TW202346332A

TW202346332A - 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２刺突（Ｓ）抗體及其在治療ＣＯＶＩＤ－１９中的用途

Info

Publication number: TW202346332A
Application number: TW111149774A
Authority: TW
Inventors: 蓋爾史密斯; 妮塔帕特爾
Original assignee: 美商諾瓦瓦克斯股份有限公司
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-12-01
Also published as: WO2023122786A3; AR128082A1; WO2023122786A2

Abstract

本發明提供了與SARS-CoV-2刺突（S）蛋白結合的抗體。本發明進一步涉及使用與SARS-CoV-2刺突（S）蛋白結合的上述抗體的醫藥組合物、免疫治療組合物和方法。

Description

抗SARS-CoV-2刺突（S）抗體及其在治療COVID-19中的用途

[相關申請的交叉引用]

本申請要求2021年12月23日提交的美國臨時申請號63/293,451的優先權。將上述申請通過引用以其整體併入本文。

[對電子序列表的引用]

將電子序列表（NOVV_097_01WO_SeqList_ST26.xml；大小：221,021位元組；創建日期：2022年12月22日）的內容通過引用以其整體併入本文。

本公開文本總體上涉及可用於治療病毒感染的抗突發性急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）抗體及其片段。具體而言，使用所述抗SARS-CoV-2刺突（S）抗體及其片段來治療2019冠狀病毒病（COVID-19）。

感染性疾病仍然是遍及全世界的問題。突發性急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的爆發已經在全球範圍內感染超過6.4億人。在全球範圍內，死亡人數已經超過660萬。SARS-CoV-2冠狀病毒與在過去17年裡已經導致數百人死亡的嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）屬於同一病毒家族。SARS-CoV-2導致疾病COVID-19。SARS-CoV-2 S刺突蛋白的突變使得SARS-CoV-2變體能夠避開由先前感染SARS-CoV-2產生或通過疫苗接種產生的中和單株抗體。

因此，開發治療COVID-19的廣泛中和抗體是合意的。

本文提供了與突發性急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）蛋白結合的抗體或其片段。在實施例中，輕鏈互補決定區1（VL CDR1）選自SEQ ID NO: 11-14和76；輕鏈互補決定區2（VL CDR2）選自SEQ ID NO: 15-18和77；輕鏈互補決定區3（VL CDR3）選自SEQ ID NO: 19-22和78；重鏈互補決定區1（VH CDR1）選自SEQ ID NO: 23-26和79；重鏈互補決定區2（VH CDR2）選自SEQ ID NO: 27-30和80；並且重鏈互補決定區3（VH CDR3）選自SEQ ID NO: 31-34和81。在實施例中，所述抗體或其片段包含 (i) 根據SEQ ID NO: 23的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 27的VH CDR2；和根據SEQ ID NO: 31的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 11的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 15的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 19的VL CDR3；(ii) 根據SEQ ID NO: 24的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 28的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 32的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 12的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 16的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 20的VL CDR3；(iii) 根據SEQ ID NO: 25的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 29的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 33的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 13的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 17的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 21的VL CDR3；(iv) 根據SEQ ID NO: 26的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 30的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 34的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 14的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 18的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 22的VL CDR3；或者 (v) 根據SEQ ID NO: 79的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 80的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 81的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 76的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 77的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 78的VL CDR3。在實施例中，可變重鏈（VH）結構域的胺基酸序列包含以下胺基酸序列或由以下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與具有SEQ ID NO: 5-8和75中任一個的胺基酸序列的多肽具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。在實施例中，可變輕鏈（VL）結構域的胺基酸序列包含以下胺基酸序列或由以下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與具有SEQ ID NO: 1-4和74中任一個的胺基酸序列的多肽具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。在實施例中，本文提供了一種選自以下的抗體：包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 5具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL；包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 6具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 2具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL；包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL；包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 4具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL；以及包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 75具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 74具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL。在實施例中，所述抗體或其片段是單株抗體、Fab、F(ab′)2、Fab′、scFv或單結構域抗體（sdAb）。在實施例中，所述抗體包含人IgG1或IgG4結構域。在實施例中，所述抗體或其片段對SARS-CoV-2 S多肽或其變體的解離常數（KD）為50 nM或更小、10 nM或更小、1 nM或更小、0.5 nM或更小、0.1 nM或更小、0.05 nM或更小、0.01 nM或更小或者0.001 nM或更小。在實施例中，所述抗體或其片段與一種或多種CoV S多肽結合，所述一種或多種CoV S多肽與根據SEQ ID NO: 9、10、35-43、72-73和90-139中任一個的多肽具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。在實施例中，本文提供了一種編碼上述抗體或片段中的任一種的分離的核酸分子。在實施例中，本文提供了一種包含編碼上述抗體或片段中的任一種的核酸分子的表現載體。在實施例中，本文提供了一種包含上述表現載體的宿主細胞。在實施例中，本文提供了一種包含本文提供的抗體或片段和醫藥上可接受的載劑的醫藥組合物。在實施例中，本文提供了一種治療感染SARS-CoV-2病毒或其變體的有需要的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者投予本文所述的抗體或其片段。在實施例中，所述受試者為65歲或更大。在實施例中，所述受試者是免疫受損的。在實施例中，所述受試者是懷孕的女性。在實施例中，所述SARS-CoV-2變體具有選自以下的PANGO譜系：B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1。

本文提供了一種與突發性急性呼吸症候群冠狀病毒2（CoV）刺突（S）糖蛋白結合的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含：(i) 與選自SEQ ID NO: 11-14和76的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的輕鏈互補決定區1（VL CDR1）；(ii) 與選自SEQ ID NO: 15-18和77的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的輕鏈互補決定區2（VL CDR2）；(iii) 與選自SEQ ID NO: 19-22和78的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的輕鏈互補決定區3（VL CDR3）；(iv) 與選自SEQ ID NO: 23-26和79的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的重鏈互補決定區1（VH CDR1）；(v) 與選自SEQ ID NO: 27-30和80的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的重鏈互補決定區2（VH CDR2）；和 (vi) 與選自SEQ ID NO: 31-34和81的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的重鏈互補決定區3（VH CDR3）。本文提供了一種與突發性急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）蛋白結合的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含：(i) 包含與SEQ ID NO: 5-8和75的多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的可變重鏈（VH）結構域；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 1-4和74中任一個的多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的可變輕鏈（VL）結構域。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：根據SEQ ID NO: 23的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 27的VH CDR2；和根據SEQ ID NO: 31的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 11的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 15的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 19的VL CDR3。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：根據SEQ ID NO: 24的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 28的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 32的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 12的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 16的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 20的VL CDR3。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：根據SEQ ID NO: 25的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 29的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 33的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 13的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 17的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 21的VL CDR3。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：根據SEQ ID NO: 26的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 30的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 34的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 14的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 18的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 22的VL CDR3。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：根據SEQ ID NO: 79的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 80的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 81的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 76的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 77的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 78的VL CDR3。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：(i) 包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的VL。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：(i) 包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的VL。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：(i) 包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的VL。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：(i) 包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的VL。本文提供了一種包含以下的抗體或其片段：(i) 包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的VL。在實施例中，所述抗體或其片段是單株抗體、Fab、F(ab′)2、Fab′、scFv或單結構域抗體（sdAb）。在實施例中，所述抗體包含人IgG1或IgG4結構域。在實施例中，所述抗體或其片段對CoV S糖蛋白或其變體的平衡解離常數（KD）為50 nM或更小、10 nM或更小、1 nM或更小、0.5 nM或更小、0.1 nM或更小、0.05 nM或更小、0.01 nM或更小或者0.001 nM或更小。在實施例中，所述抗體或其片段以小於1.0 x 10-9莫耳/升（M）、小於1.0 x 10 ^-10M、小於1.0 x 10 ^-11M或小於1.0 x 10 ^-12M的平衡解離常數（Kd）與CoV S糖蛋白或其變體結合。在實施例中，所述抗體或其片段與一種或多種CoV S多肽結合，所述一種或多種CoV S多肽與根據SEQ ID NO: 9、10、35-43、72-73、90-139和145-147中任一個的多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。在實施例中，所述抗體或其片段與從約2種至約20種CoV S糖蛋白結合。在實施例中，所述抗體或其片段是廣泛中和抗體。在實施例中，所述抗體或其片段與CoV S糖蛋白上的表位結合，其中所述表位包含SEQ ID NO: 10的CoV S糖蛋白的胺基酸476、485、486、487和489。在實施例中，所述抗體或其片段與CoV S糖蛋白上的表位結合，其中所述表位包含SEQ ID NO: 10的CoV S糖蛋白的胺基酸485、486、487和489。在實施例中，所述抗體或其片段與CoV S糖蛋白上的表位結合，其中所述表位包含SEQ ID NO: 10的CoV S糖蛋白的胺基酸378和385。在實施例中，所述抗體或其片段與CoV S糖蛋白上的表位結合，其中所述表位包含SEQ ID NO: 10的CoV S糖蛋白的胺基酸444、445、446和448。本文提供了一種編碼本文提供的抗體或其片段的分離的核酸分子。本文提供了一種編碼本文提供的抗體或其片段的分離的核酸分子。本文提供了一種包含本文所述的核酸的表現載體。本文提供了一種包含本文提供的表現載體的宿主細胞。本文提供了一種包含本文提供的抗體或其片段和醫藥上可接受的載劑的醫藥組合物。在實施例中，所述醫藥組合物包含多達兩種、多達三種、多達四種、多達五種、多達六種、多達七種、多達八種、多達九種或多達十種本文提供的抗體或其片段。本文提供了一種治療感染SARS-CoV-2病毒或其變體的有需要的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者投予本文提供的抗體或其片段或者醫藥組合物。在實施例中，所述受試者為65歲或更大。在實施例中，所述受試者是免疫受損的。在實施例中，所述受試者不到2歲。在實施例中，所述受試者是懷孕的女性。在實施例中，所述SARS-CoV-2變體具有選自以下的PANGO譜系：B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1。在實施例中，所述SARS-CoV-2變體的世界衛生組織標籤為阿爾法、貝塔、伽馬、德爾塔、艾普西隆、約塔、卡帕、澤塔、繆或奧密克戎。

定義

如本文和所附申請專利範圍所用，單數形式“一個/一種（a）”、“一個/一種（an）”和“所述（the）”包括複數指代物，除非上下文另外明確地規定。因此，例如，提及“一種蛋白質”可以指代一種蛋白質或這種蛋白質的混合物，並且提及“所述方法”包括提及熟習此項技術者已知的等同步驟和/或方法，等等。

如本文所用，術語“佐劑”是指當與免疫原組合使用時增加或以其他方式改變或修飾針對所述免疫原誘導的免疫反應的化合物。免疫反應的修飾可以包括增強或拓寬抗體和細胞免疫反應中的任一者或兩者的特異性。如本文所用，術語“約”或“大約”當在數值之前時指示所述值 ± 10%的範圍。例如，“約100”涵蓋90和110。

如本文所用，術語“免疫原”、“抗原”和“表位”是指能夠引發免疫反應的物質，諸如蛋白質（包括糖蛋白）和肽。

如本文所用，“基本上”是指這樣分離物質（例如，化合物、多核苷酸或多肽），使得所述物質形成包含其的樣品的大多數百分比。例如，在樣品中，基本上純化的組分構成所述樣品的85%，優選85%-90%，更優選至少95%-99.5%，最優選至少99%。如果組分基本上被替代，則在樣品中剩餘的量小於或等於約0.5%至約10%，優選小於約0.5%至約1.0%。

如本文所用，術語“治療（treat）”、“治療（treatment）”和“治療（treating）”是指用於獲得有益或期望的結果（例如，臨床結果）的方法。出於本公開文本的目的，有益或期望的結果可以包括抑制或壓制感染或疾病的開始或進展；改善感染或疾病的症狀或減輕其發展；或其組合。

如本文所用，“預防（prevention）”與“防預（prophylaxis）”可互換使用，並且可以意指完全預防感染或疾病，或預防該感染或疾病的症狀的發展；延遲感染或疾病或其症狀的發作；或降低隨後發展的感染或疾病或其症狀的嚴重程度。

如本文所用，“有效劑量”或“有效量”是指抗體的足以誘導減輕病原體感染的至少一種症狀的免疫反應的量。可以例如通過測量中和分泌抗體和/或血清抗體的量，例如通過噬斑中和、補體結合、酶聯免疫吸附測定（ELISA）或微量中和測定來確定有效劑量或有效量。

如本文所用，術語“受試者”包括人和其他動物。通常，受試者是人。例如，受試者可以是成人、青少年、兒童（2歲至14歲）、嬰兒（出生至2歲）或新生兒（至多2個月）。在特定方面，受試者大達4個月大或大達6個月大。在多方面中，成人是約65歲或更大或者約60歲或更大的年長者。在多方面中，受試者是孕婦或打算懷孕的婦女。在其他方面，受試者不是人；例如非人靈長類動物；例如，狒狒、黑猩猩、大猩猩或獼猴。在某些方面，受試者可以是寵物，諸如狗或貓。

在多方面中，受試者是免疫受損的。在實施例中，向免疫受損的受試者投予引起免疫抑制的藥物。引起免疫抑制的藥物的非限制性例子包括皮質類固醇（例如，潑尼松）、烷化劑（例如，環磷醯胺）、抗代謝藥（例如，硫唑嘌呤或6-巰基嘌呤）、移植相關免疫抑制藥物（例如，環孢菌素、他克莫司、西羅莫司或嗎替麥考酚酯）、米托蒽醌、化療劑、甲胺蝶呤、腫瘤壞死因數（TNF）阻斷劑（例如，依那西普、阿達木單抗、英夫利昔單抗）。在實施例中，免疫受損的受試者被病毒（例如，人類免疫缺陷病毒或EB病毒）感染。在實施例中，病毒是呼吸道病毒，諸如呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒或小核糖核酸病毒。在實施例中，免疫受損的受試者患有獲得性免疫缺陷症候群（AIDS）。在實施例中，免疫受損的受試者是人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者。在實施例中，免疫受損的受試者是由於被設計用於預防炎症或防止移植排斥的治療方案而免疫受損。在實施例中，免疫受損的受試者是已經接受移植的受試者。在實施例中，免疫受損的受試者已經經歷了放射療法或脾切除術。在實施例中，免疫受損的受試者已經被診斷為患有癌症，自身免疫病，結核病，物質使用障礙（例如，酒精、阿片類物質或可卡因使用障礙），中風或腦血管疾病，實體器官或血液幹細胞移植，鐮狀細胞病，地中海貧血，自身免疫性淋巴增殖症候群（ALPS），自身免疫性多內分泌腺症候群1型（APS-1），NF-κB相關B細胞增殖和T細胞失能（BENTA）疾病，半胱天冬酶8缺乏狀態（CEDS），慢性肉芽腫病（CGD），普通變異型免疫缺陷病（CVID），先天性中性粒細胞減少症候群，細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）缺乏症，DOCK8缺乏症，GATA2缺乏症，伴有免疫缺陷的糖基化障礙，高免疫球蛋白E症候群（HIES），高免疫球蛋白M症候群，糖尿病，1型糖尿病，2型糖尿病，干擾素γ缺乏症，白細胞介素12缺乏症，白細胞介素23缺乏症，白細胞粘附缺陷症，脂多糖反應性米色樣錨蛋白（LRBA）缺乏症，PI3激酶疾病，PLCG2相關抗體缺乏和免疫失調（PLAID），重症聯合免疫缺陷（SCID），STAT3顯性負性疾病，STAT3功能獲得性疾病，疣、低丙種球蛋白血症、感染和骨髓粒細胞缺乏症（WHIM）症候群，維斯科特-奧爾德里奇症候群（Wisckott-Aldrich syndrome，WAS），X連鎖無丙種球蛋白血症（XLA），X連鎖淋巴組織增殖性疾病（XLP），尿毒癥，營養不良或XMEN疾病。在實施例中，免疫受損的受試者是當前吸煙者或曾經吸煙者。在實施例中，免疫受損的受試者患有B細胞缺陷、T細胞缺陷、巨噬細胞缺陷、細胞因數缺陷、吞噬細胞缺乏症、吞噬細胞功能異常、補體缺乏症或其組合。

在實施例中，受試者超重或肥胖。在實施例中，超重受試者具有≥ 25 kg/m ²且＜ 30 kg/m ²的體重指數（BMI）。在實施例中，肥胖受試者具有≥ 30 kg/m ²的BMI。在實施例中，受試者患有精神健康病症。在實施例中，精神健康病症是抑鬱症、精神分裂症或焦慮症。

如本文所用，術語“醫藥上可接受的”意指由美國聯邦政府或州政府的監管機構批准或者在美國藥典、歐洲藥典或其他公認藥典中列出用於在哺乳動物、更特別地人中使用。這些組合物可用作用於在脊椎動物中誘導保護性免疫反應的疫苗和/或抗原組合物。

如本文所用，術語“修飾”當提及SARS-CoV-2刺突（S）多肽時是指CoV S多肽的一個或多個胺基酸的突變、缺失或添加。CoV S多肽內修飾的位置可以基於將所述多肽的序列與SEQ ID NO: 10（含有信號肽的CoV S多肽）或SEQ ID NO: 9（缺少信號肽的成熟CoV S多肽）比對來確定。

術語SARS-CoV-2“變體”（在本文中與“異源SARS-CoV-2毒株”可互換使用）是指與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的SARS-CoV S多肽相比，包含具有一個或多個修飾的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。例如，與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽相比，SARS-CoV-2變體可以具有至少約2個、至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約6個、至少約7個、至少約8個、至少約9個、至少約10個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個、至少約30個、至少約31個、至少約32個、至少約33個、至少約34個或至少約35個修飾。例如，與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽相比，SARS-CoV-2變體可以具有至少一個且多達2個、多達3個、多達4個、多達5個、多達6個、多達7個、多達8個、多達9個、多達10個、多達11個、多達12個、多達13個、多達14個、多達15個、多達16個、多達17個、多達18個、多達19個、多達20個、多達21個、多達22個、多達23個、多達24個、多達25個、多達26個、多達27個、多達28個、多達29個、多達30個、多達31個、多達32個、多達33個、多達34個、多達35個修飾、多達40個修飾、多達45個修飾、多達50個修飾、多達55個修飾、多達60個修飾、多達65個修飾、多達70個修飾、多達75個修飾、多達80個修飾、多達85個修飾、多達90個修飾、多達95個修飾或多達100個修飾。在多方面中，與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽相比，SARS-CoV-2變體可以具有約2個與約35個之間的修飾、約5個與約10個之間的修飾、約5個與約20個之間的修飾、約10個與約20個之間的修飾、約15個與約25個之間的修飾、約20個與約30個之間的修飾、約20個與約40個之間的修飾、約25個與約45個之間的修飾、約25個與約100個之間的修飾、約25個與約45個之間的修飾、約35個與約100個之間的修飾。

在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%同一性的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽具有約70%與約99.9%之間的同一性的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽具有約70%與約99.5%之間的同一性的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含與具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CoV S多肽具有約90%與約99.9%之間的同一性的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽具有約90%與約99.8%之間的同一性的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽具有約95%與約99.9%之間的同一性的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽具有約95%與約99.8%之間的同一性的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含與具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CoV S多肽具有約95%與約99%之間的同一性的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株的世界衛生組織標籤為阿爾法、貝塔、伽馬、德爾塔、艾普西隆、埃塔、約塔、卡帕、澤塔、繆或奧密克戎。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株具有選自以下的PANGO譜系：B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1。以下檔描述了Pango譜系的命名並且將其通過引用以其整體併入本文：O’Toole等人 BMC Genomics, 23, 121 (2022)。

在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株的世界衛生組織標籤為奧密克戎。在實施例中，與SEQ ID NO: 9的野生型SARS-CoV-2 S多肽相比，世界衛生組織標籤為奧密克戎的異源SARS-CoV-2毒株具有至少35個修飾。在實施例中，與SEQ ID NO: 9的野生型SARS-CoV-2 S多肽相比，世界衛生組織標籤為奧密克戎的異源SARS-CoV-2毒株具有從35個至55個、從35個至65個、從35個至75個、從35個至85個、從35個至95個或從35個至105個修飾。在實施例中，修飾選自T6I、T6R、A14S、A54V、V70A、T82I、G129D、H133Q、K134E、W139R、E143G、F144L、Q170E、I197V、L199I、V200E、V200G、G239V、G244S、G326D、G326H、R333T、L355I、S358F、S358L、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、V432P、G433S、L439R、L439Q、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、F473S、F477S、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、T591I、D601G、G626V、H642Y、N645S、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失和具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入及其組合。

在實施例中，變體的CoV S多肽包含選自以下的修飾的組合： (i) A54V、T82I、G129D、L199I、G326D、S358L、S360P、S362F、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸198的缺失和具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； (ii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失和胺基酸13的缺失； (iii) T6R、A14S、T82I、G129D、E143G、L199I、G326D、S358L、S360P、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失和具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； (iv) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、K404N、N427K、L439Q、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失和胺基酸13的缺失； (v) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失和胺基酸13的缺失； (vi) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、D601G、H642Y、N645S、N666K、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失和胺基酸57的缺失； (vii) V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、G626V、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失和胺基酸57的缺失； (viii) V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失和胺基酸57的缺失； (ix) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失和胺基酸57的缺失； (x) T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失和胺基酸13的缺失； (xi) T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、Q485R、N488Y、Y492H、T591I、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失和胺基酸13的缺失； (xii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N645S、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失和胺基酸57的缺失； (xiii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失和胺基酸57的缺失； (xiv) T6I、A14S、V70A、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G239V、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失和胺基酸131的缺失； (xv) T6I、A14S、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失和胺基酸131的缺失； (xvi) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失和胺基酸57的缺失； (xvii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失和胺基酸57的缺失；以及 (xviii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失和胺基酸131的缺失； (xix) 胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失和胺基酸131的缺失、N488Y、A557D、D601G、P668H或P668R、T703I、S969A和D1105H； (xx) D67A、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； (xxi) D67A、D202G、L229H、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； (xxii) D67A、D202G、胺基酸228-230中的1個、2個或3個胺基酸的缺失、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； (xxiii) D67A、L229H、R233I、N488Y、K404N、E471K、D601G和A688V； (xxiv) L5F、T7N、P13S、D125Y、R177S、K404T、E471K、N488Y、D601G、H642Y、T1014I和V1163F； (xxv) W139C和L439； (xxvi) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、E143G、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； (xxvii) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； (xxviii) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、T82I、G129D、Y132H、E143G、A209V、K404N、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； (xxix) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、W245I、K404N、N426K、L439R、T465K、E471K、N488Y、D601G、P668R和D937N； (xxx) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、W51H、H53W、G129D、E143G、D200V、L201R、W245I、K404N、N426K、L439R、T465K、E471K、N488Y、D601G、P668R和D937N； (xxxi) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、K404N、L439R、T465K、E471Q、D601G、P668R和D937N； (xxxii) Q39R、A54V、E471K、D601G、Q664H、F875L和胺基酸56、57、131、132中的1個、2個、3個或4個的缺失； (xxxiii) T82I、D240G、E471K、D601G和A688V； (xxxiv) L439R、E471Q、D601G、P668R和Q1058H； (xxxv) G62V、T63I、R233N、L439Q、F477S、D601G、T846N和胺基酸234-240中的1個、2個、3個、4個、5個或6個的缺失； (xxxvi) T82I、Y131S、Y132N、R333K、E471K、N488Y、D601G、P668H和D937N；以及 (xxxvii) G129D、G326D、S360P、S362F、K404N、N427K、T465K、E471A或E471K、Q480K或Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H和N953K；其中將CoV S糖蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 9的序列的多肽進行編號。

如本文所用，術語“抗體（antibody）”和“抗體（antibodies）”（免疫球蛋白）涵蓋單株抗體（包括全長單株抗體）、多株抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）、人抗體、人類化抗體、駝類化（camelised）抗體、嵌合抗體、單鏈Fv（scFv）、單鏈抗體、單結構域抗體、結構域抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、展現出所需生物活性的抗體片段、二硫鍵連接的Fv（sdFv）和抗獨特型（抗Id）抗體（包括例如針對本發明的抗體的抗Id抗體）、胞內抗體和以上任一種表位結合片段。具體而言，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以屬於任何類型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、類別（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亞類。

天然抗體通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕（L）鏈和兩條相同的重（H）鏈構成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接至重鏈，而二硫連接的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間不同。每條重鏈和輕鏈還具有規則間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈在一端具有可變結構域（VH），然後是多個恒定結構域。每條輕鏈具有在一端的可變結構域（VL）和在其另一端的恒定結構域；輕鏈的恒定結構域與重鏈的第一恒定結構域對齊，並且輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域對齊。基於輕鏈恒定區的胺基酸序列，輕鏈被分類為λ鏈或κ鏈。κ輕鏈的可變結構域在本文中也可以表示為VK。術語“可變區”還可以用於描述重鏈或輕鏈的可變結構域。據信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變結構域之間形成介面。此類抗體可以源自任何哺乳動物，包括但不限於人、猴、豬、馬、兔、狗、貓、小鼠等。

