KR20140148411A - 항-cd19 항체를 이용한 다발성 경화증의 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ADCC, CDC 및/또는 아폽토시스(apoptosis)를 매개할 수 있는 항-CD19 항체의 키메라 및 인간화 버전의 이용을 통한 다발성 경화증의 치료법을 제공한다.

Description

항-CD19 항체를 이용한 다발성 경화증의 치료{TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS WITH ANTI-CD19 ANTIBODY}

다발성 경화증(multiple sclerosis; "MS")은 중추 신경계의 만성 염증성 질환이다. MS의 고유의 병리학적 특징, 및 MS의 진단을 위한 일차적인 근거로서 여전히 사용되는 특징은 중추신경계에서의 뉴런의 수초(myelin sheath)의 탈수초이다. MS는 미국에서 400,000명만큼 많은 사람에게 영향을 주며, 전세계적으로 대략 100만명의 사람에게 영향을 준다. 일반적으로, MS는 관련 증상(예를 들어, 다양한 형태의 신경염)의 주기적 양상이 있는 재발 완화형 질환(relapsing-remitting disease; RRMS)으로서 시작된다. 흔히 RRMS는 결국 진행성 경과의 질환, 이차 진행형 MS(secondary progressive MS; SPMS)로 변화되는데, 이는 더 많은 CNS 조직 손상을 특징으로 하고, 이는 더욱 쇠약해지게 하는 증상으로 이어진다. 그러나, 개인 중 10% 내지 20%에서, 처음에 상기 질환은 원발성 진행형 MS(primary progressive MS; PPMS)로 공지된 진행성 형태로 발병한다. 또한, 더욱 희귀한 형태의 질환인 진행성 재발형(progressive-relapsing; PR) MS가 있다.

현재의 가설은 T 세포가 다발성 경화증(MS)의 병인에서 중추적인 역할을 한다는 개념에 유리하게 되어 있는데, 이는 처음에, T 세포가 MS 병변에 존재하는 주된 림프구 클래스(class)라는 관찰을 기반으로 하였다(문헌[Windhagen, et al., Cytokine, secretion of myelin basic protein reactive T cells in patients with multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology, 91:1-9, 1998]; 문헌[Hafler, D. A., et al., Oral administration of myelin induces antigen-specific TGF-beta 1 secreting cells in patients with multiple sclerosis. Annals of the New York Academy of Science, 835:120-131, 1997]; 문헌[Lovett-Racke, A. E., et al., Decreased dependence of myelin basic protein-reactive T cells on CD28-mediated co-stimulation in multiple sclerosis patients, Journal of Clinical Investigation, 101:725-730, 1998]). 이는 계속하여 상기 질환의 주요한 특징이 되며, 다수의 관찰에 의해 지지된다. 예를 들어, 항-마이엘린 T 세포 수용체(T Cell Receptor; TCR)를 지닌 활성 CD4+ T 헬퍼(helper) 세포는 MS에 걸린 환자의 뇌척수액(cerebrospinal fluid; CSF)에 존재한다. 게다가, 상승된 수준의 Th1-유사 사이토카인이 MS에 걸린 환자의 CSF에서 검출되었으며, 어떤 경우에는 상기 질환의 악화와 상관되었다(문헌[Calabresi et al, Cytokine expression in cells derived from CSF of multiple sclerosis patients. Journal of Neuroimmunology, 89:198-205, 1998]).

하기를 비롯하여 MS 질환 과정의 발달 및 영속화에 B 세포가 연루될 수 있다는 증거가 있다:(1) MS 환자의 CSF에서의 상승된 면역글로불린 수준(문헌[Link, H., et al., Immunoglobulins in multiple sclerosis and infections of the nervous system, Archives of Neurology, 25:326-344, 1971]; 문헌[Link, H., et al., Immunoglobulin class and light chain type of oligoclonal bands in CSF in multiple sclerosis determined by agarose gel electrophoresis and immunofixation. Ann Neurol, 6(2):107-110, 1979]; 문헌[Perez, L, et al., B 세포 capable of spontaneous IgG secretion in cerebrospinal fluid from patients with multiple sclerosis: dependency on local IL-6 production. Clinical Experimental Immunology, 101:449-452, 1995]),(2) MS 환자의 CSF에서의 올리고클로날 밴딩(oligoclonal banding)(문헌[Link, H., et al., Immunoglobulin class and light chain type of oligoclonal bands in CSF in multiple sclerosis determined by agarose gel electrophoresis and immunofixation. Ann Neurol, 6(2):107-110, 1979]), (3) MS 환자의 CSF에서의 항-마이엘린 항체의 존재(문헌[Sun, J. H., et al, B cell responses to myelin-oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis, Journal of Immunology, 146:1490-1495, 1991]),(4) MS 환자의 CSF로부터의 항체가 이들 환자에서의 조직 상해의 전체적인 정도에 기여할 수 있다는 증거(문헌[Lassmann, H., et al., Experimental allergic encephalomyelitis: the balance between encephalitogenic T lymphocytes and demyelinating antibodies determines size and structure of demyelinated lesions. Acta Neuropathology, 75:566-576, 1988]), 및 (5) MS 환자의 CSF에서의 CD19+ B 세포 및 CD19+138+ 형질모세포의 존재(문헌[Winges, KM et al., Analysis of multiple sclerosis cerebrospinal fluid reveals a continuum of clonally related antibody-secreting cells that are predominantly plasma blasts. Journal of Neuroimmunology, 192:226-234, 2007, Cepok S et al.(2005). Brain128(Pt 7):1667-76]).

따라서, 개체, 특히 질환 병태를 갖는 개체에 있어서 형질모세포/형질 세포를 포함하는 B 세포의 표적화에 의해 MS를 치료적으로 치료하는 데 사용될 수 있는 방법에 대한 필요성이 존재한다.

일 측면에서, 본 발명은 다발성 경화증의 치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서, 항체는 CD19 항원에 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

특정 실시 양태에서, 다발성 경화증 질환은 재발 완화형(RR) MS, 원발성 진행형(primary-progressive; PP) MS, 이차 진행형(secondary-progressive; SP) MS, 재발성 진행형(relapsing-progressive; RP) MS 및 진행성 재발형(PR) MS로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 실시 양태에서, 다발성 경화증 질환은 RRMS이다. 대안적인 실시 양태에서, 다발성 경화증 질환은 PPMS, SPMS, 및 PRMS로부터 선택되는 진행성 형태의 MS이다.

특정 실시 양태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서, VH는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 번호 2의 아미노산을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함한다.

특정 실시 양태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서, VL은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 번호 5의 아미노산을 갖는 VL CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다.

다른 실시 양태에서, VH는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시 양태에서, VL은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.

대안적인 실시 양태에서, 항체는 Fc 변이체를 포함하며, 여기서, Fc 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 Fc 리간드에 대하여 변경된 친화도를 갖는다: C1q, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA. 특정 실시 양태에서, Fc 변이체는 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도가, 비견되는 분자의 것보다 약 5배 이상 더 낮으며, 여기서, 상기 Fc 변이체는 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도가, 상응하는 비변이형 Fc 분자의 것의 약 2배 이내이다.

일부 실시 양태에서, 항체는 향상된 ADCC(antigen-dependent cell-mediated-cytotoxicity; 항원 의존성 세포 매개 세포 독성) 활성을 갖는다.

특정 실시 양태에서, 다발성 경화증의 치료 방법은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 B 세포의 격감을 포함한다: 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연대 B 세포, 여포성 B 세포, 복막 B 세포 및 골수 B 세포. 특정 실시 양태에서, 본 방법은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 B 세포의 격감을 포함한다: 선구(progenitor) B 세포, 초기 프로(pro)-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프레(pre)-B 세포, 소형 프레-B 세포, 미숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원 자극된 B 세포, 형질모세포 및 형질 세포.

일부 실시 양태에서, 상기 격감은 B 세포의 수준을 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100%까지 감소시킨다.

다른 실시 양태에서, 상기 격감은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기간 동안 지속된다: 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상.

일부 실시 양태에서, 본 항체는 세포 독성제에 접합된다(conjugated). 일부 실시 양태에서, 본 항체는 항-CD20, 항-CD52, 또는 항-CD22 항체와 함께 동시 투여된다. 일부 실시 양태에서, 본 항체는 인터페론-베타, 코팍손(Copaxone)^TM, 코르티코스테로이드, 시클로스포린, 칼시뉴린 저해제, 아자티오프린, 라파뮨(Rapamune)^TM, 셀셉트(Cellcept)^TM, 메토트렉세이트 또는 미톡산트론과 함께 동시 투여된다.

또한 본 발명은 인간에 있어서 다발성 경화증을 치료하는 방법을 제공하며, 본 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 CD19 항원에 결합하는 복수의 단일 클론 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 항체의 80 내지 100%는 비푸코실화된다(afucosylated).

일부 실시 양태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서, VH는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 번호 2의 아미노산을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함한다.

다른 실시 양태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서, VL은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 번호 5의 아미노산을 갖는 VL CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다.

대안적인 실시 양태에서, VH는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, VL은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 임의의 전술한 측면 및 실시 양태의 모든 조합 뿐만 아니라 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예에 개시된 임의의 실시 양태와의 조합도 고려한다.

도 1: 인간 CD19 형질전환(huCD19Tg) 마우스(mouse) 유래의 형질 세포 상에서의 CD19의 발현
도 2: 난백알부민(ovalbumin; ova) 면역화 인간 CD19 형질전환(huCD19Tg) 마우스에서 항체 역가 및 형질 세포 수에 대한 16C4-aFuc의 영향
도 3: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 혈액 및 조직 B 세포에 대한 영향
도 4: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 비장 및 골수 형질 세포에 대한 영향
도 5: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 항-dsDNA 자기 항체에 대한 영향
도 6: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 시간이 지남에 따른 혈청 면역글로불린에 대한 영향
도 7: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 혈청 중 자기 항체의 감소
도 8: CD19에 대하여 양성인 CD27+CD38고 세포는 형질 세포 표현형을 가지며 IgG를 분비한다(도 8a: FACS 패널; 도 8b: 형태; 도 8c: 전체 IgG ELISpot)
도 9: 다양한 인간 조직에 있어서 CD19(좌측 컬럼) 및 CD20(우측 컬럼) 표면 발현 수준.
도 10: BM 유래의 CD19 음성 ASC 집단은 백신 항원에 대한 대부분의 체액성 기억을 포함한다.
도 11: 16C4afuc 처리(85일까지) 후 전혈 중 형질 세포 시그너처(Signature)의 저해. PC 시그너처의 전사체 수준은 16C4afuc 또는 위약(placebo)을 이용한 처리 후 제3일, 제29일 및 제85일에 전체 게놈 어레이(whole genome array)에 의해 경피증 환자 유래의 WB에서 평가되었다. 중위 변화 배수 값을 WB에서의 기저선과 비교한 것이 평가된 각각의 시점에서 모든 환자에 대하여 예시되어 있다. 오차 막대는 중위 절대 편차이다. *은 기저선 및 투여 후 값 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p < 0.01; 만-휘트니 U 검증(Mann-Whitney U test)).
도 12: 16C4afuc 처리 후 피부에 있어서 형질 세포 시그너처의 저해. 피부에 있어서의 PC 시그너처의 전사체 수준은 치료법 이전에 그리고 16C4afuc 또는 위약 처리 후 제29일에 탁맨(TaqMan) qPCR에 의해 평가되었다. 항존 유전자의 발현 수준을 이용하여, 그 후 각각의 환자의 PC 시그너처의 기저선 발현과의 비교에 의해 변화 배수 값이 계산되었다. 점선은 기저선 변화 배수 값(1로 설정됨)을 나타낸다. 흑색 막대는 중위 변화 배수 값을 나타낸다. *는 기저선 및 처리 후 값 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p < 0.05).
도 13: CP200 환자 유래의 혈액과 피부 사이의 형질 세포 시그너처의 조화된 저해. 혈액 및 피부 둘 모두에서 16C4afuc 처리 후 제29일에 PC 시그너처에 있어서의 중위 변화 배수 값을 기술된 바와 같이 계산하였다. CP200에 등록된, 경피증에 걸린 대상체에 있어서 피부(y축)와 전혈(x축) 사이의 PC 시그너처의 저해의 상관 분산 그래프(correlation scatter plot)가 도시되어 있다. r = 스피어만(Spearman) 순위 상관 계수. p< 0.05는 유의한 상관을 나타낸다.
도 14: 시험관내에서(in vitro) 분화된 PC의 16C4afuc 의존성 사멸. 도 14의 A. 배양한지 6.5일 후 비분화 조건 또는 PC 분화 조건 하에서 PC(CD27: 고; CD38: 고)의 상대적인 결여 또는 충분함을 예시하는 대표적인 데이터. 도 14의 B. 배양한지 6.5일 후 시험관내에서 분화된 PC의 CD19 및 CD20 발현. 도 14의 C. ADCC 검정 후 웰당 생존성 형질 세포의 평균 수. 각각의 개개의 공여자가 그래프로 도시되어 있고 평균(±S.D. 테스트 조건에 대해서는 n=6의 반복, 그리고 항체 대조구 없음에 대해서는 n=10의 반복)이 각각의 군에 대하여 예시되어 있다. ***은 항체 대조구 없음과의 쌍별 비교에 있어서 p 값 ≤ 0.001임을 나타낸다.
도 15: 같은 날 선적된 골수로부터 신선하게 단리된 인간 형질 세포의 16C4afuc 의존성 사멸. 도 15의 A. B 세포 풍부화 후 PC(CD27: 고; CD38: 고)의 확인을 예시하는 대표적인 데이터. 도 15의 B. 각각의 공여자 유래의 PC의 CD19 및 CD20의 발현. 도 15의 C. ADCC 검정 후 웰당 생존성 형질 세포의 평균 수. 각각의 개개의 공여자가 그래프로 도시되어 있고 평균(±S.D. n=6의 반복)이 각각의 군에 대하여 예시되어 있다. ***은 항체 대조구 없음과의 쌍별 비교에 있어서 p 값 ≤ 0.001임을 나타낸다.
도 16: 결과는 RRMS 환자의 CSF에 CD19+CD20- 형질모세포 및 형질 세포가 풍부함을 나타냈다. 도 17은 3개의 대표적인 유동 세포 분석법에 대한 그래프를 나타낸다.

