位置15至22的鹼基的一個或多個鹼基中具有突變(mutations)。例如，該等突變可指：用不同於取代前之鹼基的鹼基取代特定鹼基。
再更具體而言，本發明的突變5′UTR可包括藉由選自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO: 12之任何一者來描述的鹼基序列。
此外，本發明的突變5′UTR可具有或可包括相對選自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO: 12的任一序列之整體具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、80%或更多、84%或更多、85%或更多、88%或更多、90%或更多、92%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、 99%或更多、99.5%或更多、99.7%或更多、99.9%或更多、且小於100%的同源性或相等性的鹼基序列，條件為相較於編碼野生種5'UTR的SEQ ID NO: 1之序列，SEQ ID NO:2至12中各自的突變序列是固定的；或者，可包括、可具有、可由下述組成、或基本上可由下述組成：相對選自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO: 12的任一序列具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、80%或更多、84%或更多、85%或更多、88%或更多、90%或更多、92%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、 99%或更多、99.5%或更多、99.7%或更多、99.9%或更多、且小於100%的同源性或相等性的鹼基序列，但不限於此。
此外，顯見的是，任何在部分序列中具有刪除、修飾、取代、保留取代或添加的突變5′UTR也可包括在本發明的範圍內，只要該鹼基序列具有這樣的同源性或相等性並表現出對應於本發明的突變5′UTR 的效能。
如本文所使用，“多核苷酸(polynucleotide)”是指具有預定長度或更長長度的DNA或RNA 股，其為核苷酸的聚合物，其中核苷酸單體藉由共價鍵以長鏈形狀連接。
如本文所使用，術語 “突變(mutant)”是指多核苷酸基於一個或多個鹼基之修飾而具有與修飾前的鹼基序列不同的鹼基序列，但保持其功能或特性。這種突變通常可藉由修飾多核苷酸之鹼基序列的一個或多個鹼基並評估經修飾的多核苷酸的特性加以識別。換言之，相較於修飾前的多核苷酸，突變多核苷酸的能力可被增加、不變或降低。突變多核苷酸可以與諸如變異體(variant)、修飾(modification)、被修飾的多核苷酸(modified polynucleotide)、被修飾的基因(modified gene)、突變(mutant)、突變蛋白(mutein)、發散體(divergent)等術語互換使用，並且只要是所使用的術語具有變異的意義，則不限於此。
突變多核苷酸可以與其它序列或連接子(linker)共軛，以加以識別、純化或合成。
如本文所使用，術語“對應於(corresponding to)”是指位於多核苷酸中列出的位置之鹼基，或與多核苷酸中列出的鹼基相似、相等或同源的鹼基。在對應位置的鹼基之識別可為確定意指特定序列的序列中的特定鹼基。如本文所使用， “對應區域(corresponding region)”通常是指在相關多核苷酸序列或參考多核苷酸序列中的相似或對應位置。
例如，任意鹼基序列與SEQ ID NO： 1對位，並且據此，可參照SEQ ID NO: 1之鹼基和對應鹼基的數值位置，來對鹼基序列的每個鹼基進行編號。例如，如本文中所描述的序列對位演算法(alignment algorithm)可通過與查詢序列（也稱為"參考序列(reference sequence)"）中的鹼基等的位置進行比較，來確定鹼基的位置或發生諸如取代(insertion)、插入(insertion)或刪除(deletion)等修飾的位置。
關於這樣的對位，例如，可使用Needleman-Wunsch演算法（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443–453）、EMBOSS套件的Needleman程式（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.16:276–277）等，但不限於此，並且可以合適地使用本技術領域中已知的序列對位程式、成對序列比較演算法等。
如本文所使用，術語“同源性(homology)”或“相等性(identity)”是指兩個給定的胺基酸序列或鹼基序列之間的相似程度，並且可表示成百分比。術語“同源性”和“相等性”通常可以互換使用。
藉由標準對位演算法(standard alignment algorithm)確定保留的多核苷酸或多肽的序列同源性或相等性，並且可一起使用由所使用的程式所建立的預設空位罰分（default gap penalty）。基本上，同源或相等序列通常能夠在中度或高度嚴密的條件下與整體或部分序列雜交。顯而易見的是，雜交更包括與包括常用密碼子(general codon)、或考慮到密碼子簡併性(codon degeneracy)的密碼子之多核苷酸的雜交。