術語“可變”是指如下事實：在抗體之間，可變結構域的某些部分在序列上有很大差異，並且負責每種特定抗體對其特定抗原的結合特異性。然而，可變性並不是均勻地分佈在抗體的整個可變結構域中。可變性集中在輕鏈和重鏈可變結構域兩者中的稱為互補決定區（CDR）的區段中。可變結構域的更高度保守的部分被稱為架構區（FW）。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含主要採用β-折疊組態、通過三個CDR連接的四個FW區，其形成連接β-折疊結構並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分的環。每條鏈中的CDR通過FW區緊密靠近地保持在一起，並且與來自另一條鏈的CDR一起促成抗體的抗原結合位點的形成（參見，Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。恒定結構域通常不直接參與抗原結合，但是可以影響抗原結合親和力並且可以展現出各種效應子功能，諸如抗體在ADCC、CDC和/或細胞凋亡中的參與。

當在本文中使用時，術語“高變區”是指抗體的與其結合抗原相關的胺基酸殘基。高變區涵蓋“互補決定區”或“CDR”的胺基酸殘基（例如，輕鏈可變結構域的殘基24-34（VL CDR1）、50-56（VL CDR2）和89-97（VL CDR3）以及重鏈可變結構域的殘基31-35（VH CDR1）、50-65（VH CDR2）和95-102（VH CDR3）；Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）和/或來自“高變環”的那些殘基（例如，輕鏈可變結構域中的殘基26-32（VL CDR1）、50-52（VL CDR2）和91-96（VL CDR3）以及重鏈可變結構域中的殘基26-32（VH CDR1）、53-55（VH CDR2）和96-101（VH CDR3）；Chothia和Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)）。“架構”或“FW”殘基是側接CDR的那些可變結構域殘基。FW殘基存在於嵌合抗體、人類化抗體、人抗體、結構域抗體、雙抗體、疫苗抗體（vaccibody）、線性抗體和雙特異性抗體中。

如本文所用的術語“單株抗體”是指從基本上同質的抗體群體（即，除了可能少量存在的可能自然發生的突變之外，構成所述群體的單獨抗體是相同的）獲得的抗體。單株抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇（表位）的不同抗體的常規（多株）抗體製劑相反，每種單株抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優勢還在於它們可以由未被其他產生免疫球蛋白的細胞污染的雜交瘤細胞合成。替代產生方法是熟習此項技術者已知的，例如，單株抗體可以由用編碼單株抗體的重鏈和輕鏈基因穩定或暫態轉染的細胞產生。

修飾語“單株”指示抗體的特徵是從基本上同質的抗體群體獲得的，並且不應解釋為需要通過任何特定方法工程化抗體。術語“單株”在本文中用於指代源自選殖細胞群體（包括任何真核、原核或噬菌體殖株）的抗體，而不是工程化抗體的方法。例如，待根據本發明使用的單株抗體可以通過首先由Kohler等人, Nature, 256:495 (1975)描述的雜交瘤方法製備，或者可以通過任何重組DNA方法製備（參見例如，美國專利號4,816,567），包括例如使用Clackson等人, Nature, 352:624-628 (1991)和Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫中分離。這些方法可以用於產生單株哺乳動物抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人抗體、結構域抗體、雙抗體、疫苗抗體、線性抗體和雙特異性抗體。

術語“嵌合”抗體包括這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的至少一個部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，並且所述一條或多條鏈的至少一個其他部分與源自另一種物種或屬於另一種抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源；以及此類抗體的片段，只要它們展現出所需的生物活性即可（美國專利號4,816,567；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本文的目的嵌合抗體包括包含源自非人靈長類動物（例如，舊大陸猴，諸如狒狒、恒河猴或食蟹猴）的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列的“靈長類動物類化（primatized）”抗體（美國專利號5,693,780）。

非人（例如，鼠）抗體的“人類化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體是這樣的人免疫球蛋白（受體抗體），其中天然CDR殘基被來自具有所需特異性、親和力和能力的非人物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物）的相應CDR殘基替代。在一些情況下，人免疫球蛋白的FW區殘基被相應非人殘基替代。此外，人類化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能。通常，人類化抗體重鏈或輕鏈將包含至少一個或多個可變結構域的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR對應於非人免疫球蛋白的CDR，並且所有或基本上所有FW是人免疫球蛋白序列的FW。在某些實施例中，人類化抗體將包含免疫球蛋白恒定區（Fc）的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區的至少一部分。關於進一步的細節，參見Jones等人, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature, 332:323-329 (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。

“人抗體”可以是源自人的抗體或從轉基因生物體獲得的抗體，所述轉基因生物體已經被“工程化”以回應於抗原激發產生特異性人抗體並且可以通過本領域已知的任何方法產生。在某些技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件引入源自含有內源性重鏈和輕鏈基因座的靶向破壞的胚胎幹細胞系的生物體的品系中。轉基因生物體可以合成對人抗原具有特異性的人抗體，並且所述生物體可以用於產生分泌人抗體的雜交瘤。人抗體也可以是這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈由源自一種或多種人DNA來源的核苷酸序列編碼。全人抗體也可以通過基因或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術或體外啟動的B細胞構建，其全部都是本領域已知的。

“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”是指非特異性細胞毒性細胞（例如，自然殺傷（NK）細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞）識別靶細胞上的結合抗體隨後引起靶細胞裂解的細胞介導的反應。在一個實施例中，此類細胞是人細胞。雖然不希望限於任何特定的作用機制，但這些介導ADCC的細胞毒性細胞通常表現Fc受體（FcR）。用於介導ADCC的原代細胞NK細胞表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血細胞上的FcR表現總結於Ravetch和Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)中。為了評估分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，諸如美國專利號5,500,362或5,821,337中描述的測定。用於此類測定的有用效應細胞包括外周血單個核細胞（PBMC）和自然殺傷（NK）細胞。可替代地或另外地，可以在體內（例如，在動物模型中，諸如披露於Clynes等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)中的動物模型）評估目的分子的ADCC活性。

“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指分子在補體的存在下啟動補體啟動和裂解靶標的能力。通過使補體系統的第一組分（C1q）與和同源抗原複合的分子（例如，抗體）結合來啟動補體啟動途徑。為了評估補體啟動，可以進行CDC測定，例如如Gazzano-Santaro等人, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)中所述。

“效應細胞”是表現一種或多種FcR並執行效應子功能的白細胞。細胞至少表現FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV並執行ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞（PBMC）、自然殺傷（NK）細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞。

術語“Fc受體”或“FcR”用於描述與抗體的Fc區結合的受體。在一個實施例中，FcR是天然序列人FcR。此外，在某些實施例中，FcR是結合IgG抗體的FcR（γ受體），並且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA（“啟動受體”）和FcγRIIB（“抑制受體”），它們具有主要在其胞質結構域方面不同的類似胺基酸序列。啟動受體FcγRIIA在其胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸啟動基序（ITAM）。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸抑制基序（ITIM）。（參見，Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)）。FcR綜述於Ravetch和Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)；Capel等人, Immunomethods, 4:25-34 (1994)；和de Haas等人, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995)中。本文的術語“FcR”涵蓋其他FcR，包括將來要鑒定的FcR。所述術語還包括負責將母體IgG轉移至胎兒的新生兒受體FcRn（Guyer等人, Immunol., 117:587 (1976)和Kim等人, J. Immunol., 24:249 (1994)）。

“Fv”是含有完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。此區域由緊密非共價或共價締合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。在此組態中，每個可變結構域的三個CDR相互作用以將抗原結合位點限定在VH-VL二聚體的表面上。這六個CDR共同為抗體賦予抗原結合特異性。然而，即使單個可變結構域（或僅包含三個對抗原具有特異性的CDR的半個Fv）也具有識別和結合抗原的能力，但是其親和力低於完整的結合位點。

待用於本文所述的一種或多種治療的抗體對表位的“親和力”是本領域很好理解的術語，並且意指抗體與表位結合的程度或強度。可以以本領域已知的許多方式測量和/或表現親和力，所述方式包括但不限於平衡解離常數（KD或Kd）、表觀平衡解離常數（KD’或Kd’）和IC50（在競爭測定中實現50%抑制所需的量）。應理解的是，出於本發明的目的，親和力是與表位結合的給定抗體群體的平均親和力。在本文中以mg IgG/mL或mg/mL為單位報告的KD’值指示mg Ig/mL血清，但是可以使用血漿。當將抗體親和力用作投予本文所述的治療方法或選擇本文所述的治療方法的基礎時，可以在治療之前和/或期間測量抗體親和力，並且所獲得的值可以由臨床醫生用於評估人類患者是否為治療的適當候選人。

如本文所用，術語“親合力”是抗體結合抗原的總結合強度（即，兩條抗體臂）的量度。親合力取決於以下三個因素：(i) 抗體對抗原上的表位的親和力；(ii) 抗體和抗原兩者的價態；和 (iii) 相互作用部分的結構排列。可以通過使用本領域已知的任何手段（諸如但不限於通過修飾間接螢光抗體，如由Gray等人, J. Virol. Meth., 44:11-24. (1993)所述）在抗原過量時測量抗原-抗體鍵的解離來確定抗體親合力。

如本文所用，術語“中和抗體”是指降低病原體在宿主中開始或維持感染的能力的抗體。中和抗CoV S糖蛋白抗體是降低SARS-CoV-2病毒或其變體在宿主中開始或維持感染的能力的抗體。

“表位”是本領域很好理解的術語，並且意指展現出與抗體特異性結合的任何化學部分。“抗原”是含有表位的部分或分子，因此，也與抗體特異性結合。

如本文所用的術語“抗體半衰期”意指抗體的藥動學特性，其是在投予抗體分子後它們的平均存活時間的量度。抗體半衰期可以表示為從患者身體或其特定區室消除50%已知量的免疫球蛋白所需的時間，例如如在血清或血漿中測量的（即，循環半衰期）或在其他組織中測量的。一種免疫球蛋白或免疫球蛋白類別與另一種免疫球蛋白或免疫球蛋白類別的半衰期可以不同。通常，抗體半衰期的增加導致所投予抗體在循環中的平均停留時間（MRT）的增加。

術語“同種型”是指抗體的重鏈或輕鏈恒定區的分類。抗體的恒定結構域不參與與抗原的結合，但是展現出各種效應子功能。根據重鏈恒定區的胺基酸序列，可以將給定的人抗體或免疫球蛋白分配到免疫球蛋白的以下五種主要類別之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些類別中的幾種可以進一步分為亞類（同種型），例如IgG1（γ1）、IgG2（γ2）、IgG3（γ3）和IgG4（γ4）以及IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定區分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白的結構和三維組態是熟知的。在各種人免疫球蛋白類別中，已知只有人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM啟動補體。已知人IgG1和IgG3在人仲介導ADCC。人輕鏈恒定區可以被分類為兩種主要類別κ和λ。

如本文所用，術語“免疫原性”意指化合物能夠引起免疫反應（刺激特異性抗體的產生和/或特異性T細胞的增殖）。

如本文所用，術語“廣泛中和抗體”是指與多於一種異源SARS-CoV-2毒株的SARS-CoV-2 S糖蛋白結合的抗體或其片段。在實施例中，廣泛中和抗體結合至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種或至少20種異源SARS-CoV-2毒株的SARS-CoV-2 S糖蛋白。在實施例中，廣泛中和抗體結合至少兩種且多達三種、多達四種、多達五種、多達六種、多達七種、多達八種、多達九種、多達十種、多達11種、多達12種、多達13種、多達14種、多達15種、多達16種、多達17種、多達18種、多達19種或多達20種異源SARS-CoV-2毒株的SARS-CoV-2 S糖蛋白。在實施例中，廣泛中和抗體結合2種與10種之間的異源SARS-CoV-2毒株的SARS-CoV-2 S糖蛋白。

與SARS-CoV-2刺突多肽結合的抗體

本發明涉及與SARS-CoV-2刺突多肽及其變體結合的抗體（抗CoV S糖蛋白抗體）以及包含這些抗體的組合物。SARS-CoV-2刺突多肽（“CoV S糖蛋白”）可以包含以下的胺基酸序列：

QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT（SEQ ID NO: 9）。

在實施例中，CoV S糖蛋白包含N末端信號肽；此蛋白質具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列。信號肽加底線。

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT（SEQ ID NO: 10）。

CoV S糖蛋白（SEQ ID NO: 9）分為S1亞基（SEQ ID NO: 9的胺基酸1-672）和S2亞基（SEQ ID NO: 9的胺基酸673-1260）。S1亞基進一步分為N末端結構域（NTD，SEQ ID NO: 9的胺基酸1-318）、受體結合結構域（RBD，SEQ ID NO: 9的胺基酸318-514）、亞結構域1和2（SD1/2，SEQ ID NO: 9的胺基酸529-668）和弗林蛋白酶切割位點（SEQ ID NO: 2的胺基酸669-672）。S2亞基包含HR1結構域（SEQ ID NO: 9的胺基酸889-971）、HR2結構域（SEQ ID NO: 2的胺基酸1150-1200）、跨膜結構域（TM，SEQ ID NO: 2的胺基酸1201-1224）和胞質結構域（CD，SEQ ID NO: 9的胺基酸1225-1260）。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體與SARS-CoV 2 S糖蛋白的S1亞基、S2亞基、NTD、RBD、弗林蛋白酶切割位點、HR1結構域、TM結構域、CD或其組合結合。

在實施例中，與SEQ ID NO: 9的CoV S糖蛋白相比，CoV S糖蛋白具有多達1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個或100個修飾。

對CoV S糖蛋白的示例性修飾在下表中示出。

在 SEQ ID NO: 10 內的位置	在 SEQ ID NO: 9 內的位置	潛在修飾
14-305	1-292	˙多達約1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、220個、230個、240個、250個、260個、270個、280個、290個或292個胺基酸的缺失
18	5	˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成酪胺酸 ˙突變成色胺酸
19	6	˙突變成精胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成組胺酸 ˙突變成異白胺酸
20	7	˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成麩醯胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸
24	11	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸 ˙缺失
25	12	˙在胺基酸25後插入胺基酸脯胺酸-脯胺酸-丙胺酸(PPA) ˙缺失
26	13	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸 ˙缺失
27	14	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸
52	39	˙突變成精胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成組胺酸
64	51	˙突變成組胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸
66	53	˙突變成色胺酸 ˙突變成酪胺酸 ˙突變成苯丙胺酸
67	54	˙突變成擷胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成白胺酸
69	56	˙胺基酸的缺失
70	57	˙胺基酸的缺失 ˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成酪胺酸 ˙突變成色胺酸
75	62	˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成異白胺酸
76	63	˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸
80	67	˙突變成丙胺酸 ˙突變成甘胺酸
83	70	˙突變成丙胺酸
95	82	˙突變成β支鏈胺基酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸
138	125	˙突變成酪胺酸 ˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成色胺酸
142	129	˙突變成天門冬胺酸 ˙突變成麩胺酸
143	130	˙胺基酸的缺失
144	131	˙胺基酸的缺失 ˙突變成絲胺酸
145	132	˙胺基酸的缺失 ˙突變成組胺酸 ˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成麩醯胺酸
146	133	˙突變成芳香族胺基酸 ˙突變成酪胺酸 ˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成色胺酸 ˙突變成麩醯胺酸 ˙突變成天門冬醯胺酸
147	134	˙突變成麩胺酸 ˙突變成天門冬胺酸
152	139	˙突變成半胱胺酸 ˙突變成甲硫胺酸 ˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成離胺酸
156	143	˙突變成甘胺酸 ˙突變成丙胺酸
157	144	˙胺基酸的缺失 ˙突變成白胺酸
158	144	˙胺基酸的缺失
183	170	˙突變成麩胺酸 ˙突變成天門冬胺酸
190	177	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸 ˙突變成半胱胺酸
210	197	˙突變成擷胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸
211	198	˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸 ˙胺基酸的缺失
212	199	˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸 ˙胺基酸的缺失
213	200	˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸 ˙突變成脯胺酸 ˙突變成甘胺酸 ˙突變成麩胺酸 ˙突變成天門冬胺酸
214	201	˙突變成精胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成組胺酸 ˙突變成天門冬胺酸 ˙突變成麩胺酸 ˙在214後插入胺基酸麩胺酸-脯胺酸-麩胺酸(EPE)
215	202	˙突變成甘胺酸 ˙突變成丙胺酸 ˙在215後插入胺基酸麩胺酸-脯胺酸-麩胺酸(EPE)
222	209	˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成異白胺酸
241-244	228-231	˙1個、2個、3個或4個胺基酸的缺失 ˙
242	229	˙突變成組胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸
246	233	˙突變成β支鏈胺基酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成蘇胺酸 ˙突變成天門冬醯胺酸
247	234	˙胺基酸的缺失
248	235	˙胺基酸的缺失
249	236	˙胺基酸的缺失
250	237	˙胺基酸的缺失
251	238	˙胺基酸的缺失
252	239	˙胺基酸的缺失 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸
253	240	˙突變成甘胺酸 ˙胺基酸的缺失
257	244	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸
258	245	˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸
339	326	˙突變成天門冬胺酸 ˙突變成麩胺酸 ˙突變成組胺酸
346	333	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸 ˙突變成蘇胺酸 ˙突變成絲胺酸
368	355	˙突變成異白胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸
371	358	˙突變成白胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成酪胺酸 ˙突變成色胺酸
373	360	˙突變成脯胺酸
375	362	˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成酪胺酸 ˙突變成色胺酸
376	363	˙突變成丙胺酸 ˙突變成甘胺酸
405	392	˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成麩醯胺酸
408	395	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸
417	404	˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成蘇胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成絲胺酸 ˙突變成麩醯胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸
432	419	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
439	426	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸 ˙
440	427	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
444	431	˙突變成蘇胺酸 ˙突變成絲胺酸
445	432	˙突變成脯胺酸
446	433	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸
452	439	˙突變成精胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成組胺酸 ˙突變成麩醯胺酸 ˙突變成天門冬醯胺酸
453	440	˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成色胺酸
460	447	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸
477	464	˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成麩醯胺酸
478	465	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
484	471	˙突變成丙胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸 ˙突變成麩醯胺酸 ˙突變成天門冬醯胺酸
486	473	˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸
490	477	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸
493	480	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
494	481	˙突變成脯胺酸
496	483	˙突變成絲胺酸 ˙突變成蘇胺酸
498	485	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
501	488	˙突變成酪胺酸 ˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成色胺酸
505	492	˙突變成組胺酸
547	534	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
570	557	˙突變成天門冬胺酸 ˙突變成麩胺酸
604	591	˙突變成異白胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成β支鏈胺基酸
613	600	˙突變成組胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸
614	601	˙突變成甘胺酸 ˙突變成丙胺酸
639	626	˙突變成擷胺酸 ˙突變成白胺酸 ˙突變成異白胺酸
655	642	˙突變成酪胺酸 ˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成色胺酸
658	645	˙突變成絲胺酸
677	664	˙突變成組胺酸
679	666	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
681	668	˙突變成組胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸
682-685	669-672	˙1個、2個、3個或4個胺基酸的突變
689-698	676-685	˙多達約1個、多達約2個、多達約3個、多達約4個、多達約5個、多達約6個、多達約7個、多達約8個、多達約9個或多達約10個胺基酸的缺失
701	688	˙突變成β支鏈胺基酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成蘇胺酸
704	691	˙突變成白胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸
715-724	702-711	˙多達約1個、多達約2個、多達約3個、多達約4個、多達約5個、多達約6個、多達約7個、多達約8個、多達約9個或多達約10個胺基酸的缺失
716	703	˙突變成β支鏈胺基酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成異白胺酸
764	751	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
788-806	775-793	˙多達約1個、多達約2個、多達約3個、多達約4個、多達約5個、多達約6個、多達約7個、多達約8個、多達約9個、多達約10個、多達約11個、多達約12個、多達約13個、多達約14個、多達約15個、多達約16個、多達約17個、多達約18個或多達約19個胺基酸的缺失
796	783	˙突變成酪胺酸 ˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成色胺酸
819-828	806-815	˙多達約1個、多達約2個、多達約3個、多達約4個、多達約5個、多達約6個、多達約7個、多達約8個、多達約9個或多達約10個胺基酸的缺失
856	843	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
859	846	˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成麩醯胺酸
888	875	˙突變成白胺酸 ˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸
950	937	˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成麩醯胺酸
954	941	˙突變成組胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸
969	956	˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成組胺酸
981	968	˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成酪胺酸 ˙突變成色胺酸
982	969	˙突變成丙胺酸 ˙突變成甘胺酸 ˙突變成蘇胺酸
986	973	˙突變成脯胺酸 ˙突變成甘胺酸
987	974	˙突變成脯胺酸 ˙突變成甘胺酸
1027	1014	˙突變成異白胺酸 ˙突變成擷胺酸 ˙突變成絲胺酸
1071	1058	˙突變成組胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成離胺酸
1118	1105	˙突變成組胺酸 ˙突變成離胺酸 ˙突變成精胺酸 ˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成麩醯胺酸
1176	1163	˙突變成苯丙胺酸 ˙突變成酪胺酸 ˙突變成色胺酸
1199	1186	˙突變成天門冬醯胺酸 ˙突變成麩醯胺酸
1214-1237	1201-1224	˙TM的一個或多個胺基酸的缺失
1238-1273	1225-1260	˙CD的一個或多個胺基酸的缺失

在實施例中，CoV S糖蛋白具有與SEQ ID NO: 9、10、35-43、72、73、90-139和145-147中的任一個至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體可以介導抗原依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。在實施例中，本發明涉及IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG5同種型的抗CoV S糖蛋白抗體。在實施例中，抗體介導人ADCC、CDC和/或細胞凋亡。

在一個實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含可變重鏈（VH）和可變輕鏈（VL）。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含具有SEQ ID NO: 1-4和74中的任一個的胺基酸序列或者與SEQ ID NO: 1-4和74中的任一個具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含具有SEQ ID NO: 5-8和75中的任一個的胺基酸序列或者與SEQ ID NO: 5-8和75中的任一個具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 1的VL或者與SEQ ID NO: 1至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VL，以及SEQ ID NO: 5的VH或者與SEQ ID NO: 5至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VH。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 2的VL或者與SEQ ID NO: 2至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VL，以及SEQ ID NO: 6的VH或者與SEQ ID NO: 6至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VH。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 3的VL或者與SEQ ID NO: 3至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VL，以及SEQ ID NO: 7的VH或者與SEQ ID NO: 7至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VH。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 4的VL或者與SEQ ID NO: 4至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VL，以及SEQ ID NO: 8的VH或者與SEQ ID NO: 8至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VH。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 75的VL或者與SEQ ID NO: 75至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VL，以及SEQ ID NO: 74的VH或者與SEQ ID NO: 74至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的VH。

在實施例中，SEQ ID NO: 1-4的VL包含N末端前導序列。可以去除SEQ ID NO: 1-4和74中的任一個的N末端前導序列的多達1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸。在實施例中，本文提供了包含VL（無N末端前導序列）的抗體。在實施例中，SEQ ID NO: 5-8和75中的任一個的VH包含N末端前導序列。可以去除SEQ ID NO: 5-8和75中的任一個的N末端前導序列的多達1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸。在實施例中，本文提供了包含VH（無N末端前導序列）的抗體。在實施例中，本文所述的抗體包含VH或VL的N末端前導序列的多達1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸。

在實施例中，VL和VH選自下表1。加實線底線的胺基酸是VL和VH的N末端前導序列。加粗的胺基酸是每個VL和VH的CDR。架構區加虛線底線。

表1.抗CoV S糖蛋白抗體的VL和VH序列

抗體名稱	VL	VH
425.6	QIVLTQSPAI MSVSPGEKVTMTC SASSTMSFMYWYQ QKPGSSPRLLIY DTSNLAS GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC QQWNTYPLTFGAG TKLELKR(SEQ ID NO: 1)	V QLKQSGPSLVQPSQSLSITCTVSGFSLT SYGIHWV RQSPGKGLEWLG VIWRGGSTDYNAAFMS RLTITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAT HTEGDDVDYWGQG TSVTVSS(SEQ ID NO: 5)
35.13	EIQMTQSPSS MSASLGDRITITC QATQDIVKNLNWYQ QKPGKPPSFLIY HATELAK GVPSRFSGSGSGSDYSLTISNLESEDFADYYC LQFYDFPFTFGAG TKLELKR(SEQ ID NO: 2)	Q VQLQQSGAELGKPGASVKLSCRASGYTFT RYYIYWV KQRPGQGLEWIG EINPSNGDTHFNEKFKT KATLTVDKSSSSAHIHLTSLTSEDSAVYYCSI HAYSFDFWGQG TTLTVSS(SEQ ID NO: 6)
239.12	DIQ MTQSPASLSASVGETVTITC GASENIYGALNWYQ RKQGKSPQLLIY GATNLAD GMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYC QNVLSTPYTFGGG TKLEIKR(SEQ ID NO: 3)	E VKLEESGPVLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWNWI RQFPGNKLEWMG YISNSAGTSYNPSLKS RISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAS GGWSSYYAMDYWGQG TSVTVSS(SEQ ID NO: 7)
322.3	METDTLLLWVLLLWVPGSTG NIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVDSYGSSFMHWYQ QKPGQPPKLLIY LASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC QQNNEDPRTFGGG TKLEIK(SEQ ID NO: 4)	MGWSRIFLFLLSIIAGVHC RVQLQQSGPELVKPGASVTISCKASGYIFT SDYIHWV KQRPGQGPEWIG WIYPGNINTKYNEKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAR DDGNLYYYAMDYWGQG TSVTVSS(SEQ ID NO: 8)
199.9	MET DTLLLWVLLLWVPGSTGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVDTYGNSFMHWYQ QKPGQP PKLLIY LASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC QQNNEDPLTFGAG TKLELK(SEQ ID NO: 74)	MGWSYIILFLVATATGVHS LVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASG YTFTSYFMYWV RQRPGQGLEWIG EINPSNGGNDFNEKFKSKAT LTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRS GDYGYDGFAYWGQG TLVTVSA (SEQ ID NO: 75)