본 발명은 인간 CD19 항원에 결합하는 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 하기 중 하나 이상을 매개할 수 있는 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다: 보체 의존성 세포 매개 세포 독성(complement-dependent cell-mediated cytotoxicity; CDC), 항원 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC), 및 세포 예정사(programmed cell death)(아폽토시스(apoptosis)). 또한 본 발명은 IgG1 및/또는 IgG3 인간 이소타입(isotype)의 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 이외에도, 인간 ADCC, CDC, 또는 아폽토시스를 매개할 수 있는 IgG2 및/또는 IgG4 인간 이소타입의 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 MS의 치료를 위한 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체의 사용 방법에 관한 것이다.

"다발성 경화증"은 마이엘린의 진행성 파괴를 특징으로 하는 중추 신경계의 만성적인 그리고 종종 불구로 만드는 질환을 나타낸다. 상기에 논의된 바와 같이, 4가지의 국제적으로 인식된 형태의 MS, 즉, 원발성 진행형 다발성 경화증(PPMS), 재발 완화형 다발성 경화증(RRMS), 이차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 및 진행성 재발성 다발성 경화증(PRMS)이 있다.

"재발 완화형 다발성 경화증" 또는 "RRMS"는 질환 진행의 결여를 특징으로 하는 질환 재발들 사이의 회복기 시에 후유증 및 잔존 결손이 있거나 완전한 회복이 있는 명백하게 규정된 질환 재발(악화로도 공지됨)을 특징으로 한다. RRMS의 규정 요소로는 신경 기능의 급성 악화의 에피소드, 이어서 가변적인 정도의 회복이 있으며, 이때 공격들 사이에는 안정한 경과가 있다(문헌[Lublin, F.D. & Reingold, S.C(1996) Neurology(46) 907-911]). 재발은 수 일, 수 주 또는 수 개월 동안 지속될 수 있으며, 회복은 느리고 점진적이거나 거의 순간적일 수 있다. MS를 나타내는 대부분의 사람은 먼저 RRMS로 진단된다. 전형적으로 이는 상기 사람들이 20대 또는 30대일 때 그러하지만, 훨씬 더 일찍 또는 훨씬 더 늦게 일어나는 진단이 공지되어 있다. 남성보다 2배 더 많은 여성이 이러한 하위 유형의 MS를 나타낸다. 재발 동안, 중추 신경계(CNS)의 백질 영역 내의 신경 섬유(뉴런) 주위의 보호 격리 수초, 마이엘린은 신체 그 자신의 면역계에 의해 염증 반응에 있어서 손상될 수 있다. 이는 어느 영역의 CNS가 손상되는지에 따라 상당히 달라지는 매우 다양한 신경학적 증상을 야기한다. 재발 직후, 염증 반응은 차츰 약해지며, CNS에서의 특별한 유형의 신경교세포(희돌기교세포로 칭해짐)는 재수초형성(remyelination)--축삭 주위의 수초가 복구될 수 있는 과정을 후원한다. 관해에 책임이 있는 것을 수 있는 것은 이러한 재수초형성이다. RRMS에 걸린 환자의 대략 50%는 질환이 발병한지 10년 이내에 SPMS로 전환된다. 30년 후에, 이러한 수치는 90%로 상승한다. 임의의 시간에, 재발 완화형의 상기 질환은 MS에 걸린 모든 사람들의 대략 55%를 차지한다.

원발성 진행형 다발성 경화증 또는 PPMS는, 초기부터 신경 기능의 저하를 완화시키지 않으며, 간헐적 정체(plateauing) 및 간헐적 신경 기능의 사소한 개선을 허용하는 질환 진행을 특징으로 한다. PPMS에서의 필수 요소는 점진적인 그리고 거의 계속적으로 악화되는 기능인데, 이는 사소한 변동을 허용하지만 특유한 재발은 없다(문헌[Lublin, F.D. & Reingold, S.C(1996)]). PPMS는, 발병이 전형적으로 30대 후반 또는 40대 초반에, RRMS보다 평균 약 10년 후에 있다는 점에서, 남성이 여성만큼 빈번하게 병에 걸린다는 점에서, 그리고 초기 질환 활성이 종종 척수에서 있으며 뇌에서는 없다는 점에서 RRMS 및 SPMS와는 다르다. 종종 PPMS는 뇌 내로 이동하지만, 뇌 영역을 손상시킬 가능성이 RRMS 또는 SPMS보다는 덜하다. 예를 들어, PPMS에 걸린 사람들은 RRMS 또는 SPMS에 걸린 사람들보다 인지 문제가 발병될 가능성이 덜하다. PPMS는 MRI 스캔에서 염증(가돌리늄 증강) 병변을 나타낼 가능성이 가장 적은 MS의 하위 유형이지만, 최근의 실험은 상기 병변이 나타나지 않음을 입증하였다(문헌[Hawker Ann Neurol 2009]). 원발성 진행형 형태의 상기 질환은 다발성 경화증에 걸린 모든 사람들 중 10 내지 15%에 영향을 준다. PPMS는 문헌[McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7(2001)]의 기준에 따라 규정될 수 있다.(문헌[Polman et al 2010 Diagnostic Criteria for Multiple Sclerosis:2010 Revisions to the McDonald Criteria ANN NEUROL 2011;69:292-302]). 본원에서 치료되는 PPMS에 걸린 대상체는 일반적으로 가능성 있게 또는 확정적으로 PPMS로 진단된 것이다.

"이차 진행형 다발성 경화증" 또는 "SPMS"는 초기 RRMS 후에, 가끔의 재발, 사소한 관해, 및 침체기 또는 정체기가 있거나 없는, 진행이 있는 질환 경과를 특징으로 한다. SPMS는 대부분의 SPMS 환자가 처음에는 상기에 정의된 바와 같이 RR 질환으로 시작한다는 점에서 장기간의 RRMS의 결과로 보일 수 있다. 그러나, 일단 재발들 사이의 기저선이 점진적으로 열화되기 시작하면, 환자는 RRMS로부터 SPMS로 스위칭되었다(switched)(문헌[Lublin, F.D. & Reingold, S.C(1996)]). SPMS이 발병하는 사람들은 2년 내지 40년 동안 또는 그보다 더 오랫 동안 지속된 기간의 RRMS를 가졌을 수 있다. 이차 진행형 병기의 발병으로부터 장애가 시작되며, 이는 이것이 RRMS 동안 진전된 것보다 훨씬 더 빠르게 진전되지만, 상기 진행은 일부 개체에 있어서 진행이 여전히 꽤 느릴 수 있다. 10년 후, RRMS에 걸린 사람들 중 50%에서는 SPMS가 발병되었을 것이다. SPMS는 RRMS에서보다 더 낮은 수준의 염증 병변 형성과 결부되는 경향이 있지만, 전체 질환 부담은 계속하여 진행된다. 임의의 시간에, SPMS는 다발성 경화증에 걸린 모든 사람들 중 대략 30%를 차지한다.

"진행성 재발성 다발성 경화증"은 "PRMS"를 나타내며, 이는 명백한 급성 재발이 있고, 완전한 회복이 있거나 없는, 발병으로부터 진행성인 질환을 특징으로 하는 것으로서, 재발들 사이의 기간은 계속적인 진행을 특징으로 한다. PRMS는 비록 희귀하기는 하지만, 추가의 임상 경과이다(문헌[Lublin, F.D. & Reingold, S.C(1996)]. PRMS는 다발성 경화증에 걸린 모든 사람들 중 대략 5%에 영향을 준다. 일부 신경과 의사는 PRMS가 PPMS의 변이형이라고 믿으며, PRMS에 걸린 환자는 종종 PPMS에 걸린 이들과 동일한 예후를 갖는 것으로 간주된다.

다발성 경화증은 또한 "양성 MS" 또는 "악성 MS"로 정의될 수 있다. 양성 MS는 환자가 모든 신경계에서 여전히 완전히 기능성인 채로 있는 질환 상태로 정의될 수 있다. 전형적으로, 이는 질환의 발병 후 약 15년 동안 지속될 수 있다. 악성 MS는 급속한 진행 경과를 특징으로 하는 진환 상태로서 정의될 수 있는데, 이는 질환 발병 경과 후 상대적으로 짧은 시간 내에 다수의 신경계에서의 상당한 장애 또는 사망에 이르게 된다(문헌[Lublin, F.D. & Reingold, S.C(1996)]).

MS는 오랫 동안 T 세포 매개 질환으로 간주되어 왔지만, MS에서의 B 세포의 역할에 대한 증가 중인 강조 및 상기 역할의 이해가 있다. RRMS 환자에 있어서의 공개(open-label) 임상 연구 및 제어된 임상 연구 둘 모두에 있어서, 항-CD20 MAb[즉, 리툭시맙(rituximab) 및 오크렐리주맙(ocrelizumab)]을 이용한 B 세포의 격감에 의해 염증 병변 및 재발 속도가 유의하게 감소되었다(문헌[Hauser et al, 2008]; 문헌[Bar-Or et al, 2008]; 문헌[Kappos et al, 2011]). B 세포 격감 MAb를 이용한 이들 임상 연구에서 입증된 효능은 MS 병인에서의 B 세포의 중요성을 확인해 주었다. 리툭시맙 및 오크렐리주맙은 CD20을 발현하는 B 세포를 격감시키는 반면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항체는 CD19를 발현하는 B 세포를 표적화한다. 그러나, 대안적인 치료법에 대한 충족되지 않은 임상적 필요성이 여전히 남아 있다. 본 발명은 다발성 경화증의 치료에 있어서의 항-CD19 항체의 용도를 제공한다. 개념상으로, B 세포를 격감시킬 수 있는 항-CD19 항체는, CD19가 CD20을 발현하는 모든 B 세포 상에서 발현됨을 고려하면, MS의 치료에 있어서 당업계에 공지된 항-CD20 항체의 모든 이점을 가질 것으로 예상되어야 하지만, CD19의 표적화는 추가의 이점을 부여할 가능성이 있으며, 그 이유는 CD20을 발현하지 않거나, 상당한 수준의 CD20을 발현하지 않는 B 세포 상에서 이것이 또한 발현되기 때문이다. CD29를 발현하는 더욱 넓은 범위의 B 세포 하위 세트(subset)는 더욱 초기의 전구체 세포 및 더욱 후기의 분화된 세포를 포함하며, 상기 분화된 세포는 형질모세포 및 일부 형질 세포를 포함하는데, 이들은 항체 생성의 주요 소스(source)이다(문헌[Dalakas, 2008]; 문헌[Tedder, 2009]).

이러한 더욱 넓은 범위의 B 세포 상에서의 CD19의 발현은 MS의 치료의 맥락에서 중요하며, 그 이유는 기계론적으로, B 세포는 MS에서 항체 의존성 및 항체 비의존성 역할 둘 모두를 갖는 것으로 보이기 때문이다. 이는 MS에 걸린 환자의 뇌척수액(CSF) 및 중추신경계(CNS)에 있어서 CNS 성분에 대한 자기 항체, 항체 분비 형질 세포, 및 B 세포의 관찰을 기반으로 하며, 이때 MS 환자 중 90% 초과는 그의 CSF에 있어서 면역글로불린의 올리고클로날(oligoclonal) 밴드를 갖는다. 따라서, 이러한 더욱 넓은 범위의 B 세포를 표적화함으로써, B 세포 격감 항-CD19 항체는 MS의 치료에 있어서 더욱 큰 영향을 줄 가능성이 있으며, 그 이유는 이것이 형질모세포 및 형질 세포를 또한 사멸시키기 때문인데, 이들은 MS에 있어서 더욱 근접한 항체 생성 세포이다. 게다가, CD20-, CD19 및 CD138+인 형질모세포는 MS에 걸린 환자에 있어서 진행 중인 활성 염증에 연루된 주요 이펙터(effector) B 세포 집단인 것으로 제안되었다(문헌[Cepok S et al.(2005). Brain128(Pt 7):1667-76]).

