CN117980475A - 编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的5’utr变体序列及其用途 - Google Patents

编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的5’utr变体序列及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了一种编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的突变基因，该基因包括突变5’‑非翻译区(5’UTR)，还提供了包括该基因的生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的微生物，以及使用该微生物生产PHA的方法。

Description

编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的5’UTR变体序列及其 用途
[技术领域]
本公开涉及一种编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的突变基因，该基因包括突变5’-非翻译区(5’UTR)，还涉及包括该基因的生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的微生物，以及使用该微生物生产PHA的方法。
[背景技术]
由于基于石油的难降解塑料日益累积，环境污染问题层出不穷，人们开始关注用可生物降解的生物塑料来替代这些难降解塑料。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种生物塑料材料，是一种在微生物中累积的基于聚酯的天然聚合物。PHA是一种可生物降解材料，不产生有毒废物，并且已知是一种具有热塑性和弹性等的环境友好型聚合物。在PHA中，最具代表性的已知材料是使用3-羟基丁酸酯(3HB)单体聚合的聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)。P3HB的物理性质与聚丙烯相似，聚丙烯是一种合成树脂，用于汽车零件、家电零件等。由于P3HB可以相对容易地由微生物合成，所以已经对其生产进行了许多商业研究。然而，P3HB由于高结晶度而具有脆性，并且由于在其熔点附近分解而难以加工，因此存在局限性。因此，已经开展了通过与新材料共混或单体共聚合来生产PHA共聚物的研究。其中，聚(3-羟基丁酸酯-共-4-羟基丁酸酯(P(3HB-co-4HB))共聚物是一种由于添加4-羟基丁酸酯(4HB)单体而具有弹性体特性的材料。PHA的物理性质根据4HB单体的添加比例而发生变化，并且PHA可以用于生产各种产品。因此，PHA作为一种颇具前途的可生物降解聚合物材料而备受关注。
[公开内容]
[技术问题]
本公开人已经鉴定了编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的突变基因，该突变基因包括突变5’非翻译区(5’UTR)，并且证实了在包括该基因的生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的微生物中生产PHA，从而完成了本公开。
[技术解决方案]
本公开的一个目的是提供一种编码突变5’-非翻译区(5’UTR)的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变。
本公开的另一个目的是提供一种突变多核苷酸，其包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变。
本公开的另一个目的是提供一种生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的微生物，该微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列。
本公开的另一个目的是提供一种生产PHA的方法，该方法包括在培养基中培养生产PHA的微生物的步骤，该微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列。
本公开的另一个目的是提供一种用于生产PHA的组合物，该组合物包括生产PHA的微生物，该微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列；培养该微生物的培养基；或者其中两种或更多种的组合。
本公开的另一个目的是提供微生物在PHA生产中的用途，该微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列。
下面将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每项描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。也就是说，本公开中公开的各个元素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受下面所述的具体描述的限制。此外，本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的公开内容的具体实施方案的许多等同物。此外，这些等同物应被解释为落入本公开的范围内。
本公开的一个方面提供了一种编码突变5’-非翻译区(5’UTR)的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变。
如本文所用，术语“5’-非翻译区(5’UTR)”是指存在于mRNA转录本的5’端但不翻译成氨基酸的区域。mRNA翻译成蛋白质始于30S核糖体亚单位与5’UTR的结合。具体地，当30S核糖体亚单位中的16S rRNA(16S核糖体RNA)与5’UTR内的RBS结合，tRNA识别并结合mRNA的起始密码子(AUG)时，翻译成蛋白质就开始了。已知5’UTR的核糖体结合位点和起始密码子存在于大约6至8个核苷酸之外。
在本公开中，5’UTR包括这样的序列，其中该序列与16S rRNA的3’端序列互补，即Shine-Dalgarno序列是保守的，并且Shine-Dalgarno序列之前及之后的序列被修饰。