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含具有SEQ ID NO: 23-26和79中的任一個的胺基酸序列的可變重鏈互補決定區1（VH CDR1）。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含具有SEQ ID NO: 27-30和80中的任一個的胺基酸序列的可變重鏈互補決定區2（VH CDR2）。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含具有SEQ ID NO: 31-34和81中的任一個的胺基酸序列的可變重鏈互補決定區3（VH CDR3）。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含具有SEQ ID NO: 11-14和76中的任一個的胺基酸序列的可變輕鏈互補決定區1（VL CDR1）。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含具有SEQ ID NO: 15-18和77中的任一個的胺基酸序列的可變輕鏈互補決定區2（VL CDR2）。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含具有SEQ ID NO: 19-22和78中的任一個的胺基酸序列的可變輕鏈互補決定區3（VL CDR3）。

在實施例中，本文提供了抗CoV S糖蛋白抗體，所述抗CoV S糖蛋白抗體包含選自SEQ ID NO: 11-14和76的VL CDR1；選自SEQ ID NO: 15-18和77的VL CDR2；選自SEQ ID NO: 19-22和78的VL CDR3；選自SEQ ID NO: 23-26和79的VH CDR1；選自SEQ ID NO: 27-30和80的VH CDR2；和選自SEQ ID NO: 31-34和81的VH CDR3。

在實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3獨立地選自表2。

表2.抗CoV S糖蛋白抗體的CDR序列

抗體名稱	VL CDR1	VL CDR2	VL CDR3	VH CDR1	VH CDR2	VH CDR3
425.6	SASSTMSFMY (SEQ ID NO: 11)	DTSNLAS (SEQ ID NO: 15)	QQWNTYPLT (SEQ ID NO: 19)	SYGIH (SEQ ID NO: 23)	VIWRGGSTDYNAAFMS (SEQ ID NO: 27)	HTEGDDVDY (SEQ ID NO: 31)
35.13	QATQDIVKNLN (SEQ ID NO: 12)	HATELAK (SEQ ID NO: 16)	LQFYDFPFT (SEQ ID NO: 20)	RYYIY (SEQ ID NO: 24)	EINPSNGDTHFNEKFKT (SEQ ID NO: 28)	HAYSFDF (SEQ ID NO: 32)
239.12	GASENIYGALN (SEQ ID NO: 13)	GATNLAD (SEQ ID NO: 17)	QNVLSTPYT (SEQ ID NO: 21)	SDYAWN (SEQ ID NO: 25)	YISNSAGTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 29)	GGWSSYYAMDY (SEQ ID NO: 33)
322.3	RASESVDSYGSSFMH (SEQ ID NO: 14)	LASNLES (SEQ ID NO: 18)	QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 22)	SDYIH (SEQ ID NO: 26)	WIYPGNINTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 30)	DDGNLYYYAMDY (SEQ ID NO: 34)
199.9	RASESVDTYGNSFMH (SEQ ID NO: 76)	LASNLES (SEQ ID NO: 77)	QQNNEDPLT (SEQ ID NO: 78)	YTFTSYFMY (SEQ ID NO: 79)	EINPSNGGNDFNEKFKS (SEQ ID NO: 80)	GDYGYDGFAY (SEQ ID NO: 81)

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 23的VH CDR1、SEQ ID NO: 27的VH CDR2和SEQ ID NO: 31的VH CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 11的VL CDR1、SEQ ID NO: 15的VL CDR2和SEQ ID NO: 19的VL CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 23的VH CDR1、SEQ ID NO: 27的VH CDR2和SEQ ID NO: 31的VH CDR3，以及SEQ ID NO: 11的VL CDR1、SEQ ID NO: 15的VL CDR2和SEQ ID NO: 19的VL CDR3。

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 24的VH CDR1、SEQ ID NO: 28的VH CDR2和SEQ ID NO: 32的VH CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 12的VL CDR1、SEQ ID NO: 16的VL CDR2和SEQ ID NO: 20的VL CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 24的VH CDR1、SEQ ID NO: 28的VH CDR2和SEQ ID NO: 32的VH CDR3，以及SEQ ID NO: 12的VL CDR1、SEQ ID NO: 16的VL CDR2和SEQ ID NO: 20的VL CDR3。

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 25的VH CDR1、SEQ ID NO: 29的VH CDR2和SEQ ID NO: 33的VH CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 13的VL CDR1、SEQ ID NO: 17的VL CDR2和SEQ ID NO: 21的VL CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 25的VH CDR1、SEQ ID NO: 29的VH CDR2和SEQ ID NO: 33的VH CDR3，以及SEQ ID NO: 13的VL CDR1、SEQ ID NO: 17的VL CDR2和SEQ ID NO: 21的VL CDR3。

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 26的VH CDR1、SEQ ID NO: 30的VH CDR2和SEQ ID NO: 34的VH CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 14的VL CDR1、SEQ ID NO: 18的VL CDR2和SEQ ID NO: 22的VL CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 26的VH CDR1、SEQ ID NO: 30的VH CDR2和SEQ ID NO: 34的VH CDR3，以及SEQ ID NO: 14的VL CDR1、SEQ ID NO: 18的VL CDR2和SEQ ID NO: 22的VL CDR3。

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 79的VH CDR1、SEQ ID NO: 80的VH CDR2和SEQ ID NO: 81的VH CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 76的VL CDR1、SEQ ID NO: 77的VL CDR2和SEQ ID NO: 78的VL CDR3。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含SEQ ID NO: 79的VH CDR1、SEQ ID NO: 80的VH CDR2和SEQ ID NO: 81的VH CDR3，以及SEQ ID NO: 76的VL CDR1、SEQ ID NO: 77的VL CDR2和SEQ ID NO: 78的VL CDR3。

本發明涵蓋與CoV S糖蛋白結合的抗體，所述抗體包含可以與SARS-CoV 2 S糖蛋白或其變體結合的本文所述的VH結構域（VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3），VL結構域（VL CDR1、VL CDR2或VL CDR3）的衍生物。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體與SARS-CoV-2毒株的CoV S糖蛋白結合，所述SARS-CoV-2毒株具有選自以下的PANGO譜系：B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1。

熟習此項技術者已知的標準技術可以用於在編碼抗體的核苷酸序列中引入修飾（例如，添加、缺失和/或取代），包括例如通常用於產生胺基酸取代的定點誘變和PCR介導的誘變。在另一個實施例中，VH和/或VL CDR衍生物可以具有在一個或多個預測的非必需胺基酸殘基（即，對於抗體與SARS-CoV-2 S糖蛋白特異性結合不是關鍵的胺基酸殘基）處進行的保守胺基酸取代（例如，同上）。也可以沿著編碼VH和/或VL CDR的序列的全部或部分隨機引入突變（諸如通過飽和誘變），並且可以篩選所得突變體的生物活性以鑒定保留活性的突變體。在誘變後，可以表現編碼的抗體並且可以確定所述抗體的活性。

本發明進一步涵蓋與SARS-CoV-2 S糖蛋白結合的抗體，其中所述抗體或抗體片段包含一個或多個CDR，其中所述CDR包含與本文所述的一個或多個CDR的胺基酸序列至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。兩個胺基酸序列的同一性百分比可以通過熟習此項技術者已知的任何方法（包括但不限於BLAST蛋白搜索）來確定。

抗CoV S糖蛋白抗體的架構區

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體包含各自含有四個架構區（FW1、FW2、FW3和FW4）的VL和VH。在實施例中，VL的FW1、FW2、FW3和FW4獨立地選自表4。在實施例中，VH的FW1、FW2、FW3和FW4獨立地選自表5。

表4.抗CoV S糖蛋白抗體的VL的FW1、FW2、FW3、FW4

抗體名稱	FW1	FW2	FW3	FW4
425.6	MSVSPGEKVTMT (SEQ ID NO: 44)	QKPGSSPRLL (SEQ ID NO: 48)	GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYY (SEQ ID NO: 52)	TKLELKR (SEQ ID NO: 56)
35.13	MSASLGDRITIT (SEQ ID NO: 45)	QKPGKPPSFL (SEQ ID NO: 49)	GVPSRFSGSGSGSDYSLTISNLESEDFADYY (SEQ ID NO: 53)	TKLELKR (SEQ ID NO: 57)
239.12	MTQSPASLSASVGETVTIT (SEQ ID NO: 46)	RKQGKSPQLL (SEQ ID NO: 50)	GMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYY (SEQ ID NO: 54)	TKLEIKR (SEQ ID NO: 58)
322.3	NIVLTQSPASLAVSLGQRATIS (SEQ ID NO: 47)	QKPGQPPKLL (SEQ ID NO: 51)	GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYY (SEQ ID NO: 55)	TKLEIK (SEQ ID NO: 59)
199.9	DTLLLWVLLLWVPGSTGNIVLTQSPASLAVSLGQRATIS (SEQ ID NO: 82)	QKPGQPPKLL (SEQ ID NO: 83)	GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYY (SEQ ID NO: 84)	TKLELK (SEQ ID NO: 85)

表5.抗CoV S糖蛋白抗體的VH的FW1、FW2、FW3、FW4

抗體名稱	FW1	FW2	FW3	FW4
425.6	QLKQSGPSLVQPSQSLSIT (SEQ ID NO: 60)	RQSPGKG (SEQ ID NO: 64)	RLTITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYY (SEQ ID NO: 140)	TSVTVSS (SEQ ID NO: 68)
35.13	VQLQQSGAELGKPGASVKLS (SEQ ID NO: 61)	KQRPGQG (SEQ ID NO: 65)	KATLTVDKSSSSAHIHLTSLTSEDSAVYY (SEQ ID NO: 141)	TTLTVSS (SEQ ID NO: 69)
239.12	VKLEESGPVLVKPSQSLSLT (SEQ ID NO: 62)	RQFPGNK (SEQ ID NO: 66)	RISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYY (SEQ ID NO: 142)	TSVTVSS (SEQ ID NO: 70)
322.3	RVQLQQSGPELVKPGASVTIS (SEQ ID NO: 63)	KQRPGQG (SEQ ID NO: 67)	KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYF (SEQ ID NO: 143)	TSVTVSS (SEQ ID NO: 71)
199.9	LVQLQQPGAELVKPGASVKLS (SEQ ID NO: 86)	RQRPGQG (SEQ ID NO: 87)	LTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYY (SEQ ID NO: 88)	TLVTVS (SEQ ID NO: 89)

Kabat編號是基於Kabat等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 出版號91-3242, 由National Institutes of Health, National Technical Information Service以三卷集出版的開創性工作（在下文中稱為“Kabat”）。Kabat提供了來自許多物種抗體同種型的免疫球蛋白鏈的多序列比對。將比對的序列根據單一編號系統（Kabat編號系統）進行編號。Kabat序列自1991年出版以來已經更新，並且可作為電子序列資料庫（最新可下載版本1997）獲得。通過與Kabat參考序列進行比對，可以根據Kabat對任何免疫球蛋白序列進行編號。因此，Kabat編號系統提供了用於對免疫球蛋白鏈進行編號的統一系統。除非另外指示，否則根據Kabat編號系統對本文所述的所有免疫球蛋白胺基酸序列進行編號。類似地，根據Kabat編號系統對本文所提到的所有單個胺基酸位置進行編號。

在另一個實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體的親和常數或K _a（k _on/k _off）可以為至少10 ²M ^-1、至少5 X 10 ²M ^-1、至少10 ³M ^-1、至少5 X 10 ³M ^-1、至少10 ⁴M ^-1、至少5 X 10 ⁴M ^-1、至少10 ⁵M ^-1、至少5 X 10 ⁵M ^-1、至少10 ⁶M ^-1、至少5 X 10 ⁶M ^-1、至少10 ⁷M ^-1、至少5 X 10 ⁷M ^-1、至少10 ⁸M ^-1、至少5 X 10 ⁸M ^-1、至少10 ⁹M ^-1、至少5 X 10 ⁹M ^-1、至少10 ¹⁰M ^-1、至少5 X 10 ¹⁰M ^-1、至少10 ¹¹M ^-1、至少5 X 10 ¹¹M ^-1、至少10 ¹²M ^-1、至少5 X 10 ¹²M ^-1、至少10 ¹³M ^-1、至少5 X 10 ¹³M ^-1、至少10 ¹⁴M ^-1、至少5 X 10 ¹⁴M ^-1、至少10 ¹⁵M ^-1或至少5 X 10 ¹⁵M ^-1。在實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體的解離常數或K _d（k _off/k _on）可以小於5 x 10 ^-2M、小於10 ^-2M、小於5 x 10 ^-3M、小於10 ^-3M、小於5 x 10 ^-4M、小於10 ^-4M、小於5 x 10 ^-5M、小於10 ^-5M、小於5 x 10 ^-6M、小於10 ^-6M、小於5 x 10 ^-7M、小於10 ^-7M、小於5 x 10 ^-8M、小於10 ^-8M、小於5 x 10 ^-9M、小於10 ^-9M、小於5 x 10 ^-10M、小於10 ^-10M、小於5 x 10 ^-11M、小於10 ^-11M、小於5 x 10 ^-12M、小於10 ^-12M、小於5 x 10 ^-13M、小於10 ^-13M、小於5 x 10 ^-14M、小於10 ^-14M、小於5 x 10 ^-15M或小於10 ^-15M，如使用本文所述的或熟習此項技術者已知的方法（例如，BIAcore測定、ELISA）評估的。

本發明進一步提供了包含編碼本文所述的抗CoV S糖蛋白抗體或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發明還涵蓋在嚴格或較低嚴格性雜交條件（例如，如本文所定義的）下與編碼抗CoV S糖蛋白抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。

嚴格雜交條件包括但不限於，在約45ºC下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC）中與濾器結合性DNA雜交，然後在約50ºC-65ºC下在0.2X SSC/0.1% SDS中進行一次或多次洗滌；高嚴格條件，諸如在約45ºC下在6X SSC中與濾器結合性DNA雜交，然後在約60ºC下在0.1X SSC/0.2% SDS中進行一次或多次洗滌；或者熟習此項技術者已知的任何其他嚴格雜交條件（參見例如，Ausubel, F.M.等人編輯 1989 Current Protocols in Molecular Biology, 第1卷, Green Publishing Associates, Inc.和John Wiley and Sons, Inc., NY 在第6.3.1頁至第6.3.6頁和第2.10.3頁）。

通過本領域已知的任何方法，可以獲得多核苷酸，並且可以確定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，則編碼所述抗體的多核苷酸可以由化學合成的寡核苷酸組裝（例如，如Kutmeier等人, BioTechniques 17:242 (1994)中所述），簡言之，其涉及合成含有編碼抗體的序列部分的重疊寡核苷酸，對這些寡核苷酸進行退火和連接，然後通過PCR擴增連接的寡核苷酸。

編碼抗體的多核苷酸也可以由來自合適來源的核酸產生。如果不可獲得含有編碼特定抗體的核酸的殖株，但是抗體分子的序列是已知的，則編碼免疫球蛋白的核酸可以化學合成或通過以下方式從合適的來源（例如，抗體cDNA文庫，或由從表現所述抗體的任何組織或細胞（諸如選擇表現抗體的雜交瘤細胞）產生的cDNA文庫或從所述組織或細胞中分離的核酸（優選polyA+RNA））獲得：使用可與序列的3’和5’端雜交的合成引子進行PCR擴增，或使用對特定基因序列具有特異性的寡核苷酸探針進行選殖，以鑒定例如來自編碼所述抗體的cDNA文庫的cDNA殖株。然後可以使用本領域熟知的任何方法將通過PCR產生的擴增的核酸選殖到複製型殖株載體中。

本發明還提供了編碼本文所述的抗體的VH和VL架構區和CDR的多核苷酸序列以及用於它們在哺乳動物細胞中的有效表現的表現載體。

在一個實施例中，本文所述的抗CoV S糖蛋白抗體介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、補體依賴性細胞介導的細胞毒性（CDC）和/或細胞凋亡。在一個實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC）和/或細胞凋亡。在一個實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體具有增強的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。在一個實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體包含介導增強的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）的變體Fc區。在一個實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體包含具有與Asn297連接的複合N-糖苷連接的糖鏈的Fc區，其中岩藻糖不與在還原端的N-乙醯葡糖胺結合，其中所述Fc區介導增強的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。

人類化抗 CoV S 糖蛋白抗體的產生

本文所述的人類化抗體可以使用本領域已知的多種技術產生，所述技術包括但不限於CDR移植（參見例如，歐洲專利號EP 239,400；國際公開號WO 91/09967；以及美國專利號5,225,539、5,530,101和5,585,089，將其各自通過引用以其整體併入本文），鑲飾或表面重修（參見例如，歐洲專利號EP 592,106和EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等人, 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814；和Roguska等人, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:969-973，將其各自通過引用以其整體併入本文），鏈改組（參見例如，美國專利號5,565,332，將其通過引用以其整體併入本文），以及披露於例如以下文獻中的技術：美國專利號6,407,213、美國專利號5,766,886、國際公開號WO 9317105、Tan等人, J. Immunol., 169:1119-25 (2002)、Caldas等人, Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)、Morea等人, Methods, 20(3):267-79 (2000)、Baca等人, J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997)、Roguska等人, Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)、Couto等人, Cancer Res., 55 (23增刊):5973s-5977s (1995)、Couto等人, Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)、Sandhu JS, Gene, 150(2):409-10 (1994)和Pedersen等人, J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)，將其各自通過引用以其整體併入本文。通常，FW區中的FW殘基將被來自CDR供體抗體的相應殘基取代以改變、優選改善抗原結合。通過本領域熟知的方法來鑒定這些FW取代，例如通過對CDR和FW殘基的相互作用建模以鑒定對於抗原結合重要的FW殘基，以及通過序列比較以鑒定在特定位置處的不尋常FW殘基。（參見例如，Queen等人, 美國專利號5,585,089；和Riechmann等人, 1988, Nature, 332:323，將其通過引用以其整體併入本文）。

人類化抗CoV S糖蛋白抗體具有從非人來源引入其中的一個或多個胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變結構域。因此，人類化抗體包含來自非人免疫球蛋白分子的一個或多個CDR和來自人的架構區。抗體的人類化是本領域熟知的，並且基本上可以遵循Winter和合作者（Jones等人, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人, Science, 239:1534-1536 (1988)）的方法通過將齧齒動物CDR或CDR序列取代為人抗體的相應序列（即，CDR移植（EP 239,400；PCT公開號WO 91/09967；和美國專利號4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，將其內容通過引用以其整體併入本文））來進行。在此類人類化嵌合抗體中，顯著少於完整的人可變結構域已經被來自非人物種的相應序列取代。實際上，人類化抗體通常是這樣的人抗體，其中一些CDR殘基和可能一些FW殘基被來自齧齒動物抗體中的類似位點的殘基取代。抗CoV S糖蛋白抗體的人類化也可以通過鑲飾或表面重修（EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等人, Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；和Roguska等人, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:969-973 (1994)）或者鏈改組（美國專利號5,565,332）來實現，將所述文獻的內容通過引用以其整體併入本文。

對待用於製備人類化抗體的輕鏈和重鏈兩者的人可變結構域的選擇是為了降低抗原性。根據所謂的“最佳擬合”方法，針對已知人可變結構域序列的整個文庫對齧齒動物抗體的可變結構域序列進行篩選。然後篩選與齧齒動物的序列最密切相關的人序列的對於預期的人類化mAb的抗原結合、適當結構形成和/或穩定性可能是關鍵的特定殘基的存在（Sims等人, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等人, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)，將其內容通過引用以其整體併入本文）。然後將匹配所需標準的所得FW序列用作人類化抗體的人供體FW區。

另一種方法使用源自輕鏈或重鏈的特定亞組的所有人抗體的共有序列的特定FW。相同的FW可以用於幾種不同的人類化抗CoV S糖蛋白抗體（Carter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等人, J. Immunol., 151:2623 (1993)，將其內容通過引用以其整體併入本文）。

抗CoV S糖蛋白抗體可以人類化為保留對SARS-CoV-2 S糖蛋白的高親和力和其他有利的生物特性。根據本發明的一方面，通過使用親本序列和人類化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人類化產物的方法來製備人類化抗體。免疫球蛋白三維模型是普遍可得的，並且是熟習此項技術者熟悉的。可獲得說明並展示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構形結構的電腦程式。檢查這些展示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合SARS-CoV-2 S糖蛋白的能力的殘基。以這種方式，可以從受體和輸入序列中選擇並組合FW殘基，從而獲得所需的抗體特徵（例如，對SARS-CoV-2 S糖蛋白的親和力）。通常，CDR殘基直接且最實質地涉及對抗原結合的影響。

“人類化”抗體可以保留與原始抗體類似的抗原特異性，在本發明中即結合SARS-CoV-2 S糖蛋白的能力。然而，使用某些人類化方法，抗體對SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合的親和力和/或特異性可以使用如由Wu等人, J. Mol. Biol, 294:151 (1999)（將其內容通過引用以其整體併入本文）描述的“定向進化”的方法改變。

可以通過選擇不同的人架構區用於移植如本文所述的239.12、322.3、425.6和35.13 CDR來構建本文所述的人類化抗CoV S糖蛋白抗體。

單株抗 CoV S 糖蛋白抗體

單株抗CoV S糖蛋白抗體對SARS-CoV-2抗原展現出結合特異性，並且可以介導人ADCC、CDC和/或細胞凋亡機制。這種抗體可以使用本領域已知的多種多樣的技術（包括使用雜交瘤技術、重組技術和噬菌體展示技術或其組合）產生。抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。工程化抗CoV S糖蛋白抗體可以通過本領域已知的任何手段（包括但不限於以下描述的那些技術和對那些技術的改進）產生。大規模高產率生產通常涉及培養產生工程化抗CoV S糖蛋白抗體的宿主細胞，並且從宿主細胞培養物中回收抗CoV S糖蛋白抗體。

雜交瘤技術

單株抗體可以使用雜交瘤技術產生，所述雜交瘤技術包括本領域已知的和例如在以下文獻中教導的技術：Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988)；Hammerling等人, Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)（將所述參考文獻通過引用以其整體併入本文）。例如，在雜交瘤方法中，對小鼠或其他適當的宿主動物（諸如倉鼠或獼猴）進行免疫以得到產生或能夠產生抗體的淋巴細胞，所述抗體將與用於免疫的蛋白質特異性結合。淋巴細胞也可以在體外進行免疫。然後使用合適的融合劑（諸如聚乙二醇）將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 第59-103頁 (Academic Press, 1986)）。

將如此製備的雜交瘤細胞接種在合適的培養基中並且使它們在其中生長，所述培養基含有一種或多種抑制非融合的親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HGPRT或HPRT），則雜交瘤的培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤和胸苷（HAT培養基），所述物質防止HGPRT缺陷型細胞生長。

具體實施例採用這樣的骨髓瘤細胞，它們有效融合，支持由所選的產生抗體的細胞穩定地高水準產生抗體，並且對諸如HAT培養基的培養基敏感。這些骨髓瘤細胞系包括鼠骨髓瘤細胞系，諸如源自可從美國加利福尼亞州聖地牙哥的索爾克研究所細胞分配中心（Salk Institute Cell Distribution Center）獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤以及可從美國馬里蘭州羅克維爾的美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection）獲得的SP-2或X63-Ag8.653細胞的鼠骨髓瘤細胞系。還已經描述了用於產生人單株抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。

對雜交瘤細胞在其中生長的培養基進行測定，以產生針對SARS-CoV-2 S糖蛋白的單株抗體。由雜交瘤細胞產生的單株抗體的結合特異性可以通過免疫沈澱或通過體外結合測定（諸如放射免疫測定（RIA）或酶聯免疫吸附測定（ELISA））來確定。

在鑒定出產生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞後，可以通過有限稀釋程序對殖株進行亞選殖，並且通過標準方法使其生長（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 第59-103頁 (Academic Press, 1986)）。用於此目的的合適培養基包括例如D-MEM或RPMI 1640培養基。另外，雜交瘤細胞可以在動物中作為腹水腫瘤在體內生長。

通過常規免疫球蛋白純化程序（例如像蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析）將由亞殖株分泌的單株抗體與培養基或血清適當地分離。