可使用已知的電腦演算法，如“FASTA”程式，例如，使用如Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:2444中的預設參數，來確定任何兩個多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性(similarity)或相等性。 或者是，可使用Needleman-Wunsch演算法（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443 - 453)，如執行於歐洲分子生物學開放軟體套組（EMBOSS）組件的Needleman程式（5.0.0或其後的版本）（Rice et al., 2000, Trends Genet.16:276 - 277）（包括GCC程式套組（Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research12:387 (1984)）），BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J MOLEC BIOL215:403 (1990)； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego,1994, and CARILLO et al.(1988) SIAM J Applied Math48:1073) ，來確定同源性、相似性或相等性。舉例而言，可使用國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST或ClustalW，來確定同源性、相似性(similarity)或相等性。
可藉由使用例如，GAP電腦程式(如Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482中所宣告的Needleman et al.(1970), J Mol Biol.48:443)比對序列資訊，來確定多核苷酸或多肽的同源性、相似性或相等性。簡言之，該GAP程式將同源性、相似性或相等性界定為相似的經對位之符號（即，核苷酸或胺基酸）之數量除以兩個序列之較短者中的符號之總數所獲得之值。該GAP程式的預設參數可包括：(1) 二進位比較矩陣（包含表示相同的數值1及表示不同的數值0）以及Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353–358 (1979) 中所揭露的 Gribskov et al.(1986) Nucl . Acids Res.14: 6745之加權比較矩陣（或EDNAFULL (NCBI NUC4.4之EMBOSS版本) 取代矩陣）；(2) 對各空位（gap）之3.0的罰分（penalty）以及各空位中每個符號額外0.10的罰分（或是一個空位開啟10罰分，且一空位延伸0.5罰分）；以及(3) 對於終端空位無罰分。
考慮到密碼子簡併性或生物體較佳的密碼子旨在表現包括本發明的突變5'UTR的突變基因，在本發明之多核苷酸中，在編碼區中可進行各種修飾，只要不改變包括本發明的突變5'UTR的突變基因的鹼基序列。
此外，本發明之多核苷酸可包括可自已知基因序列製備之探針，例如，該序列並不受限，只要其係為在嚴密條件下可以與對本發明之多核苷酸序列的一部分或整體為互補性的序列雜交的序列。該”嚴密條件(“stringent conditions)”意指能使多核苷酸之間發生特定雜交的條件。此等條件具體敘述於文獻中（見J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50–9.51, 11.7–11.8）。其示例包括：其中具有高同源性或相等性，亦即，具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、80%或更多、84%或更多、85%或更多、88%或更多、90%或更多、92%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多， 99.5%或更多、99.7%或更多、99.8%或更多或99.9%或更多之同源性或相等性的多核苷酸彼此雜交、但具有較低之同源性或相等性之多核苷酸不彼此雜交的條件；或在相當於60°C、1X SSC、0.1% SDS，具體而言，60°C、0.1X SSC、0.1% SDS，更具體而言68°C、0.1X SSC、0.1% SDS之溫度及鹽濃度下進行一次，具體而言，進行兩次或三次清洗的條件，其係用於典型的南方雜交法 (Southern hybridization)之清洗條件。
雖然根據雜交的嚴密性允許鹼基之間的不匹配(mismatches)，但雜交要求兩個核酸具有互補序列。術語“互補(complementary)”使用於描述能夠相互雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，關於DNA，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本發明之多核苷酸亦可包括實質上相似的核酸序列以及與整個序列互補的經分離的核酸片段。
具體而言，可使用包括T m值為55°C下的雜交步驟的雜交條件及上述條件，來檢測與本發明之多核苷酸具有同源性或相等性之多核苷酸。T m值可為60°C、63°C或65°C，但並不限於此，其可由本技術領域中具通常知識者根據目的予以合適調整。
雜交多核苷酸的合適嚴密性取決於多核苷酸的長度和互補程度，並且其變數是所屬技術領域中眾所周知的（例如，Sambrook, J. et al.， 見上文）。
編碼本發明之突變5′UTR的突變多核苷酸可調控編碼目標蛋白質之多核苷酸轉化為蛋白質的轉譯，該目標蛋白質可操作地連接至該多核苷酸。
例如，目標蛋白質可為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，但不限於此，並且編碼本發明之突變5′UTR的多核苷酸可以普遍使用於下述目的：調控編碼各種目標蛋白質之多核苷酸轉化為蛋白質的轉譯。
本發明的另一個態樣提供一種突變多核苷酸，其包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變。
突變多核苷酸、SEQ ID NO： 1 的鹼基序列及突變 5′UTR 與上述相同。
如本文所使用，術語“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)”是一種促進將碳酸氫鹽加入磷酸烯醇丙酮酸中以形成草醯乙酸鹽(oxaloacetate)的酶，草醯乙酸鹽是一種4-碳化合物和無機磷酸鹽，並且對進入TCA循環的碳通量具有主要影響，並且編碼其的 ppc基因的表現程度可能影響微生物生產的聚羥基烷酸酯(PHA)中4-羥基丁酸酯(4HB)的含量。