“修饰的5’UTR序列”或“修饰的5’UTR”是指组成5’UTR的碱基序列中的一个或多个碱基被修饰，并且此类修饰可以包括碱基的取代、添加、缺失或倒位。作为代表性实例，5’UTR可以包括这样的序列，其中Shine-Dalgarno序列是保守的，并且存在于Shine-Dalgarno序列之前及之后的碱基序列中的一个或多个碱基通过取代、添加、缺失或倒位被修饰。
5’UTR可以包括核糖体结合位点(RBS)。
如本文所用，术语“核糖体结合位点(RBS)”是指存在于mRNA链内部的区域(结构)，核糖体直接与其结合，并且RBS能够启动翻译，或者是导致该区域被转录的DNA链的区域(结构)。大多数原核生物具有RBS，它是一个短序列，该短序列使得核糖体很容易识别并结合mRNA，靠近含有开放阅读框(ORF)的mRNA上起始密码子(通常为“AUG”)的5’上游。RBS包括与16S rRNA的3’端序列互补的序列，该序列称为Shine-Dalgarno序列。
本公开的突变5’UTR可以是这样的突变5’UTR，其中野生型5’UTR的SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变。
在本公开中，SEQ ID NO：1的碱基序列可以是编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的5’-非翻译区(5’UTR)。本公开的5’UTR可以包括SEQ ID NO：1的碱基序列、可以具有SEQID NO：1的碱基序列、可以由SEQ ID NO：1的碱基序列组成或可以基本上由SEQ ID NO：1的碱基序列组成。
SEQ ID NO：1的碱基序列可以包括与SEQ ID NO：1所述的碱基序列具有至少70％、75％、76％、80％、84％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更多同源性或同一性的碱基序列。此外，显而易见的是，在序列的一部分中具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加的任何碱基序列也可以包括在本公开的范围内，只要该碱基序列具有此类同源性或同一性并且表现出对应于5’UTR的功效。
具体地，本公开的5’UTR(其中一个或多个碱基发生突变)可以与“突变5’UTR”或“含有突变RBS的序列”互换使用，其中5’UTR中的RBS序列发生突变。
更具体地，本公开的突变5’UTR可以在对应于SEQ ID NO：1的碱基序列中第15至22位的碱基的任何一个或多个碱基中具有突变。例如，突变可以是指用不同于取代前碱基的碱基来取代特定碱基。
更具体地，本公开的突变5’UTR可以包括由选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：12中的任何一个描述的碱基序列。
此外，本公开的突变5’UTR可以具有或可以包括：与选自SEQ ID NO：2至SEQ IDNO：12的任何一个序列的整体具有70％或更多、75％或更多、76％或更多、80％或更多、84％或更多、85％或更多、88％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.5％或更多、99.7％或更多、99.9％或更多且小于100％同源性或同一性的碱基序列，条件是与编码野生型5’UTR的SEQ ID NO：1的序列相比，SEQ ID NO：2至12中的各个突变序列是固定的；或者可以包括、可以具有、可以由以下组成或可以基本上由以下组成：与选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：12的任何一个序列具有70％或更多、75％或更多、76％或更多、80％或更多、84％或更多、85％或更多、88％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.5％或更多、99.7％或更多、99.9％或更多且小于100％同源性或同一性的碱基序列，但不限于此。
此外，显而易见的是，在部分序列中具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加的任何突变5’UTR也可以包括在本公开的范围内，只要该碱基序列具有此类同源性或同一性并且表现出对应于本公开的突变5’UTR的功效。
如本文所用，“多核苷酸”是核苷酸的聚合物，其中核苷酸单体通过共价键连接为长链形状，多核苷酸是指具有预定或更长长度的DNA或RNA链。
如本文所用，术语“突变体”指由于一个或多个碱基的修饰而具有不同于修饰前碱基序列的碱基序列、但保持功能或性质的多核苷酸。通常可以通过修饰多核苷酸碱基序列的一个或多个碱基并评估修饰的多核苷酸的性质，来鉴定此类突变体。换言之，与修饰前的多核苷酸相比，突变多核苷酸的能力可以增加、不变或降低。突变多核苷酸可以与诸如变体、修饰、修饰的多核苷酸、修饰的基因、突变体、突变蛋白质、趋异(divergent)等术语互换使用，并且不限于此，只要该术语与变化的含义连用。
突变多核苷酸可以与其他序列或接头缀合，以便鉴定、纯化或合成。
如本文所用，术语“对应于”是指多核苷酸中所列位置的碱基，或与多核苷酸中所列碱基相似、相同或同源的碱基。识别对应位置的碱基可以是确定序列中的特定碱基，该序列是指特定序列。如本文所用，“对应区域”通常是指相关多核苷酸序列或参考多核苷酸序列中的相似或对应位置。
例如，将任何碱基序列与SEQ ID NO：1进行比对，基于此，碱基序列的每个碱基可以参考SEQ ID NO：1的碱基和对应碱基的数字位置进行编号。例如，如本公开中所述的序列比对算法可以通过与查询序列(也称为“参考序列”)中的碱基位置进行比较，来确定碱基位置或发生诸如取代、插入或缺失的修饰的位置。
对于此类比对，例如，可以使用Needleman–Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)、EMBOSS软件包的Needleman程序(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276–277)等，但不限于此，并且可以适当使用本领域已知的序列比对程序、成对序列比较算法等。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或碱基序列之间的相似程度，可以用百分比表示。术语“同源性”和“同一性”通常可以互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性由标准比对算法确定，并且由所用程序建立的默认空位罚分可以一起使用。基本上，同源或相同的序列通常能够在中等或高严格条件下与整个或部分序列杂交。显而易见的是，杂交也包括与多核苷酸杂交，该多核苷酸包括通用密码子或考虑到密码子简并性的密码子。