부가적으로, B 세포는 CNS에서 항원제시에서 그리고 MS 질환 과정의 일부로서 미경험(naive) CNS 반응성 T 세포의 프라이밍(priming)에서 그 역할을 할 수 있다(문헌[Sellebjerg et al, 1998]). CNS에서의 B 세포의 항원 제시 세포 기능에 대한 증거는 CNS에서의 B 세포 및 형질 세포가 신속한 그리고 광범위한 T 세포 매개, 항원 구동 클론 확장 및 체세포 초돌연변이(hypermutation)를 겪었음을 나타내는 연구에 기인한다(문헌[Qin et al, 2003]; 문헌[Monson et al, 2005]). 중요하게는, CD19+ CD20- 단명 형질모세포가, MS에 걸린 환자에 있어서 진행 중인 활성 염증에 연루된 주요 이펙터 B 세포 집단인 것으로 제안되었다(문헌[Cepok et al, 2005]). 부가적으로, CNS 상주 B 세포는 다른 파괴적 면역 세포를 유인하여 상기 면역 세포의 생존을 지원하는 전염증성 사이토카인의 생성에 또한 기여한다. 크르지시엑(Krzysiek) 및 동료(문헌[Krzysiek et al, 1999])는 B 세포 수용체 신호전달이 미경험, 기억, 및 배중심(germinal centre) B 세포에 의해 2가지 T 세포 케모카인인 대식세포 염증성 단백질(macrophage inflammatory protein; MIP)-1a 및 MIP-1b의 발현을 유도함을 관찰하였다. 최근의 연구에 의하면, MS에 있어서 뇌의 수막층 및 수막하층에서 관찰되는 림프 신생(lymphoid neogenesis)이 인접 미세환경의 사이토카인 및 케모카인에 의해 구동될 가능성이 있음이 제안되었다. 코르시온(Corcione) 및 동료(문헌[Corcione et al, 2004])는 MS 환자의 CSF 및 CNS 조직에서 림포톡신(lymphotoxin)-α, CXCL12, 및 CXCL13을 확인하였다. 부가적으로, 종양 괴사 인자 패밀리(family)의 B 세포 활성화 인자(B-cell activating factor; BAFF)의 발현은 MS 뇌 병변에서 유의하게 상향조절된다(문헌[Krumbholz et al, 2005]). MS에서의 엡스타인-바아(Epstein-Barr) 바이러스의 역할은 여전히 논란의 여지가 있지만, 백질 병변에서 검출가능한 잠재적 감염 B 세포에 대한 보고서가 있다. 잠재 단백질인 LMP-1 및 LMP-2A의 발현은 B 세포의 생존 및 분화를 촉진하며, MS에서의 이들 세포의 조절 장애에 기여할 수 있는데, 이는 항체 생성 및 CD4 및 CD8 T 세포에의 항원 제시를 향상시킴으로써 상기 질환 과정을 증폭시킨다(문헌[Serafini et al, 2010]).

실험적 자가면역성 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis; EAE)은 병에 걸린 동물로부터의 마이엘린 성분 또는 척수 균질화물을 이용한 면역화에 의해 유도되는 MS의 동물 모델로서, 이는 CNS 유도된 면역 반응을 생성한다. EAE 모델에서, 항-CD20 MAb를 이용한 활성 질환 동안의 B 세포의 격감은 EAE 증상을 50% 내지 100%만큼 극적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Matsushita et al, 2008]; 문헌[Monson　et　al,　2011]). 이들 설치류 데이터는 인간 마이엘린 희돌기교세포 당단백질 유도 EAE의 마모셋 모델에서 상기 질환의 임상적인 징후 및 병리학적 소견 둘 모두를 방지하는 B 세포 격감에 의해 지지되었다(문헌[Kap et al, 2010]). 현재, 임상 실험으로부터 CD20 B 세포 격감을 인간이 경험하는 것은 MS에서의 B 세포의 중요성에 대한 최상의 증거 및 결과를 개선시키기 위한 이들 세포의 표적화의 유용성을 제공한다(문헌[Hauser et al, 2008]; 문헌[Bar-Or et al, 2008]; 문헌[Kappos et al, 2011]).

신경학적 결손의 재발 및 관해 또는 진행의 존재 또는 부재를 기반으로 하면, MS 환자는 4가지의 임상 타입 중 1가지로 분류될 수 있다. 원발성 진행형(PP) MS는 "가끔의 정체 및 일시적인 사소한 개선이 있는, 발병으로부터의 질환의 진행"을 나타내지만, 이는 그의 경과 동안 재발 또는 관해가 없다. 이차 진행형(SP) MS 환자는 재발성 관해성(relapsing-remitting; RR) MS의 패턴으로 시작되는데, 이는 나중에 중첩 재발이 있거나 없는 진행성 경과로의 변환을 겪는다. PP 환자는 치료제에 대한 그의 반응 면에서 뿐만 아니라 그의 임상 특성, 유전적 특성, 실험실 특성, 영상화 특성, 및 병리학적 특성 면에서도 RR 및 SP MS에 걸린 환자와 다른 것으로 보고되어 있다. PP 타입의 발생률은 MS에 걸린 환자들 사이에서 8 내지 37%인 것으로 보고되어 있다. PPMS는 더욱 높은 연령에서(40세 이후) 나타내는 환자에 있어서 상대적으로 더 일반적이며, 남성에 있어서 더 일반적이다. PP 질환에 있어서 가장 일반적으로 나타나는 것은 만성 진행성 척수병증이다. 병리학적으로, PPMS는 SPMS와 비교하여 혈관 주위 세포 침윤(perivascular cuffing) 및 실질(parenchymal) 세포 침윤이 덜하다. PPMS는 유의한 그리고 중증도의 장애의 예후를 가지며, 어떠한 치료적 개입도 그의 가차없는 진행성 경과를 저지하거나 늦추는 것으로 입증되지 않았다.

최근의 병리학적 연구는 형질 세포 및 형질모세포의 잠재적인 역할 및 이러한 CD19 양성, CD10 음성 B 세포 계열 유래 세포의 잠재적인 역할에 대한 핵심적인 통찰력을 제공한다.

프리셔(Frischer)의 연구(문헌[Brain 2009])에서, 탈수초화 병변의 활성과 상관된 T 세포 및 B 세포 침윤과, 한편, 명백한 형질 세포(CD19+이고 CD20-임) 침윤 둘 모두가 이차 진행형 다발성 경화증(SPMS) 및 원발성 진행형 다발성 경화증에 걸린 환자에 있어서 가장 현저하였다. 이들 형질 세포 침윤은 지속되었으며, 이때 T 세포 및 B 세포 침윤은 시간이 지남에 따라 연령 매칭 대조구에서 관찰되는 수준으로 감소하였다. 침윤과 축삭 상해 사이의 유의한 결부가 진행성 형태의 다발성 경화증에서 뿐만 아니라 전체 다발성 경화증 집단에서도 관찰되었다.

요컨대, B 세포 및 MS의 병리생리학에서의 그의 역할의 이해의 진보는 B 세포 표적화 치료법에 대한 강한 근거를 제공하며, 항-CD19는 이차 진행형 MS의 확립에 추가의 영향을 줄 수 있고, PPMS에 연루된 CD19+ CD20- B 세포를 표적화하는 독특한 능력을 가질 수 있다.

본 발명은 다발성 경화증을 앓고 있는 대상체에서 다발성 경화증을 치료하는 방법을 제공하며, 본 방법은 CD19 항원에 결합하는 유효량의 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 순환 B 세포를 격감시키기에 충분한 양의 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체는 ADCC, CDC, 및/또는 아폽토시스를 매개할 수 있다.

용어

본 발명을 추가로 상세하게 계속하여 기술하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 공정 단계에 한정되지 않으며, 따라서 이는 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용될 때, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 문맥이 달리 명백하게 진술하지 않으면, 복수형 지시 대상을 포함함이 주지되어야 한다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 문헌[Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 발명에서 사용되는 용어들 중 다수의 일반 사전을 당업자에게 제공한다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고된 1문자 기호에 의해 또는 그의 일반적으로 공지된 3문자 기호에 의해 본원에서 언급될 수 있다. 이와 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그의 일반적으로 용인된 1문자 코드에 의해 언급될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "항체" 및 "항체들"(면역글로불린)이라는 용어는 단일 클론 항체(전장 단일 클론 항체를 포함함), 폴리클로날(polyclonal) 항체, 2가지 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 2특이성 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 낙타과 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편, 디술피드 결합된 Fv(sdFv), 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함함), 인트라바디(intrabody), 및 상기 중 임의의 것의 에피토프(epitope) 결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(class)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 클래스(subclass)의 것일 수 있다.

일반적으로 천연 항체는 2개의 동일 경쇄(L chain) 및 2개의 동일한 중쇄(H chain)으로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체형 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 결합되는 반면, 디술피드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄들 사이에서 달라진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술피드 가교체를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH), 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(VL)을 갖고 그의 다른 한 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 맞추어지며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 맞추어진다. 경쇄는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 기반으로 하여 람다 사슬 또는 카파 사슬 중 어느 하나로 분류된다. 카파 경쇄의 가변 도메인은 본원에서 VK로도 나타낼 수 있다. "가변 영역"이라는 용어는 또한 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인을 기술하는 데 사용될 수 있다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. 이러한 항체는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 임의의 포유류로부터 유래될 수 있다.

"가변"이라는 용어는 가변 도메인의 특정한 부분이 항체들 사이에서 서열 면에서 광범위하게 상이하고 각각의 특정 항체의, 그의 특정 항원에 대한 결합 특이성에 책임이 있다는 사실을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인들을 통하여 고르게 분포하는 것은 아니다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에 있어서 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region; CDR)으로 칭해지는 절편 내에 상기 가변성이 집중되어 있다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크(framework) 영역(FW)으로 칭해진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 4개의 FW 영역을 포함하는데, 상기 FW 영역은 대체로 β-시트 구성을 취하며, 3개의 CDR에 의해 연결되어 있고, 이는 β-시트 구조체를 연결하는 그리고 일부의 경우에 β-시트 구조체의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FW 영역에 의해 매우 근접하게 결합되며, 다른 사슬로부터의 CDR에 의해, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)] 참조). 일반적으로 불변 도메인은 항원 결합에 직접적으로 연루되지는 않지만, 항원 결합 친화도에 영향을 줄 수 있고, ADCC, CDC 및/또는 아폽토시스에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있다.

본원에서 사용될 때, "단일 클론 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉, 개개의 항체들이 포함된 집단은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일 클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대하여 유도된다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정 부위들(에피토프들)에 대하여 유도된 상이한 항체들을 포함하는 종래의(폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일 클론 항체는 항원 상의 단일 결정 부위에 대하여 유도된다. 단일 클론 항체는, 그의 특이성에 더하여, 다른 면역글로불린 생성 세포로 오염되지 않은 하이브리도마(hybridoma) 세포에 의해 상기 항체가 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 대안적인 생성 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 단일 클론 항체는 단일 클론 항체를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 유전자로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염된 세포에 의해 생성될 수 있다.

"키메라" 항체라는 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 일부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위 클래스에 속하는 항체에 있어서의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대하여 상동성이고, 상기 사슬(들)의 적어도 하나의 다른 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위 클래스에 속하는 항체에 있어서의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대하여 상동성인 항체를 포함하며, 이외에도, 이러한 항체의 단편이 요망되는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면, 이러한 항체의 단편을 포함한다(미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)]). 본원의 관심있는 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이(Old World Monkey), 예컨대 개코 원숭이, 붉은 털 원숭이 또는 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이) 및 인간 불변 영역 서열로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다(미국 특허 제5,693,780호).

"인간화" 형태의 비인간(예를 들어, 쥐과) 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 있어서, 인간화 항체는 천연 CDR 잔기가 요망되는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종의 상응하는 CDR(공여 항체)로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수령 항체)이다. 일부의 경우에, 인간 면역글로불린의 FW 영역 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수령 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개량하기 위하여 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄는 실질적으로 모든 적어도 1개 이상의 가변 도메인을 포함하며, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비인간 면역글로불린의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FW는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 특정 실시 양태에서, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 포함하며, 이는 전형적으로 인간 면역글로불린의 것이다. 추가의 상세 사항에 대해서는 문헌[Jones et al., Nature, 321:522-525(1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)]을 참조한다.