可從已知的資料庫NCBI’s GenBank等獲得磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的胺基酸序列。
例如，本發明之磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可衍生自微生物，但不限於此。
在本發明中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可包括SEQ ID NO：26描述的胺基酸序列、可具有SEQ ID NO：26描述的胺基酸序列、或可由SEQ ID NO：26描述的胺基酸序列組成，或者可基本上由SEQ ID NO：26描述的胺基酸序列組成。
在本發明中，SEQ ID NO：26的胺基酸序列可包括具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%或99.9%或更多同源性或相等性的胺基酸序列。此外，顯而易見的是，任何具有胺基酸序列的蛋白質在序列的一部分中具有刪除(deletion)、修飾(modification)、取代(substitution)、保留取代(conservative substitution)或添加(addition)者，也可包括在本發明的範圍內，只要該胺基酸序列具有這樣的同源性或相等性，並且表現出與包括SEQ ID NO： 26的胺基酸序列的蛋白質相對應的效能。
其實例包括具有序列添加或刪除的蛋白質，其在自然發生突變、沉默突變(silent mutation)或保留取代(conservative substitution)時不改變在胺基酸序列的N末端、C末端及/或在胺基酸序列內的本發明之蛋白質的功能。
“保留取代(conservative substitution)”意指將一胺基酸以另一具有相似結構及/或化學特性的胺基酸取代。這種胺基酸取代通常可以基於殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性特性的相似性而發生。通常，保留取代可能幾乎不影響或不影響蛋白質或多肽的活性。
在本發明中，編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因可為 ppc基因。
可從已知資料庫NCBI’s GenBank 等獲得 ppc基因的鹼基序列。
例如，本發明的 ppc基因可衍生自微生物，但不限於此。
本發明的編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之多核苷酸可包括編碼SEQ ID NO：27描述的胺基酸序列的鹼基序列。作為本發明的示例，本發明之多核苷酸可具有、或可包括SEQ ID NO：27之序列。此外，本發明之多核苷酸可由SEQ ID NO：27之序列組成，或者可基本上由SEQ ID NO：27之序列組成。具體而言，可藉由SEQ ID NO：27之鹼基序列描述的多核苷酸來編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
在本發明之多核苷酸中，只要考慮到密碼子簡併性或旨在表現本發明之磷烯醇丙酮酸羧化酶的生物體中較佳的密碼子，就可在編碼區進行各種修飾。具體而言，本發明之多核苷酸可包括相對SEQ ID NO： 27之序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%、或99.9%或更多同源性或相等性之鹼基序列。
關於本發明之目的，相較於包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列且更包括編碼野生種5′UTR的鹼基序列的多核苷酸，包括編碼本發明之磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸可調控由其生產的聚羥基烷酸酯（PHA）的4-羥基丁酸酯（4HB）單體之含量。
例如，包括編碼本發明之磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸可將由其生產的PHA之4HB單體之含量調控在下述範圍內：基於PHA的總重量，3 wt%至21 wt%。例如，關於包括編碼本發明之磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，由其生產的PHA之4HB單體的含量可為基於PHA的總重量，約21 wt% 或更少，具體而言，20.3 wt% 或更少、20 wt% 或更少、19 wt% 或更少、18.7 wt% 或更少、18 wt% 或更少、17 wt% 或更少、16 wt% 或更少、15 wt% 或更少、14 wt% 或更少、13.9 wt% 或更少、13 wt% 或更少、12 wt% 或更少、11.6 wt% 或更少、11 wt% 或更少、10.7 wt% 或更少、10 wt% 或更少、9 wt% 或更少、8.3 wt% 或更少、8 wt% 或更少、7 wt% 或更少、6 wt% 或更少、5 wt% 或更少、4 wt% 或更少、或3.2 wt% 或更少，但不限於此。
如本文所使用，“聚羥基烷酸酯（polyhydroxyalkanoate；PHA）”是微生物中積累的聚酯基天然聚合物，是一種生物可降解的材料，不產生有毒廢物，並且已知為具有熱塑性和彈性等特性的環保聚合物。在PHA中，已知最具代表性的材料是使用3-羥基丁酸（3HB）單體聚合的聚-3-羥基丁酸酯（P3HB）。還有一種聚（3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸酯（P（3HB-co-4HB））共聚物，其係藉由加入4-羥基丁酸酯（4HB）單體來製備而成的，具有作為彈性體的特性，但不限於此。在本發明中，PHA可具體地為包括4HB單體的PHA共聚物，同時更包括一種或多種不同於4HB的單體，或者同時更包括彼此不同的兩種、三種、四種、五種、六種或更多種單體。更具體而言，該單體更包括與4HB單體一起作為與4HB不同的單體可為選自2-羥基丁酸、乳酸、乙醇酸、3-羥基丁酸酯（3HB）、3-羥基丙酸酯（3HP）、3-羥基戊酸酯（3HV）、3-羥基己酸酯（3HH）、3-羥基庚酸酯（3HHep）、3-羥基辛酸酯（3HO）、3-羥基辛酸酯（3HN）、 3-羥基癸酸酯（3HD）、3-羥基十一酸酯（3HDd）、4-羥基戊酸酯（4HV）、5-羥基戊酸酯（5HV）及6-羥基己酸酯（6HH）所組成的群組之一或多種單體。