可以使用已知的计算机算法(诸如“FASTA”程序)，来确定任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，例如，在Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中使用默认参数。可替代地，可以使用Needleman–Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)来确定同源性、相似性或同一性，如在EMBOSS软件包的Needleman程序中所进行(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0版或更高)(包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,J MOLEC BIOL 215:403(1990))；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop编著,Academic Press,圣迭亚戈,1994；以及CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW可用于确定同源性、相似性或同一性。
可以通过比较序列信息来确定多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性，例如使用GAP计算机程序，诸如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443，如在例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所声称的。大体而言，GAP程序可以被定义为通过将相似对齐的符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短一个序列中的符号总数而获得的值。GAP程序的缺省参数可以包括：(1)二元比较矩阵(包括值1和0，1用于同一性，0用于非同一性)和Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵(或EDNAFULL(EMBOSS版本NCBI NUC4.4)取代矩阵)，如公开于Schwartz和Dayhoff编著,AtlasOf Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,第353–358页(1979)；(2)对于每个空位，罚分3.0，并且对于每个空位中的每个符号，附加0.10罚分(或者空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5)；以及(3)对于端部空位，没有罚分。
在本公开的多核苷酸中，考虑到密码子简并性或意图表达包括本公开的突变5’UTR的突变基因的生物体中优选的密码子，只要不改变包括本公开的突变5’UTR的突变基因的碱基序列，可以在编码区进行各种修饰。
此外，本公开的多核苷酸可以包括探针，该探针可以由已知基因序列制备，例如，没有限制的序列，只要该序列可以在严格条件下与本公开的多核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交。“严格条件”是指能使多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(参见Sambrook,J.等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory press,冷泉港,纽约,1989；Ausubel,F.M.等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,纽约,9.50-9.51,11.7-11.8)。严格条件的实例包括这样的条件：在该条件下，具有较高同源性或同一性的多核苷酸，即具有70％或更多、75％或更多、76％或更多、80％或更多、84％或更多、85％或更多、88％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.5％或更多、99.7％或更多、99.8％或更多、或99.9％或更多同源性或同一性的多核苷酸，彼此杂交，而具有较低同源性或同一性的多核苷酸不彼此杂交；或者在该条件下，在盐浓度和温度相当于60℃、1X SSC、0.1％ SDS，特别是60℃、0.1％ SSC、0.1％SDS，更特别是68℃、0.1X SSC、0.1％SDS，进行一次洗涤，特别是两次至三次洗涤，这些都是常规Southern杂交的洗涤条件。
杂交要求两个核酸具有互补序列，尽管根据杂交的严格性允许碱基之间错配。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开的多核苷酸也可以包括基本相似的核酸序列以及与整个序列互补的分离的核酸片段。
具体地，可以使用杂交条件来检测与本公开的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸，该杂交条件包括在55℃的Tm值和上述条件下的杂交步骤。Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的进行适当调整。
多核苷酸杂交的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，变量是本领域众所周知的(例如，Sambrook,J.等人，同上)。
编码本公开的突变5’UTR的突变多核苷酸可以调控编码与其操作性连接的靶蛋白的多核苷酸翻译成蛋白质。
例如，靶蛋白可以是磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，但不限于此，并且本公开的编码突变5’UTR的多核苷酸可以通用于调控编码各种靶蛋白的多核苷酸翻译成蛋白质的目的。
本公开的另一个方面提供了一种包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变。
突变多核苷酸、SEQ ID NO：1的碱基序列和突变5’UTR与上述相同。