"인간 항체"는 항원 챌린지(challenge)에 응답하여 특이적 인간 항체를 생성하도록 "엔지니어링된(engineered)" 형질전환 유기체로부터 수득된 항체 또는 인간으로부터 유래된 항체일 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 특정 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소는 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 유기체의 주(strain) 내로 도입된다. 형질전환 유기체는 인간 항원에 대하여 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있으며, 상기 유기체는 인간 항체 분비 하이브리도마의 생성에 사용될 수 있다. 또한 인간 항체는 중쇄 및 경쇄가 인간 DNA의 하나 이상의 소스로부터 유래된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 항체일 수 있다. 완전 인간 항체는 또한 파지 디스플레이(phage display) 기술, 또는 시험관내 활성화 B 세포 뿐만 아니라 유전자 또는 염색체 형질감염법에 의해서도 구성될 수 있으며, 이들 모두는 당업계에 공지되어 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"이라는 용어는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하는 데 사용된다. 일 실시 양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 게다가, 특정 실시 양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 것이며(감마 수용체) FcγRI, FcγRII, FcγRIII, 및 FcγRIV 하위 클래스의 수용체를 포함하는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된(spliced) 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 이들의 세포질 도메인에서 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신 기재 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 함유한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신 기재 저해 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif; ITIM)를 함유한다.(문헌[Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)] 참조). FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)]; 문헌[Capel et al., Immunomethods, 4:25-34(1994)]; 및 문헌[de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41(1995)]에 개관되어 있다. 미래에 확인될 것을 비롯한 다른 FcR은 본원에서 "FcR"이라는 용어에 포함된다. 또한 상기 용어는 신생아 수용체, FcRn을 포함하는데, 이는 모(maternal) IgG의 태아로의 전달에 책임이 있다(문헌[Guyer et al., Immunol., 117:587(1976)] 및 문헌[Kim et al., J. Immunol., 24:249(1994)]).

"항체 의존성 세포 매개 세포 독성" 및 "ADCC"는 비특이적 세포 독성 세포(예를 들어, 자연 살해(Natural Killer; NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 상기 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응을 나타낸다. 일 실시 양태에서, 이러한 세포는 인간 세포이다. 어떠한 특정 작용 기작에도 한정되고자 함이 없이, ADCC를 매개하는 이러한 세포 독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcR)를 발현한다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII을 발현하며, 반면에, 단구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)]에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 시험관내 ADCC 검정법, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 미국 특허 제5,821,337호에 기술된 것이 수행될 수 있다. 이러한 검정법에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 동물 모델, 예컨대 문헌[Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 95:652-656(1998)]에 개시된 것에서 평가될 수 있다.

"이펙터 세포"는 1개 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 상기 세포는 적어도 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현하며, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단구, 세포 독성 T 세포 및 호중구를 포함한다.

"보체 의존성 세포 독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 나타낸다. 보체 활성화 경로는, 예를 들어 동계 항원과 복합체를 형성한 항체인 분자에 보체계의 제1 성분(C1q)이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163]에 기술된 CDC 검정법이 수행될 수 있다.

항- CD19 항체

본 발명은 인간 CD19 항원에 결합하는 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체에 관한 것이며, 이외에도, 이러한 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체는 항원 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 매개할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 인간 ADCC, CDC 및/또는 아폽토시스를 매개할 수 있는, IgG2 및/또는 IgG4 인간 이소타입의 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체 뿐만 아니라 IgG1 및/또는 IgG3 인간 이소타입의 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가의 실시 양태에서, 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체는 항-IgM/CpG 자극 B 세포 증식을 저해할 수 있다.

예로서, CD19에 특이적으로 결합하는 예시적인 인간화 항체가 본원에 제공된다. 특정한 예시적 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함한다. 특정 실시 양태에서, VH는 서열 번호 1의 아미노 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 2의 아미노 서열을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 3의 아미노 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 부가적인 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, VL을 포함한다. 일부 실시 양태에서, VL은 서열 번호 4의 아미노 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 5의 아미노 서열을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 6의 아미노 서열을 포함하는 CDR3 서열을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.

특정한 예시적 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함한다. 특정 실시 양태에서, VH는 서열 번호 9의 아미노 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 10의 아미노 서열을 포함하는 CDR2 서열 및 서열 번호 11의 아미노 서열을 포함하는 CDR3 서열을 포함한다. 부가적인 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 서열 번호 14의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, VL을 포함한다. 일부 실시 양태에서, VL은 서열 번호 12의 아미노 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 13의 아미노 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노 서열을 포함하는 CDR3 서열을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.

변이형 Fc 영역

Fc 영역의 변이체(예를 들어, 아미노산의 치환 및/또는 부가 및/또는 결실)는 항체의 이펙터 기능을 향상시키거나 감소시킨다는 것이 공지되어 있으며(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 미국 특허 제5,885,573호; 미국 특허 제6,538,124호; 미국 특허 제7,317,091호; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제6,538,124호; 국제 특허 공개 제WO 03/074679호; 국제 특허 공개 제WO 04/029207호; 국제 특허 공개 제WO 04/099249호; 국제 특허 공개 제WO 99/58572호; 미국 특허 공개 제2006/0134105호; 미국 특허 공개 제2004/0132101호; 미국 특허 공개 제2006/0008883호 참조), 항체의 약동학적 특성(예를 들어, 반감기)을 변경시킬 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,277,375호 및 미국 특허 제7,083,784호 참조). 따라서, 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 변경된 Fc 영역(본원에서 "변이형 Fc 영역"으로도 칭해짐)을 포함하며, 여기서, 항체의 기능적 및/또는 약동학적 특성을 변화시키기 위하여 하나 이상의 변경이 Fc 영역에서 이루어졌다. 이러한 변경은 Clq 결합 및 보체 의존성 세포 독성(CDC)을 감소 또는 증가시키거나, IgG에 있어서 FcγR 결합, 및 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 또는 항체 의존성 세포 매개 식작용(antibody dependent cell-mediated phagocytosis; ADCP)을 감소 또는 증가시킬 수 있다. 본 발명은 변이형 Fc 영역을 갖는 본원에 기술된 항체를 포함하며, 여기서, 변화는 이펙터 기능을 섬세하게 조정하여서 요망되는 이펙터 기능을 제공하기 위하여 이루어졌다. 따라서, 본 발명의 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 변이형 Fc 영역(즉, 하기에 논의된 바와 같이 변경된 Fc 영역)을 포함한다. 변이형 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 항-CD19 항체는 본원에서 "Fc 변이형 항체"로도 칭해진다. 본원에서 사용될 때, 천연이라는 것은 비변형 모 서열을 나타내며, 천연 Fc 영역을 포함하는 항체는 본원에서 "천연 Fc 항체"로 칭해진다. Fc 변이형 항체는 당업계의 숙련자에게 공지된 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다. 비제한적 예는(예를 들어, 하이브리도마로부터의) 항체 암호화 영역의 단리 및 단리된 항체 암호화 영역의 Fc 영역 내에 1개 이상의 요망되는 치환을 만드는 것을 포함한다. 대안적으로, 항-CD19 항체의 항원 결합 부분(예를 들어, 가변 영역)을 변이형 Fc 영역을 암호화하는 벡터 내에 서브클로닝할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 변이형 Fc 영역은 천연 Fc 영역과 비교하여 이펙터 기능의 유사한 유도 수준을 나타낸다. 또 다른 실시 양태에서, 변이형 Fc 영역은 천연 Fc와 비교하여 더욱 높은 이펙터 기능 유도를 나타낸다. 변이형 Fc 영역의 일부 특정 실시 양태가 본원에 상술되어 있다. 이펙터 기능의 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본원에서 사용될 때, Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함함이 이해된다. 따라서, Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인과, 이들 도메인의 N-말단의 가요성 힌지(hinge)를 나타낸다. IgA 및 IgM에 있어서, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG에 있어서, Fc는 면역글로불린 도메인 C감마2 및 C감마3(Cγ2 및 Cγ3)과, C감마1(Cγ1)과 C감마2(Cγ2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 잔기 C226 또는 P230에서 그의 카르복실 말단까지를 포함하도록 규정되며, 여기서, 넘버링은 카밧(Kabat)에 개시된 바와 같이 EU 인덱스에 따른다. Fc는 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질의 맥락에서의 이 영역, 또는 단리된 이 영역을 나타낼 수 있다. EU 인덱스에 의해 넘버링할 경우 270, 272, 312, 315, 356, 및 358 위치를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다수의 상이한 Fc 위치에서 다형성이 관찰되었으며, 따라서, 제시된 서열과 종래 기술의 서열 사이에는 약간의 차이가 존재할 수 있다.

본 발명은 비견되는 분자(예를 들어, 야생형 Fc 서열을 갖는 분자, 또는 비변이형 Fc 서열을 갖는 분자)에 비하여 Fc 리간드(예를 들어, Fc 수용체, C1q)에 대하여 변경된 결합 특성을 갖는 Fc 변이형 단백질을 포함한다. 결합 특성의 예는 결합 특이성, 평형 해리 상수(K_D), 해리 및 회합 속도(각각 k_off 및 k_on), 결합 친화도 및/또는 친화력을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 낮은 K_D를 갖는 결합 분자(예를 들어, Fc 변이형 단백질, 예컨대 항체)가 높은 K_D를 갖는 결합 분자보다 바람직할 수 있음이 일반적으로 이해된다. 그러나, 일부의 경우에, k_on 또는 k_off의 값이 K_D의 값보다 더 관련이 있을 수 있다. 당업계의 숙련자라면 어떠한 동적 파라미터가 주어진 항체 응용에 가장 중요한지를 결정할 수 있다.

Fc 도메인의, 그의 리간드에 대한 친화도 및 결합 특성은 평형법(예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정법(enzyme-linked immunoabsorbent assay; ELISA), 또는 방사면역검정법(radioimmunoassay; RIA)), 또는 동역학적 방법(예를 들어, 비아코어(BIACORE)^TM 분석법), 및 다른 방법, 예컨대 간접적 결합 검정법, 경쟁적 저해 검정법, 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer; FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과)를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아닌, Fc-FcγR 상호작용, 즉, FcγR에 대한 Fc 영역의 특이적 결합의 결정을 위한 당업계에 공지된 다양한 시험관내 검정 방법(생화학 또는 면역학 기반의 검정법)에 의해 결정될 수 있다. 이들 방법 및 다른 방법은 조사되는 성분들 중 하나 이상에서의 표지체를 이용하고/하거나 색원체, 형광, 발광, 또는 동위원소 표지체를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다양한 검출법을 이용할 수 있다. 결합 친화도 및 동역학적 특성에 대한 상세한 설명은 문헌[Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia(1999)]에서 발견될 수 있는데, 이는 항체-면역원 상호작용에 초점을 맞추고 있다.

일부 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 1개 이상의 Fc 리간드에 대하여 향상된 결합성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 리간드에 대한 친화도가 비견되는 분자의 것보다 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 5배 이상, 또는 7배 이상, 또는 10배 이상, 또는 20배 이상, 또는 30배 이상, 또는 40배 이상, 또는 50배 이상, 또는 60배 이상, 또는 70배 이상, 또는 80배 이상, 또는 90배 이상, 또는 100배 이상, 또는 200배 이상 더 크다. 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 수용체에 대하여 향상된 결합성을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대하여 향상된 결합성을 갖는다. 추가의 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIB에 대하여 향상된 결합성을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 수용체 FcRn에 대하여 향상된 결합성을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 C1q에 대하여 향상된 결합성을 갖는다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 변이형 Fc 도메인을 포함하며, 여기서, 상기 변이형 Fc 도메인은 비견되는 비변이형 Fc 도메인에 비하여 Fc 감마 수용체 IIB에 대하여 향상된 결합 친화도를 갖는다. 추가의 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 변이형 Fc 도메인을 포함하며, 여기서, 상기 변이형 Fc 도메인은 Fc 감마 수용체 IIB에 대한 친화도가, 비견되는 비변이형 Fc 도메인의 것보다 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 5배 이상, 또는 7배 이상, 또는 10배 이상, 또는 20배 이상, 또는 30배 이상, 또는 40배 이상, 또는 50배 이상, 또는 60배 이상, 또는 70배 이상, 또는 80배 이상, 또는 90배 이상, 또는 100배 이상, 또는 200배 이상 더 크다.

일부 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 1개 이상의 Fc 리간드에 대하여 감소된 결합성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 리간드에 대한 친화도가 비견되는 분자의 것보다 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 5배 이상, 또는 7배 이상, 또는 10배 이상, 또는 20배 이상, 또는 30배 이상, 또는 40배 이상, 또는 50배 이상, 또는 60배 이상, 또는 70배 이상, 또는 80배 이상, 또는 90배 이상, 또는 100배 이상, 또는 200배 이상 더 낮다. 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 수용체에 대하여 감소된 결합성을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대하여 감소된 결합성을 갖는다. 추가의 구체적인 실시 양태에서, 본원에 기술된 Fc 변이형 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도가 비견되는 분자의 것보다 약 5배 이상 더 낮으며, 여기서, 상기 Fc 변이체는 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도가 비견되는 분자의 것의 약 2배 이내이다. 또 다른 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 Fc 수용체 FcRn에 대하여 감소된 결합성을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 C1q에 대하여 감소된 결합성을 갖는다.