特別是，由於PHA的物理特性隨4HB單體的添加比例變化，其可用於各種產品的生產，因此當可調整4HB單體的比例時，PHA可具產業上利用性。
具體而言，PHA的結晶(crystallization)程度（結晶度(crystallinity)）可根據4HB單體的添加比例而變化，更具體而言，當4HB單體的含量增加時，結晶度降低，並且PHA表現出非晶形 (amorphous)特性而不是半結晶(semi-crystalline)性，這可能會降低加工特性。因此，藉由維持4HB單體的合適含量來保持PHA的可加工性很重要。
因此，藉由將PHA之4HB單體含量調控在基於PHA總重量為3 wt%至21 wt%的範圍內，本發明的包含編碼磷烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸可生產具有半結晶特性之加工性能優異的PHA。
本發明的又一態樣可提供：一種編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；一種突變多核苷酸，包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列；或包括其之載體。
突變多核苷酸、SEQ ID NO： 1 之鹼基序列和突變 5′UTR 與上述相同。
該載體可為用於在宿主細胞中表現目標多核苷酸的表現載體(expression vector)，但不限於此。
本發明的載體可包括：包括可操作地連接至合適的表現調節區(或表現調控序列)的目標多核苷酸之鹼基序列的DNA建構體，使得目標多核苷酸，亦即本發明的更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列的突變多核苷酸，可在合適的宿主中表現。表現調節區可包括能夠啟動轉錄的啟動子、用於調控轉錄的任何操作子序列、編碼合適RBS的序列、以及調控轉錄和轉譯之終止的序列。載體可轉化為合適的宿主細胞，然後可獨立於宿主基因組進行複製或發揮功能，或者可整合到基因組本身中。
本發明中使用的載體沒有特別限制，但可使用本領域已知的任何載體。常用載體的例子可包括天然或重組質體（plasmid）、黏接質體（cosmid）、病毒、及噬菌體（bacteriophage）。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等作為噬菌體載體或黏接質體載體，而可使用pDZ系統、pBR系統、pUC系統、pBluescript II系統、pGEM系統、pTZ系統、pCL系統、pET系統等作為質體載體。具體而言，可使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC載體等。
例如，通過用於細胞內染色體插入之載體，可將目標多核苷酸插入染色體。 將多核苷酸插入染色體可用本技術領域中已知的任何方法進行，例如同源重組，但不限於此。該載體可更包括用於確認染色體插入的選擇標記。該選擇標記用於選擇通過載體轉化的細胞，即用於確認目標核酸分子的插入，並且可使用賦予可選擇的表型的標記，該等表型係例如抗藥性(resistance)、營養缺陷性(auxotrophy)、細胞毒性劑的抗性(resistance to cytotoxic agents)或表面多肽的表現。在使用選擇劑處理的環境中，只有表現選擇標記的細胞存活或表現出其它表型性狀，因此可選擇出轉化細胞。
如本文所使用，述語“轉化(transformation)”意指將包含目標多核苷酸的載體導入宿主細胞或微生物，使得該多核苷酸可在宿主細胞中表現。轉化後的多核苷酸可藉由插入宿主細胞的染色體中予以定位，也可以定位於染色體外，只要其可以在宿主細胞中表現。該多核苷酸包括編碼目標多肽的DNA及/或RNA。 該多核苷酸可以以任何形式被導入，只要其可被導入宿主細胞並表現。例如，多核苷酸可以表現匣(expression cassette)的形式導入宿主細胞，該表現匣是包含自主表現所需的所有元素的基因建構體。表現匣通常包括可操作地連接至多核苷酸的啓動子、轉錄終止信號、核糖體結合位點和翻譯終止信號。表現匣的形式可為能夠自我複製的表現載體。此外，所述多核苷酸可以以其自身的形式導入宿主細胞，並可操作地與在宿主細胞中表現所需的序列連接，但不限於此。
此外，術語“可操作地連接(operably linked)”是指本發明的更包括編碼突變5'UTR的鹼基序列的突變多核苷酸的鹼基序列功能性連接至啟動子序列，該啟動子序列啟動及介導該更包括編碼突變5'UTR的鹼基序列的突變多核苷酸的表現。
在本發明中，編碼突變5′UTR的鹼基序列，即編碼突變5′UTR的突變多核苷酸可調控編碼目標蛋白質的多核苷酸轉化為蛋白質的轉譯，該目標蛋白質可操作地連接至該多核苷酸。例如，目標蛋白質可為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，但不限於此。其可以普遍使用於調控編碼各種目標蛋白質的多核苷酸轉化為蛋白質的轉譯之目的。
本發明的又一態樣可提供一種生產聚羥基烷酸酯的微生物，該微生物包括：編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1的鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列。
本發明的微生物可包括：選自本發明的編碼突變5′UTR的突變多核苷酸所組成群組之一者或多者，其中SEQ ID NO: 1的鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼該突變5′UTR的鹼基序列；或包括其之載體。