如本文所用，术语“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶”是一种促进碳酸氢盐加成到磷酸烯醇丙酮酸上以形成草酰乙酸盐的酶，草酰乙酸盐是一种4碳化合物和无机磷酸盐，对进入TCA循环的碳通量具有主要影响，并且编码该酶的ppc基因的表达水平可以影响微生物生产的聚羟基脂肪酸酯(PHA)的4-羟基丁酸酯(4HB)含量。
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列可以从已知数据库NCBI的GenBank等中获得。
例如，本公开的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可以来源于微生物，但不限于此。
在本公开中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可以包括SEQ ID NO：26所述的氨基酸序列、可以具有SEQ ID NO：26所述的氨基酸序列、可以由SEQ ID NO：26所述的氨基酸序列组成，或可以基本上由该氨基酸序列组成。
在本公开中，SEQ ID NO：26的氨基酸序列可以包括与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更多同源性或同一性的氨基酸序列。此外，显而易见的是，具有在部分序列中缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可以包括在本公开的范围内，只要该氨基酸序列具有此类同源性或同一性，并且表现出与包括氨基酸序列SEQ ID NO：26的蛋白质对应的功效。
其实例包括在氨基酸序列的N末端、C末端和/或氨基酸序列内部具有不改变本公开蛋白质功能的序列添加或缺失、天然发生的突变、沉默突变或保守取代。
“保守取代”是指一个氨基酸被另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸取代。此类氨基酸取代通常基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。通常，保守取代可以几乎不影响蛋白质或多肽的活性，或不影响蛋白质或多肽的活性。
在本公开中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因可以是ppc基因。
ppc基因的碱基序列可以从已知数据库NCBI的GenBank等中获得。
例如，本公开的ppc基因可以来源于微生物，但不限于此。
本公开的编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的多核苷酸可以包括编码SEQ ID NO：27所述的氨基酸序列的碱基序列。例如，本公开的多核苷酸可以具有或可以包括SEQ ID NO：27的序列。此外，本公开的多核苷酸可以由SEQ ID NO：27的序列组成，或可以基本上由该序列组成。具体地说，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可以由SEQ ID NO：27的碱基序列所述的多核苷酸编码。
在本公开的多核苷酸中，考虑到密码子简并性或意图欲表达本公开的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的生物体中优选的密码子，只要磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列不改变，可以在编码区进行各种修饰。具体地，本公开的多核苷酸可以包括与SEQ ID NO：27的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更多同源性或同一性的碱基序列。
关于本公开的目的，与包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列并进一步包括编码野生型5’UTR的碱基序列的多核苷酸相比，本公开的包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸可以调控由其生产的聚羟基脂肪酸酯(PHA)的4-羟基丁酸酯(4HB)单体的含量。
例如，按PHA的总重量计，本公开的包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸可以将由其生产的PHA的4HB单体的含量调控在3重量％至21重量％的范围内。例如，按PHA的总重量计，关于本公开的包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，由其生产的PHA的4HB单体的含量可以是约21重量％或更少，具体地，20.3重量％或更少、20重量％或更少、19重量％或更少、18.7重量％或更少、18重量％或更少、17重量％或更少、16重量％或更少、15重量％或更少、14重量％或更少、13.9重量％或更少、13重量％或更少、12重量％或更少、11.6重量％或更少、11重量％或更少、10.7重量％或更少、10重量％或更少、9重量％或更少、8.3重量％或更少、8重量％或更少、7重量％或更少、6重量％或更少、5重量％或更少、4重量％或更少、或3.2重量％或更少，但不限于此。
本文所用的“聚羟基脂肪酸酯(PHA)”是一种在微生物中累积的聚酯基天然聚合物，是一种可生物降解材料，不产生有毒废物，并且已知是一种具有热塑性和弹性等的环境友好型聚合物。在PHA中，最具代表性的已知材料是使用3-羟基丁酸酯(3HB)单体聚合的聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)。还有一种聚(3-羟基丁酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))共聚物，其通过添加4-羟基丁酸酯(4HB)单体来制备，以具有弹性体的特性，但不限于此。在本公开中，PHA可以具体地是PHA共聚物，其包括4HB单体，同时还包括一种或多种不同于4HB的单体，或者同时还包括两种、三种、四种、五种、六种或更多种彼此不同的单体。更具体地，作为不同于4HB的单体，与4HB单体一起进一步被包括的单体可以是选自2-羟基丁酸酯、乳酸、乙醇酸、3-羟基丁酸酯(3HB)、3-羟基丙酸酯(3HP)、3-羟基戊酸酯(3HV)、3-羟基己酸酯(3HH)、3-羟基庚酸酯(3HHep)、3-羟基辛酸酯(3HO)、3-羟基辛酸酯(3HN)、3-羟基癸酸酯(3HD)、3-羟基十一酸酯(3HDd)、4-羟基戊酸酯(4HV)、5-羟基戊酸酯(5HV)和6-羟基己酸酯(6HH)的一种或多种单体。