重組 DNA 技術

容易地分離編碼本文所述的抗CoV S糖蛋白抗體的DNA並且使用常規程序（例如，通過使用能夠與編碼抗CoV S糖蛋白抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針）進行測序。雜交瘤細胞充當這種DNA的來源。一旦分離，便可以將DNA置於表現載體中，然後將所述表現載體轉染到原本不產生免疫球蛋白的宿主細胞（諸如大腸桿菌（E. coli）細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞或骨髓瘤細胞）中，以在重組宿主細胞中獲得抗CoV S糖蛋白抗體的合成。

在噬菌體展示方法中，功能性抗體結構域展示在攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上。具體而言，從動物cDNA文庫（例如，受影響組織的人或鼠cDNA文庫）擴增編碼V _H和V _L結構域的DNA序列。將編碼V _H和V _L結構域的DNA通過PCR用scFv連接子重組在一起，並且選殖到噬菌粒載體中。將載體電穿孔到大腸桿菌中，並且用輔助噬菌體感染大腸桿菌。在這些方法中使用的噬菌體通常是包括fd和M13的絲狀噬菌體，並且V _H和V _L結構域通常重組融合至噬菌體基因III或基因VIII。可以用抗原（例如，使用標記的抗原或者結合或捕獲到固體表面或珠上的抗原）選擇或鑒定表現與特定抗原結合的抗原結合結構域的噬菌體。可以用於製備本發明的抗體的噬菌體展示方法的例子包括披露於以下文獻中的噬菌體展示方法：Brinkman等人, 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50；Ames等人, 1995, J. Immunol. Methods, 184:177-186；Kettleborough等人, 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958；Persic等人, 1997, Gene, 187:9-18；Burton等人, 1994, Advances in Immunology, 57:191-280；國際申請號PCT/GB91/O1 134；國際公開號WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；以及美國專利號5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108；將其各自通過引用以其整體併入本文。

如以上參考文獻中所述，在選擇噬菌體後，可以分離來自噬菌體的抗體編碼區，並且將其用於產生完整抗體（包括人抗體）或任何其他所需的抗原結合片段，並且在任何所需宿主（包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌）中表現，例如如下所述。也可以使用本領域已知的方法採用重組產生Fab、Fab’和F(ab’) ₂片段的技術，所述方法諸如披露於以下文獻中的方法：PCT公開號WO 92/22324；Mullinax等人, 1992, BioTechniques, 12(6):864-869；Sawai等人, 1995, AJRI, 34:26-34；和Better等人, 1988, Science, 240:1041-1043（將所述參考文獻通過引用以其整體而併入）。

可以從使用McCafferty等人, Nature, 348:552-554 (1990)中描述的技術產生的抗體噬菌體文庫中分離抗體。Clackson等人, Nature, 352:624-628 (1991)、 Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)分別描述了使用噬菌體文庫的鼠抗體和人抗體的分離。鏈改組可以用於產生高親和力（nM範圍）的人抗體（Marks等人, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)），並且組合感染和體內重組可以用作構建非常大的噬菌體文庫的策略（Waterhouse等人, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)）。因此，這些技術是用於分離抗CoV S糖蛋白抗體的傳統單株抗體雜交瘤技術的可行替代方案。

為了產生完整抗體，包括VH或VL核苷酸序列、限制性位點和保護限制性位點的側翼序列的PCR引子可以用於擴增scFv殖株中的VH或VL序列。利用熟習此項技術者已知的選殖技術，可以將PCR擴增的VH結構域選殖到表現重鏈恒定區（例如，人γ4恒定區）的載體中，並且可以將PCR擴增的VL結構域選殖到表現輕鏈恒定區（例如，人κ或λ恒定區）的載體中。用於表現VH或VL結構域的載體可以包含EF-1a啟動子、分泌信號、可變結構域的選殖位點、恒定結構域的選殖位點和選擇標記（諸如新黴素）。也可以將VH和VL結構域選殖到一種表現必要恒定區的載體中。然後使用熟習此項技術者已知的技術將重鏈轉化載體和輕鏈轉化載體共轉染到細胞系中以產生表現全長抗體（例如，IgG）的穩定或暫態細胞系。

還可以修飾DNA，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定結構域的編碼序列取代同源鼠序列（美國專利號4,816,567；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)），或通過將非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或部分共價連接至免疫球蛋白編碼序列。

嵌合抗體

本文的抗CoV S糖蛋白抗體具體包括嵌合抗體（免疫球蛋白），其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而所述一條或多條鏈的另一部分與源自另一種物種或屬於另一種抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源；以及此類抗體的片段，只要它們展現出所需的生物活性即可（美國專利號4,816,567；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本文的目的嵌合抗體包括包含源自非人靈長類動物（例如，舊大陸猴，諸如狒狒、恒河猴或食蟹猴）的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列的“靈長類動物類化”抗體（美國專利號5,693,780）。

在實施例中，本文所述的抗CoV S糖蛋白抗體或對SARS-CoV-2 S糖蛋白的K _D可以為50 nM或更小、10 nM或更小、1 nM或更小、0.5 nM或更小、0.1 nM或更小、0.05 nM或更小、0.01 nM或更小或者0.001 nM或更小。適合於確定本發明的抗體或其改變的/突變的衍生物的此類結合特徵的方法和試劑是本領域已知的和/或可商購的（參見上文，以及例如美國專利號6,849,425、美國專利號6,632,926、美國專利號6,294,391和美國專利號6,143,574，將其各自通過引用以其整體特此併入）。此外，為此類動力學分析設計的設備和軟體是可商購的（例如，Biacore ^®A100和Biacore ^®2000儀器；Biacore International AB，瑞典烏普薩拉）。

關於序列的同一性或相似性在本文中被定義為在比對序列並且引入空位（如果必要）以獲得最大序列同一性百分比後，候選序列中與抗CoV S糖蛋白抗體相同（即，相同殘基）或類似（即，基於共同的側鏈特性，來自相同的組的胺基酸殘基，參見下文）的胺基酸殘基的百分比。在可變結構域外的抗體序列中的N末端、C末端或內部延伸、缺失或插入都不應當被解釋為影響序列同一性或相似性。

用於比較兩個或更多個序列的同一性的方法是本領域熟知的。使用可在網上獲得的工具CLUSTALW2計算同一性百分比。可以將以下默認參數用於CLUSTALW2配對比對：蛋白質權重矩陣 = Gonnet；空位開放 = 10；空位延伸 = 0.1。除非另外說明，否則利用CLUSTALW2工具來計算本文的同一性百分比。

為了產生改變的抗體，在物種依賴性抗體的一個或多個高變區中引入一個或多個胺基酸改變（例如，取代）。也可以在抗CoV S糖蛋白抗體中引入架構區殘基的一個或多個改變（例如，取代），其中這些改變導致抗體突變體對來自第二哺乳動物物種的抗原的結合親和力提高。待修飾的架構區殘基的例子包括非共價直接結合抗原的殘基（Amit等人, Science, 233:747-753 (1986)）；與CDR相互作用/影響CDR的構形的殘基（Chothia等人, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)）；和/或參與V _L-V _H介面的殘基（EP 239 400B1）。在某些實施例中，修飾一個或多個此類架構區殘基導致抗體對來自第二哺乳動物物種的抗原的結合親和力增強。例如，在本發明的此實施例中可以改變從約一個至約五個架構殘基。有時，這可能足以產生適合用於在臨床前試驗中使用的抗體突變體，甚至在沒有高變區殘基被改變的情況下。然而，通常，改變的抗體將包含一個或多個另外的高變區改變。

被改變的高變區殘基可以隨機變化，特別是在抗CoV S糖蛋白抗體對來自第二哺乳動物物種的抗原的起始結合親和力使得可以容易地篩選這種隨機產生的改變的抗體的情況下。

用於產生這種改變的抗體的一種有用程序被稱為“丙胺酸掃描誘變”（Cunningham和Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)）。這裡，一個或多個高變區殘基被一個或多個丙胺酸或聚丙胺酸殘基替代，以影響胺基酸與來自第二哺乳動物物種的抗原的相互作用。然後通過在或對取代位點引入另外的或其他突變來完善顯示出對取代的功能敏感性的那一個或多個高變區殘基。因此，雖然預先確定用於引入胺基酸序列變異的位點，但不需要預先確定突變本身的性質。如本文所述，篩選以這種方式產生的Ala突變體的生物活性。

用於產生這種改變的抗體的另一種程序涉及使用噬菌體展示的親和力成熟（Hawkins等人, J. Mol. Biol., 254:889-896 (1992)和Lowman等人, Biochemistry, 30(45):10832-10837 (1991)）。簡言之，使幾個高變區位點（例如，6-7個位點）突變，以在每個位點處產生所有可能的胺基酸取代。如此產生的抗體突變體從絲狀噬菌體顆粒以單價方式展示，作為與包裝在每個顆粒內的M13的基因III產物的融合體。然後如本文所公開，篩選噬菌體展示的突變體的生物活性（例如，結合親和力）。

抗體序列中的突變可以包括取代、缺失（包括內部缺失）、添加（包括產生融合蛋白的添加），或胺基酸序列內和/或與其鄰近但導致“沈默”變化的胺基酸殘基的保守取代，因為這種變化產生在功能上等同的抗CoV S糖蛋白抗體。可以基於所涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質的相似性進行保守胺基酸取代。例如，非極性（疏水）胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、擷胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；帶正電荷的（鹼性）胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；並且帶負電荷的（酸性）胺基酸包括天門冬胺酸和麩胺酸。另外，甘胺酸和脯胺酸是可以影響鏈取向的殘基。非保守取代將需要將這些類別之一的成員交換為另一種類別的成員。此外，如果需要，可以將非經典胺基酸或化學胺基酸類似物作為取代或添加引入抗體序列中。非經典胺基酸包括但不限於常見胺基酸的D-異構體、α-胺基異丁酸、4-胺基丁酸、Abu、2-胺基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-胺基己酸、Aib、2-胺基異丁酸、3-胺基丙酸、鳥胺酸、正白胺酸、正擷胺酸、羥脯胺酸、肌胺酸、瓜胺酸、磺基丙胺酸、叔丁基甘胺酸、叔丁基丙胺酸、苯基甘胺酸、環己基丙胺酸、β-丙胺酸、氟胺基酸、設計胺基酸（諸如β-甲基胺基酸、Cα-甲基胺基酸、Nα-甲基胺基酸）和一般的胺基酸類似物。

在另一個實施例中，使用噬菌體展示對選擇進行修飾的位點進行親和力成熟（參見上文）。

本領域已知的任何誘變技術都可以用於修飾DNA序列中的單獨核苷酸，為了在抗體序列中進行一個或多個胺基酸取代，或用於產生/缺失限制性位點以有助於進一步操作。此類技術包括但不限於化學誘變、體外定點誘變（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985)；Hutchinson, C.等人, J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)）、寡核苷酸定點誘變（Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-463 (1985)；Hill等人, Methods Enzymol., 155:558-568 (1987)）、基於PCR的重疊延伸（Ho等人, Gene, 77:51-59 (1989)）、基於PCR的大引子誘變（Sarkar等人, Biotechniques, 8:404-407 (1990)）等。可以通過雙鏈雙去氧DNA測序確認修飾。

在本發明的某些實施例中，可以修飾抗CoV S糖蛋白抗體以產生融合蛋白；即融合至異源蛋白、多肽或肽的抗體或其片段。

可以通過基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組（統稱為“DNA改組”）的技術產生另外的融合蛋白。DNA改組可以用於改變抗CoV S糖蛋白抗體（例如，具有較高親和力和較低解離速率的抗體或其片段）的活性。一般參見，美國專利號5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458，以及Patten等人, 1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson等人, 1999, J. Mol. Biol., 287:265-76；及Lorenzo和Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313（將這些專利和出版物中的每一個通過引用以其整體特此併入）。抗體可以進一步是如在全部都是Ledbetter等人的美國公開案20030118592、美國公開案200330133939和PCT公開案WO 02/056910（將其通過引用以其整體併入本文）中所述的結合結構域免疫球蛋白融合蛋白。

結構域抗體

本發明的組合物和方法的抗CoV S糖蛋白抗體可以是對應於人抗體的重鏈的可變區（V _H）或輕鏈的可變區（V _L）的結構域抗體（例如，含有抗體的小功能結合單元的抗體）。結構域抗體的例子包括但不限於可從Domantis Limited（英國劍橋）和Domantis Inc.（美國麻塞諸塞州劍橋）獲得的對治療靶標具有特異性的結構域抗體（參見例如，WO 04/058821；WO 04/003019；美國專利號6,291,158；6,582,915；6,696,245；和6,593,081）。

雙抗體

在本發明的某些實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體是“雙抗體”。術語“雙抗體”是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含與同一條多肽鏈（V _H-V _L）中的輕鏈可變結構域（V _L）連接的重鏈可變結構域（V _H）。通過使用過短而不允許在同一條鏈上的兩個結構域之間配對的連接子，迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙抗體更全面地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)中。

線性抗體

在本發明的某些實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體是線性抗體。線性抗體包含形成一對抗原結合區的一對串聯Fd區段（V _H-C _H1-V _H-C _H1）。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。參見，Zapata等人, Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)。

抗體片段

“抗體片段”包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab ^’、F(ab ^’) ₂和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。

傳統上，經由蛋白水解消化完整抗體來得到這些片段（參見例如，Morimoto等人, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)和Brennan等人, Science, 229:81 (1985)）。然而，現在可以直接由重組宿主細胞產生這些片段。例如，可以從以上討論的抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。也可以直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段並且將其化學偶聯以形成F(ab') ₂片段（Carter等人, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）。根據另一種方法，可以直接從重組宿主細胞培養物中分離F(ab') ₂片段。用於產生抗體片段的其他技術對於熟練從業人員將是清楚的。在其他實施例中，選擇的抗體是單鏈Fv片段（scFv）。參見例如，WO 93/16185。在某些實施例中，抗體不是Fab片段。

雙特異性抗體

雙特異性抗體是對至少兩種不同的表位具有結合特異性的抗體。

用於製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。（參見例如，Millstein等人, Nature, 305:537-539 (1983)；Traunecker等人, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)；Suresh等人, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)；Kostelny等人, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)；Hollinger等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)；Gruber等人, J. Immunol., 152:5368 (1994)；美國專利號4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,81；95,731,168；4,676,980；和4,676,980；WO 94/04690；WO 91/00360；WO 92/200373；WO 93/17715；WO 92/08802；和EP 03089）。

在本發明的組合物和方法的抗CoV S糖蛋白抗體是雙特異性的一個實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體可以是人或人類化的，並且對SARS-CoV-2 S糖蛋白和T細胞上的表位可以具有特異性，或者可以能夠與人效應細胞（例如像單核細胞/巨噬細胞和/或自然殺傷細胞）結合以實現細胞死亡。

在一個實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體是能夠與第一抗原和第二抗原特異性結合的雙特異性抗體，其中所述第一抗原是SARS-CoV-2 S糖蛋白，並且所述第二抗原是選自FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIV的Fcγ受體。在一個另外的實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體是能夠與SARS-CoV-2和FcγRIIB特異性結合的雙特異性抗體。在另一個實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體是能夠與SARS-CoV-2 S糖蛋白和人FcγRIIB特異性結合的雙特異性抗體。

變體 Fc 區

本發明提供了具有變體Fc結構域（即，非天然存在的Fc區，例如包含一個或多個非天然存在的胺基酸殘基的Fc區）的抗CoV S糖蛋白抗體。本發明的變體Fc區還涵蓋包含胺基酸缺失、添加和/或修飾的Fc區。

將理解的是，如本文所用的Fc區包括包含不包括第一恒定區免疫球蛋白結構域的抗體恒定區的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最後兩個恒定區免疫球蛋白結構域，並且是IgE和IgM的最後三個恒定區免疫球蛋白結構域，以及這些結構域N-末端的柔性鉸鏈。對於IgA和IgM，Fc可以包括J鏈。對於IgG，Fc包含免疫球蛋白結構域Cgamma2和Cgamma3（Cγ2和Cγ3）以及在Cgamma1（Cγ1）與Cgamma2（Cγ2）之間的鉸鏈。儘管Fc區的邊界可能變化，但通常所界定的人IgG重鏈Fc區包含其羧基末端的殘基C226或P230，其中編號是根據如Kabat等人（1991, NIH出版91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA）中的EU索引。“如Kabat中所闡述的EU索引”是指如Kabat等人同上中所述的人IgG1 EU抗體的殘基編號。Fc可以指代分離的此區域，或抗體、抗體片段或Fc融合蛋白情況下的此區域。Fc變體蛋白可以是包含Fc區的抗體、Fc融合體或任何蛋白質或蛋白質結構域，包括但不限於包含變體Fc區（其是非天然存在的Fc變體）的蛋白質。注意：已經在許多Fc位置（包括但不限於Kabat 270、272、312、315、356和358）處觀察到多態性，因此在呈現的序列與現有技術的序列之間可能存在微小差異。

本發明涵蓋具有變體Fc結構域的抗CoV S糖蛋白抗體。相對于可比較分子（例如，除了具有野生型Fc區之外，具有相同胺基酸序列的蛋白質），變體Fc結構域對Fc配體（例如，Fc受體、C1q）可以具有改變的結合特性。結合特性的例子包括但不限於結合特異性、平衡解離常數（K _D）、解離和締合速率（分別為k _off和k _on）、結合親和力和/或親合力。通常理解的是，具有低K _D的結合分子（例如，諸如抗體的Fc變體蛋白）可以比具有高K _D的結合分子優選。然而，在一些情況下，kon或koff的值可以比K _D的值更相關。熟習此項技術者可以確定哪個動力學參數對於給定的抗體應用最重要。

Fc結構域對其配體的親和力和結合特性可以通過本領域已知的用於確定Fc-FcγR相互作用（即，Fc區與FcγR的特異性結合）的多種體外測定方法（基於生物化學或免疫學的測定）來確定，所述體外測定方法包括但不限於平衡方法（例如，酶聯免疫吸附測定（ELISA）或放射免疫測定（RIA））或動力學（例如，BIACORE ^®分析）以及其他方法諸如間接結合測定、競爭抑制測定、螢光共振能量轉移（FRET）、凝膠電泳和層析（例如，凝膠過濾）。這些和其他方法可以在一種或多種被檢查的組分上利用標記和/或採用多種檢測方法，包括但不限於發色、螢光、發光或同位素標記。結合親和力和動力學的詳細描述可以在Paul, W.E.編輯, Fundamental Immunology, 第4版, Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)中找到，其聚焦於抗體-免疫原相互作用。

在一個實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗CoV S糖蛋白抗體具有增強的與一種或多種Fc配體的結合。在另一個實施例中，具有變體Fc結構域的抗CoV S糖蛋白抗體對Fc配體的親和力比可比較分子對Fc配體的親和力高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在一個具體實施例中，具有變體Fc結構域的抗CoV S糖蛋白抗體具有增強的與Fc受體的結合。在另一個具體實施例中，具有變體Fc結構域的抗CoV S糖蛋白抗體具有增強的與Fc受體FcγRIIIA的結合。在一個另外的具體實施例中，具有變體Fc結構域的抗CoV S糖蛋白抗體具有增強的與Fc受體FcγRIIB的結合。在仍另一個具體實施例中，具有變體Fc結構域的抗CoV S糖蛋白抗體具有增強的與Fc受體FcRn的結合。在又另一個具體實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗CoV S糖蛋白抗體具有增強的與C1q的結合。

在一個實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體包含變體Fc結構域，其中相對於可比較的非變體Fc結構域，所述變體Fc結構域具有增強的對Fcγ受體IIB的結合親和力。在一個另外的實施例中，本發明的抗CoV S糖蛋白抗體包含變體Fc結構域，其中所述變體Fc結構域對Fcγ受體IIB的親和力比可比較的非變體Fc結構域對Fcγ受體IIB的親和力高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。

可以通過增加Fc區對FcRn的結合親和力來增加包含Fc區的蛋白質的血清半衰期。在一個實施例中，相對于可比較分子，包含變體Fc結構域的抗體具有增強的血清半衰期。

“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是指這樣的細胞毒性形式，其中結合到某些細胞毒性細胞（例如，自然殺傷（NK）細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞）上存在的Fc受體（FcR）上的分泌Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠與攜帶抗原的靶細胞特異性結合，隨後用細胞毒素殺死靶細胞。指向靶細胞表面的特異性高親和力IgG抗體“武裝”細胞毒性細胞，並且是這種殺傷絕對必需的。靶細胞的裂解是細胞外的，需要直接的細胞與細胞接觸，並且不涉及補體。

可以測定包含變體Fc結構域的抗體通過ADCC介導靶細胞裂解的能力。為了評估ADCC活性，將目的Fc變體蛋白與可以被抗原抗體複合物啟動的免疫效應細胞組合添加到靶細胞中，導致靶細胞的細胞溶解。通常通過從裂解的細胞釋放標記（例如，放射性底物、螢光染料或天然細胞內蛋白）來檢測細胞溶解。用於此類測定的有用效應細胞包括外周血單個核細胞（PBMC）和自然殺傷（NK）細胞。體外ADCC測定的具體例子描述於Wisecarver等人, 1985 79:277-282；Bruggemann等人, 1987, J Exp Med 166:1351-1361；Wilkinson等人, 2001, J Immunol Methods 258:183-191；Patel等人, 1995 J Tmmunol Methods 184:29-38中。也可以在體內（例如，在動物模型中，諸如披露於Clynes等人, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656中的動物模型）評估目的Fc變體蛋白的ADCC活性。

在一個實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體具有增強的ADCC活性。在一個具體實施例中，具有變體Fc結構域的抗體的ADCC活性比可比較分子的ADCC活性高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一個具體實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體具有增強的與Fc受體FcγRIIIA的結合並且具有增強的ADCC活性。在其他實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體既具有增強的ADCC活性又具有增強的血清半衰期。

在一個實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體具有降低的ADCC活性。在一個具體實施例中，Fc變體蛋白的ADCC活性比可比較分子的ADCC活性低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一個具體實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體具有減弱的與Fc受體FcγRIIIA的結合並且具有降低的ADCC活性。在其他實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體既具有降低的ADCC活性又具有增強的血清半衰期。

“補體依賴性細胞毒性”和“CDC”是指在補體的存在下靶細胞的裂解。通過使補體系統的第一組分（C1q）與和同源抗原複合的分子（例如，抗體）結合來啟動補體啟動途徑。為了評估補體啟動，可以進行CDC測定，例如如Gazzano-Santoro等人, 1996, J. Immunol. Methods, 202:163中所述。在一個實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體具有增強的CDC活性。在一個具體實施例中，Fc變體蛋白的CDC活性比可比較分子的CDC活性高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在其他實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體既具有增強的CDC活性又具有增強的血清半衰期。

在一個實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體具有減弱的與一種或多種Fc配體的結合。在另一個實施例中，具有變體Fc結構域的抗體對Fc配體的親和力比可比較分子對Fc配體的親和力低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在一個具體實施例中，具有變體Fc結構域的抗體具有減弱的與Fc受體的結合。在另一個具體實施例中，具有變體Fc結構域的抗體具有減弱的與Fc受體FcγRIIIA的結合。在一個另外的具體實施例中，本文所述的具有變體Fc結構域的抗體對Fc受體FcγRIIIA的親和力比可比較分子對Fc受體FcγRIIIA的親和力低至少約5倍，其中所述具有變體Fc結構域的抗體對Fc受體FcγRIIB的親和力在可比較分子對Fc受體FcγRIIB的親和力的約2倍內。在仍另一個具體實施例中，Fc變體蛋白具有減弱的與Fc受體FcRn的結合。在又另一個具體實施例中，相對于可比較分子，具有變體Fc結構域的抗體具有減弱的與C1q的結合。

在一個實施例中，本發明提供了具有變體Fc結構域的抗體，其中Fc區在一個或多個選自以下的位置處包含非天然存在的胺基酸殘基：234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）。任選地，Fc區可以在熟習此項技術者已知的另外的和/或替代的位置處包含非天然存在的胺基酸殘基（參見例如，美國專利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT專利公開案WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217；WO 05/092925和WO 06/020114）。

在一個實施例中，本發明提供了配製品，其中Fc區在一個或多個選自以下的位置處包含非天然存在的胺基酸殘基：234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）。任選地，Fc區可以在熟習此項技術者已知的另外的和/或替代的位置處包含非天然存在的胺基酸殘基（參見例如，美國專利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT專利公開案WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217；WO 05/092925和WO 06/020114）。

在一個具體實施例中，本發明提供了具有變體Fc結構域的抗體，其中Fc區包含至少一個選自以下的非天然存在的胺基酸殘基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、2341、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、2351、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、2401、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、2621、262A、262T、262E、2631、263A、263T、263M、264L、2641、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、2651、265L、265H、265T、2661、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、2961、296H、269G、297S、297D、297E、298H、2981、298T、298F、2991、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、3051、313F、316D、325Q、325L、3251、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、3281、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、3301、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、3311、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）。任選地，Fc區可以包含熟習此項技術者已知的另外的和/或替代的非天然存在的胺基酸殘基（參見例如，美國專利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT專利公開案WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217）。