如本文所使用，術語 “微生物(microorganism) (或菌株(strain) )” 包括所有野生種微生物或天然或人工基因修飾微生物，而且其可為其中特定機制由於外來基因的插入或內源基因的活性增強或失活而弱化或強化的微生物，而且其可為包括用於表現目標多核苷酸的基因修飾的微生物。該微生物可為大腸桿菌屬(genus Escherichia)的一種微生物。具體而言，該微生物可為大腸桿菌( Escherichia coli)。
本發明的菌株可具有生產PHA之能力。
本發明的菌株可為藉由下述所製備的重組菌株：向天然野生種微生物、未修飾微生物或生產PHA的微生物導入待轉錄至本發明之突變5′UTR的突變核酸分子、或包括待轉錄至突變5′UTR之突變核酸分子的編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之突變基因。
如本文所使用，“未修飾微生物(unmodified microorganism)”不排除包括可能天然發生於微生物中的突變的菌株，並且可為野生種菌株或天然菌株本身，或者可為由於自然或人為因素引起的遺傳變異而改變性狀之前的菌株。例如，未修飾微生物可為未導入或尚未導入本發明的編碼突變5′UTR的突變多核苷酸、或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列於其中的菌株。術語 “未修飾微生物”可與“修飾前菌株(strain before being modified)”、“修飾前微生物(microorganism before being modified)”、 “未變性菌株(unvaried strain)”、 “未修飾菌株(unmodified strain)”、“未變性微生物(unvaried microorganism)”或“參考微生物(reference microorganism)”互換使用。
關於本發明之目的，相較於表現包括待轉錄至野生種5′UTR之核酸分子的編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的菌株，本發明的菌株可將由其生產的聚羥基烷酸酯的4HB單體的含量調控在基於PHA總重量之3 wt%至21 wt%的範圍內。
如另一示例，在本發明的重組微生物中，可額外強化或弱化PHA生物合成途徑中某些蛋白質的活性。
在本發明的微生物中，突變多核苷酸、SEQ ID NO： 1之鹼基序列、突變5′UTR和PHA與其它具體實施例中所描述的相同。
本發明的又一個態樣提供一種生產PHA的方法，該方法包括在培養基中培養生產PHA的微生物的步驟，該微生物包括：編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列。
本發明的生產PHA之方法可包括在培養基中培養微生物的步驟，該微生物包括從編碼突變5′UTR的突變多核苷酸中選擇的任意一種或多種，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼該突變5′UTR的鹼基序列；或包含其之載體。
如本文所使用，術語 “培養(culturing)”意指在合適控制的環境條件下生長本發明的微生物。可根據本領域已知的合適培養基和培養條件進行本發明的培養過程。本技術領域中具通常知識者可根據所選擇的微生物容易地調整和使用這樣的培養過程。具體而言，培養可為批次型(batch type)、連續型(continuous type)及/或批次餵料型(fed-batch type)，但不限於此。
如本文所使用，術語 “培養基(medium)”意指含有以培養本發明微生物所需的營養素為主要成分的混合物質，且該培養基提供生存和發育不可或缺的營養素、生長因子等，並包括水。具體而言,作為本發明微生物培養用的培養基及其它培養條件，只要是通常用於培養微生物的培養基，就可不受特別限制地使用任何培養基。本發明的微生物可在含有合適碳源、氮源、磷源、無機化合物、胺基酸及/或維生素等的一般培養基中培養，同時在好氧條件下控制溫度、酸鹼度等。
在本發明中，碳源包括碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等；甘露醇、山梨醇等糖醇；有機酸如丙酮酸、乳酸、檸檬酸等；胺基酸如谷氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等等。可使用天然有機營養素，例如澱粉水解物，糖蜜，黑糖蜜，米糠，木薯，甘蔗渣和玉米浸泡液。具體而言，可使用碳水化合物如葡萄糖和滅菌預處理的糖蜜（即糖蜜轉化為還原糖），並且可不受限制地以各種方式使用適量的其它碳源。這些碳源可單獨使用，也可使用這些碳源的兩種或更多種的組合，但不限於此。
作為氮源，可使用無機氮源如氨、硫酸銨、氯化銨、醋酸銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨等；以及谷氨酸、蛋氨酸、谷氨醯胺等胺基酸等有機氮源，蛋白腖、NZ-胺、肉類萃取物、酵母萃取物、麥芽萃取物、玉米浸泡液、酪蛋白水解物、魚或其分解產物、脫脂豆餅或其分解產物等。這些氮源可單獨使用，也可使用這些氮源的兩種或更多種的組合，但不限於此。
該磷源可包括磷酸單鉀、磷酸二鉀或與之相對應的含鈉鹽。作為該無機化合物，可使用氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣等。 除這些化合物外，還可含有胺基酸、維他命及/或合適的前驅物等。可分批或連續地將這些成分或前驅物添加到培養基中，但並不限於此。
在培養本發明的微生物時，可藉由在培養基中合適添加氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸等化合物來調整培養基的pH。 在培養過程中，可使用脂肪酸聚二醇酯等消泡劑抑制發泡。此外，為了維持培養基的好氧狀態，可向培養基內注入氧氣或含氧氣體，或者為了維持厭氧狀態(anaerobic)和微好氧(microaerobic)狀態，可不注入氣體或可注入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體，但不限於此。
在本發明的培養物中，培養溫度可保持在20°C至45°C，具體而言，保持在25°C至40°C，並且可培養微生物約10小時至約160小時，但不限於此。