特别地，由于PHA的物理性质根据可用于生产各种产品的4HB单体的添加比例而变化，当4HB单体的比例可调控时，这在工业上可能是有用的。
具体地，PHA的结晶程度(结晶度)可以根据4HB单体的添加比例而变化，更具体地，当4HB单体的含量增加时，结晶度降低，PHA表现出无定形性质而非半结晶性质，这可能降低加工性能。因此，通过保持适当的4HB单体含量来保持PHA的加工性能极为重要。
因此，按PHA的总重量计，通过将PHA的4HB单体含量调控在3重量％至21重量％的范围内，本公开的包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸可以生产具有半结晶性质和优异加工性能的PHA。
本公开的另一方面可以提供一种编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ IDNO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列；或包括其的载体。
突变多核苷酸、SEQ ID NO：1的碱基序列和突变5’UTR与上述相同。
载体可以是用于在宿主细胞中表达靶多核苷酸的表达载体，但不限于此。
本公开的载体可以包括DNA构建体，该DNA构建体包括与合适的表达调控区(或表达调控序列)操作性连接的靶多核苷酸的碱基序列，使得靶多核苷酸(即，本公开的进一步包括编码突变5’UTR的碱基序列的突变多核苷酸)可以在合适的宿主中表达。表达调控区可包括能够启动转录的启动子、任何调控转录的操纵子序列、编码合适RBS的序列以及调控转录和翻译终止的序列。载体可以被转化到合适的宿主细胞中，然后可以独立于宿主基因组进行复制或发挥功能，或者可以被整合到基因组本身中。
本公开中使用的载体没有特别限制，但是可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可用作噬菌体载体或粘粒载体，pDZ系统、pBR系统、pUC系统、pBluescript II系统、pGEM系统、pTZ系统、pCL系统、pET系统等可用作质粒载体。具体地，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体等。
例如，靶多核苷酸可以通过用于细胞内染色体插入的载体插入到染色体中。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入到染色体中，例如同源重组，但不限于此。载体还可以包括用于确认染色体插入的选择标志物。选择标志物用于选择用载体转化的细胞，即用于确认靶核酸分子的插入，并且可以使用赋予可选择表型(诸如药物抗性、营养缺陷型、细胞毒性剂抗性或表面多肽表达)的标志物。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标志物的细胞存活或表现出其他表型特征，因此可以选择转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”是指将包括靶多核苷酸的载体引入宿主细胞或微生物中，使得多核苷酸可以在宿主细胞中表达。可以通过将转化的多核苷酸插入到宿主细胞的染色体中或位于染色体之外(只要它可以在宿主细胞中表达)，来定位转化的多核苷酸。多核苷酸包括编码靶多肽的DNA和/或RNA。多核苷酸可以以任何形式被引入，只要它可以被引入宿主细胞中并表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被引入宿主细胞中，表达盒是含有自主表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸操作性连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以以其自身形式被引入宿主细胞中，并操作性连接到在宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。
此外，术语“操作性连接”是指本公开的还包括编码突变5’UTR的碱基序列的突变多核苷酸的碱基序列与启动子序列功能性地连接，该启动子序列启动并介导该还包括编码突变5’UTR的碱基序列的突变多核苷酸的表达。
在本公开中，编码突变5’UTR的碱基序列，即编码突变5’UTR的突变多核苷酸，可以调控编码操作性连接的靶蛋白的多核苷酸翻译成蛋白质。例如，靶蛋白可以是磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，但不限于此。它可以普遍用于调控编码各种靶蛋白的多核苷酸翻译成蛋白质的目的。
本公开的另一方面可以提供一种生产聚羟基脂肪酸酯的微生物，该微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列。
本公开的微生物可以包括选自以下的一种或多种：本公开的编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列；或包括其的载体。
如本文所用，术语“微生物(或菌株)”包括所有野生型微生物或天然或人工遗传修饰的微生物，并且它可以是由于外源基因的插入或内源基因的活性增强或失活而使特定机制减弱或增强的微生物，并且它可以是包括用于表达靶多核苷酸的遗传修饰的微生物。微生物可以是埃希氏菌属(Escherichia)的微生物。具体地，微生物可以是大肠杆菌(Escherichia coli)。
本公开的菌株可以具有PHA生产能力。
本公开的菌株可以是重组菌株，其通过将待转录为本公开的突变5’UTR的突变核酸分子引入天然野生型微生物、未修饰的微生物或生产PHA的微生物中而制备；或编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的突变基因，包括待转录为突变5’UTR的突变核酸分子。
如本文所用，“未修饰的微生物”不排除包括可能在微生物中天然发生的突变的菌株，并且可以是野生型菌株或天然菌株本身，或者可以是由于天然或人工因素通过遗传变异改变性状之前的菌株。例如，未修饰的微生物可以是这样的菌株，其中含有本公开的编码突变5’UTR的突变多核苷酸；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，进一步包括编码突变5’UTR的碱基序列的突变多核苷酸未被引入或尚未被引入。术语“未修饰的微生物”可以与“修饰前的菌株”、“修饰前的微生物”、“未变异的菌株”、“未修饰的菌株”、“未变异的微生物”或“参考微生物”互换使用。