在一個具體實施例中，本發明提供了具有變體Fc結構域的抗體，其中Fc區包含至少一個選自以下的非天然存在的胺基酸殘基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、2341、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、2351、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、2401、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、2621、262A、262T、262E、2631、263A、263T、263M、264L、2641、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、2651、265L、265H、265T、2661、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、2961、296H、269G、297S、297D、297E、298H、2981、298T、298F、2991、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、3051、313F、316D、325Q、325L、3251、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、3281、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、3301、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、3311、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、3311、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）。任選地，Fc區可以包含熟習此項技術者已知的另外的和/或替代的非天然存在的胺基酸殘基（參見例如，美國專利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT專利公開案WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217）。

在另一個實施例中，本發明提供了具有變體Fc結構域的抗體，其中Fc區在一個或多個選自239、330和332（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的位置處包含至少一個非天然存在的胺基酸。在一個具體實施例中，本發明提供了Fc變體，其中Fc區包含至少一個選自239D、330L和332E（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸。任選地，Fc區可以在一個或多個選自252、254和256（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的位置處進一步包含另外的非天然存在的胺基酸。在一個具體實施例中，本發明提供了Fc變體，其中Fc區包含至少一個選自239D、330L和332E（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸，並且在一個或多個位置處包含至少一個選自252Y、254T和256E（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸。

在另一個實施例中，本發明提供了具有變體Fc結構域的抗體，其中Fc區在一個或多個選自234、235和331（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的位置處包含至少一個非天然存在的胺基酸。在一個具體實施例中，本發明提供了Fc變體，其中Fc區包含至少一個選自234F、235F、235Y和331S（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸。在一個另外的具體實施例中，本發明的Fc變體包含非天然存在的胺基酸殘基234F、235F和331S（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）。在另一個具體實施例中，本發明的Fc結構域包含非天然存在的胺基酸殘基234F、235Y和331S（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）。任選地，Fc區可以在一個或多個選自252、254和256（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的位置處進一步包含另外的非天然存在的胺基酸。在一個具體實施例中，本發明提供了Fc變體，其中Fc區包含至少一個選自234F、235F、235Y和331S（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸；並且在一個或多個位置處包含至少一個選自252Y、254T和256E（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸。

在另一個實施例中，本發明提供了具有變體Fc結構域的抗體，其中Fc區在一個或多個選自239、330和332（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的位置處包含至少一個非天然存在的胺基酸。在一個具體實施例中，本發明提供了Fc變體蛋白配製品，其中Fc區包含至少一個選自239D、330L和332E（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸。任選地，Fc區可以在一個或多個選自252、254和256（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的位置處進一步包含另外的非天然存在的胺基酸。在一個具體實施例中，本發明提供了Fc變體蛋白配製品，其中Fc區包含至少一個選自239D、330L和332E（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸，並且在一個或多個位置處包含至少一個選自252Y、254T和256E（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸。

在另一個實施例中，本發明提供了具有變體Fc結構域的抗體，其中Fc區在一個或多個選自234、235和331（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的位置處包含至少一個非天然存在的胺基酸。在一個具體實施例中，本發明提供了Fc變體蛋白配製品，其中Fc區包含至少一個選自234F、235F、235Y和331S（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸。任選地，Fc區可以在一個或多個選自252、254和256（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的位置處進一步包含另外的非天然存在的胺基酸。在一個具體實施例中，本發明提供了Fc變體蛋白配製品，其中Fc區包含至少一個選自234F、235F、235Y和331S（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸；並且在一個或多個位置處包含至少一個選自252Y、254T和256E（如通過如Kabat中所闡述的EU索引編號）的非天然存在的胺基酸。

在一個實施例中，本發明的Fc變體可以與其他已知的Fc變體組合，所述其他已知的Fc變體諸如披露於以下文獻中的Fc變體：Ghetie等人, 1997, Nat Biotech. 15:637-40；Duncan等人, 1988, Nature 332:563-564；Lund等人, 1991, J. Immunol 147:2657-2662；Lund等人, 1992, Mol Immunol 29:53-59；Alegre等人, 1994, Transplantation 57:1537-1543；Hutchins等人, 1995, Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984；Jefferis等人, 1995, Immunol Lett. 44:111-117；Lund等人, 1995, Faseb J 9:115-119；Jefferis等人, 1996, Immunol Lett 54:101-104；Lund等人, 1996, J Immunol 157:4963-4969；Armour等人, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624；Idusogie等人, 2000, J Immunol 164:4178-4184；Reddy等人, 2000, J Immunol 164:1925-1933；Xu等人, 2000, Cell Immunol 200:16-26；Idusogie等人, 2001, J Immunol 166:2571-2575；Shields等人, 2001, J Biol Chem 276:6591-6604；Jefferis等人, 2002, Immunol Lett 82:57-65；Presta等人, 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490；美國專利號5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美國專利公開號2004/0002587和PCT公開案WO 94/29351；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919；WO 04/029207；WO 04/099249；WO 04/063351。本發明還涵蓋包含缺失、添加和/或修飾的Fc區。Fc結構域的仍其他修飾/取代/添加/缺失對於熟習此項技術者將是容易清楚的。

用於產生非天然存在的Fc區的方法是本領域已知的。例如，胺基酸取代和/或缺失可以通過誘變方法產生，所述誘變方法包括但不限於定點誘變（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)）、PCR誘變（Higuchi, “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, Academic Press, San Diego, 第177-183頁 (1990)）和盒式誘變（Wells等人, Gene 34:315-323 (1985)）。優選地，通過重疊延伸PCR方法（Higuchi, “PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification”, Stockton Press, New York, 第61-70頁 (1989)）進行定點誘變。重疊延伸PCR技術（Higuchi, 同上）也可以用於將任何所需的一個或多個突變引入靶序列（起始DNA）中。例如，重疊延伸方法中的第一輪PCR涉及用外部引子（引子1）和內部誘變引子（引子3）擴增靶序列，並且單獨用第二外部引子（引子4）和內部引子（引子2）擴增靶序列，產生兩個PCR區段（區段A和B）。內部誘變引子（引子3）被設計為含有與靶序列的錯配，指定所需的一個或多個突變。在第二輪PCR中，使用兩種外部引子（引子1和4）通過PCR擴增第一輪PCR的產物（區段A和B）。用限制酶消化所得的全長PCR區段（區段C），並且將所得的限制性片段選殖到適當的載體中。作為誘變的第一步，將起始DNA（例如，編碼Fc融合蛋白、抗體或僅Fc區）可操作地選殖到誘變載體中。引子被設計用於反映所需的胺基酸取代。可用于產生變體Fc區的其他方法是本領域已知的（參見例如，美國專利號5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美國專利公開號2004/0002587和PCT公開案WO 94/29351；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919；WO 04/029207；WO 04/099249；WO 04/063351）。

在一些實施例中，具有變體Fc結構域的抗體包含一種或多種工程化糖型，即共價附接至包含Fc區的分子的碳水化合物組合物。工程化糖型可用於多種目的，包括但不限於增強或降低效應子功能。工程化糖型可以通過熟習此項技術者已知的任何方法產生，例如通過使用工程化或變體表現株、通過與一種或多種酶（例如，DI N-乙醯葡糖胺基轉移酶III（GnTIII））共表現、通過在各種生物體或來自各種生物體的細胞系中表現包含Fc區的分子或通過在已經表現包含Fc區的分子後修飾一種或多種碳水化合物。用於產生工程化糖型的方法是本領域已知的，並且包括但不限於在以下文獻中描述的方法：Umana等人, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180；Davies等人, 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等人, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa等人, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473)；美國專利號6,602,684；美國序號10/277,370；美國序號10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；Potillegent™技術（Biowa, Inc.，新澤西州普林斯頓）；GlycoMAb™糖基化工程技術（GLYCART biotechnology AG，瑞士蘇黎世）。參見例如，WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等人, 2004, JMB, 336: 1239-49。

抗體的糖基化

在仍另一個實施例中，修飾根據本發明利用的抗體的糖基化。例如，可以製備去糖基化的抗體（即，抗體缺乏糖基化）。可以改變糖基化例如以增加抗體對靶抗原的親和力。此類碳水化合物修飾可以通過例如改變抗體序列內的糖基化的一個或多個位點來實現。例如，可以進行一個或多個胺基酸取代，其導致消除一個或多個可變區架構糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這種去糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。這種方法進一步詳細描述於美國專利號5,714,350和6,350,861中。也可以進行一個或多個胺基酸取代，其導致消除存在于Fc區中的糖基化位點（例如，IgG的天門冬醯胺酸297）。此外，可以在缺乏必要的糖基化機器的細菌細胞中產生去糖基化的抗體。

也可以製備具有改變的糖基化類型的抗體，諸如具有減少量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化的抗體或具有增加的二等分GlcNAc結構的抗體。已經證明此類改變的糖基化模式增加抗體的ADCC能力。此類碳水化合物修飾可以通過例如在具有改變的糖基化機器的宿主細胞中表現抗體來實現。本領域已經描述了具有改變的糖基化機器的細胞，並且可以將其用作表現本發明的重組抗體的宿主細胞，從而產生具有改變的糖基化的抗體。參見例如，Shields, R.L.等人 (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umana等人 (1999) Nat. Biotech. 17:176-1，以及美國專利號：US 6,946,292；歐洲專利號：EP 1,176,195；PCT公開案WO 03/035835；WO 99/54342，將其各自通過引用以其整體併入本文。

工程化效應子功能

可能需要在效應子功能方面修飾本發明的抗CoV S糖蛋白抗體。例如，可以在Fc區中引入一個或多個半胱胺酸殘基，從而允許在此區域中形成鏈間二硫鍵。如此產生的同二聚體抗體可以具有改善的內化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和/或抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。參見，Caron等人, J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)和Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)。也可以使用異雙功能交聯劑製備具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體，如Wolff等人, Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)中所述。也可以工程化抗體，其具有雙Fc區，從而可以具有增強的補體裂解和ADCC能力。參見，Stevenson等人, Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)。

工程化抗體的Fc區以改變效應子功能的其他方法是本領域已知的（例如，都是Koenig等人的美國專利公開號20040185045和PCT公開號WO 2004/016750，其描述了改變Fc區以與對FcγRIIA的結合親和力相比增強對FcγRIIB的結合親和力；還參見，Armour等人的PCT公開號WO 99/58572、ldusogie等人的PCT公開號WO 99/51642和Deo等人的U.S. 6,395,272；將其公開內容以其整體併入本文）。修飾Fc區以降低對FcγRIIB的結合親和力的方法也是本領域已知的（例如，都是Ravetch等人的美國專利公開號20010036459和PCT公開號WO 01/79299，將其公開內容以其整體併入本文）。還已經描述了具有與野生型Fc區相比對FcγRIIIA和/或FcγRIIA的結合親和力增強的變體Fc區的修飾的抗體（例如，Stavenhagen等人的PCT公開號WO 2004/063351，將其公開內容以其整體併入本文）。

本領域已知的體外測定（諸如本文所述的體外測定）可以用於確定在本發明的組合物和方法中使用的抗CoV S糖蛋白抗體是否能夠介導ADCC。

抗 CoV S 糖蛋白抗體的製造 / 產生

工程化所需的抗CoV S糖蛋白抗體後，可以使用本領域熟知的用於大規模製造抗體的方法以商業規模產生抗CoV S糖蛋白抗體。例如，這可以使用重組表現系統（諸如但不限於以下描述的重組表現系統）來實現。

重組表現系統

抗體或其變體的重組表現通常需要構建含有編碼所述抗體的多核苷酸的表現載體。已經獲得編碼抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其部分的多核苷酸後，可以使用本領域熟知的技術通過重組DNA技術產生用於產生抗體分子的載體。參見例如，美國專利號6,331,415，將其通過引用以其整體併入本文。因此，本文描述了用於通過表現含有編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸來製備蛋白質的方法。熟習此項技術者熟知的方法可以用於構建含有抗體編碼序列和適當的轉錄和轉譯控制信號的表現載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術和體內基因重組。因此，本發明提供了複製型載體，所述複製型載體包含可操作地連接至啟動子的編碼抗體分子、抗體的重鏈或輕鏈、抗體或其部分的重鏈或輕鏈可變結構域或者重鏈或輕鏈CDR的核苷酸序列。此類載體可以包括編碼抗體分子的恒定區的核苷酸序列（參見例如，國際公開號WO 86/05807和WO 89/01036；和美國專利號5,122,464），並且可以將抗體的可變結構域選殖到這種載體中用於表現整條重鏈、整條輕鏈或者整條重鏈和整條輕鏈兩者。

在另一個實施例中，可以使用靶向同源重組製備抗CoV S糖蛋白抗體以產生抗CoV S糖蛋白抗體的全部或部分（參見，美國專利號6,063,630、6,187,305和6,692,737）。在某些實施例中，可以使用隨機重組技術製備抗CoV S糖蛋白抗體以產生抗CoV S糖蛋白抗體的全部或部分（參見，美國專利號6,361,972、6,524,818、6,541,221和6,623,958）。也可以使用Cre介導的位點特異性同源重組在由包含修飾的免疫球蛋白基因座的細胞的基因組序列表現抗體的細胞中產生抗CoV S糖蛋白抗體（參見，美國專利號6,091,001）。宿主細胞系可以源自人或非人物種，包括但不限於小鼠和中國倉鼠。在需要產生人抗體或人類化抗體的情況下，宿主細胞系應當是人細胞系。這些方法可以有利地用於工程化永久表現抗體分子的穩定細胞系。

通過常規技術將表現載體轉移到宿主細胞中後，然後通過常規技術培養轉染的細胞以產生抗體。因此，本發明包括含有可操作地連接至異源啟動子的編碼本發明的抗體或其片段、或其重鏈或輕鏈、或其部分、或本發明的單鏈抗體的多核苷酸的宿主細胞。在用於表現雙鏈抗體的某些實施例中，可以在宿主細胞中共表現編碼重鏈和輕鏈兩者的載體以表現整個免疫球蛋白分子，如下所詳述。

多種宿主-表現載體系統可以用於表現抗CoV S糖蛋白抗體或其部分，所述宿主-表現載體系統可以用於工程化和產生抗CoV S糖蛋白抗體（參見例如，美國專利號5,807,715）。例如，與載體（諸如來自人巨細胞病毒的主要中間早期基因啟動子元件）結合的哺乳動物細胞（諸如中國倉鼠卵巢細胞（CHO））是抗體的有效表現系統（Foecking等人, Gene, 45:101 (1986)；和Cockett等人, Bio/Technology, 8:2 (1990)）。另外，可以選擇調節插入的抗體序列的表現或以所需的具體方式修飾並加工抗體基因產物的宿主細胞株。蛋白質產物的此類修飾（例如，糖基化）和加工（例如，切割）對於蛋白質的功能可以是重要的。不同宿主細胞具有轉譯後加工和修飾蛋白質和基因產物的獨特且特定的機制。可以選擇適當的細胞系或宿主系統以確保表現的抗體或其部分的正確修飾和加工。為此，可以使用具有用於正確加工初級轉錄物、基因產物的糖蛋白和磷酸化的細胞機器的真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NSO（不內源性地產生任何功能性免疫球蛋白鏈的鼠骨髓瘤細胞系）、CRL7030和HsS78Bst細胞。

在細菌系統中，可以根據被表現的抗體分子的預期用途有利地選擇許多表現載體。例如，當要產生大量這種抗體時，為了產生包含抗CoV S糖蛋白抗體的醫藥組合物，可能需要指導高水準的易於純化的融合蛋白產物的表現的載體。此類載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278（Ruther等人, EMBO, 12:1791 (1983)），其中抗體編碼序列可以與lac Z編碼區同框地單獨連接到載體中，從而產生融合蛋白；pIN載體（Inouye和Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985)；Van Heeke和Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 24:5503-5509 (1989)）；等等。pGEX載體也可以用於將外來多肽表現為與麩胱甘肽-S-轉移酶（GST）的融合蛋白。通常，此類融合蛋白是可溶的，並且可以通過吸附並結合至麩胱甘肽-瓊脂糖親和基質，然後在游離麩胱甘肽的存在下洗脫而容易地從裂解細胞中純化。pGEX載體被設計用於將凝血酶和/或因數Xa蛋白酶切割位點引入表現的多肽中，使得選殖的靶基因產物可以從GST部分釋放。

在昆蟲系統中，將苜蓿銀紋夜蛾（Autographa californica）核型多角體病毒（AcNPV）用作表現外來基因的載體。病毒在草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細胞中生長。可以將抗體編碼序列單獨選殖到病毒的非必需區（例如，多角體蛋白基因）中，並且置於AcNPV啟動子（例如，多面體蛋白啟動子）的控制下。

在哺乳動物宿主細胞中，可以利用許多基於病毒的表現系統。在將腺病毒用作表現載體的情況下，可以將目的抗體編碼序列連接至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物（例如，晚期啟動子和三聯體前導序列）。然後可以通過體外或體內重組將此嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組的非必需區（例如，區域E1或E3）中將產生重組病毒，其是能存活的並且能夠在感染的宿主中表現抗體分子（例如參見，Logan和Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359 (1984)）。為了有效轉譯插入的抗體編碼序列，還可能需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。此外，起始密碼子通常應當與所需編碼序列的閱讀框同框，以確保整個插入物的轉譯。這些外源轉譯控制信號和起始密碼子可以具有天然和合成的多種來源。可以通過包含適當的轉錄增強子元件、轉錄終止子等來增強表現效率（參見例如，Bittner等人, Methods in Enzymol., 153:51-544(1987)）。

穩定的表現可以用於長期、高產率地產生重組蛋白。例如，可以產生穩定表現抗體分子的細胞系。可以用包含表現控制元件（例如，啟動子、增強子、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等）和選擇性標記基因的適當工程化的載體轉化宿主細胞。在引入外來DNA後，可以允許細胞在富集培養基中生長1-2天，然後轉換到選擇培養基。重組質粒中的選擇性標記賦予對選擇的抗性，並且允許將質粒穩定整合到它們的染色體中的細胞生長並且形成集落，進而可以將所述集落選殖並且擴增到細胞系中。編碼抗CoV S糖蛋白抗體的質粒可以用於將基因/cDNA引入適合於培養產生的任何細胞系中。

可以使用許多選擇系統，包括但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶（Wigler等人, Cell, 11:223 (1977)）、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（Szybalska和Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202 (1992)）和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶（Lowy等人, Cell, 22:8-17 (1980)）基因可以分別用於tk ^-、hgprt ^-或aprr細胞。此外，抗代謝物抗性可以用作以下基因的選擇基礎：dhfr，其賦予對甲胺蝶呤的抗性（Wigler等人, Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 (1980)；O’Hare等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981)）；gpt，其賦予對黴酚酸的抗性（Mulligan和Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981)）；neo，其賦予對胺基糖苷G-418的抗性（Wu和Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；及Morgan和Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；May, TIB TECH 11(5):155-2 15 (1993)）；和hygro，其賦予對潮黴素的抗性（Santerre等人, Gene, 30:147 (1984)）。本領域眾所周知的重組DNA技術的方法可以常規地應用於選擇所需的重組殖株，並且此類方法描述於例如Ausubel等人 (編輯), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kricgler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；以及在第12和13章中, Dracopoli等人 (編輯), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin等人, 1981, J. Mol. Biol., 150:1中，將其通過引用以其整體併入本文。

可以通過載體擴增來增加抗體分子的表現水準（關於綜述，參見Bebbington和Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, 第3卷. Academic Press, New York (1987)）。當表現抗體的載體系統中的標記是可擴增的時，存在于宿主細胞培養物中的抑制劑水準的增加將使標記基因的拷貝數增加。由於擴增區與抗體基因相關，抗體的產生也將增加（Crouse等人, Mol. Cell. Biol., 3:257 (1983)）。可以通過使用重組蛋白生產領域技術人員已知的重組方法和工具來增強抗體表現水準，所述重組方法和工具包括重構周圍染色質並且以活性人工轉錄結構域的形式增強轉基因表現的技術。

可以用兩種表現載體（編碼重鏈來源的多肽的第一載體和編碼輕鏈來源的多肽的第二載體）共轉染宿主細胞。這兩種載體可以含有相同或不同的選擇性標記。也可以使用編碼並且能夠表現重鏈和輕鏈多肽兩者的單一載體。在此類情況下，輕鏈應當置於重鏈的5’以避免產生過量的有毒游離重鏈（Proudfoot, Nature 322:562-65 (1986)；和Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2197 (1980)）。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包含cDNA或基因組DNA。

已經通過重組表現產生抗體分子後，可以通過本領域已知的用於純化免疫球蛋白分子的任何方法純化所述抗體分子，例如通過層析（例如，離子交換、親和力（特別是通過對特定抗原的親和力）、蛋白A或蛋白G和分級柱層析）、離心、差別性溶解度或通過任何其他用於純化蛋白質的標準技術。此外，本發明的抗體或其片段可以融合至本文所述或本領域以其他方式已知的異源多肽序列，以促進純化。

抗體純化和分離

當使用重組技術時，抗體可以在細胞內產生，在周質間隙中產生，或者直接被分泌到培養基中。如果抗體在細胞內產生，則作為第一步，例如通過離心或超濾去除微粒狀碎片（宿主細胞或裂解的片段）。Carter等人, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)描述了用於分離抗體的程序，所述抗體被分泌到大腸桿菌的周質間隙中。簡言之，將細胞體在乙酸鈉（pH 3.5）、EDTA和苯甲基磺醯氟（PMSF）的存在下經約30分鐘解凍。可以通過離心去除細胞碎片。在抗體突變體被分泌到培養基中的情況下，通常首先使用可商購的蛋白質濃縮濾器（例如，Amicon或Millipore Pcllicon超濾單元）濃縮來自此類表現系統的上清液。可以在任何上述步驟中包括蛋白酶抑制劑（諸如PMSF）以抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素以防止外來污染物的生長。

可以使用例如羥基磷灰石層析、疏水相互作用層析、離子交換層析、凝膠電泳、透析和/或親和層析單獨或與其他純化步驟組合純化由細胞製備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適用性取決於存在於抗體突變體中的任何免疫球蛋白Fc結構域的種類和同種型。蛋白A可以用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體（Lindmark等人, J. Immunol. Methods, 62:1-13 (1983)）。推薦蛋白G用於所有小鼠同種型以及用於人γ3（Guss等人, EMBO J., 5:15671575 (1986)）。親和配體所附接的基質最常見是瓊脂糖，但是其他基質是可用的。機械穩定的基質（諸如控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯）允許比用瓊脂糖可實現的更快的流速和更短的加工時間。在抗體包含CH ₃結構域的情況下，Bakerbond ABX樹脂（J.T. Baker，新澤西州菲力浦斯堡）可用於純化。根據待回收的抗體，其他蛋白質純化技術（諸如離子交換柱上的分級、乙醇沈澱、反相HPLC、二氧化矽上的層析、肝素上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂（諸如聚天門冬胺酸柱）上的SEPHAROSE層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沈澱）也是可用的。

在任何一個或多個初步純化步驟後，可以使包含目的抗體和污染物的混合物經歷低pH疏水相互作用層析，使用pH在約2.5-4.5之間的洗脫緩衝液，並且在低鹽濃度（例如，約0-0.25 M鹽）下進行。

治療性抗 CoV S 糖蛋白抗體

在本發明的組合物和方法中使用的抗CoV S糖蛋白抗體可以是可治療COVID-19或中和SARS-CoV-2病毒或其變體的人抗體或人類化抗體。在某些實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體可以是嵌合抗體或小鼠抗體。在某些實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體可以是單株人抗體、人類化抗體或嵌合抗體。在本發明的組合物和方法中使用的抗CoV S糖蛋白抗體可以是IgG1或IgG3人同種型或者在人群體中發現的任何IgG1或IgG3等位基因的人抗體或人類化抗體。在其他實施例中，在本發明的組合物和方法中使用的抗CoV S糖蛋白抗體可以是IgG2或IgG4人同種型或者在人群體中發現的任何IgG2或IgG4等位基因的人抗體或人類化抗體。

在某些實施例中，抗體是已知抗體的同種型轉換變體（例如，轉換為IgG1或IgG3人同種型），諸如以上所述的那些。

在本公開文本的組合物和方法中使用的抗CoV S糖蛋白抗體可以是裸抗體、免疫綴合物或融合蛋白。

篩選抗體的 SARS-CoV-2 S 糖蛋白結合

結合測定可以用於鑒定結合SARS-CoV-2 S糖蛋白的抗體。結合測定可以作為直接結合測定或作為競爭結合測定進行。可以使用標準ELISA或標準流式細胞術測定檢測結合。在直接結合測定中，測試候選抗體與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合。另一方面，競爭結合測定評估候選抗體與已知的抗CoV S糖蛋白抗體或其他結合SARS-CoV-2 S糖蛋白的化合物競爭的能力。