由本發明的培養物生產的PHA可分泌到培養基中，或者可保留在細胞中。
本發明的生產PHA之方法可更包括製備本發明的微生物的步驟、製備用於培養微生物的培養基的步驟、或這些步驟的組合（以任何順序），例如在培養步驟之前。
本發明的生產PHA之方法可更包括從根據該培養的培養基（經受培養的培養基）或從菌株中回收PHA的步驟。在培養步驟之後，可更包括回收步驟(recovering step)。
根據本發明之培養微生物之方法，例如，批次(batch,)、連續(continuous)或批次餵料(fed-batch)培養法，回收可為通過本技術領域眾知的收集目標PHA之合適方法。可使用例如，離心、過濾、使用結晶蛋白沉澱劑處理（鹽析）、萃取、超音波分解(ultrasonic disintegration)、超過濾(ultrafiltration)、透析(dialysis)、各種形式的層析法如分子篩層析法（凝膠過濾）、吸附層析法(adsorption chromatography)、離子交換層析法(ion-exchange chromatography)、親和力層析法(affinity chromatography)等，HPLC或其等之組合。可通過本領域已知的合適方法，從培養基或微生物中回收目標PHA。
本發明的生產PHA之方法可更包括純化步驟。純化可通過本領域已知的合適方法進行。例如，當本發明的生產PHA之方法同時包括回收步驟和純化步驟時，回收步驟及純化步驟可連續或不連續地進行，而不管順序如何，或者可同時進行或組合成一個步驟進行，但不限於此。
關於本發明之目的，相較於包括要轉錄成野生種5′UTR的核酸分子的編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，由本發明的菌株表現之包括待轉錄至突變5′UTR的突變核酸分子的編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的突變基因可將由其生產的聚羥基烷酸酯的4HB單體之含量調控在基於PHA總重量之3%至21 wt%的範圍內。
在本發明的方法中，突變多核苷酸、SEQ ID NO: 1之鹼基序列、突變5′UTR、PHA等與上述其它實施例中所描述相同。
本發明的又一個態樣提供一種用於生產PHA之組成物，該組成物包括生產PHA的微生物，該微生物包括編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1的鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列；培養微生物之培養基；或其兩者或更多者的組合。
本發明的組成物可更包括任意合適的賦形劑，其通常用於生產PHA的組成物中。此等賦形劑可為：例如，防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等滲劑等，但不限於此。
本發明的又一個態樣提供一種微生物在生產PHA之用途，該微生物包括編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR之鹼基序列。
突變多核苷酸、SEQ ID NO: 1的鹼基序列、突變5′UTR、PHA等與上述其它實施例所述相同。
[有利功效]
本發明的5′-非轉譯區（5′UTR）突變序列可用於控制TCA循環的碳通量，特別是控制生產聚羥基烷酸酯（PHA）的微生物的4-羥基丁酸（4HB）之含量，從而提供具有所需物理特性的PHA。 [發明模式]
在下文中，將參照示例性實施例更詳細地描述本發明。然而，以下示例性實施例只是用於說明本發明的較佳實施例，因此本發明的範圍不旨在由此受到限制。同時，本發明技術領域或類似技術領域中具通常知識者可充分理解並易於實現本說明書中未描述的技術內容。此外，在本說明書中，引用了許多論文和專利文獻，並註明所引用文獻的出處。所引用論文和專利文獻中揭露的全部內容通過引用併入本說明書，以便更清楚地描述本發明所屬技術領域的水準和本發明的內容。
實例 1 ：建構用於將突變導入編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的 ppc 基因的 5′- 非轉譯區（ 5′UTR ）及篩選的資料庫藉由以下方法製備用於建構 ppc基因的5′UTR突變資料庫的模板載體。使用作為模板的大腸桿菌MG1655之染色體及SEQ ID NOS:13和14的引子對，擴增野生種 ppc基因之5′UTR序列。PCR條件重複25次：在95°C變性(denaturation)20秒，在56°C下退火40秒，在72°C下擴增30秒。對於基於螢光的篩選，使用SEQ ID NOS: 15和16的引子對擴增啓動子下游的待表現之螢光蛋白。重複25次PCR條件：在95℃下變性20秒，在56℃下退火40秒，在72℃下擴增1分鐘。通過以組裝方式複製兩種經擴增之產物及經BamH1限制酶（NEB）處理的pCL1920載體來建構模板載體。
為了使用對應載體來製備 ppc基因的5′UTR突變資料庫，使用SEQ ID NOS：13和17的引子對從所製備的模板載體中擴增隨機序列。PCR條件重複25次：在95°C變性20秒，在56°C下退火40秒，在72°C下擴增30秒。使用SEQ ID NOS：18和19的引子對來擴增模板載體的剩餘序列，並藉由以組裝方式複製經擴增的兩個片段而獲得資料庫(library)載體。PCR條件重複25次：在95°C變性20秒，在56°C下退火40秒，在72°C下擴增3分鐘。使用大腸桿菌DH5α進行複製，並使用含有75 mg/L的觀黴素（Spectinomycin）的LB培養基進行菌株選擇。對於DNA擴增，使用AccuPower® ProFi Taq PCR 預混料（Bioneer）。
在含有500μL的LB培養基和補充有75mg / L的觀黴素(spectinomycin)的96-孔板(96-well plate)中，播種藉由將所建構的資料庫載體轉化為大腸桿菌MG1655所獲得的單菌落，並在37°C下培養16小時。用500μL的聚羥基烷酸酯(PHA)生產培養基(美國發明專利US 10323261 B2)稀釋1/100的飽和培養基，在細胞於培養基中充分飽和後測定螢光。此時，使用具有野生種 ppc基因的5′UTR序列的模板載體作為對照。使用多標籤讀板儀（PerkinElmer）測量螢光和OD 600，並藉由除以OD 600對所測量的螢光值進行標準化（normalized）。