임의의 특정 Fc 변이형 단백질이 ADCC에 의해 표적 세포의 용해를 매개하는 능력이 검정될 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위하여, 관심있는 Fc 변이형 단백질을 면역 이펙터 세포와 조합된 표적 세포에 첨가하는데, 상기 이펙터 세포는 항원 항체 복합체에 의해 활성화되어 표적 세포를 세포 용해시킨다. 일반적으로 세포 용해는 용해된 세포로부터의 표지체(예를 들어, 방사성 기질, 형광 염료 또는 천연 세포내 단백질)의 방출에 의해 검출된다. 이러한 검정법에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 시험관내 ADCC 검정법의 구체적인 예가 문헌[Wisecarver et al., 1985 79:277-282]; 문헌[Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351-1361]; 문헌[Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183-191]; 문헌[Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29-38]에 기술되어 있다. 관심있는 Fc 변이형 단백질의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 동물 모델, 예컨대 문헌[Clynes et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656]에 개시된 것에서 또한 평가될 수 있다.

일부 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성을 갖는다. 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 ADCC 활성이 비견되는 분자의 것보다 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 5배 이상, 또는 10배 이상, 또는 50배 이상, 또는 100배 이상 더 크다. 또 다른 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성을 갖고, Fc 수용체 FcγRIIIA에 대하여 향상된 결합성을 갖는다. 다른 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 향상된 ADCC 활성 및 향상된 혈청중 반감기 둘 모두를 갖는다.

일부 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 감소된 ADCC 활성을 갖는다. 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 ADCC 활성이 비견되는 분자의 것보다 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 5배 이상, 또는 10배 이상, 또는 50배 이상, 또는 100배 이상 더 낮다. 또 다른 구체적인 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 감소된 ADCC 활성을 갖고, Fc 수용체 FcγRIIIA에 대하여 감소된 결합성을 갖는다. 다른 실시 양태에서, Fc 변이형 단백질은 비견되는 분자에 비하여 감소된 ADCC 활성 및 향상된 혈청중 반감기 둘 모두를 갖는다.

일부 실시 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하며, 여기서, Fc 영역은 카밧에서 개시된 바와 같이 EU 인덱스에 의해 넘버링할 경우 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 및 443으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 임의로, Fc 영역은 당업계이 숙련자에게 공지된 부가적인 및/또는 대안적인 위치에 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 미국 특허 제6,277,375호; 미국 특허 제6,737,056호; 국제 특허 공개 제WO 01/58957호; 국제 특허 공개 제WO 02/06919호; 국제 특허 공개 제WO 04/016750호; 국제 특허 공개 제WO 04/029207호; 국제 특허 공개 제WO 04/035752호; 국제 특허 공개 제WO 04/074455호; 국제 특허 공개 제WO 04/099249호; 국제 특허 공개 제WO 04/063351호; 국제 특허 공개 제WO 05/070963호; 국제 특허 공개 제WO 05/040217호, 국제 특허 공개 제WO 05/092925호 및 국제 특허 공개 제WO 06/020114호 참조).

특정 실시 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하며, 여기서, Fc 영역은 카밧에서 개시된 바와 같이 EU 인덱스에 의해 넘버링할 경우 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L, 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y 및 434W로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 임의로, Fc 영역은 당업계의 숙련자에게 공지된 부가적인 및/또는 대안적인 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 미국 특허 제6,277,375호; 미국 특허 제6,737,056호; 국제 특허 공개 제WO 01/58957호; 국제 특허 공개 제WO 02/06919호; 국제 특허 공개 제WO 04/016750호; 국제 특허 공개 제WO 04/029207호; 국제 특허 공개 제WO 04/035752호 및 국제 특허 공개 제WO 05/040217호).

항체의 글리코실화

항체를 포함하는 많은 폴리펩티드는 올리고당류에 의한 글리코실화와 같이, 탄수화물 모이어티(moiety)를 포함하는 다양한 번역 후 변형에 처해진다. 글리코실화에 영향을 줄 수 있는 몇몇 인자가 있다. 종, 조직 및 세포 유형은 모두 글리코실화가 일어나는 방식에 있어서 중요한 것으로 밝혀졌다. 게다가, 혈청 농도와 같은 배양 조건의 변경을 통하여, 세포외 환경이 글리코실화에 직접적인 영향을 줄 수 있다(문헌[Lifely et al., 1995, Glycobiology 5(8): 813-822]).

모든 항체는 중쇄의 불변 영역 내의 보존된 위치에 탄수화물을 함유한다. 각각의 항체 이소타입은 특유한, 다양한 N 결합 탄수화물 구조를 갖는다. IgG는 CH2 도메인의 Asn297에 단일 N 결합 바이안테나리(biantennary) 탄수화물을 갖는다. 혈청 유래의 또는 하이브리도마 또는 엔지니어링된 세포에서 생체외에서 생성된 IgG에 있어서, IgG는 Asn297 결합 탄수화물과 관련하여 이종성이다(문헌[Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76]; 문헌[Wright et al., 1997, Trends Biotech 15:26-32], 상기 문헌 둘 모두는 전적으로 참고로 포함됨). 인간 IgG에 있어서, 코어 올리고당은 보통 GlcNAc₂Man₃GlcNAc로 이루어지며, 이때 바깥쪽 잔기들의 수가 다르다.

본 발명의 탄수화물 모이어티는 올리고당류의 설명에 있어서 일반적으로 사용되는 명명법을 참고로 하여 기술된다. 이 명명법을 이용하는 탄수화물에 관한 화학적 특성의 개관은 전적으로 참고로 포함된 문헌[Hubbard et al. 1981, Ann. Rev. Biochem. 50:555-583]에서 발견된다. 이러한 명명법은 예를 들어 만노스를 나타내는 Man; 2-N-아세틸글루코사민을 나타내는 GlcNAc; 갈락토스를 나타내는 Gal; 푸코스에 대한 Fuc; 및 글루코스를 나타내는 Glc를 포함한다. 시알산은 5-N-아세틸뉴라민산의 경우 속기 기호 NeuNAc으로, 그리고 5-글리콜릴뉴라미닉에 대해서는 NeuNGc로 기술된다.

본 발명은 변형 글리코형 또는 엔지니어링된 글리코형을 포함하는 항체를 고려한다. 본원에서 사용될 때, "변형 글리코형" 또는 "엔지니어링된 글리코형"은 단백질, 예를 들어 항체에 공유적으로 부착된 탄수화물 구성을 의미하며, 여기서, 상기 탄수화물 구성은 모 단백질의 것과 화학적으로 다르다. 엔지니어링된 글리코형은 FcγR 매개 이펙터 기능의 향상 또는 감소를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다양한 목적에 유용할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역에 공유적으로 부착된 푸코실화 올리고당류의 수준이 감소되도록 변형된다. Fc 영역에 공유적으로 부착된 푸코실화 올리고당류의 수준이 감소된 항체는 증가된 ADCC 활성을 갖는 것으로 입증되었다.

변형된 글리코형을 생성하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다(문헌[Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473]);(국제 특허 공개 제WO 01/29246A1호; 국제 특허 공개 제WO 02/31140A1호; 국제 특허 공개 제WO 02/30954A1호); 문헌[Yamane-Ohnuki et al., 2004, Biotechnology and Bioengineering 87(5):614-621];(포텔리전트(Potelligent)^TM 기술[미국 뉴저지주 프린스턴 소재의 바이오와, 인크.(Biowa, Inc.)]; 이들 모두는 명백하게 참고로 포함됨). 이들 기술은 예를 들어 엔지니어링되거나 또는 달리 처리된 다양한 유기체 또는 세포주(예를 들어, Lec-13 CHO 세포 또는 래트 하이브리도마 YB2/0 세포)에서 IgG를 발현시킴으로써, 또는 글리코실화 경로에 연루된 효소(예를 들어, FUT8 [α1,6-푸코실트랜스퍼라아제]를 조절함으로써, Fc 영역에 공유적으로 부착된 푸코실화 올리고당류의 수준을 제어한다.

본 발명은 Fc 영역을 갖는 복수의 글리코실화 단일 클론 항-CD19 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 글리코실화 항-CD19 항체 중 약 51 내지 100%는 CH2 도메인의 Asn297에 비푸코실화 코어 탄수화물 구조, 예를 들어 푸코스가 결여된 코어 탄수화물 구조를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 글리코실화 항체 중 약 80 내지 100%, 또는 약 90 내지 99%, 또는 약 100%는 CH2 도메인의 Asn297에 비푸코실화 코어 탄수화물 구조를 포함한다.

전술한 것은 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항-CD19 항체의 예이다. 부가적인 예시적 항체가 미국 특허 공개 제2008-0138336호에 제공되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본원에 개시된 항-CD19 항체는 hCD19 형질전환 마우스 모델 시스템에서 재조합 인간 CD19 분자를 발현하는 B 세포를 효율적으로 격감시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Yazawa et al, Proc Natl Acad Sci USA. 102(42):15178-83(2005)] 및 문헌[Herbst et al., 335(1):213-22(2010)] 참조). 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연대 B 세포, 여포성 B 세포, 복막 B 세포, 및/또는 골수 B 세포를 격감시킬 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 선구 B 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프레-B 세포, 소형 프레-B 세포, 미숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원 자극된 B 세포, 및/또는 형질 세포의 격감을 달성할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 20일 이상, 25일 이상, 또는 30일 이상 동안 지속될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 또는 10주 이상 동안 지속될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상 동안 지속될 수 있다.

또한 본원에 개시된 항-CD19 항체는 인간 대상체에서 B 세포를 효율적으로 격감시킬 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100%의 B 세포 격감을 달성할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 인간 대상체에서 B 세포 하위 세트를 격감시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연대 B 세포, 여포성 B 세포, 복막 B 세포, 및/또는 골수 B 세포를 격감시킬 수 있다. CD19는 모든 발달 단계에서 B 세포의 표면 상에 존재한다. 따라서, 항-CD19 항체는 모든 발달 단계의 B 세포를 격감시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 선구 B 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프레-B 세포, 소형 프레-B 세포, 미숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원 자극된 B 세포, 및/또는 형질 세포의 격감을 달성할 수 있다. B 세포의 격감은 장기간의 시간 동안 지속될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 20일 이상, 25일 이상, 또는 30일 이상 동안 지속될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 또는 10주 이상 동안 지속될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상 동안 지속될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 항-CD19 항체는 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%의 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연대 B 세포, 여포성 B 세포, 복막 B 세포, 골수 B 세포, 선구 B 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프레-B 세포, 소형 프레-B 세포, 미숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원 자극된 B 세포, 및/또는 형질 세포를 격감시킨다.

B 세포의 격감은 장기간의 시간 동안 지속될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 20일 이상, 25일 이상, 또는 30일 이상 동안 지속될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 또는 10주 이상 동안 지속될 수 있다. 추가의 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 격감은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상 동안 지속될 수 있다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 보체 의존성 세포 매개 세포 독성(CDC), 및/또는 아폽토시스를 매개한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 및/또는 아폽토시스를 매개한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 향상된 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 갖는다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 향상된 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 매개하는 변이형 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 푸코스가 환원 말단에서 N-아세틸글루코사민에 결합되지 않은, Asn297에 결합된 복합 N-글리코시드 결합 당 사슬을 갖는 Fc 영역을 포함하며, 여기서, 상기 Fc 영역은 향상된 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 매개한다.

면역접합( immunoconjugate ) 및 융합 단백질

본 발명의 특정 측면에 따르면, 치료제 또는 독소가 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 키메라, 인간 또는 인간화 항-CD19 항체에 접합될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 이들 접합은 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 치료제 및 독소의 예는 엔디인 패밀리의 구성원의 분자, 예컨대 칼리케아미신 및 에스페라미신을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한 화학 독소가 듀오카르마이신(예를 들어, 미국 특허 제5,703,080호 및 미국 특허 제4,923,990호 참조), 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜팔란, 클로람부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스플라티늄, 에토포시드, 블레오마이신 및 5-플루오로우라실로 이루어진 군으로부터 취해질 수 있다. 화학요법제의 예는 또한 아드리아마이신(Adriamycin), 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드(Ara-C), 시클로포스파미드( Cyclophosphamide), 티오테파(Thiotepa), 탁소테레(Taxotere)(도세탁셀), 부술판(Busulfan), 사이톡신(Cytoxin), 탁솔(Taxol), 메토트렉세이트, 시스플라틴(Cisplatin), 멜팔란(Melphalan), 빈블라스틴(Vinblastine), 블레오마이신(Bleomycin), 에토포시드(Etoposide), 이포스파미드(Ifosfamide), 미토마이신(Mitomycin) C, 미톡산트론, 빈크레이스틴(Vincreistine), 비노렐빈(Vinorelbine), 카르보플라틴(Carboplatin), 테니포시드(Teniposide), 다우노마이신(Daunomycin), 카미노마이신(Caminomycin), 아미노프테린(Aminopterin), 닥티노마이신(Dactinomycin), 미톰이신(Mitomycin), 에스페라미신(Esperamicin)(미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란, 및 다른 관련 질소 머스타드로 이루어진 군으로부터 취해질 수 있다.