在直接結合測定中，使SARS-CoV-2 S糖蛋白與候選抗體在允許候選抗體與SARS-CoV-2 S糖蛋白結合的條件下接觸。結合可以發生在溶液中或固體表面上。候選抗體可以先前已經被標記以用於檢測。任何可檢測的化合物都可以用於標記，所述化合物諸如但不限於發光、螢光或放射性同位素或含有所述發光、螢光或放射性同位素的基團，或者非同位素標記（如酶或染料）。在足以發生結合的培育期後，將反應暴露於去除過量或非特異性結合的抗體的條件和操作。通常，它涉及用適當的緩衝液洗滌。最後，檢測候選抗體與SARS-CoV-2 S糖蛋白之間的複合物的存在。

在競爭結合測定中，評價候選抗體抑制或代替已知的抗CoV S糖蛋白抗體（或其他化合物）與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合的能力。在添加和不添加候選抗體的情況下，可以將SARS-CoV-2 S糖蛋白的標記的已知結合劑與候選抗體混合，並且置於在它們之間的相互作用將正常發生的條件下。可以將結合SARS-CoV-2糖蛋白的SARS-CoV-2糖蛋白的標記的已知粘合劑的量與在存在或不存在候選抗體的情況下結合的量進行比較。

在一個實施例中，用一種或多種固定在固體表面上的組分進行結合測定，以促進抗體抗原複合物的形成和檢測。在各種實施例中，固體支持物可以是但不限於聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、硝化纖維、右旋糖酐、尼龍、聚丙烯醯胺和瓊脂糖。支援結構可以包括珠、膜、微粒、反應容器（諸如微量滴定板、試管或其他反應容器）的內表面。SARS-CoV-2 S糖蛋白或其片段或其他組分的固定化可以通過共價或非共價附接來實現。在一個實施例中，附接可以是間接的，即通過附接的抗體。在另一個實施例中，用表位（諸如麩胱甘肽S-轉移酶（GST））標記SARS-CoV-2 S糖蛋白和陰性對照，使得與固體表面的附接可以由可商購的抗體（諸如抗GST（Santa Cruz Biotechnology））介導。

例如，可以使用固定至固體支持物的SARS-CoV-2 S糖蛋白進行這種親和結合測定。通常，標記結合反應的非移動組分（在這種情況下為候選抗CoV S糖蛋白抗體）以使得能夠進行檢測。多種標記方法是可得的並且可以使用，所述標記方法諸如發光、生色團、螢光或放射性同位素或含有所述發光、生色團、螢光或放射性同位素的基團，以及非同位素標記（諸如酶或染料）。在一個實施例中，用螢光團（諸如異硫氰酸螢光素（FITC，可從聖路易斯的Sigma Chemicals獲得））標記候選抗CoV S糖蛋白抗體。可以使用固定在固體表面上的SARS-CoV-2 S糖蛋白進行這種親和結合測定。然後將抗CoV S糖蛋白抗體與抗原一起培育，並且通過本領域已知的方法檢測抗體的特異性結合，所述方法包括但不限於BiaCore分析、ELISA、FMET和RIA方法。

最後，可以通過本領域已知的任何檢測方法檢測殘留在固體表面上的標記。例如，如果用螢光團標記候選抗CoV S糖蛋白抗體，則可以使用螢光計來檢測複合物。

可以將SARS-CoV-2 S糖蛋白以表現SARS-CoV-2 S糖蛋白的完整細胞或含有人SARS-CoV-2 S糖蛋白的分離膜的形式添加到結合測定中。因此，可以在存在和不存在候選抗CoV S糖蛋白抗體的情況下，在培養的完整細胞中或在動物模型中測定與SARS-CoV-2糖蛋白的直接結合。可以將標記的候選抗CoV S糖蛋白抗體與表現SARS-CoV-2 S糖蛋白的細胞混合，並且可以添加候選抗CoV S糖蛋白抗體。分離膜可以用於鑒定與SARS-CoV-2 S糖蛋白相互作用的候選抗CoV S糖蛋白抗體。例如，在使用分離膜的典型實驗中，可以將細胞基因工程化為表現SARS-CoV-2 S糖蛋白。膜可以通過標準技術收穫並且用於體外結合測定。標記的候選抗CoV S糖蛋白抗體（例如，螢光標記的抗體）與膜結合並且測定其特異性活性；通過與在過量的未標記的（冷）候選抗CoV S糖蛋白抗體的存在下進行的結合測定進行比較來確定特異性結合。對應於SARS-CoV-2 S糖蛋白的一個或多個區域（例如，RBD）的多肽或含有SARS-CoV-2 S糖蛋白的一個或多個區域的融合蛋白也可以用於非基於細胞的測定系統中以鑒定與SARS-CoV-2 S糖蛋白的部分結合的抗體。在非基於細胞的測定中，將重組表現的人SARS-CoV-2 S糖蛋白通過熟習此項技術者熟知的手段（參見Ausubel等人, 同上）附接至固體基材（諸如試管、微升孔或柱）。然後測定測試抗體與SARS-CoV-2 S糖蛋白結合的能力。

結合反應也可以在溶液中進行。在此測定中，允許標記的組分在溶液中與其一種或多種結合配偶體相互作用。如果標記的組分與其一種或多種結合配偶體之間的大小差異允許這種分離，則分離可以通過使結合反應的產物通過超濾器來實現，所述超濾器的孔允許未結合的標記組分通過，但不允許其一種或多種結合配偶體或與其一種或多種配偶體結合的標記組分通過。分離也可以使用能夠從溶液中捕獲標記組分的結合配偶體的任何試劑（諸如針對結合配偶體的抗體等）來實現。

在一個實施例中，例如，可以通過使來自連續噬菌體展示文庫的噬菌體通過連接至固相（諸如塑膠珠）的含有SARS-CoV-2 S糖蛋白或其部分（例如，SARS-CoV-2 S糖蛋白的RBD）或其衍生物、類似物、片段或結構域的柱來篩選噬菌體文庫。通過改變洗滌緩衝液的嚴格性，可以富集表現對SARS-CoV-2 S糖蛋白具有高親和力的肽的噬菌體。可以選殖從柱中分離的噬菌體，並且可以直接測量親和力。瞭解哪些抗體及其胺基酸序列賦予與SARS-CoV-2 S糖蛋白的最強結合，電腦模型可以用於鑒定SARS-CoV-2 S糖蛋白與候選抗體之間的分子接觸。

在另一個具體實施例中，固體支持物是含有附接至微量滴定皿的SARS-CoV-2糖蛋白的膜。例如，候選抗體可以結合在允許微量滴定皿中的文庫成員表現的條件下培養的表現文庫抗體的細胞。收穫與SARS-CoV-2結合的文庫成員。通過舉例的方式，此類方法一般描述於Parmley和Smith, 1988, Gene, 73:305-318；Fowlkes等人, 1992, BioTechniques, 13:422-427；PCT公開號WO 94/18318；以及上文引用的參考文獻中。鑒定為與SARS-CoV-2 S糖蛋白結合的抗體可以具有以上所述的抗體的任何類型或修飾。

篩選抗體的人 ADCC 效應子功能

在本發明的某些實施例中，使用人IgG類別的抗體，其具有諸如血清中的長半衰期和介導各種效應子功能的能力的功能特徵（Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., 第1章 (1995)）。人IgG類抗體被進一步分類為以下4種亞類：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。迄今為止，對於ADCC和CDC作為IgG類抗體的效應子功能已經進行了大量研究，並且據報導，在人IgG類別的抗體當中，IgG1亞類在人中具有最高的ADCC活性和CDC活性（Chemical Immunology, 65, 88 (1997)）。

人IgG1亞類抗體的ADCC活性和CDC活性的表現通常涉及抗體的Fc區與存在於效應細胞（諸如殺傷細胞、自然殺傷細胞或啟動的巨噬細胞）表面上的抗體的受體（在下文中稱為“FcγR”）的結合。可以結合各種補體組分。關於結合，已經提出在抗體的鉸鏈區和C區的第二結構域（在下文中稱為“Cγ2結構域”）中的幾個胺基酸殘基是重要的（Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993)、Immunology, 86, 319 (1995)、Chemical Immunology, 65, 88 (1997)），並且Cγ2結構域中的糖鏈（Chemical Immunology, 65, 88 (1997)）也是重要的。

可以在效應子功能方面修飾抗CoV S糖蛋白抗體，例如以增強抗體的ADCC和/或補體依賴性細胞毒性（CDC）。這可以通過在抗體的Fc區中引入一個或多個胺基酸取代來實現。也可以在Fc區中引入一個或多個半胱胺酸殘基，允許在此區域中形成鏈間二硫鍵。以這種方式，可以產生同二聚體抗體，其可以具有改善的內化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和ADCC（Caron等人, J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992)和Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)）。異雙功能交聯劑也可以用於產生具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體（Wolff等人, Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)）。也可以將抗體工程化為具有兩個或更多個Fc區，導致補體裂解和ADCC能力增強（Stevenson等人, Anti-Cancer Drug Design, (3)219-230 (1989)）。

工程化抗體的Fc區以改變效應子功能的其他方法是本領域已知的（例如，都是Koenig等人的美國專利公開號20040185045和PCT公開號WO 2004/016750，其描述了改變Fc區以與對FcγRIIA的結合親和力相比增強對FcγRIIB的結合親和力；還參見Armour等人的PCT公開號WO 99/58572、Idusogic等人的PCT公開號WO 99/51642和Dco等人的U.S. 6,395,272；將其公開內容以其整體併入本文）。修飾Fc區以降低對FcγRIIB的結合親和力的方法也是本領域已知的（例如，都是Ravetch等人的美國專利公開號20010036459和PCT公開號WO 01/79299，將其公開內容以其整體併入本文）。還已經描述了具有與野生型Fc區相比對FcγRIIIA和/或FcγRIIA的結合親和力增強的變體Fc區的修飾的抗體（例如，Stavenhagen等人的PCT公開號WO 2004/063351；將其公開內容以其整體併入本文）。

已經發現了至少四種不同類型的FcγR，其分別被稱為FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）和FcγRIV。在人中，FcγRII和FcγRIII分別被進一步分類為FcγRIIa和FcγRIIb，以及FcγRIIIa和FcγRIIIb。FcγR是一種屬於免疫球蛋白超家族的膜蛋白，FcγRII、FcγRIII和FcγRIV具有作為組成成分的具有含有兩個免疫球蛋白樣結構域的細胞外區域的α鏈，FcγRI具有作為組成成分的具有含有三個免疫球蛋白樣結構域的細胞外區域的α鏈，並且α鏈參與IgG結合活性。另外，FcγRI和FcγRIII具有作為組成成分的γ鏈或ζ鏈，其具有與α鏈相關的信號轉導功能（Annu. Rev. Immunol., 18, 709 (2000)、Annu. Rev. Immunol., 19, 275 (2001)）。FcγRIV已經由Bruhns等人, Clin. Invest. Med., (Canada) 27:3D (2004)進行描述。

為了評估目的抗CoV S糖蛋白抗體的ADCC活性，可以使用體外ADCC測定，諸如描述於美國專利號5,500,362或5,821,337的體外ADCC測定。也可以使用可商購的試劑盒（例如，CytoTox 96 ^®（Promega））進行測定。用於此類測定的有用效應細胞包括但不限於外周血單個核細胞（PBMC）、自然殺傷（NK）細胞和NK細胞系。表現轉基因Fc受體（例如，CD16）和相關信號傳導多肽（例如，FcεRI-γ）的NK細胞系也可以充當效應細胞（參見例如Campbell的WO 2006/023148 A2）。例如，可以測定任何特定抗體通過補體啟動和/或ADCC介導靶細胞裂解的能力。使目的細胞在體外生長並對其進行標記；將抗體與可以被抗原抗體複合物啟動的免疫細胞（即，參與ADCC反應的效應細胞）組合添加到細胞培養物中。也可以測試抗體的補體啟動。在任一種情況下，通過從裂解的細胞釋放標記來檢測靶細胞的細胞溶解。也可以通過檢測胞質蛋白（例如，LDH）向上清液中的釋放來確定靶細胞裂解的程度。事實上，可以使用患者自身的血清作為補體和/或免疫細胞的來源篩選抗體。然後能夠在體外測試仲介導人ADCC的抗體可以治療性地用於該特定患者。也可以在體內（例如，在動物模型中，諸如披露於Clynes等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)中的動物模型）評估目的分子的ADCC活性。此外，用於調節（即，增加或降低）抗體的ADCC活性的水準和任選的CDC活性的水準的技術是本領域熟知的。參見例如，美國專利號6,194,551。本發明的抗體可以能夠具有或可能已經被修飾以具有誘導ADCC和/或CDC的能力。確定ADCC功能的測定可以使用人效應細胞實踐以評估人ADCC功能。此類測定還可以包括旨在篩選通過壞死和/或細胞凋亡機制誘導、介導、增強、阻斷細胞死亡的抗體的測定。包括利用可行的染料的測定、檢測和分析半胱天冬酶的方法以及測量DNA斷裂的測定在內的此類方法可以用於評估用目的抗CoV S糖蛋白抗體體外培養的細胞的細胞凋亡活性。

例如，膜聯蛋白V或TdT介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）測定可以如Decker等人, Blood (USA) 103:2718-2725 (2004)中所述進行，以檢測細胞凋亡活性。TUNEL測定涉及用用於摻入DNA鏈斷裂中的螢光素標記的dUTP培養目的細胞。然後處理細胞以通過流式細胞術進行分析。膜聯蛋白V測定使用螢光素綴合的膜聯蛋白V檢測磷脂醯絲胺酸（PS）在凋亡細胞的質膜外的出現，所述螢光素綴合的膜聯蛋白V特異性識別暴露的PS分子。同時，可行的染料（諸如碘化丙啶）可以用於排除晚期凋亡細胞。將細胞用標記的膜聯蛋白V染色並且通過流式細胞術進行分析。

中和抗體

在實施例中，本文所述的抗CoV S糖蛋白抗體是中和抗體。在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體中和SARS-CoV-2病毒或其變體。

抗 CoV S 糖蛋白抗體綴合物

根據本發明的某些方面，化合物可以與抗CoV S糖蛋白抗體綴合，用於在本發明的組合物和方法中使用。在某些實施例中，這些綴合物可以作為融合蛋白產生。

抗CoV S糖蛋白抗體的共價修飾被包括在本發明的範圍內。如果適用，它們可以通過化學合成或通過抗體的酶促或化學切割來進行。通過使抗體的靶胺基酸殘基與能夠和所選側鏈或者N或C末端殘基反應的有機衍生劑反應，將抗CoV S糖蛋白抗體的其他類型的共價修飾引入分子中。

最常見的是使半胱胺醯基殘基與α-鹵代乙酸酯（和相應的胺）（諸如氯乙酸或氯乙醯胺）反應，以得到羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。類似地，也可以使用碘試劑。半胱胺醯基殘基也通過與以下的反應來衍生化：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯並-2-氧雜-1,3-二唑。

組胺醯基殘基通過在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應來衍生化，因為此試劑對組胺醯基側鏈具有相對特異性。對溴苯醯甲基溴也是有用的；反應可以在0.1 M甲胂酸鈉中在pH 6.0下進行。

使離胺醯基和胺基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用這些試劑衍生化具有反轉離胺醯基殘基電荷的作用。用於衍生化含α-胺基的殘基和/或含ε-胺基的殘基的其他合適試劑包括醯亞胺酯（諸如甲基吡啶亞胺甲酯）、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮和轉胺酶催化的與乙醛酸的反應。

精胺醯基殘基通過與包括苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮和茚三酮在內的一種或幾種常規試劑反應進行修飾。因為胍官能團的高pKa，精胺醯基殘基的衍生化通常需要在鹼性條件下進行反應。此外，這些試劑可以與離胺酸的ε-胺基以及精胺酸的ε-胺基反應。

可以進行酪胺醯基殘基的具體修飾，特別關注的是通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最常見的是，分別使用N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷來形成0-乙醯基酪胺醯基種類和3-硝基衍生物。使用 ¹²⁵I或 ¹³¹I碘化酪胺醯基殘基以製備標記的蛋白質，用於在放射免疫測定中使用。

羧基側基團（天門冬胺醯基或麩胺醯基）通過與碳二亞胺（R-N=C=N-R’）（其中R和R’是不同的烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二甲基苯基)碳二亞胺）反應進行選擇性修飾。此外，天門冬胺醯基和麩胺醯基殘基通過與銨離子反應而轉化為天門冬醯胺酸醯基和麩醯胺酸醯基殘基。

麩醯胺酸醯基和天門冬醯胺酸醯基殘基通常分別脫醯胺為相應的麩胺醯基和天門冬胺醯基殘基。這些殘基在中性或鹼性條件下脫醯胺。這些殘基的脫醯胺形式落入本發明的範圍內。

其他修飾包括脯胺酸和離胺酸的羥基化，絲胺醯基或蘇胺醯基殘基的羥基的磷酸化，離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈的α-胺基的甲基化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 第79-86頁 (1983)），N末端胺的乙醯化和任何C末端羰基的醯胺化。

另一種類型的共價修飾涉及將糖苷與抗體化學或酶促偶聯。這些程序是有利的，因為它們不需要在具有用於N-或O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生抗體。根據所使用的偶聯模式，可以使一種或多種糖附接至 (a) 精胺酸和組胺酸；(b) 游離羧基；(c) 游離巰基，諸如半胱胺酸的游離巰基；(d) 游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸的游離羥基；(e) 芳香族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸的芳香族殘基；或 (f) 麩醯胺酸的醯胺基。這些方法描述於1987年9月11日公開的WO 87/05330及Aplin和Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 第259-306頁 (1981)中。

醫藥組合物

本發明還涉及包含抗CoV S糖蛋白抗體的組合物和使用上述組合物治療人類受試者的COVID-19的方法。

本發明涉及包含IgG1或IgG3人同種型的抗CoV S糖蛋白抗體的醫藥組合物。本發明還涉及包含可以介導人ADCC的IgG2或IgG4人同種型的抗CoV S糖蛋白抗體的醫藥組合物。在某些實施例中，本發明還涉及包含可以通過本領域已知手段產生的單株人、人類化或嵌合抗CoV S糖蛋白抗體的醫藥組合物。

在其他特定實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體可以介導ADCC、補體依賴性細胞毒性或細胞凋亡。

抗體半衰期

在實施例中，本文所述的抗CoV S糖蛋白抗體的半衰期是約1小時至約60天。例如，抗CoV S糖蛋白抗體的半衰期長達約1小時、長達約2小時、長達約3小時、長達約4小時、長達約5小時、長達約6小時、長達約7小時、長達約8小時、長達約9小時、長達約10小時、長達約11小時、長達約12小時、長達約13小時、長達約14小時、長達約15小時、長達約16小時、長達約17小時、長達約18小時、長達約19小時、長達約20小時、長達約21小時、長達約22小時、長達約23小時、長達約24小時、長達約2天、長達約3天、長達約4天、長達約5天、長達約6天、長達約7天、長達約8天、長達約9天、長達約10天、長達約11天、長達約12天、長達約13天、長達約14天、長達約15天、長達約16天、長達約17天、長達約18天、長達約19天、長達約20天、長達約21天、長達約22天、長達約23天、長達約24天、長達約25天、長達約26天、長達約27天、長達約28天、長達約29天、長達約30天、長達約31天、長達約32天、長達約33天、長達約34天、長達約35天、長達約36天、長達約37天、長達約38天、長達約39天、長達約40天、長達約41天、長達約42天、長達約43天、長達約44天、長達約45天、長達約46天、長達約47天、長達約48天、長達約49天、長達約50天、長達約51天、長達約52天、長達約53天、長達約54天、長達約55天、長達約56天、長達約57天、長達約58天、長達約59天或長達約60天。在某些實施例中，本發明的組合物和方法的抗體的半衰期可以通過本領域已知的方法延長。這種延長可以反過來減少抗體組合物的用劑的量和/或頻率。具有改進的體內半衰期的抗體和用於製備它們的方法披露於美國專利號6,277,375；以及國際公開號WO 98/23289和WO 97/3461中。

也可以通過用或不用多功能連接子將惰性聚合物分子（諸如高分子量聚乙二醇（PEG））通過PEG與抗體的N或C末端的位點特異性綴合或經由存在于離胺醯基殘基上的ε-胺基附接至抗體來延長抗CoV S糖蛋白抗體在體內的血清循環。將使用導致生物活性損失最小的線性或支鏈聚合物衍生化。可以通過SDS-PAGE和質譜密切監測綴合程度，以確保PEG分子與抗體的正確綴合。未反應的PEG可以通過尺寸排阻層析或通過離子交換層析與抗體-PEG綴合物分離。可以使用熟習此項技術者已知的方法（例如，通過本文所述的免疫測定）測試PEG衍生化的抗體的結合活性以及體內功效。

此外，為了使抗體在體內更穩定或在體內具有更長的半衰期，可以將本發明的組合物和方法的抗體與白蛋白綴合。這些技術是本領域熟知的，參見例如國際公開號WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；以及歐洲專利號EP 413,622，將其全部通過引用併入本文。

藥物配製品、投予和用劑

本發明的藥物配製品含有作為活性成分的抗CoV S糖蛋白抗體。配製品含有以適合於向人類患者投予的單位重量或體積有效產生所需反應的量的裸抗體、免疫綴合物或融合蛋白，並且優選是無菌的。

抗CoV S糖蛋白抗體組合物可以與醫藥上可接受的載劑一起配製。術語“醫藥上可接受的”意指一種或多種不干擾活性成分的生物活性的有效性的無毒材料。此類製劑可以常規地含有鹽、緩衝劑、防腐劑、相容的載劑和任選的其他治療劑。此類醫藥上可接受的製劑還可以常規地含有適合於投予人體內的相容的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質。當在醫藥中使用時，鹽應當是醫藥上可接受的，但是非醫藥上可接受的鹽可以方便地用於製備其醫藥上可接受的鹽並不排除在本發明的範圍之外。此類藥理學和醫藥上可接受的鹽包括但不限於由以下酸製備的鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、硼酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，醫藥上可接受的鹽可以製備為鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，諸如鈉、鉀或鈣鹽。術語“載劑”表示天然或合成的有機或無機成分，活性成分與其組合以促進應用。醫藥組合物的組分還能夠與本發明的抗體以及與彼此共混合，共混合方式使得沒有將實質損害所需藥物功效的相互作用。

根據本發明的某些方面，抗CoV S糖蛋白抗體組合物可以通過將具有所需純度的抗體或免疫綴合物與任選的生理學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備用於儲存（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.編輯 (1999)），呈凍乾配製品或水溶液的形式。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，並且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑（諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；烷基對羥基苯甲酸酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬絡合物（例如，鋅-蛋白質絡合物）；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN、PLURONICS™或聚乙二醇（PEG）。

抗CoV S糖蛋白抗體組合物還可以任選地含有合適的防腐劑，諸如：苯紮氯銨；氯丁醇；對羥基苯甲酸酯和硫柳汞。

抗CoV S糖蛋白抗體組合物可以方便地以單位劑量形式呈現，並且可以通過藥學領域熟知的任何方法製備。所有方法都包括使活性劑與構成一種或多種輔助成分的載劑結合的步驟。通常，通過以下方式製備抗CoV S糖蛋白抗體組合物：使活性化合物與液體載劑、細碎的固體載劑或兩者均勻且緊密地結合，然後（如果必要）使產物成形。

適合於腸胃外投予的組合物方便地包含抗CoV S糖蛋白抗體的無菌水性或非水性製劑，其優選與接受者的血液等滲。可以根據已知的方法使用合適的分散劑或潤濕劑和助懸劑配製此製劑。無菌可注射製劑也可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或混懸劑，例如作為在1,3-丁二醇中的溶液。可以採用的可接受的媒劑和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，常規地將無菌的不揮發性油用作溶劑或助懸介質。為此目的，可以採用任何溫和的不揮發性油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。另外，諸如油酸的脂肪酸可以用於製備可注射劑。適合於口服、皮下、靜脈內、肌內等投予的載劑配方可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA中找到。

活性成分也可以包埋在例如通過凝聚技術或通過介面聚合反應的微膠囊（例如，分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊）中，包埋在膠體藥物遞送系統（例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒和奈米膠囊）中，或包埋在粗乳液中。此類技術披露於Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編輯 (1980)中。

待用於體內投予的配製品通常是無菌的。這通過經由無菌過濾膜過濾而容易地實現。

可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的合適例子包括含有抗CoV S糖蛋白抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，所述基質呈成型製品（例如，薄膜或微膠囊）的形式。緩釋基質的例子包括聚酯、水凝膠（例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯（美國專利號3,773,919）、L-麩胺酸和γ-乙基-L-麩胺酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物（諸如LUPRON DEPOT™（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球））和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙烯基乙酸酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質持續較短時間段。當所包封的抗體長時間保留在體內時，它們可能由於在37ºC下暴露於水分而變性或聚集，導致生物活性的喪失和可能的免疫原性的變化。根據所涉及的機制，可以設計合理的策略來穩定化。例如，如果發現聚集機制是通過硫代基-二硫鍵互換形成分子間S-S鍵，則可以通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制水分含量、使用適當的添加劑以及開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定化。在某些實施例中，在本發明的組合物中使用的醫藥上可接受的載劑不影響人ADCC或CDC。