結果，共識別了合計11株不同表現水準的菌株，分離出各菌株的質體，各自命名為載體ver.1至載體ver.11，並測序以識別突變序列。
上述使用的質體如下表1所示，引子序列係如下表2所示。
上述經識別的載體 ver. 1至載體 ver. 11 的突變序列係如下表 3 所示。
[表 1]
質體名稱 基因型
模板載體 pCL1920-Pppc-gfp, Sp R
資料庫載體 pCL1920-Pppc*-gfp, Sp R
載體 ver. 1 pCL1920-Pppc_v1-gfp, Sp R
載體 ver. 2 pCL1920-Pppc_v2-gfp, Sp R
載體 ver. 3 pCL1920-Pppc_v3-gfp, Sp R
載體 ver. 4 pCL1920-Pppc_v4-gfp, Sp R
載體 ver. 5 pCL1920-Pppc_v5-gfp, Sp R
載體 ver. 6 pCL1920-Pppc_v6-gfp, Sp R
載體 ver. 7 pCL1920-Pppc_v7-gfp, Sp R
載體 ver. 8 pCL1920-Pppc_v8-gfp, Sp R
載體 ver. 9 pCL1920-Pppc_v9-gfp, Sp R
載體 ver. 10 pCL1920-Pppc_v10-gfp, Sp R
載體 ver. 11 pCL1920-Pppc_v11-gfp, Sp R
[表2]
SEQ ID NO: 序列名稱 序列 (5′ -＞ 3′)
13 引子1 CGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGTCGGATGCGATACTTGCGCATC
14 引子2 CTCCAGTGAAAAGTTCTTCTCCTTTACTGACATTACTACGCAATGCGGAATATTG
15 引子3 GAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG
16 引子4 GACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGCTCAAATGCCTGAGGTTTCAG
17 引子5 GCGGAATATTGTTCGTTCATATTNNNNNNNNNACCCCATC
18 引子6 ATGAACGAACAATATTCCGC
19 引子7 CCCGGGTACCGAGCTCGAATTCAC
[表3]
SEQ ID NO: 名稱 5′UTR序列 (5′ -＞ 3′)
1 Pppc (WT) GATAAGATGGGGTGTCTGGGGTAAT
2 Pppc_v1 GATAAGATGGGGTGTC GGGGGTAAT
3 Pppc_v2 GATAAGATGGGGTGTCTG AGG GAAT
4 Pppc_v3 GATAAGATGGGGTGTC GG AGG GAAT
5 Pppc_v4 GATAAGATGGGGTGT ATGGGG GAAT
6 Pppc_v5 GATAAGATGGGGTG GC GG ACGTAAT
7 Pppc_v6 GATAAGATGGGGTGTCTGGGG GAAT
8 Pppc_v7 GATAAGATGGGGTGTC GGGGG GAAT
9 Pppc_v8 GATAAGATGGGGTG GAGG ACG GAAT
10 Pppc_v9 GATAAGATGGGGTG GC GG GGG GAAT
11 Pppc_v10 GATAAGATGGGGTG GATGGGG GAAT
12 Pppc_v11 GATAAGATGGGGTGTC GGG CGTAAT
實例2：建構導入突變序列的菌株及分析所生產的PHA中的單體含量 基於生產聚（3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸酯（P（3HB-co-4HB））的菌株，製備了生產PHA的菌株，其中導入了實例1中所識別的突變RBS序列。作為親代菌株(parent strain)，使用了生產P（3HB-co-4HB）的菌株，其中P（3HB-co-4HB）中的4HB含量為約20%（美國發明專利US 10323261 B2）。首先，分別使用SEQ ID NOS：20和21的引子對來擴增經識別序列的突變序列。PCR條件重複25次：在95°C下變性20秒，在56°C下退火40秒，在72°C下擴增30秒。為了使用含有選擇標記的線性DNA片段進行基因重組，使用SEQ ID NOS:22和23之引子對擴增att-Kan R-att DNA片段。PCR條件重複25次:在95℃下變性20秒，在56℃下退火40秒，在72℃下擴增2分鐘。為了將該片段連接至先前擴增的序列，使用SEQ ID NOS:24和25之引子對進行重疊之PCR。重複25次PCR條件：在95℃下變性20秒，在56℃下退火40秒，在72℃下擴增2分15秒。將擴增的DNA轉化成生產PHA的菌株後，在含有50毫克/升之卡那黴素的選擇培養基中選擇導入了RBS突變的菌株。對於DNA擴增，使用AccuPower® ProFi Taq PCR預混料(Bioneer)。
引子序列係如下表4所示。
[表4]
SEQ ID NO: 序列名稱 序列(5′ -＞ 3′)
20 引子8 CTTGATGGTTTCTCCCAGCACTTTGCCGAGCATACTGACATTACTACGCAATGCGGAATATTG
21 引子9 CATAGCTGTGAAGCAGCTCCAGCCTACACTTAACATTTCCATAAGTTACG
22 引子10 CTTATGGAAATGTTAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
23 引子11 AATAATGTCGGATGCGATACTTGCGCATCTTATCCGACCTACACCTTTGGTGTTACTTGGGGCGATTTTATGGGAATTAGCCATGGTCC