특정 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 세포 증식 억제제, 세포 독성제 또는 면역 억제제에 접합되며, 여기서, 세포 독성제는 엔디인, 렉시트롭신, 듀오카르마이신, 탁산, 퓨로마이신, 돌라스타틴, 마이탄시노이드, 및 빈카 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한, 더욱 구체적인 실시 양태에서, 세포 독성제는 파클리탁셀, 도세탁셀, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 돌라스타틴-10, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 칼리케아미신, 마이탄신, DM-1, 아우리스타틴 E, AEB, AEVB, AEFP, MMAE(미국 특허 출원 제10/983,340호 참조), 또는 네트롭신이다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체-세포 독성제 접합의 세포 독성제는 항-튜뷸린 에이전트(agent)이다. 구체적인 실시 양태에서, 세포 독성제는 빈카 알칼로이드, 포도필로톡신(podophyllotoxin), 탁산, 박카틴 유도체, 크립토피신, 마이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 및 돌라스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시 양태에서, 세포 독성제는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈, VP-16, 캄프토테신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에피틸론 A, 에피틸론 B, 노코다졸, 코이키신, 콜시미드, 에스트라무스틴, 세마도틴, 디스코데르몰리드, 마이탄신, DM-1, AEFP, 아우리스타틴 E, AEB, AEVB, AEFP, MMAE 또는 엘레우테로빈이다.

특정 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 링커를 통하여 세포 독성제에 접합되며, 여기서, 링커는 펩티드 링커이다. 다른 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 링커를 통하여 세포 독성제에 접합되며, 여기서, 링커는 val-cit 링커, phe-lys 링커, 히드라존 링커, 또는 디술피드 링커이다.

특정 실시 양태에서, 항-CD19 항체-세포 독성제 접합의 항-CD19 항체는 링커를 통하여 세포 독성제에 접합되며, 여기서, 링커는 5.5 미만의 pH에서 가수분해가능하다. 구체적인 실시 양태에서, 링커는 5.0 미만의 pH에서 가수분해가능하다.

특정 실시 양태에서, 항-CD19 항체-세포 독성제 접합의 항-CD19 항체는 링커를 통하여 세포 독성제에 접합되며, 여기서, 링커는 프로테아제에 의해 절단가능하다. 구체적인 실시 양태에서, 프로테아제는 리소좀 프로테아제이다. 다른 실시 양태에서, 프로테아제는 특히 막 결부 프로테아제, 세포내 프로테아제, 또는 엔도좀 프로테아제이다.

특정 실시 양태에서, 항-CD19 항체-세포 독성제 접합의 세포 독성제는 타이로신 키나아제 저해제이다. 예시적인 타이로신 키나아제 저해제 화합물은 ABT-869(애보트(Abbott)), 수텐트(Sutent)(화이자(Pfizer)), KI-20227(키린 브루어리(Kirin Brewery)), CYC-10268(사이토피아(Cytopia)), YM-359445(아스텔라스 파르마(Astellas Pharma)), PLX-647(페노믹스 코포레이션(Phenomix Corp.)/플렉시콘(Plexxikon)), JNJ-27301937(존슨 앤드 존슨(Johnson & Johnson)), 및 GW-2580(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline))을 포함한다.

다른 실시 양태에서, 타이로신 키나아제 저해제는 Syk 저해제이다. 예시적인 Syk 저해제는 포스타마티닙(Fostamatinib)을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 양태에서, 타이로신 키나아제 저해제는 Lyn 저해제이다. 예시적인 Lyn 저해제는 바페티닙을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 양태에서, 타이로신 키나아제 저해제는 브루톤(Bruton) 타이로신 키나아제(Btk) 저해제이다. 예시적인 Btk 저해제는 PCI-32765(파마사이클릭스(Pharmacyclics))를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 면역접합에서 사용될 수 있는 다른 독소는 유독 렉틴, 식물 독소, 예컨대 리신, 아브린, 모데신, 보툴리나, 및 디프테리아 독소를 포함한다. 물론, 다양한 독소들의 조합물이 또한 하나의 항체 분자에 커플링됨으로써 가변적인 세포 독성을 제공할 수 있다. 본 발명의 병용 요법에서 적합하게 이용되는 예시적인 독소로는 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, DNase I, 포도상구균 장독소-A( Staphylococcal enterotoxin-A), 미국자리공(pokeweed) 항-바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 및 슈도모나스 내독소가 있다. 예를 들어, 문헌[Pastan et al., Cell, 47:641(1986)], 및 문헌[Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43(1994)]을 참조한다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아(diphtheria) A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래의 것), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아(Momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 저해제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 국제 특허 공개 제WO 93/21232호를 참조한다.

적합한 독소 및 화학요법제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed.(Mack Publishing Co. 1995)], 및 문헌[Goodman And Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed.(MacMillan Publishing Co. 1985)]에 기술되어 있다. 다른 적합한 독소 및/또는 화학요법제가 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다.

병용 요법

본원에 기술된 항-CD19 면역요법제는 항-CD20 MAb, 항-CD52 MAb, 항-CD22 항체, 및 항-CD20 항체, 예컨대 리툭산(RITUXAN)^TM(C2B8; 리툭시맙^TM; 아이디이씨 파마슈티칼즈(IDEC Pharmaceuticals))을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다른 B 세포 표면 수용체 항체와 조합되어 동시 투여될 수 있다.

본원에 기술된 항-CD19 면역요법제는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 및/또는 FcγRIII으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Fc 수용체에 대하여 특이적인 항체와 조합되어 동시 투여될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 항-CD19 면역요법제는 FcγRIIB에 대하여 특이적인 항체와 조합되어 투여될 수 있다. 이 목적에 적합한 항-FcγRIIB 항체가 미국 특허 공개 제2004185045호, 국제 특허 공개 제WO05051999A호, 국제 특허 공개 제WO05018669호 및 국제 특허 공개 제WO04016750호에 기술되어 있다.

특정 실시 양태에서, 항-CD19 및 항-CD20 및/또는 항-CD22 mAb 및/또는 항-CD52 mAb는, 임의로 동일한 제약 조성물로, 임의의 적합한 비로 동시 투여될 수 있다. 예시를 위하여, 항-CD19 항체와 항-CD20 항체의 비는 약 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:500 또는 1:1000의 비 또는 이보다 더 큰 비일 수 있다. 이와 마찬가지로, 항-CD19 항체와 항-CD22 항체의 비는 약 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:500 또는 1:1000의 비 또는 이보다 더 큰 비일 수 있다. 이와 유사하게, 항-CD19 항체와 항-CD52 항체의 비는 약 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:500 또는 1:1000의 비 또는 이보다 더 큰 비일 수 있다.

본원에 기술된 MS의 치료를 위한 항-CD19 면역요법제는 또한 다발성 경화증의 치료에 있어서 활성을 가질 수 있는 1가지 이상의 부가적인 약물과 조합되어 동시 투여될 수 있다. 이들은 인터페론-베타, 예컨대 아보넥스(Avonex)^TM 및 레비프(Rebif)^TM를 포함한다. 다발성 경화증의 치료에 있어서 활성을 가질 수 있는 부가적인 약물은 코팍손^TM; 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손 또는 메틸프레드니솔론; 면역억제제, 예를 들어 시클로스포린(또는 다른 칼시뉴린 저해제, 예컨대 프로그라프(Prograf)^TM); 아자티오프린, 라파뮨^TM 및 셀셉트^TM; 항-대사산물, 예컨대 메토트렉세이트; 및 항신생물제, 예컨대 미톡산트론을 포함한다.

제약 제형

항-CD19 항체 조성물은 제약적으로 허용가능한 담체를 이용하여 제형화될 수 있다. "제약적으로 허용가능한"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 간섭하지 않는 하나 이상의 비독성 재료를 의미한다. 이러한 제제는 일상적으로 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 및 임의로, 다른 치료제를 함유할 수 있다. 이러한 제약적으로 허용가능한 제제는 또한 일상적으로, 인간 내로의 투여에 적합한 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 함유할 수 있다. 의약에서 사용될 때, 염은 제약적으로 허용가능하여야 하지만, 제약적으로 허용가능하지 않은 염이 이의 제약적으로 허용가능한 염의 제조에 편리하게 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 범주로부터 제외되지 않는다. 이러한 약리학적으로 그리고 제약적으로 허용가능한 염은 하기 산으로부터 제조되는 것을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다: 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 붕산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 또한, 제약적으로 허용가능한 염은 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토류 염, 예컨대 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조될 수 있다. "담체"라는 용어는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타내며, 활성 성분은 이와 조합되어 적용을 용이하게 한다. 또한 제약 조성물의 성분은, 요망되는 의약품 효능을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 없도록 하는 방식으로 본 발명의 항체와, 그리고 서로와 동시 혼합될 수 있다.

본 발명의 특정 측면에 따르면, 항-CD19 항체 조성물은 요망되는 정도의 순도를 갖는 항체 또는 면역접합을 임의적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써, 동결건조 제형 또는 수성 용액의 형태로 보관하기 위한 것으로 제조될 수 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed.(1999)]). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수령체에 대하여 비독성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn- 단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN), 플루로닉스(PLURONICS).TM. 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

항-CD19 항체는 비경구, 두개내, 국소, 피하, 복강내, 폐내, 비강내, 및/또는 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 정맥내, 동맥내, 또는 복강내 주입을 포함한다. 게다가, 항체는 예를 들어 감쇠하는 용량의 항체를 이용하여, 펄스 주입에 의해 적합하게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 정맥내, 두개내, 피하 또는 척수강내, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 투여될 수 있다.

제약 제형들 중 일부는 하기를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다:

(a) 100 mg(10 mL) 또는 500 mg(50 mL)의 단회 사용용 바이알 중 10 mg/ml의 농도로 공급되는, 항-CD19 항체의 정맥내(i.v.) 투여용의 살균, 보존제 무함유 액체 농축물. 이 제품은 염화나트륨, 시트르산나트륨 2수화물, 폴리소르베이트 및 주사용 살균수를 사용하여 i.v. 투여용으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 제품은 9.0 mg/mL의 염화나트륨, 7.35 mg/mL의 시트르산나트륨 2수화물, 0.7 mg/mL의 폴리소르베이트(polysorbate) 80, 및 주사용 살균수 중에 제형화될 수 있다. pH는 6.5로 조정된다.

(b) 피하(s.c.) 주사용의, 단회 사용용 유리 바이알 중의 살균, 동결건조 분말. 상기 제품은 수크로스, L-히스티딘 염산염 1수화물, L-히스티딘 및 폴리소르베이트 20을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 각각의 단회 사용용 바이알은 150 mg의 항-CD19 항체, 123.2 mg의 수크로스, 6.8 mg의 L-히스티딘 염산염 1수화물, 4.3 mg의 L-히스티딘, 및 3 mg의 폴리소르베이트 20을 포함할 수 있다. 1.3 ml의 주사용 살균수를 이용한 단회 사용용 바이알의 재구성은 대략 1.5 ml의 용액을 생성하여 125 mg/1.25 ml(100 mg/ml)의 항체를 전달한다.

(c) 정맥내(i.v.) 투여용의, 살균, 보존제 무함유 동결건조 분말. 상기 제품은 α,α-트레할로스 2수화물, L-히스티딘 HCl, 히스티딘 및 폴리소르베이트 20 USP를 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 각각의 바이알은 440 mg의 항-CD19 항체, 400 mg의 α,α-트레할로스 2수화물, 9.9 mg의 L-히스티딘 HCl, 6.4 mg의 L-히스티딘, 및 1.8 mg의 폴리소르베이트 20, USP를 포함할 수 있다. 1.1%의 벤질 알코올을 보존제로서 함유하는, 20 ml의 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection; BWFI), USP를 이용한 재구성은 대략 6의 pH의, 21 mg/ml의 항체를 함유하는 다회 용량 용액을 생성한다.