本文公開的抗CoV S糖蛋白抗體也可以配製為免疫脂質體。“脂質體”是由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的小囊泡，其可用于向人遞送藥物（諸如本文公開的抗CoV S糖蛋白抗體）。脂質體的組分通常以雙層形式排列，類似於生物膜的脂質排列。通過本領域已知的方法（諸如Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；以及美國專利號4,485,045和4,544,545中所述）製備含有本發明的抗體的脂質體。具有增強的循環時間的脂質體披露於美國專利號5,013,556中。特別有用的脂質體可以通過反相蒸發方法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生化的磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）的脂質組合物產生。將脂質體通過具有限定孔徑的過濾器擠出以產生具有所需直徑的脂質體。本發明的抗體可以與如Martin等人, J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)中所述的脂質體經由二硫鍵互換反應綴合。治療劑也可以包含在脂質體內。參見，Gabizon等人, J. National Cancer Inst., (19)1484 (1989)。

在某些實施例中，本發明的醫藥組合物在4ºC下是穩定的。在某些實施例中，本發明的醫藥組合物在室溫下是穩定的。

可以通過任何途徑向人類患者投予本發明的組合物，所述途徑包括但不限於靜脈內、皮內、透皮、皮下、肌內、吸入（例如，經由氣霧劑）、經頰（例如，舌下）、局部（即，皮膚和粘膜表面兩者，包括氣道表面）、鞘內、關節內、胸膜內、腦內、動脈內、腹膜內、口服、淋巴管內、鼻內、直腸或陰道投予、通過區域導管灌注或通過直接病灶內注射。在一個實施例中，通過經限定的時間段（例如，0.5至2小時）給予的靜脈內推注或靜脈內輸注來投予本發明的組合物。本發明的組合物可以通過蠕動方式或以儲庫的形式遞送，但是在任何給定的情況下最合適的途徑將取決於（如本領域熟知的）諸如以下的因素：受試者的物種、年齡、性別和總體狀況，被治療的病症的性質和嚴重程度和/或被投予的特定組合物的性質（即，劑量、配方）。

在實施例中，包含抗CoV S糖蛋白抗體的組合物的劑量以mg/kg患者體重為單位測量。在其他實施例中，包含抗CoV S糖蛋白抗體的組合物的劑量以mg/kg患者去脂體重（即，體重減去體脂含量）為單位測量。在又其他實施例中，包含抗CoV S糖蛋白抗體的組合物的劑量以mg/m ²患者體表面積為單位測量。在又其他實施例中，包含抗CoV S糖蛋白抗體的組合物的劑量以每劑向患者投予的mg數為單位測量。劑量的任何測量都可以與本發明的組合物和方法結合使用，並且劑量單位可以通過本領域的標準手段轉換。

熟習此項技術者將理解，可以基於許多因素選擇劑量，所述因素包括受試者的年齡、性別、物種和狀況。例如，本發明的組合物的有效量可以由得自體外測試系統或得自動物模型（例如，棉鼠或猴）測試系統的劑量-反應曲線外推。用於評價抗體的作用的模型和方法是本領域已知的（Wooldridge等人, Blood, 89(8): 2994-2998 (1997)，通過引用以其整體併入本文）。

可以在本發明的方法中使用的用劑方案的例子包括但不限於每天一次、每週三次（間歇的）、每週一次、每14天一次、每月一次、每6-8週一次、每2個月一次、每6個月一次或每年一次。

在實施例中，抗CoV S糖蛋白抗體的劑量的範圍從10 mg至約2 g。例如，抗CoV S糖蛋白抗體的劑量可以是約10 mg、約20 mg、約30 mg、約40 mg、約50 mg、約60 mg、約70 mg、約80 mg、約90 mg、約100 mg、約150 mg、約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約550 mg、約600 mg、約650 mg、約700 mg、約750 mg、約800 mg、約850 mg、約900 mg、約950 mg、約1 g、約1.05 g、約1.1 g、約1.15 g、約1.2 g、約1.25 g、約1.3 g、約1.35 g、約1.4 g、約1.45 g、約1.5 g、約1.55 g、約1.6 g、約1.65 g、約1.7 g、約1.75 g、約1.8 g、約1.85 g、約1.9 g、約1.95 g、約2 g或其間的任何範圍和子範圍。

在實施例中，本公開文本提供了用於治療感染SARS-CoV-2病毒或其變體的受試者的方法，所述方法包括投予包含本文所述的抗CoV S糖蛋白抗體的組合物。在實施例中，其SARS-CoV-2變體具有選自以下的PANGO譜系：B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1。

毒性測試

本發明的組合物和/或治療方案的耐受性、毒性和/或功效可以在細胞培養物或實驗動物中通過例如用於確定LD50（對群體的50%致死的劑量）、ED50（在群體的50%中治療有效的劑量）和IC50（有效實現50%抑制的劑量）的標準藥學程序來確定。

從細胞培養測定和動物研究獲得的資料可以用於配製用於在人中使用的組合物和/或治療方案的一系列劑量。此類藥劑的劑量可以位於包括ED50在內的有很小毒性或沒有毒性的循環濃度範圍內。劑量可以根據所採用的劑型和所利用的投予途徑在此範圍內變化。對於在本發明的方法中使用的任何療法，可以通過適當的動物模型來估計治療有效劑量。根據動物模型的物種，可以根據本領域公認的公式（例如，如由Freireich等人, Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, monkey, dog, and human, Cancer Chemotherapy Reports, NCI 1966 40:219-244所提供）縮放劑量以用於人類使用。從細胞培養測定獲得的資料可用於預測潛在毒性。動物研究可以用於配製特定劑量，以達到包括如在細胞培養中確定的IC50（即，實現症狀的半最大抑制的測試化合物濃度）在內的循環血漿濃度範圍。這樣的資訊可以用於更準確地確定在人中的有用劑量。可以例如通過高效液相層析、ELISA或通過基於細胞的測定來測量血漿藥物水準。

實例

實例 1 ：抗體 239.12 、 322.3 、 425.6 和 35.13 的發現

利用雜交瘤技術產生五種與來自SARS-CoV-2病毒的SARS-CoV-2 S多肽結合的抗體。

給小鼠注射CoV S糖蛋白BV2373、BV2438、BV2465或BV2540。BV2373、BV2438、BV2465和BV2540分別包含SEQ ID NO: 35、36、37和119的胺基酸序列。BV2373、BV2438、BV2465和BV2540的胺基酸序列提供於表A中。

表A：BV2373、BV2438和BV2465的胺基酸序列

CoV S糖蛋白	胺基酸序列	SEQ ID NO:
BV2373	QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	35
BV2438	QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFANPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRGLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLHALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPQQAQSVASQSIIAYTMSLGVENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	36
BV2465	QCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	37
BV2540	QCVNLITRTQSYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLGRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	119

將小鼠的產生抗體的B細胞與永生B細胞融合以產生雜交瘤。篩選雜交瘤的與CoV S糖蛋白結合的抗體。

從產生自用BV2373免疫的小鼠的雜交瘤中鑒定出抗體239.12和322.3。從由用BV2438免疫的小鼠產生的雜交瘤中鑒定出抗體425.6。從由用BV2465免疫的小鼠產生的雜交瘤中鑒定出抗體35.13。從由用BV2540免疫的小鼠產生的雜交瘤中鑒定出抗體35.13。

239.12、322.3、425.6、35.13和199.9的VH和VL序列標識於表B中。

表B：239.12、322.3、425.6、35.13和199.9的VH和VL序列

抗體名稱	VL	VH
425.6	QIVLTQSPAIMSVSPGEKVTMTCSASSTMSFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWNTYPLTFGAGTKLELKR (SEQ ID NO: 1)	VQLKQSGPSLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGSTDYNAAFMSRLTITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCATHTEGDDVDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 5)
35.13	EIQMTQSPSSMSASLGDRITITCQATQDIVKNLNWYQQKPGKPPSFLIYHATELAKGVPSRFSGSGSGSDYSLTISNLESEDFADYYCLQFYDFPFTFGAGTKLELKR (SEQ ID NO: 2)	QVQLQQSGAELGKPGASVKLSCRASGYTFTRYYIYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGDTHFNEKFKTKATLTVDKSSSSAHIHLTSLTSEDSAVYYCSIHAYSFDFWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 6)
239.12	DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIYGALNWYQRKQGKSPQLLIYGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQNVLSTPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 3)	EVKLEESGPVLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISNSAGTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCASGGWSSYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 7)
322.3	METDTLLLWVLLLWVPGSTGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGSSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 4)	MGWSRIFLFLLSIIAGVHCRVQLQQSGPELVKPGASVTISCKASGYIFTSDYIHWVKQRPGQGPEWIGWIYPGNINTKYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDDGNLYYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 8)
199.9	METDTLLLWVLLLWVPGSTGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQP PKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 74)	MGWSYIILFLVATATGVHSLVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYFMYWVRQRPGQGLEWIGEINPSNGGNDFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSGDYGYDGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 75)

實例 2 ：抗體 239.12 、 322.3 、 425.6 、 35.13 和 199.9 與 SARS-CoV-2 S 糖蛋白的結合的表徵

目的：探測抗體239.12、322.3、425.6、35.13和199.9與源自親本SARS-CoV-2病毒（具有SEQ ID NO: 9的SARS-CoV-2 S糖蛋白的SARS-CoV-2病毒）和多種SARS-CoV-2變體的CoV S糖蛋白結合的能力。還探測上述抗體抑制hACE2與SARS-CoV-2 S糖蛋白之間的相互作用的能力。最後，探測上述抗體中和活SARS-CoV-2病毒和假病毒的能力。

方法 - 重組CoV S糖蛋白產生：將編碼CoV S糖蛋白的基因進行密碼子優化以在草地貪夜蛾（Sf9）細胞中表現，並且由全長CoV S糖蛋白基因序列合成產生。CoV S糖蛋白含有無活性的弗林蛋白酶切割位點QQAQ（SEQ ID NO: 144），並且在K986P和V987P處引入兩個脯胺酸點突變，其中胺基酸根據SEQ ID NO: 10進行編號。表J含有本文所用的SARS-CoV-2 S糖蛋白的胺基酸序列。

方法 - 抗體產生：根據實例1中描述的方法產生抗體。

方法 - 生物膜層干涉測量：使用Octet QK 384儀器（ForteBio，加利福尼亞州費利蒙）進行CoV S糖蛋白與捕獲在生物感測器上的brMAb（即，239.12；322.3；425.6；35.13；和199.9）的結合動力學研究。簡言之，為了測量與CoV S糖蛋白（即，SARS-CoV-2 rS）的結合，將相應的brMAb以2 µg/mL與抗小鼠Fc生物感測器偶聯600秒，然後是洗滌步驟，在其中進行基線測量。CoV S糖蛋白的胺基酸序列可見於表J。然後，測量CoV S糖蛋白的締合持續600秒，然後是600秒的解離步驟。使用Octet軟體HT10.0分析結合動力學。為了測量brMAb與刺突RBD-His的結合動力學，將RBD-His（2 µg/mL）與Ni-NTA生物感測器偶聯。在基線測量後，測量抗體的締合持續600秒，然後解離600秒。使用Octet軟體HT10.0分析結合動力學。

方法 - ELISA：將96孔微量滴定板用1.0 µg/mL SARS-CoV-2 S蛋白包被。在阻斷非特異性結合後，添加連續稀釋的單株抗體，並且使用辣根過氧化物酶（HRP）綴合的抗小鼠測量抗體的結合。在OD 450 nm處測量底物轉化率。通過四參數曲線擬合計算EC50值。

方法 - hACE2受體抑制：通過ELISA評價抗體阻斷人血管緊張素轉換酶2（hACE2）受體與CoV S糖蛋白之間的相互作用的能力。簡言之，將96孔板在4ºC下用1.0 μg/mL CoV S糖蛋白包被隔夜。將板用PBS-T洗滌，並且用TBS Startblock阻斷緩衝液阻斷非特異性結合。將血清或mAb溶液以1:20稀釋度開始連續稀釋2倍，並且在室溫下添加到包被的孔中持續1小時。在洗滌後，將30 ng/mL組胺酸標記的hACE2在室溫下添加到孔中持續1小時。添加HRP綴合的抗組胺酸IgG並且培育1小時，然後添加TMB底物。用SpectraMax Plus讀板儀在OD 450 nm處讀取板，並且用SoftMax Pro軟體分析資料。在SoftMax Pro程式中使用以下等式計算每個樣品的每個稀釋度的抑制%：100-[(平均值結果/在陽性對照下的對照值)*100]。

生成血清稀釋度與抑制%的關係圖，並且通過四參數邏輯斯諦（4PL）曲線擬合至資料進行曲線擬合。在SoftMax Pro程式中確定hACE2與CoV S糖蛋白的結合抑制50%時的血清抗體力價或抗體濃度（IC ₅₀）。使用GraphPad Prism 7.05軟體對單獨動物的hACE2受體抑制力價（組幾何平均力價）和95% CI繪圖。對於低於測定LOD的力價，報告力價＜ 20（起始稀釋度），並且將值“10”分配給樣品以計算組平均力價。

方法 - 活SARS-CoV-2中和測定：在馬里蘭大學醫學院（University of Maryland, School of Medicine）（馬里蘭州巴爾的摩）的特殊病原動物生物安全3級設施（select agent Animal Biosafety Level 3 facility）中進行活SARS-CoV-2的處理。將Vero/TMPRSS2細胞維持在由補充有10%（v/v）胎牛血清（熱滅活的，Sigma-Aldrich）、1%（v/v）青黴素/鏈黴素和1%（v/v）L-麩醯胺酸（2 mM最終濃度，Gibco）的DMEM（Quality Biological）組成的完全培養基中。在Vero/TMPRSS2細胞中製備SARS-CoV-2分離株的儲備病毒並且確認序列。將單株抗體一式兩份地處理，最終初始濃度為10 µg/mL，然後1:2連續稀釋，產生12個稀釋度的系列並且每個孔含有100 µL。必要時處理較低的樣品濃度。所有稀釋都在補充有10%（v/v）胎牛血清（熱滅活的，Sigma）、1%（v/v）青黴素/鏈黴素（Gemini Bio-products）和1%（v/v）L-麩醯胺酸（2 mM最終濃度，Gibco）的DMEM（Quality Biological）中進行。然後將稀釋板運輸到BSL-3實驗室，並且將100 µL稀釋的SARS-CoV-2接種物添加到每個孔中，以在轉移到滴定板中後得到0.01的感染複數（MOI）。每個板上都包括未處理的只有病毒的對照和類比感染對照。然後將樣品/病毒混合物在37ºC（5.0% CO ₂）下培育1小時，之後將100 µL轉移到具有匯合的Vero/TMPRSS2細胞的透明96孔滴定板中。將滴定板在37ºC（5.0% CO ₂）下培育48-72 h（取決於變體），然後對每個樣品稀釋度進行視覺化CPE確定。顯示出CPE的第一樣品稀釋度報告為中和＞ 99%的測試SARS-CoV-2濃度（Neut ₉₉）所需的最小樣品稀釋度。

方法 - 假病毒中和測定：使用慢病毒平臺產生SARS-CoV-2假病毒。簡言之，獲得包括CoV S糖蛋白的骨架質粒和輔助質粒。使用來自EPICoV資料庫的編碼CoV S糖蛋白序列的基因通過GenScript合成pcDNA3.1的奧密克戎變體，然後對原型（編碼SEQ ID NO: 9的刺突糖蛋白的SARS-CoV-2病毒）假病毒進行密碼子優化和胞質尾缺失。將HEK293T細胞以1 × 10 ⁶個細胞/孔接種在6孔組織培養板中並且在37ºC下培育隔夜，並且用表現標記蛋白（螢光素酶或Zs green）的編碼慢病毒骨架的質粒、表現CoV S糖蛋白的質粒和表現其他HIV蛋白以形成病毒體的質粒使用LIPOFECTAMINE ^TM3000轉染。在轉染後七十二小時，收集上清液並且將其通過0.45 µM過濾器過濾以獲得假病毒原液。在-80ºC下儲存假病毒原液的等分試樣。

然後使用穩定表現hACE2的HEK293T細胞系進行假病毒中和測定。將含有本文所述的抗體的溶液在HEK293T細胞培養基（DMEM + 10% FBS + 1%青黴素 + 鏈黴素 + 麩醯胺酸，沒有嘌呤黴素）中連續稀釋兩倍，並且向96孔組織培養板中的每個孔中添加50 µL。然後將五十微升的SARS-CoV-2假病毒原液（對應於3%-7% GFP）添加到每個孔中，然後在37ºC下培育一小時。然後，將100 µL含有嘌呤黴素的HEK293T培養基中的2.5 × 10 ⁴個細胞HEK293T/hACE2細胞添加到孔中，然後在37ºC下培育72小時。在培育後，使用移液管小心地去除培養基，並且添加50 µL胰蛋白酶以使細胞離散。利用使用移液管進行的手動攪拌使細胞離散，並且將在PBS中製備的4%多聚甲醛添加到每個孔中。通過用Guava流式細胞儀和InCyte軟體（Luminex）在488-510 nm處測量螢光來確定病毒複製。分析資料，並且在GraphPad Prism中生成每個樣品的中和曲線，通過四參數曲線擬合計算50%中和力價（EC50）。

結果 - 生物膜層干涉測量：表C示出了抗體239.12、322.3、425.6和35.13與CoV S糖蛋白（與來自SARS-CoV-2奧密克戎毒株的CoV S糖蛋白有關）的RBD的結合動力學。

表C：239.12、322.3、425.6和35.13與CoV S糖蛋白（與來自SARS-CoV-2奧密克戎毒株的CoV S糖蛋白有關）的RBD的結合。

抗體名稱	締合速率常數(1/Ms)	解離速率常數(1/s)	K _D(M)
239.12	不結合
322.3	1.38E+05	1.27E+07	1.69E-12
425.6	2.72E+05	1.23E+03	4.89E-09
35.13	1.42E+05	1.77E+07	1.93E-12

表D示出了所評價的每種抗體的結合動力學參數。如表D所示，每種抗體與多種CoV S糖蛋白結合。具體來說，239.12與和SARS-CoV-2親本毒株、伽馬毒株、德爾塔毒株和阿爾法毒株有關的CoV S糖蛋白結合。322.3與和SARS-CoV-2親本毒株、伽馬毒株、貝塔毒株、德爾塔毒株、阿爾法毒株和多種奧密克戎毒株有關的CoV S糖蛋白結合。35.13與和SARS-CoV-2親本毒株、伽馬毒株、貝塔毒株、德爾塔毒株、阿爾法毒株和多種奧密克戎毒株有關的CoV S糖蛋白結合。425.6與和SARS-CoV-2親本毒株、伽馬毒株、貝塔毒株、德爾塔毒株、阿爾法毒株和多種奧密克戎毒株有關的CoV S糖蛋白結合。

圖 1A-1D示出了239.12（圖 1A）、322.3（圖 1B）、425.6（圖 1C）和35.13（圖 1D）與和SARS-CoV-2親本毒株（SEQ ID NO: 35）、SARS-CoV-2伽馬毒株（SEQ ID NO: 38）、SARS-CoV-2貝塔毒株（SEQ ID NO: 36）、SARS-CoV-2德爾塔毒株（SEQ ID NO: 37）、SARS-CoV-2阿爾法毒株（SEQ ID NO: 39）和SARS-CoV-2奧密克戎毒株（SEQ ID NO: 42）有關的CoV S糖蛋白（與CoV S糖蛋白）的結合曲線。

圖 1E-1I示出了239.12（圖 1E）、322.3（圖 1F）、425.6（圖 1G）、35.13（圖 1H）和199.9（圖 1I）與和SARS-CoV-2 S奧密克戎毒株有關的各種CoV S糖蛋白的結合曲線。

表D：抗體239.12、322.3、35.13和425.6與CoV S糖蛋白的結合動力學

239.12

322.3

35.13

425.6

199.9

BV #

rS 變體

ka (a/Ms)

kd (1/dis)

KD (M)

ka (a/Ms)

kd (1/dis)

KD (M)

ka (a/Ms)

kd (1/dis)

KD (M)

ka (a/Ms)

kd (1/dis)

KD (M)

ka (a/Ms)

kd (1/dis)

KD (M)

BV2373 (SEQ ID NO: 35)

原型

5.29E+04

1.79E-07

3.81E-12

2.72E+03

1.29E-07

5.71E-11

3.3E+04

1.67E-07

5.29E-12

1.06E+05

1.80E-07

＜1.0E-12

不結合

BV2425 (SEQ ID NO: 39)

阿爾法

7.28E+04

1.62E-07

2.26E-12

5.57E+04

1.54E-07

7.87E-11

5.65E+04

1.43E-07

3.22E-12

1.23E+05

1.84E-07

＜1.0E-12

*

BV2438 (SEQ ID NO: 101)

貝塔

不結合

2.01E+04

1.24E-07

6.48E-12

1.05E+04

1.54E-07

1.52E-11

1.19E+05

2.08E-07

＜1.0E-12

*

BV2443 (SEQ ID NO: 107)

伽馬

2.94E+04

1.25E-07

4.31E-12

1.18E+03

1.26E-07

1.07E-10

9.09E+03

1.70E-07

1.98E-11

5.27E+04

1.72E-07

＜1.0E-12

*

BV2465 (SEQ ID NO: 113)

德爾塔

4.97E+04

1.40E-07

3.45E-12

3.69E+03

1.63E-07

7.87E-11

4.19E+04

1.42E-07

3.73E-12

1.17E+05

1.88E-07

＜1.0E-12

*

BV2509 (SEQ ID NO: 42)

BA.1

不結合

2.54E+03

1.43E-07

8.74E-11

1.55E+04

1.52E-07

9.82E-12

4.13E+04

1.54E-07

3.91E-12

8.04E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

BV2523 (SEQ ID NO: 118)

BA.2

不結合

7.45E+03

1.78E-07

4.05E-11

1.91E+04

1.61E-07

8.43E-12

3.82E+04

1.37E-07

3.69E-12

5.93E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

BV2540 (SEQ ID NO: 119)

BA.5

不結合

1.11E+04

1.46E-07

1.32E-11

1.76E+04

1.21E-07

7.23E-12

8.59E+04

1.50E-07

1.76E-12

7.44E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

BV2541 (SEQ ID NO: 120)

BA.4

不結合

5.56E+03

＜1.0E-07

＜1.0E-12

2.27E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

6.29E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

*

BV2542 (SEQ ID NO: 122)

BA.2.12.1

不結合

2.69E+03

1.22E-07

4.15E-11

1.50E+04

1.14E-07

7.87E-12

4.02E+04

1.51E-07

3.81E-12

6.00E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

BV2561 (SEQ ID NO: 145)

BA.2.75

不結合

5.51E+03

＜1.0E-07

4.47E-12

8.30E+03

＜1.0E-07

6.87E-12

4.69E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

5.09E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

BV2562 (SEQ ID NO: 146)

BA.4.6

不結合

2.10E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

3.85E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

9.83E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

8.42E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

BV2589 (SEQ ID NO: 133)

BQ.1.1

不結合

1.27E+04

＜1.0E-07

1.63E-12

2.69E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

不結合

7.65E+04

＜1.0E-07

＜1.0E-12

*未評價

結果 - ELISA：圖 2A-2D示出了239.12（圖 2A）、322.3（圖 2B）、425.6（圖 2C）、35.13（圖 2D）與各種CoV S糖蛋白的結合的EC50。圖 2E-2I示出了239.12（圖 2E）、322.3（圖 2F）、425.6（圖 2G）、35.13（圖 2H）和199.9（圖 2I）與和SARS-CoV-2 S奧密克戎毒株有關的各種CoV S糖蛋白的結合的EC50。表E示出了35.13與CoV S糖蛋白的結合的EC50。表F1示出了抗體（239.12、322.3、426.7和35.13）與源自奧密克戎毒株的CoV S糖蛋白的結合的EC50（ng/mL）。表F2示出了199.9與CoV S糖蛋白的結合的EC50（ng/mL）。

表E：奧密克戎相關CoV S糖蛋白與抗體之間的結合的EC50（ng/mL）

SARS-CoV-2 S 蛋白	EC50 (ng/mL)
武漢	7
貝塔B.1.351	119
阿爾法B.1.1.7	11
伽馬P.1	12
德爾塔B.1.617.2	10
德爾塔+	11
繆	179
奧密克戎	50

表F1：奧密克戎相關CoV S糖蛋白與抗體之間的結合的EC50（ng/mL）

SARS-CoV-2 變體 rS	抗 rS ELISA (EC50 ： ng/mL)
239.12	322.3	425.6	35.13
BA.1	＞5000	197	＞5000	38
BA.2	＞5000	195	28	53
BA.4	＞5000	82	16	＞10000
BA.5	＞10000	45	14	1027
BA.2.12.1	＞5000	225	34	104
BA.2.75	＞10000	144	＞10000	48
BA.2.75.2	＞5000	24	＞5000	＞5000
BA.4.6	＞10000	117	21	＞10000
BQ.1.1	＞5000	77	＞5000	＞5000
BQ.1	＞5000	85	＞5000	＞5000
XBB	＞5000	111	＞5000	＞5000