24 引子12 CTTGATGGTTTCTCCCAGCAC
25 引子13 AATAATGTCGGATGCGATACTTG
為了評估導入RBS突變的11種菌株的PHA生產能力，將它們播種在LB培養基中並培養至充分飽和。此後，將每個菌株播種在含有25mL之含有5%葡萄糖的PHA生產培養基的250 mL角擋板燒瓶中，並在37°C下以230rpm震盪培養5小時，並在35°C下震盪培養43小時。培養完成後，使用氣相層析法分析PHA中的細胞內PHA含量和4HB含量。特定的培養條件和分析條件參考先前使用的條件（美國發明專利US 10323261 B2）。
如下表5所示，係導入突變序列的生產PHA菌株的4HB含量。
[表5]
序列名稱 PHA (mg) 4HB 含量(wt%)
Pppc 12.3 21.2%
Pppc_v1 11.9 20.3%
Pppc_v2 12.8 13.9%
Pppc_v3 13.8 18.7%
Pppc_v4 13.5 12.0%
Pppc_v5 7.7 8.3%
Pppc_v6 9.8 11.6%
Pppc_v7 12.1 10.7%
Pppc_v8 12.9 16.0%
Pppc_v9 13.2 9.0%
Pppc_v10 14.2 5.0%
Pppc_v11 11.3 3.2%
如表5所示，在具有野生種RBS序列的對照菌株中，PHA中的4HB含量為21.2%，而在具有突變RBS序列的突變菌株中，PHA中的4HB含量從20.3%下降到3.2%。因此，證實藉由將突變RBS序列導入生產PHA的菌株中，可以有效控制PHA單體的含量。
在導入突變RBS序列的11種菌株中，Pppc_v10菌株被命名為CB02-6588，並於2022年12月9日寄存在《布達佩斯條約》的國際寄存單位之韓國微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms；KCCM)，並指定寄存編號為KCCM13300P。
基於上述說明，本技術領域中具通常知識者將理解本發明可在不改變其技術精神或本質特徵的情況下以不同的具體形式予以實現。因此，應當理解上述實施例不是限制性的，而是在所有態樣皆屬說明性的。發明的範圍由所附的申請專利範圍界定，而不是由其前面的描述界定，故落入請求項的界限和邊界、或此類界限和邊界的均等内容內的所有修改和修飾皆旨在被申請專利範圍所涵蓋。
[存取編號] 寄存機構名稱：韓國微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms) 寄存編號：KCCM13300P 寄存日期：2022.12.09
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無。

Claims (11)

  1. 一種編碼突變 5′-非轉譯區 （5′UTR） 的突變多核苷酸，其中 SEQ ID NO： 1 之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變。
  2. 一種包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR的鹼基序列，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變。
  3. 如請求項1或2所述之突變多核苷酸，其中該突變5′UTR在對應於SEQ ID NO: 1之鹼基序列中位置15至22的鹼基的任一個或多個鹼基中具有突變。
  4. 如請求項1或2所述之突變多核苷酸，其中該突變5′UTR包括選自SEQ ID NOS：2至12之任一個或多個鹼基序列。
  5. 如請求項1所述之突變多核苷酸，其中該編碼突變5′UTR的突變多核苷酸調控編碼目標蛋白質之多核苷酸轉化為蛋白質的轉譯，該目標蛋白質可操作地連接至該多核苷酸。
  6. 如請求項5所述之突變多核苷酸，其中該目標蛋白質為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
  7. 如請求項2所述之突變多核苷酸，其中相較於包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列且更包括編碼野生種5′UTR之鹼基序列的多核苷酸，該包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸將由其生產的聚羥基烷酸酯的4-羥基丁酸（4HB）單體含量調控在基於PHA（聚羥基烷酸酯）總重量之3 wt%至21 wt%的範圍內。
  8. 一種生產聚羥基烷酸酯之微生物，該微生物包括：編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR之鹼基序列。
  9. 如請求項8所述之微生物，其中由該微生物生產的聚羥基烷酸酯的4-羥基丁酸（4HB）單體含量被調控在基於PHA總重量之3 wt%至21 wt%的範圍內。
  10. 一種生產聚羥基烷酸酯之方法，該方法包括在培養基中培養生產聚羥基烷酸酯之微生物的步驟，該微生物包括：編碼突變5′UTR的突變多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1之鹼基序列中的一個或多個鹼基發生突變；或包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸，該突變多核苷酸更包括編碼突變5′UTR之鹼基序列。
  11. 如請求項10所述之方法，其中相較於包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列且更包括編碼野生種5′UTR之鹼基序列的多核苷酸，該包括編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之鹼基序列的突變多核苷酸將由其生產的4-羥基丁酸（4HB）單體含量調控在基於PHA總重量之3 wt%至21 wt%的範圍內。
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