(d) 항-CD19 항체가 수크로스, 폴리소르베이트, 제1인산나트륨 1수화물, 및 제2인산나트륨 2수화물을 이용하여 제형화된, 정맥내 주입용의 살균, 동결건조 분말. 에를 들어, 각각의 단회 사용용 바이알은 100 mg의 항-CD19 항체, 500 mg의 수크로스, 0.5 mg의 폴리소르베이트 80, 2.2 mg의 제1인산나트륨 1수화물, 및 6.1 mg의 제2인산나트륨 2수화물을 포함할 수 있다. 보존제는 존재하지 않는다. 10 ml의 주사용 살균수, USP를 이용한 재구성 후, 생성된 pH는 대략 7.2이다.

(e) 단회 사용용, 1 ml 사전 충전 시린지 또는 자동 주입기로 공급되는, 피하 투여용의 살균, 보존제 무함유 용액. 상기 제품은 염화나트륨, 제1인산나트륨 2수화물, 제2인산나트륨 2수화물, 시트르산나트륨, 시트르산 1수화물, 만니톨, 폴리소르베이트 80 및 주사용수, USP를 이용하여 제형화될 수 있다. 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 약 5.2로 조정할 수 있다.

예를 들어, 각각의 시린지는 0.8 ml(40 mg)의 약물 제품을 전달하도록 제형화될 수 있다. 각각의 0.8 ml은 40 mg의 항-CD19 항체, 4.93 mg의 염화나트륨, 0.69 mg의 제1인산나트륨 2수화물, 1.22 mg의 제2인산나트륨 2수화물, 0.24 mg의 시트르산나트륨, 1.04의 시트르산 1수화물, 9.6 mg의 만니톨, 0.8 mg의 폴리소르베이트 80 및 주사용수, USP를 함유한다.

(f) 주사용 살균수(SWFI), USP로 재구성되고 피하(s.c.) 주사제로서 투여되는, 단회 사용용 바이알 중에 담긴 살균, 보존제 무함유, 동결건조 분말. 상기 제품은 수크로스, 히스티딘 염산염 1수화물, L-히스티딘, 및 폴리소르베이트를 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 75 mg 바이알은 129.6 mg 또는 112.5 mg의 항-CD19 항체, 93.1 mg의 수크로스, 1.8 mg의 L-히스티딘 염산염 1수화물, 1.2 mg의 L-히스티딘, 및 0.3 mg의 폴리소르베이트 20을 포함할 수 있으며, 0.9 ml의 SWFI, USP를 이용한 재구성 후 0.6 ml 중 75 mg의 항체를 전달하도록 설계된다. 150 mg 바이알은 202.5 mg 또는 175 mg의 항-CD19 항체, 145.5 mg의 수크로스, 2.8 mg의 L-히스티딘 염산염 1수화물, 1.8 mg의 L-히스티딘, 및 0.5 mg의 폴리소르베이트 20을 포함할 수 있으며, 1.4 ml의 SWFI, USP를 이용한 재구성 후 1.2 ml 중 150 mg의 항체를 전달하도록 설계된다.

(g) 주사용 살균수를 이용한 재구성을 위한 살균, 동결건조 제품. 상기 제품은 만니톨, 히스티딘 및 글리신을 이용하여 근육내(IM) 주사용으로 단회 사용용 바이알로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 각각의 단회 사용용 바이알은 100 mg의 항-CD19 항체, 67.5 mg의 만니톨, 8.7 mg의 히스티딘 및 0.3 mg의 글리신을 포함할 수 있으며, 1.0 ml의 주사용 살균수로 재구성될 경우 1.0 ml 중 100 mg의 항체를 전달하도록 설계된다. 또 다른 예로서, 각각의 단회 사용용 바이알은 50 mg의 항-CD19 항체, 40.5 mg의 만니톨, 5.2 mg의 히스티딘 및 0.2 mg의 글리신을 포함할 수 있으며, 0.6 ml의 주사용 살균수로 재구성될 경우 50 mg의 항체를 전달하도록 설계된다.

(h) 100 mg/ml의 농도로 공급되는, 근육내(IM) 주사용의 살균, 보존제 무함유 용액. 상기 제품은 히스티딘, 글리신, 및 주사용 살균수를 이용하여 단회 사용용 바이알로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 각각의 단회 사용용 바이알은 100 mg의 항-CD19 항체, 4.7 mg의 히스티딘, 및 0.1 mg의 글리신을 이용하여, 1 ml 중 100 mg의 항체를 전달하도록 설계된 1.2 ml의 부피로 제형화될 수 있다. 또 다른 예로서, 각각의 단회 사용용 바이알은 50 mg의 항체, 2.7 mg의 히스티딘 및 0.08 mg의 글리신을 이용하여, 0.5 ml 중 50 mg의 항체를 전달하도록 설계된 0.7 ml 또는 0.5 ml의 부피로 제형화될 수 있다.

투약

당업계의 숙련자라면, 투여량 및 치료 섭생법은 대상체의 연령, 성별, 인종 및 질환 상태(예를 들어, MS의 병기 및/또는 형태)를 비롯한 다수의 인자를 기반으로 하여 선택될 수 있음을 인지한다. 예를 들어, 적절한 투여량 및 치료 섭생법은 환자 또는 환자 집단에서 MS의 특별한 병기 및/또는 형태에 대하여 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 용량 응답 곡선은 상이한 병기 및/또는 형태의 MS를 갖는 환자의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효량을 결정하기 위하여 당업계의 표준 프로토콜을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 유효량은 시험관내 테스트 시스템 또는 동물 모델(예를 들어, 코튼랫(cotton rat) 또는 원숭이) 테스트 시스템으로부터 유도된 용량-응답 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 항체의 효과의 평가를 위한 모델 및 방법은 당업계에 공지되어 있다(본원에 그 전체가 참고로 포함된 문헌[Wooldridge et al., Blood, 89(8): 2994-2998(1997)]). 일반적으로, 더욱 진전된 병기 및/또는 더욱 중증도의 형태의 MS를 갖는 환자는 덜 진전된 병기 및/또는 형태의 MS를 갖는 환자와 비교하여 더욱 긴 시간에 걸쳐 투여될 수 있는 더욱 높은 용량 및/또는 더욱 빈번한 용량을 요구한다. 특정 실시 양태에서, 항체 요법을 위한 당업계의 치료 섭생법 표준이 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다.

CD19 밀도 측정(예를 들어, 환자의 B 세포의 표면 상의 CD19의 밀도)은 또한 대상체의 적절한 치료 섭생법 및 투여량의 결정을 도울 수 있다. 세포에의 항체 결합의 밀도의 결정 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sato et al., J. Immunology 165:6635-6643(2000)] 참조; 상기 문헌은 특이적 CD 항원의 세포 표면 밀도의 평가 방법을 개시함). 다른 표준 방법은 스캐차드(Scatchard) 분석법을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 단편은 단리되고, 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 방사성 동위원소 표지된 항체의 비활성이 결정될 수 있다. 그 후, 항체는 CD19를 발현하는 표적 세포와 접촉된다. 상기 세포와 결부된 방사능이 측정될 수 있으며, 상기 비활성을 기반으로 하여, 상기 세포에 결합된 항체 또는 항체 단편의 양이 결정될 수 있다.

CD19 밀도에 대하여 검정하는 또 다른 적합한 방법은 형광 활성화 유동 세포 분석법을 이용한다. 일반적으로, 항체 또는 항체 단편은 CD19를 발현하는 표적 세포에 결합된다. 그 후, 상기 항체에 결합하는 제2 시약, 예를 들어 형광 색소 표지된 항-면역글로불린 항체가 첨가된다. 그 후, 형광 색소 염색을 측정하고 이를 이용하여 세포에 결합된 항체 또는 항체 단편의 밀도를 결정할 수 있다.

특정 실시 양태에서, 항-CD19 항체를 포함하는 조성물의 용량은 환자 체중 1 kg당 mg의 단위로 측정된다. 다른 실시 양태에서, 항-CD19 항체를 포함하는 조성물의 용량은 환자의 제지방 체중(즉, 체중 - 체지방 함량) 1 kg당 mg의 단위로 측정된다. 또 다른 실시 양태에서, 항-CD19 항체를 포함하는 조성물의 용량은 환자의 신체 표면적 1 m²당 mg의 단위로 측정된다. 또 다른 실시 양태에서, 항-CD19 항체를 포함하는 조성물의 용량은 환자에게 투여되는 용량당 mg의 단위로 측정된다. 임의의 용량 측정이 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있으며, 투여 단위는 당업계의 표준에 의해 환산될 수 있다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 항-CD19 항체는 B 세포에 결합하며, B 세포를 효율적으로(즉, 낮은 투여량으로) 격감시킬 수 있다(이는 본원에 기술된 바와 같음). 더욱 높은 정도의 결합은 환자의 B 세포의 표면 상의 인간 CD19의 밀도가 높을 경우 달성될 수 있다. 특정 실시 양태에서,(임의로 제약 조성물의 일부로서의 제약적으로 허용가능한 담체 중의) 항체의 투여량은 약 0.0005, 0.001, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.375, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20, 37.5, 또는 50 mg/m² 이상 및/또는 약 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 37.5, 20, 15, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.375, 0.1, 0.075 또는 0.01 mg/m² 미만이다. 특정 실시 양태에서, 상기 투여량은 약 0.0005 내지 약 200 mg/m², 약 0.001 내지 150 mg/m², 약 0.075 내지 125 mg/m², 약 0.375 내지 100 mg/m², 약 2.5 내지 75 mg/m², 약 10 내지 75 mg/m², 및 약 20 내지 50 mg/m²이다. 관련 실시 양태에서, 사용되는 항-CD19 항체의 투여량은 환자의 체중 1 kg당 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5 mg 이상이다. 특정 실시 양태에서, 사용되는 항-CD19 항체의 용량은 환자의 체중 1 kg당 적어도 약 0.1 내지 1, 1 내지 5, 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 mg이다. 특정 실시 양태에서, 사용되는 항-CD19 항체의 용량은 환자의 체중 1 kg당 적어도 약 0.1 내지 1, 1 내지 5, 1 내지 20, 3 내지 15, 또는 5 내지 10 mg이다. 다른 실시 양태에서, 사용되는 항-CD19 항체의 용량은 환자의 체중 1 kg당 약 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg 이상이다. 특정 실시 양태에서,(임의로 제약 조성물의 일부로서의 제약적으로 허용가능한 담체 중의) 항체의 단회 투여 단위는 약 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 또는 250 mg/m² 이상일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 항-CD19 항체의 투여량은 단회 투여 단위당 1 g 이하이다. 다른 실시 양태에서, 항-CD19 항체의 투여량은 단회 투여 단위당 10 mg 내지 1000 mg의 범위이다. 일부 실시 양태에서, 항-CD19 항체의 투여량은 단회 투여 단위당 10 mg 내지 100 mg, 15 mg 내지 150 mg, 100 mg 내지 200 mg, 150 mg 내지 250 mg, 200 mg 내지 300 mg, 250 mg 내지 350 mg, 300 mg 내지 400 mg, 350 mg 내지 450 mg, 400 mg 내지 500 mg, 450 mg 내지 550 mg, 500 mg 내지 600 mg, 550 mg 내지 650 mg, 600 mg 내지 700 mg, 650 mg 내지 750 mg, 700 mg 내지 800 mg, 750 mg 내지 850 mg, 800 mg 내지 900 mg, 850 mg 내지 950 mg, 또는 900 mg 내지 1000 mg의 범위이다.

상기 용량 전부는 예시적인 것으로서, 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 그러나, 항-CD19 항체가 독소 또는 방사성 치료제와 함께 사용될 경우, 상기에 기술된 더욱 낮은 용량이 바람직할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 환자가 낮은 수준의 CD19 밀도를 가질 경우, 상기에 기술된 더욱 낮은 용량이 바람직할 수 있다.

이러한 본 발명의 방법의 일부 실시 양태에서, 본 발명의 항체 및/또는 조성물은 약 375 mg/m² 미만의 용량으로; 약 37.5 mg/m² 미만의 용량으로; 약 0.375 mg/m² 미만의 용량으로; 및/또는 약 0.075 mg/m² 내지 약 125 mg/m²의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시 양태에서, 투여 섭생법은 반복된 간격으로 투여되는 낮은 용량들을 포함한다. 예를 들어, 일 실시 양태에서, 본 발명의 조성물은 약 375 mg/m² 미만의 용량으로, 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200일마다의 간격으로 투여될 수 있다.

특정 투여량은 적어도 약 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 또는 180일 이상의 기간 동안 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료된 대상에 있어서 B 세포를 격감시킬 수 있다. 특정 실시 양태에서, 프레-B 세포(표면 면역글로불린을 발현하지 않음)가 격감된다. 특정 실시 양태에서, 성숙 B 세포(표면 면역글로불린을 발현함)가 격감된다. 다른 실시 양태에서, 모든 비악성 타입의 B 세포가 격감을 나타낼 수 있다. 이러한 타입의 B 세포 중 임의의 것을 사용하여 B 세포 격감을 측정할 수 있다. B 세포 격감은 체액, 예컨대 혈청에서, 또는 조직, 예컨대 골수에서 측정될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시 양태에서, B 세포는 본 발명의 조성물 및 방법의 사용 전에 치료 중인 환자에서의 B 세포 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 격감된다. 본 발명의 방법의 다른 실시 양태에서, B 세포는 인간에 있어서의 전형적인 표준 B 세포 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 격감된다. 관련 실시 양태에서, 인간에 있어서의 전형적인 표준 B 세포 수준은 연령, 성별, 중량 및 다른 인자와 관련하여 치료 중인 환자에 비견되는 환자를 이용하여 결정된다.