关于本公开的目的，与表达编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(该基因包括待转录为野生型5’UTR的核酸分子)的菌株相比，按PHA的总重量计，本公开的菌株可以将由其生产的聚羟基脂肪酸酯的4HB单体的含量调控在3重量％至21重量％的范围内。
对于另一个实例，在本公开的重组微生物中，PHA生物合成途径中一些蛋白质的活性可以被另外增强或减弱。
在本公开的微生物中，突变多核苷酸、SEQ ID NO：1的碱基序列、突变5’UTR和PHA与其他实施方案中所述的相同。
本公开的另一方面提供了一种生产PHA的方法，该方法包括在培养基中培养生产PHA的微生物的步骤，该微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列。
本公开公开的生产PHA的方法可以包括在培养基中培养微生物的步骤，该微生物包括选自以下的任何一种或多种：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列；或包括其的载体。
如本文所用，术语“培养”是指在适当控制的环境条件下培养本公开的微生物。本公开的培养过程可以根据本领域已知的合适的培养基和培养条件来进行。本领域技术人员可以根据选择的微生物容易地调整和使用此类培养过程。具体地，培养可以是分批型、连续型和/或补料分批型，但不限于此。
如本文所用，术语“培养基”是指含有培养本公开的微生物所需的营养物作为主要成分的混合物质，并且该培养基提供营养物、生长因子等，包括水，这些都是生存发展所不可缺少的。具体地，作为用于培养本公开的微生物的培养基和其他培养条件，可以使用任何培养基而没有特别限制，只要它是通常用于培养微生物的培养基。本公开的微生物可以在含有合适碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的普通培养基中培养，同时控制温度、pH值等，处于有氧条件下。
在本公开中，碳源包括碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；糖醇，诸如甘露醇、山梨醇等；有机酸，诸如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；氨基酸，诸如谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等；等等。可以使用天然有机营养物，诸如淀粉水解产物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯、甘蔗残渣和玉米浆。具体地，可以使用碳水化合物(诸如葡萄糖)和灭菌的预处理糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，并且可以以各种方式使用适量的其他碳源而没有限制。这些碳源可以单独使用，或者两种或更多种组合使用，但不限于此。
作为氮源，可以使用：无机氮源，诸如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；以及有机氮源，诸如氨基酸(诸如谷氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺等)、蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等。这些氮源可以单独使用，或者两种或更多种组合使用，但不限于此。
磷源可以包括磷酸一钾、磷酸二钾或对应的含钠盐。作为无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。除了这些化合物，还可以含有氨基酸、维生素和/或合适的前体等。这些组分或前体可以分批或连续添加到培养基中，但不限于此。
在本公开的微生物的培养过程中，可以通过以适当的方式向培养基中添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来调节培养基的pH。在培养过程中，可以通过使用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来抑制起泡。此外，可以向培养基中注入氧气或含氧气体以维持培养基的有氧状态，或者可以不注入气体，或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体以维持厌氧和微有氧状态，但不限于此。
在本公开的培养中，培养温度可以保持在20℃至45℃，具体地，25℃至40℃，并且微生物可以培养约10小时至约160小时，但不限于此。
由本公开的培养生产的PHA可以分泌到培养基中或者可以保留在细胞中。
例如，本公开的生产PHA的方法还可以包括在培养步骤之前制备本公开的微生物的步骤、制备用于培养微生物的培养基的步骤、或这些步骤的组合(以任何顺序)。
本公开的生产PHA的方法可以进一步包括从根据培养的培养基(进行培养的培养基)或从菌株中回收PHA的步骤。在培养步骤之后可以进一步包括回收步骤。
回收可以是：根据本公开的培养微生物的方法，例如分批、连续或补料分批培养方法，通过本领域已知的合适方法收集目标PHA。例如，离心、过滤、用结晶蛋白质沉淀剂处理(盐析)、提取、超声波分解、超滤、透析、各种形式的层析(诸如分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析等)、HPLC或其组合。可以通过本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收目标PHA。
本公开的生产PHA的方法可以进一步包括纯化步骤。纯化可以通过本领域已知的合适方法进行。例如，当本公开的生产PHA的方法包括回收步骤和纯化步骤时，回收步骤和纯化步骤可以不考虑顺序而连续或不连续地进行，或者可以同时进行，或者合并为一个步骤，但不限于此。
关于本公开的目的，与编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(该基因包括待转录为野生型5’UTR的核酸分子)相比，按PHA的总重量计，由本公开的菌株表达的编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的突变基因(该突变基因包括待转录为突变5’UTR的突变核酸分子)可以将由其生产的聚羟基脂肪酸酯的4HB单体含量调控到3重量％至21重量％的范围内。