表F2：SARS-CoV-2 S多肽與199.9之間的結合的EC50（ng/mL）

CoV S 糖蛋白有關的毒株	抗 rS ELISA (EC50 ： ng/mL)
親本	＞5000
阿爾法	n.d.
貝塔	n.d.
伽馬	n.d.
德爾塔	＞5000
BA.1	~5000
BA.2	~5000
BA.4	16
BA.5	20
BA.2.12.1	＞10000
BA.2.75	＞10000
BA.2.75.2	1
BA.4.6	21
BQ.1.1	16
XBB	3867

結果 - hACE2受體抑制：表G示出了35.13將hACE2與CoV S糖蛋白之間的相互作用抑制50%的濃度（IC50）。表H1示出了抗體將hACE2與奧密克戎相關CoV S糖蛋白之間的相互作用抑制50%的濃度（IC50）。表H2示出了199.9將hACE2與CoV S糖蛋白之間的相互作用抑制50%的濃度（IC50）。圖 5A-5C示出了35.13（圖 5A）、425.6（圖 5B）和322.3（圖 5C）的hACE2受體抑制作用。

表G：35.13和425.6抑制hACE2與CoV S糖蛋白之間的相互作用的IC50

	35.13	425.6
CoV S 糖蛋白	抑制 hACE2 與 SARS-CoV-2 S 蛋白之間的相互作用的 IC50 (ng/mL)	抑制 hACE2 與 SARS-CoV-2 S 蛋白之間的相互作用的 IC50 (ng/mL)
武漢	74	64
貝塔B.1.351	922	48
阿爾法B.1.1.7	142	100
伽馬P.1	70	48
卡帕B.1.617.1	*	43
德爾塔B.1.617.2	98	69
德爾塔+	65	*
繆	982	*
奧密克戎	102	＞3000

*未確定

表H1：抗體抑制hACE2與奧密克戎相關CoV S糖蛋白之間的相互作用的IC50

CoV S 糖蛋白所來源的毒株	50% 受體抑制 (IC50 ： ng/mL)
239.12	322.3	425.6	35.13
BA.1	＞3000	493	＞3000	97
BA.2	＞3000	224	32	126
BA.4	＞3000	543	37	＞5000
BA.5	＞5000	779	28	＞3000
BA.2.12.1	＞3000	866	28	177
BA.2.75	＞5000	＞5000	＞5000	169
BA.2.75.2	＞3000	184	＞3000	＞3000
BA.4.6	＞5000	411	71	＞5000
BQ.1.1	＞3000	265	＞3000	＞3000
BQ.1	＞3000	656	＞3000	＞3000
XBB	＞3000	130	＞3000	＞3000

表H2：199.9抑制hACE2與奧密克戎相關CoV S糖蛋白之間的相互作用的IC50

CoV S 糖蛋白	50% 受體抑制 (IC50 ： ng/mL)
親本	＞3000
阿爾法	n.d.
貝塔	n.d.
伽馬	n.d.
德爾塔	＞3000
BA.1	2106
BA.2	676
BA.4	38
BA.5	28
BA.2.12.1	2114
BA.2.75	411
BA.2.75.2	648
BA.4.6	56
BQ.1.1	32
XBB	3778

結果 - 活SARS-CoV-2中和測定：SARS-CoV-2中和測定：35.13中和親本SARS-CoV-2以及直到奧密克戎BA.4.的變體菌株。在此測定中，35.13不中和BA.4.6或BA.5。425.6展現出針對所有測試變體（除了奧密克戎BQ.1.1之外）的有效中和活性。圖 4A-4C示出了中和大於99%的測試SARS-CoV-2濃度（Neut99）所需的35.13（圖 4A）、425.6（圖 4B）和322.3（圖 4C）的最小樣品稀釋度。

表I示出了425.6中和50%的SARS-CoV-2病毒時的濃度。“N.D.”意指尚未收集資料點。

表I：425.6抑制hACE2與CoV S糖蛋白之間的相互作用的IC50以及在中和50%的SARS-CoV-2時的濃度

	425.6	35.13
CoV S 糖蛋白	50% SARS-CoV-2 中和 (ng/mL)	50% SARS-CoV-2 中和 (ng/mL)
武漢WA	24.5	N.D.
貝塔B.1.351	5.31	N.D.
阿爾法B.1.1.7	2.96	N.D.
伽馬P.1	7.22	N.D.
卡帕B.1.617.1	3.0	N.D.
德爾塔B.1.617.2	N.D.	N.D.
奧密克戎BA.1	210.51	7.32
奧密克戎BA.2	2.38	7.32
奧密克戎BA.4	1.23	2.44
奧密克戎BA.5	4.27	N.D.
奧密克戎BA.2.12.1	2.27	2.44

[0259]結果 - 假病毒中和：圖 6A-6B示出了抗體35.13（圖 6A）和425.6（圖 6B）的假病毒中和。

表J：用於評價結合動力學的CoV S糖蛋白多肽

CoV S 糖蛋白	胺基酸序列	SEQ ID NO:
BV2373	QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	35
BV2438 (也稱為BV2426)	QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFANPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRGLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLHALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPQQAQSVASQSIIAYTMSLGVENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	36
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BV2443	QCVNFTNRTQLPSAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNYPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLSEFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAAIKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASFVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	38
BV2425	QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIDDTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSHQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPINFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILARLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTHNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	39
BV2472	QCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGITAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	40
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德爾塔克戎	MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHVISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPIIVREPEDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLKGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFKGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDIFSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	139
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BV2562	MFVFLVLLPLVSSQCVNLITRTQSYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLGRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNSSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	146
BV2577	MFVFLVLLPLVSSQCVNLITRTQSYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHENNKSRMESELRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPVNLGRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSSWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYRYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGSNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNISNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLINLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT	147

實例 3 ：抗體 239.12 、 322.3 、 425.6 和 35.13 的表位作圖

目的：進行丙胺酸掃描誘變以鑒定239.12、322.3、425.6和35.13抗體的表位。

方法：由Integral Molecular（賓夕法尼亞州費城）使用SARS-CoV-2（Wuhan-Hu-1毒株）S蛋白RBD鳥槍法誘變突變文庫（使用S蛋白的全長表現構建體製備）提供鳥槍法誘變表位作圖服務。RBD的一百八十四個殘基單獨突變為丙胺酸，並且丙胺酸殘基突變為絲胺酸。將突變體文庫排列在384孔微孔板中，暫態轉染到HEK293T細胞中，並且允許表現22 h。然後將細胞與在表現野生型刺突的細胞上使用獨立的結合滴定曲線預先確定的濃度的抗體一起培育。將細胞在4%（v/v）多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences）中固定，並且用加鈣和鎂的PBS（PBS++）中的0.2%（w/v）皂苷（Sigma-Aldrich）透化，之後與在PBS++、10%普通山羊血清（Sigma）和0.1%皂苷中稀釋的brMAb一起培育。使用3.75 μg/mL在含0.1%皂苷的10%普通山羊血清中的Alexa-Fluor-488綴合的二抗（Jackson ImmunoResearch Laboratories）檢測抗體。將細胞用PBS++/0.1%皂苷洗滌三次，然後在PBS中洗滌兩次，並且使用高通量Intellicyte iQue流式細胞儀（Sartorius）檢測平均細胞螢光。通過減去來自類比轉染的對照的信號並且相對於來自野生型S轉染的對照的信號歸一化，相對於野生型S蛋白反應性計算針對每種突變S蛋白殖株的抗體反應性。如果殖株內的突變不支持測試mAb的反應性但支持其他SARS-CoV-2抗體的反應性，則它們被鑒定為對於mAb表位是關鍵的。此反篩選策略有助於排除局部錯誤折疊或具有表現缺陷的S蛋白突變體。在Clustal Omega（ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo）中比對Novavax重組刺突（rS）蛋白的胺基酸序列。指出了相對於原始序列的任何點突變，並且突出了brMAb結合的關鍵胺基酸。指出了參與hACE2結合和1-4類抗體結合的殘基，如由Barnes, C.O., Jette, C.A., Abernathy, M.E.等人 SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature 588, 682-687 (2020)所述。值得注意的是，使用人mAb定義Barnes的抗體類別，並且在這項工作中描述的mAb是在小鼠中產生的。

結果：表K示出了與和野生型SARS-CoV-2 S RBD的結合相比，322.3、239.12和425.6 Fab與突變SARS-CoV-2 S RBD的結合反應性。確定加底線的胺基酸對於結合是重要的。表K中的胺基酸相對於SEQ ID NO: 10的SARS-CoV-2 S蛋白進行編號。

表K：與野生型相比，Fab與突變SARS-CoV-2 S RBD的結合反應性

	結合反應性 (% WT)
SARS-CoV-2 S 蛋白中的突變	322.3	239.12	425.6
A352S	65 (5)	104.1 (19)	1.5 (1)
K378A	12.1 (1)	105.9 (18)	129.4 (21)
T385A	8.4 (0)	115.3 (14)	131.5 (29)
L387A	0.9 (0)	43.9 (1)	48.1 (8)
C391A	32 (11)	72.6 (13)	33 (4)
K444A	80.9 (2)	71.8 (11)	-3.9 (0)
V445A	87.6 (2)	2.7 (3)	12.3 (4)
G446A	77 (0)	94.7 (15)	0.4 (3)
N448A	50.4 (6)	44.4 (5)	18.3 (8)
R457A	22.7 (1)	29.9 (11)	-4.6 (2)
S459A	80.5 (7)	113.8 (1)	0.2 (1)
G496A	113.1 (31)	11.3 (4)	138.4 (44)
Q498A	116 (16)	-3.9 (0)	137 (14)
P499A	48.4 (95)	12.1 (1)	34 (8)
T500A	99.7 (6)	11.4 (2)	101.1 (6)
H519A	93.6 (20)	106.1 (22)	3.6 (9)
C525A	14 (0)	69.9 (8)	29.9 (1)
G526A	39.5 (7)	76.8 (21)	87.3 (17)

35.13 Fab與SARS-CoV-2糖蛋白的結合的關鍵胺基酸（SEQ ID NO: 10的殘基476、485、486、487、489）示於表L中。進一步的結構資料表明，胺基酸485、486、487和489對於35.13與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合特別關鍵。此外，結構資料證實，胺基酸378和385對於322.3與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合是關鍵的，並且胺基酸444、445、446和448對於425.6與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合是關鍵的。

表L：35.13 Fab與SARS-CoV-2糖蛋白的結合的關鍵殘基

SARS-CoV-2 S 蛋白中的突變	35.13 的結合反應性 (% WT)
G476A	12.8 (4)
G485A	2.8 (1)
F486A	3.6 (1)
N487A	4.2 (0)
Y489A	4.9 (10)

圖 3A-3D示出了SARS-CoV-2 S糖蛋白（蛋白質資料庫ID：6XCN）的晶體結構。用於結合35.13（圖 3A）、425.6（圖 3B）、239.12（圖 3C）和322.3（圖 3D）Fab的關鍵殘基顯示為球形。每個圖中的右側結構顯示了用於結合每種Fab的SARS-CoV-2 S受體結合結構域（RBD）的關鍵殘基（蛋白質資料庫ID：6Z2M）。圖 7示出了來自原始、貝塔、德爾塔、伽馬、BA.1、BA.2、BA.5和BQ.1.1 SARS-CoV-2病毒的SARS-CoV-2 S糖蛋白的比對。322.3與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合的關鍵胺基酸（K378和T385）有加框。425.6與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合的關鍵胺基酸（K444、V445、G446和N448）有加框。425.6與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合的關鍵胺基酸（K444、V445、G446和N448）有加框。關鍵胺基酸的編號是相對於SEQ ID NO: 10的SARS-CoV-2 S糖蛋白。

編號實施例

1. 一種與突發性急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）蛋白結合的抗體或其片段。

2. 根據實施例1所述的抗體或其片段，其中輕鏈互補決定區1（VL CDR1）選自SEQ ID NO: 11-14；輕鏈互補決定區2（VL CDR2）選自SEQ ID NO: 15-18；輕鏈互補決定區3（VL CDR3）選自SEQ ID NO: 19-22；重鏈互補決定區1（VH CDR1）選自SEQ ID NO: 23-26；重鏈互補決定區2（VH CDR2）選自SEQ ID NO: 27-30；並且重鏈互補決定區3（VH CDR3）選自SEQ ID NO: 31-34。

3. 根據實施例1或2所述的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含： (i) 根據SEQ ID NO: 23的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 27的VH CDR2；和根據SEQ ID NO: 31的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 11的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 15的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 19的VL CDR3； (ii) 根據SEQ ID NO: 24的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 28的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 32的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 12的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 16的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 20的VL CDR3； (iii) 根據SEQ ID NO: 25的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 29的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 33的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 13的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 17的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 21的VL CDR3；或者 (iv) 根據SEQ ID NO: 26的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 30的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 34的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 14的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 18的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 22的VL CDR3。

4. 根據實施例1-3中任一項所述的抗體或其片段，其中可變重鏈（VH）結構域的胺基酸序列包含以下胺基酸序列或由以下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與具有SEQ ID NO: 5-8中任一個的胺基酸序列的多肽具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。

5. 根據實施例1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中可變輕鏈（VL）結構域的胺基酸序列包含以下胺基酸序列或由以下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與具有SEQ ID NO: 1-4中任一個的胺基酸序列的多肽具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。

6. 根據實施例1-5中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體選自：

包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 5具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL；包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 6具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 2具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL；包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL；以及包含以下的抗體：(i) 包含與SEQ ID NO: 4具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的VL。

7. 根據實施例1-6中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是單株抗體、Fab、F(ab′)2、Fab′、scFv或單結構域抗體（sdAb）。

8. 根據實施例1-7中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體包含人IgG1或IgG4結構域。

9. 根據實施例1-8中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段對SARS-CoV-2 S多肽或其變體的解離常數（KD）為50 nM或更小、10 nM或更小、1 nM或更小、0.5 nM或更小、0.1 nM或更小、0.05 nM或更小、0.01 nM或更小或者0.001 nM或更小。

10. 根據實施例1-9中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與一種或多種CoV S多肽結合，所述一種或多種CoV S多肽與根據SEQ ID NO: 9、10、35-43和72-73的多肽具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。

11. 一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼根據實施例1-10中任一項所述的抗體或其片段。

12. 一種表現載體，所述表現載體包含編碼根據實施例1-10中任一項所述的抗體或其片段的核酸區段。

13. 一種宿主細胞，所述宿主細胞包含根據實施例12所述的表現載體。

14. 一種醫藥組合物，所述醫藥組合物包含根據實施例1-10中任一項所述的抗體和醫藥上可接受的載劑。

15. 一種治療感染SARS-CoV-2病毒或其變體的有需要的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者投予根據實施例1-10中任一項所述的抗體或其片段或者根據實施例14所述的醫藥組合物。

16. 根據實施例15所述的方法，其中所述受試者為65歲或更大。

17. 根據實施例15所述的方法，其中所述受試者是免疫受損的。

18. 根據實施例15所述的方法，其中所述受試者是懷孕的女性。

19. 根據實施例15所述的方法，其中所述SARS-CoV-2變體選自：B.1.1.7 SARS-CoV-2毒株；B.1.351 SARS-CoV-2毒株；P.1 SARS-CoV-2毒株；Cal.20C SARS-CoV-2毒株；B.1.617.2 SARS-CoV-2毒株；B.1.525 SARS-CoV-2毒株；B.1.526 SARS-CoV-2毒株；B.1.617.1 SARS-CoV-2毒株；C.37 SARS-CoV-2毒株；B.1.621 SARS-CoV-2毒株；和B.1.1.529 SARS-CoV-2毒株。

通過引用併入

將本文引用的所有參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案和專利申請都出於所有目的通過引用以其整體而併入。然而，提及本文引用的任何參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案和專利申請並非並且不應當被視為承認或以任何形式暗示它們構成有效的現有技術或形成世界上任何國家公知常識的一部分。將以下專利檔出於所有目的通過引用以其整體併入本文：2022年11月30日提交的國際申請號PCT/US2022/080700；國際公開號2021/154812；和國際公開號2022/203963。

無

圖1A-1D示出了239.12（圖1A）、322.3（圖1B）、425.6（圖1C）和35.13（圖1D）與和SARS-CoV-2親本毒株（SEQ ID NO: 35）、SARS-CoV-2伽馬毒株（SEQ ID NO: 38）、SARS-CoV-2貝塔毒株（SEQ ID NO: 36）、SARS-CoV-2德爾塔毒株（SEQ ID NO: 37）、SARS-CoV-2阿爾法毒株（SEQ ID NO: 39）和SARS-CoV-2奧密克戎毒株（SEQ ID NO: 42）有關的SARS-CoV-2 S蛋白（與SARS-CoV-2 S多肽）的結合曲線。圖1E-1I示出了239.12（圖1E）、322.3（圖1F）、425.6（圖1G）、35.13（圖1H）和199.9（圖1I）與和SARS-CoV-2 S奧密克戎毒株有關的各種SARS-CoV-2 S蛋白的結合曲線。圖2A-2E示出了239.12（圖2A）、322.3（圖2B）、425.6（圖2C）、35.13（圖2D）與各種重組SARS-CoV-2 S蛋白的結合的EC50。圖2E-2I示出了239.12（圖2E）、322.3（圖2F）、425.6（圖2G）、35.13（圖2H）和199.9（圖2I）與和SARS-CoV-2 S奧密克戎毒株有關的各種SARS-CoV-2 S蛋白的結合的EC50。圖2I進一步示出了199.9與源自SARS-CoV-2親本毒株（SEQ ID NO: 35）的SARS-CoV-2 S蛋白的結合的EC50。圖3A-3D示出了SARS-CoV-2 S糖蛋白（蛋白質資料庫ID：6XCN）的晶體結構。用於結合35.13（圖3A）、425.6（圖3B）、239.12（圖3C）和322.3（圖3D）Fab的關鍵殘基顯示為球形。每個圖中的右側結構顯示了用於結合每種Fab的SARS-CoV-2 S受體結合結構域（RBD）的關鍵殘基（蛋白質資料庫ID：6Z2M）。圖4A-4C示出了中和大於99%的測試SARS-CoV-2濃度（Neut99）所需的35.13（圖4A）、425.6（圖4B）和322.3（圖4C）的最小樣品稀釋度。圖5A-5C示出了抗體35.13（圖5A）、425.6（圖5B）和322.3（圖5C）的hACE2受體抑制作用。圖6A-6B示出了抗體35.13（圖6A）和425.6（圖6B）的假病毒中和。圖7示出了來自原始、貝塔、德爾塔、伽馬、BA.1、BA.2、BA.5和BQ.1.1 SARS-CoV-2病毒的SARS-CoV-2 S糖蛋白的比對。322.3與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合的關鍵胺基酸（K378和T385）有加框。425.6與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合的關鍵胺基酸（K444、V445、G446和N448）有加框。425.6與SARS-CoV-2 S糖蛋白的結合的關鍵胺基酸（K444、V445、G446和N448）有加框。關鍵胺基酸的編號是相對於SEQ ID NO: 10的SARS-CoV-2 S糖蛋白。

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Claims

一種與突發性急性呼吸症候群冠狀病毒2（CoV）刺突（S）糖蛋白結合的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 與選自SEQ ID NO: 11-14和76的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變輕鏈互補決定區1（VL CDR1）； (ii) 與選自SEQ ID NO: 15-18和77的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變輕鏈互補決定區2（VL CDR2）； (iii) 與選自SEQ ID NO: 19-22和78的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變輕鏈互補決定區3（VL CDR3）； (iv) 與選自SEQ ID NO: 23-26和79的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變重鏈互補決定區1（VH CDR1）； (v) 與選自SEQ ID NO: 27-30和80的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變重鏈互補決定區2（VH CDR2）；和 (vi) 與選自SEQ ID NO: 31-34和81的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變重鏈互補決定區3（VH CDR3）。
一種與突發性急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）蛋白結合的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 包含與SEQ ID NO: 5-8和75的多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的可變重鏈（VH）結構域；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 1-4和74中任一個的多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的可變輕鏈（VL）結構域。
如請求項1所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 包含與SEQ ID NO: 5-8和75的多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的可變重鏈（VH）結構域；和 (ii) 包含與SEQ ID NO: 1-4和74中任一個的多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列的可變輕鏈（VL）結構域。
如請求項2所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 與選自SEQ ID NO: 11-14和76的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變輕鏈互補決定區1（VL CDR1）； (ii) 與選自SEQ ID NO: 15-18和77的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變輕鏈互補決定區2（VL CDR2）； (iii) 與選自SEQ ID NO: 19-22和78的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變輕鏈互補決定區3（VL CDR3）； (iv) 與選自SEQ ID NO: 23-26和79的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變重鏈互補決定區1（VH CDR1）； (v) 與選自SEQ ID NO: 27-30和80的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變重鏈互補決定區2（VH CDR2）；和 (vi) 與選自SEQ ID NO: 31-34和81的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%同一性的可變重鏈互補決定區3（VH CDR3）。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含：根據SEQ ID NO: 23的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 27的VH CDR2；和根據SEQ ID NO: 31的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 11的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 15的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 19的VL CDR3。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含：根據SEQ ID NO: 24的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 28的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 32的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 12的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 16的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 20的VL CDR3。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含：根據SEQ ID NO: 25的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 29的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 33的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 13的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 17的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 21的VL CDR3。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含：根據SEQ ID NO: 26的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 30的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 34的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 14的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 18的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 22的VL CDR3。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含：根據SEQ ID NO: 79的VH CDR1；根據SEQ ID NO: 80的VH CDR2；根據SEQ ID NO: 81的VH CDR3；根據SEQ ID NO: 76的VL CDR1；根據SEQ ID NO: 77的VL CDR2；和根據SEQ ID NO: 78的VL CDR3。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的VL。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的VL。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的VL。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的VL。
如請求項1-4中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含： (i) 包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的VH；和 (ii) 包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的VL。
如請求項1-14中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是單株抗體、Fab、F(ab′) ₂、Fab′、scFv或單結構域抗體（sdAb）。
如請求項1-14中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體包含人IgG1或IgG4結構域。
如請求項1-16中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段對CoV S糖蛋白或其變體的平衡解離常數（K _D）為50 nM或更小、10 nM或更小、1 nM或更小、0.5 nM或更小、0.1 nM或更小、0.05 nM或更小、0.01 nM或更小或者0.001 nM或更小。
如請求項1-16中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段以小於1.0 x 10 ^-9莫耳/升（M）、小於1.0 x 10 ^-10M、小於1.0 x 10 ^-11M或小於1.0 x 10 ^-12M的平衡解離常數（Kd）與CoV S糖蛋白或其變體結合。
如請求項1-18中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與一種或多種CoV S多肽結合，所述一種或多種CoV S多肽與根據SEQ ID NO: 9、10、35-43、72-73、90-139和145-147中任一個的多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。
如請求項1-19中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與從約2種至約20種CoV S糖蛋白結合。
如請求項1-20中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是廣泛中和抗體。
如請求項1-20中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與CoV S糖蛋白上的表位結合，其中所述表位包含SEQ ID NO: 10的CoV S糖蛋白的胺基酸476、485、486、487和489。
如請求項1-20中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與CoV S糖蛋白上的表位結合，其中所述表位包含SEQ ID NO: 10的CoV S糖蛋白的胺基酸485、486、487和489。
如請求項1-20中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與CoV S糖蛋白上的表位結合，其中所述表位包含SEQ ID NO: 10的CoV S糖蛋白的胺基酸378和385。
如請求項1-20中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與CoV S糖蛋白上的表位結合，其中所述表位包含SEQ ID NO: 10的CoV S糖蛋白的胺基酸444、445、446和448。
一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼如請求項1-25中任一項所述的抗體或其片段。
一種表現載體，所述表現載體包含如請求項26所述的核酸。
一種宿主細胞，所述宿主細胞包含如請求項27所述的表現載體。
一種醫藥組合物，所述醫藥組合物包含如請求項1-25中任一項所述的抗體或其片段和醫藥上可接受的載劑。
如請求項29所述的醫藥組合物，所述醫藥組合物包含多達兩種、多達三種、多達四種、多達五種、多達六種、多達七種、多達八種、多達九種或多達十種如請求項1-25中任一項所述的抗體或其片段。
一種治療感染SARS-CoV-2病毒或其變體的有需要的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者投予如請求項1-25中任一項所述的抗體或其片段或者如請求項29或30所述的醫藥組合物。
如請求項31所述的方法，其中所述受試者為65歲或更大。
如請求項31-32中任一項所述的方法，其中所述受試者是免疫受損的。
如請求項31-33中任一項所述的方法，其中所述受試者是懷孕的女性。
如請求項31-34中任一項所述的方法，其中所述SARS-CoV-2變體具有選自以下的PANGO譜系：B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1。
如請求項31-35中任一項所述的方法，其中所述SARS-CoV-2變體的世界衛生組織標籤為阿爾法、貝塔、伽馬、德爾塔、艾普西隆、約塔、卡帕、澤塔、繆或奧密克戎。