在本公开的方法中，突变多核苷酸、SEQ ID NO：1的碱基序列、突变5’UTR、PHA等与上述其他实施方案中描述的相同。
本公开的另一方面提供了用于生产PHA的组合物，该组合物包括生产PHA的微生物，该微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列；培养微生物的培养基；或者其中两种或更多种的组合。
本公开的组合物可以进一步包括任何合适的赋形剂，其通常用于生产PHA的组合物中。此类赋形剂可以是例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂等，但不限于此。
本公开的另一方面提供了微生物在PHA生产中的用途，该微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，该突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列。
突变体多核苷酸、SEQ ID NO：1的碱基序列、突变体5’UTR、PHA等与上述其他实施方案中描述的相同。
[有利效果]
本公开的5’-非翻译区(5’UTR)突变序列可用于控制TCA循环的碳通量，特别是控制生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的微生物的4-羟基丁酸酯(4HB)含量，从而提供具有所需物理性质的PHA。
[发明模式]
在下文中，将参考示例性实施方案更详细地描述本公开。然而，以下示例性实施方案仅仅是用于说明本公开的优选实施方案，因此本公开的范围不旨在受其限制。同时，本说明书中未描述的技术事项可以被本公开的技术领域或类似技术领域的技术人员充分理解并容易地实现。此外，在本说明书中，引用了多篇论文和专利文献，并指出其出处。所引用的论文和专利文献中公开的全部内容通过引用并入本说明书中，以便更清楚地描述本公开所属技术领域的水平和本公开的内容。
实施例1：用于将突变引入编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因的5’-非翻译区(5’UTR)的文库的构建和筛选
通过以下方法制备用于构建ppc基因5’UTR突变体文库的模板载体。使用大肠杆菌MG1655的染色体作为模板以及SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的引物对，扩增野生型ppc基因的5’UTR序列。PCR条件重复25次：95℃变性20秒，56℃退火40秒，72℃延伸30秒。对于基于荧光的筛选，使用SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的引物对，扩增启动子下游要表达的荧光蛋白。PCR条件重复25次：95℃变性20秒，56℃退火40秒，72℃延伸1分钟。通过以组装方式克隆两个扩增产物以及用BamH1限制性酶(NEB)处理的pCL1920载体，来构建模板载体。
为了使用对应的载体制备ppc基因的5’UTR突变文库，使用SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：17的引物对从制备的模板载体中扩增随机化序列。PCR条件重复25次：95℃变性20秒，56℃退火40秒，72℃延伸30秒。使用SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的引物对扩增模板载体的剩余序列，并通过以组装方式克隆所扩增的两个片段来获得文库载体。PCR条件重复25次：95℃变性20秒，56℃退火40秒，72℃延伸3分钟。大肠杆菌DH5α用于克隆，含75mg/L大观霉素(Spectinomycin)的LB培养基用于菌株选择。对于DNA扩增，使用ProFi TaqPCR PreMix(Bioneer)。
通过将所构建的文库载体转化入大肠杆菌MG1655中，获得单菌落，将该单菌落接种在含有500μL补充75mg/L大观霉素的LB培养基的96孔板中，并于37℃孵育16小时。用500μL聚羟基脂肪酸酯(PHA)生产培养基(US10323261 B2)将饱和培养基稀释1/100，待细胞在培养基中充分饱和后，测量荧光。此时，具有野生型ppc基因5’UTR序列的模板载体用作对照。使用多标记板阅读器(PerkinElmer)测量荧光和OD600，并且通过除以OD600将测量的荧光值归一化。
结果，鉴定了总共11种具有不同表达水平的菌株，分离各菌株的质粒，每种质粒从载体版本1命名至载体版本11，并对其进行测序以鉴定突变序列。
上面使用的质粒如下表1所示，引物序列如下表2所示。
上面鉴定的载体版本1至载体版本11的突变序列如下表3所示。
[表1]
[表2]
[表3]
实施例2：构建引入突变序列的菌株并分析生产的PHA中的单体含量
基于生产聚(3-羟基丁酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))的菌株，制备生产PHA的菌株，其中引入了实施例1中鉴定的突变RBS序列。作为亲本菌株，使用生产P(3HB-co-4HB)的菌株，其中P(3HB-co-4HB)中的4HB含量为约20％(美国10323261B2)。首先，分别使用SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的引物对扩增突变序列，该突变序列的序列得以鉴定。PCR条件重复25次：95℃变性20秒，56℃退火40秒，72℃延伸30秒。为了使用含有选择性标志物的线性DNA片段进行基因重组，使用SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的引物对扩增att-KanR-att DNA片段。PCR条件重复25次：95℃变性20秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分钟。为了将该片段与先前扩增的序列连接，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的引物对进行重叠PCR。PCR条件重复25次：95℃变性20秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分15秒。将扩增的DNA转化到生产PHA的菌株后，在含50mg/L卡那霉素的选择培养基中对引入了RBS突变的菌株进行选择。对于DNA扩增，使用ProFi Taq PCR PreMix(Bioneer)。
引物序列如下表4所示。
[表4]
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为了评价引入了RBS突变的11种菌株的PHA生产能力，将它们接种在LB培养基中并培养至充分饱和。此后，将每种菌株接种到250mL角挡板烧瓶(corner-baffle flask)中，该烧瓶含有25mL含5％葡萄糖的PHA生产培养基，并在37℃下以230rpm摇动培养5小时，在35℃下培养43小时。培养完成后，使用气相色谱分析细胞内PHA含量和PHA中4HB含量。具体的培养条件和分析条件参考先前使用的条件(美国10323261B2)。
引入突变序列的PHA生产菌株的4HB含量如下表5所示。
[表5]
如表5所示，在具有野生型RBS序列的对照菌株中，PHA中的4HB含量为21.2％，而在具有突变RBS序列的突变菌株中，PHA中的4HB含量从20.3％降至3.2％。因此，证实了可以通过将突变RBS序列引入PHA生产菌株而有效控制PHA单体的含量。
在引入了突变RBS序列的11种菌株中，Pppc_v10菌株被命名为CB02-6588，并于2022年12月9日保藏在根据布达佩斯条约的国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)，指定保藏号为KCCM13300P。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开可以以不同的具体形式实施，而不改变其技术精神或基本特征。在这方面，应当理解，上述实施方案并非限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本公开的范围由所附权利要求而非由其先前的描述得以限定，因此落入权利要求书的边界和范围内的所有改变和修改，或者这些边界和范围的等同物，都被权利要求书所包括。
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Claims (13)

1.一种编码突变5’-非翻译区(5’UTR)的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变。
2.一种突变多核苷酸，其包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列，所述突变多核苷酸还包括编码突变5’UTR的碱基序列，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变。
3.根据权利要求1或2所述的突变多核苷酸，其中所述突变5’UTR在对应于SEQ ID NO：1的碱基序列中第15至22位的碱基的任何一个或多个碱基中具有突变。
4.根据权利要求1或2所述的突变多核苷酸，其中所述突变5’UTR包括选自SEQ ID NO：2至12的任何一个或多个碱基序列。
5.根据权利要求1所述的突变多核苷酸，其中编码所述突变5’UTR的所述突变多核苷酸调控与其操作性连接的编码靶蛋白的多核苷酸翻译成蛋白质。
6.根据权利要求5所述的突变多核苷酸，其中所述靶蛋白是磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
7.根据权利要求2所述的突变多核苷酸，其中与包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列并且还包括编码野生型5’UTR的碱基序列的多核苷酸相比，按PHA的总重量计，包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的所述突变多核苷酸将由其生产的聚羟基脂肪酸酯的4-羟基丁酸酯(4HB)单体的含量调控在3重量％至21重量％的范围内。
8.一种生产聚羟基脂肪酸酯的微生物，所述微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，所述突变多核苷酸还包括编码所述突变5’UTR的碱基序列。
9.根据权利要求8所述的微生物，其中按PHA的总重量计，由所述微生物生产的聚羟基脂肪酸酯的4-羟基丁酸酯(4HB)单体的含量被调控在3重量％至21重量％的范围内。
10.一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，所述方法包括在培养基中培养生产聚羟基脂肪酸酯的微生物的步骤，所述微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，所述突变多核苷酸还包括编码所述突变5’UTR的碱基序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中与包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列并且还包括编码野生型5’UTR的碱基序列的多核苷酸相比，按PHA的总重量计，包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的所述突变多核苷酸将由其生产的聚羟基脂肪酸酯的4-羟基丁酸酯(4HB)单体的含量调控在3重量％至21重量％的范围内。
12.一种用于生产PHA的组合物，其包括生产PHA的微生物，其中所述微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸还包括编码所述突变5’UTR的碱基序列；培养所述微生物的培养基；或者其中两种或更多种的组合。
13.微生物在PHA生产中的用途，其中所述微生物包括：编码突变5’UTR的突变多核苷酸，其中SEQ ID NO：1的碱基序列中的一个或多个碱基发生突变；或包括编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的碱基序列的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸还包括编码所述突变5’UTR的碱基序列。
CN202280049518.7A 2021-12-24 2022-12-21 编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的5’utr变体序列及其用途 Pending CN117980475A (zh)

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