본 발명의 특정 실시 양태에서, 용량은 골수와 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 조직에서 또는 혈액에서 일정 용량을 유지하도록 증가되거나 감소될 수 있다. 관련 실시 양태에서, 용량은 본 발명의 방법 및 조성물의 항체의 요망되는 수준을 유지하기 위하여 약 2%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 95%만큼 증가되거나 감소된다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 환자의 면역 반응을 기반으로 하여 투여량이 조정될 수 있고/있거나 주입 속도가 감소될 수 있다.

특정 실시 양태에 따르면, 투여 프로토콜(예를 들어, 치료 섭생법)은 유효량의 CD19 항체를 MS 대상체에게 투여하여 환자의 체중 1 kg당 0.1 내지 1, 1 내지 5, 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 mg의 초기 항체 노출, 이어서 환자의 체중 1 kg당 0.1 내지 1, 1 내지 5, 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 mg의 제2 CD19 항체 노출을 제공하는 것을 포함하며, 제2 CD19 항체 노출은 초기 항체 노출로부터 약 15 내지 60주까지는 제공되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 투여 프로토콜은 MS 대상체에게 10 mg 내지 1000 mg, 10 mg 내지 200 mg, 100 mg 내지 300 mg, 200 mg 내지 400 mg, 300 mg 내지 500 mg, 400 mg 내지 600 mg, 500 mg 내지 700 mg, 600 mg 내지 800 mg, 700 mg 내지 900 mg, 또는 800 mg 내지 1000 mg의 CD19 항체의 초기 항체 노출, 이어서 10 mg 내지 1000 mg, 10 mg 내지 200 mg, 100 mg 내지 300 mg, 200 mg 내지 400 mg, 300 mg 내지 500 mg, 400 mg 내지 600 mg, 500 mg 내지 700 mg, 600 mg 내지 800 mg, 700 mg 내지 900 mg, 또는 800 mg 내지 1000 mg의 CD19 항체의 제2 항체 노출을 투여하는 것을 포함하며, 제2 CD19 항체 노출은 초기 항체 노출로부터 약 15 내지 60주까지는 제공되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 상기 제2 노출은 상기 초기 노출로부터 약 15 내지 20주, 약 17 내지 23주, 약 20 내지 25주, 약 23 내지 27주, 약 25 내지 30주, 약 27 내지 33주, 약 30 내지 35주, 약 33 내지 37주, 약 35 내지 40주, 약 37 내지 43주, 약 40 내지 45주, 약 43 내지 47주, 약 45 내지 50주, 약 47 내지 53주, 약 50 내지 55주, 약 53 내지 57주, 또는 약 55 내지 60주까지는 투여되지 않는다. 본 발명의 목적상, 제2 CD19 항체 노출은 대상체가 초기 항체 노출 후 CD19 항체로 치료된 그 다음 시기이며, 초기 노출과 제2 노출 사이에는 CD19 항체의 치료 또는 노출이 개재되지 않는다.

일부 실시 양태에서, 제2 CD19 항체 노출은 초기 노출로부터 약 20 내지 30주까지는 제공되지 않으며, 임의로, 환자 체중 1 kg당 약 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 mg의 제3 CD19 항체 노출이 이어진다. 일부 실시 양태에서, 제3 CD19 항체 노출은 10 mg 내지 1000 mg, 10 mg 내지 200 mg, 100 mg 내지 300 mg, 200 mg 내지 400 mg, 300 mg 내지 500 mg, 400 mg 내지 600 mg, 500 mg 내지 700 mg, 600 mg 내지 800 mg, 700 mg 내지 900 mg, 또는 800 mg 내지 1000 mg을 포함한다. 제3 노출이 투여되는 실시 양태에서, 제3 노출은 초기 노출로부터 약 40 내지 60주, 또는 약 40 내지 46주, 또는 약 43 내지 47주, 또는 약 45 내지 50주, 또는 약 47 내지 53주, 또는 약 50 내지 55주, 또는 약 53 내지 57주, 또는 약 55 내지 60주까지는 투여되지 않는다. 특정 실시 양태에서, 어떠한 추가의 CD19 항체 노출도 초기 노출로부터 적어도 약 70 내지 75주까지는 제공되지 않는다.

본원에 기술된 항체 노출들 중 임의의 하나 이상은 단회 용량의 항체로서, 또는 2회 별도 용량의 항체(즉, 제1 및 제2 용량을 구성함)로서 환자에게 제공될 수 있다. 각각의 항체 노출에 이용되는 용량의 특정 수는(하나이든지 둘이든지 간에) 예를 들어 치료되는 MS의 타입, 이용되는 항체의 타입, 제2 의약이 이용되는지 및 어떤 타입의 제2 의약이 이용되는지, 그리고 투여의 방법 및 빈도에 다라 달라진다. 2회 별도 용량이 투여되는 경우, 제2 용량은 바람직하게는 제1 용량이 투여된 시점으로부터 약 3 내지 17일, 약 6 내지 16일, 약 13 내지 16일, 또는 15일에 투여된다. 2회 별도 용량이 투여되는 경우, 항체의 제1 및 제2 용량은 바람직하게는 환자의 체중 1 kg당 약 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 mg이다. 일부 실시 양태에서, 제1 및 제2 용량은 MS 대상체에 대하여 10 mg 내지 1000 mg, 10 mg 내지 200 mg, 100 mg 내지 300 mg, 200 mg 내지 400 mg, 300 mg 내지 500 mg, 400 mg 내지 600 mg, 500 mg 내지 700 mg, 600 mg 내지 800 mg, 700 mg 내지 900 mg, 또는 800 mg 내지 1000 mg의 CD19 항체를 포함한다.

제조품

특정 실시 양태에서, 상기에 기술된 다발성 경화증의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 제조품은(a) CD19에 결합하는 항체 및 제약적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 내부에 포함하는 용기; 및(b) 다발성 경화증을 앓고 있는 대상체에게 상기 조성물을 투여하여 대상체의 체중 1 kg당 약 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 mg의 초기 항체 노출, 이어서 적어도, 대상체의 체중 1 kg당 약 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 mg의 제2 항체 노출을 제공하는 것에 대한 지시 사항을 포함하는 패키지 인서트(package insert)를 포함하며, 상기 적어도 제2 노출은 초기 노출로부터 약 16 내지 60주까지는 제공되지 않는다.

본 제조품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결부된 라벨 또는 패키지 인서트를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 다발성 경화증의 치료에 효과적인 조성물을 담고 있거나 포함하며, 살균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사용 니들에 의해 천공가능한 마개를 갖는 정맥내 용액용 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 항체이다. 라벨 또는 패키지 인서트는 다발성 경화증을 앓고 있는 대상체에서 다발성 경화증을 치료하는 데 조성물이 사용됨을 지시하며, 이때 항체 및 임의의 다른 약물의 투약의 양 및 간격에 관한 구체적인 지도가 제공된다. 본 제조품은 제약적으로 허용가능한 희석제 완충제, 예컨대 주사용 정균수, 인산염 완충 염수, 링거액(Ringer's solution) 및 덱스트로스액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 본 제조품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들 및 시린지를 비롯하여, 상업적인 견지 및 사용자의 견지에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

실시예

실시예 1. 300B4-CD19 결합의 검정

포착제로서 재조합 세포 표면 인간 CD19를 발현하는 300B4 세포를 이용하는 세포 기반 CD19 결합 검정법으로 키메라, 인간화, 또는 인간 항-CD19 항체가 hCD19에 결합하는 능력을 평가할 수 있다. 300B4 세포를 표준 프로토콜에 따라, 1 mg/ml G418의 존재 하에서, L-글루타민을 함유하고 10% 송아지 태아 혈청, β-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양한다. 표준 ELISA 프로토콜을 세포 기반 CD19 결합 검정법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 96웰의 U자 바닥의 플레이트의 개개의 웰에 1x10⁵개의 300B4 세포를 접종하고, 이를 하룻밤 인큐베이션한다. 세포를 ELISA 완충제로 1회 세척한 후 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체와 함께 얼음에서 인큐베이션한다. 테스트한 각각의 항체 농도에 대하여 삼중으로 결합 반응을 수행한다. 무관한 특이성의 이소타입 매칭 항체를 이용한 음성 대조 웰을 이 검정법에 포함시켜야 한다. 항체와 함께 인큐베이션한 후, 300B4 세포를 200 마이크로리터의 ELISA 완충제로 3회 세척한다. 300B4 세포에 결합된 키메라, 인간화, 또는 인간 항-CD19 항체의 양을 표준 프로토콜에 따라 서양 고추냉이 퍼옥시다아제와 접합된 염소 항-인간 카파 항체를 이용하여 검출할 수 있다.

실시예 2. 시험관내에서의 ADCC의 검정

사이토톡스(CytoTox) 96^TM 비방사능 세포 독성 검정법(프로메가(Promega))은 ⁵¹Cr 방출 세포 독성 검정법에 대하여 대안적인 열량 측정법이다. 사이토톡스 96^TM 검정법은 세포 용해시 방출되는 안정한 세포질 효소인 락테이트 데히드로게나아제(lactate dehydrogenase; LDH)를 정량적으로 측정한다. 배양 상청액 중의 방출된 LDH를 30분 커플링 효소 검정법을 이용하여 측정하는데, 이는 테트라졸륨 염(INT)을 적색 포르마잔 생성물로 전환시킨다. 형성된 색의 양은 용해된 세포의 수에 비례한다.

상기 검정법을 제조업자의 지시에 따라 수행한다. 간략하게는, 표적 세포를 PBS로 세척하고, 0.4x10⁶/ml의 세포 밀도로 RPMI-5 페놀 무함유 배지에 재현탁시킨다. NK 이펙터 세포를 PBS에서 1회 세척하고, 1x10⁶/ml의 세포 밀도로 RPMI-5 페놀 무함유 배지에 재현탁시킨다. 검정법을 U자 바닥의 96웰 플레이트에서 수행한다. 각각의 검정 플레이트는 실험 웰과 대조 웰의 조합을 포함한다. 실험 웰은 50 ml의 적절한 항체 희석물, 50 ml의 표적 세포 현탁물 및 50 ml의 이펙터 세포 현탁물을 조합함으로써 셋업(set up)한다. 상기에 기술된 세포 밀도는 표적 대 이펙터 세포의 비가 1:2.5로 되게 하며; 상이한 표적 대 이펙터의 비가 요망될 경우 이펙터 세포 스톡(stock)을 추가로 희석하거나 농축시킬 수 있다. 몇몇 상이한 타입의 대조 웰을 사용하여(i) 표적 세포로부터의 자발적인 LDH 방출(표적, 자발적),(ii) 이펙터 세포로부터의 자발적인 LDH 방출(이펙터, 자발적),(iii) 표적 세포로부터의 최대의 LDH 방출(표적, 최대), 및(iv) 배양 배지 중 오염물질의 존재(배경)를 설명한다. 96웰 플레이트에서 사용 중인 모든 웰은 동일한 최종 부피를 포함한다. 반응물을 삼중으로 셋업한다. 셋업 후, 플레이트를 120 x g에서 3분 동안 스핀하여 세포를 펠렛화한다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션의 종료 45분 전에, 제조업자가 공급한 용해 완충제 15 ㎕를 표적 세포 최대 방출 대조 웰에 첨가한다. 인큐베이션 후, 플레이트를 120 x g에서 4분 동안 원심분리한다. 각각의 웰로부터의 상청액 50 ㎕를 새로운 편평 바닥 96웰 플레이트로 옮긴다. 50 ㎕의 재구성 기질 믹스(제조업자가 제공한 성분들로부터 조립함)를 첨가하고, 플레이트를 광으로부터 보호하여 실온에서 10 내지 20분간 인큐베이션한다. 제조업자가 제공한 중지 완충제 50 ㎕를 첨가하고, 플레이트 판독기에서 490 또는 492 nm에서 흡광도를 측정한다. 세포 독성(%)은(실험-이펙터, 자발적-표적, 자발적)/(표적, 최대-표적, 자발적)이다. 세포 독성(%)을 계산하기 전에, 모든 다른 값들에서 배경을 뺀다.

실험 3. 시험관내에서의 FcγRIIIA 수용체 결합의 검정

인간 FcγRIIIA 수용체(CD16)에 대한 다양한 인간화 항-CD19 항체 제제의 상대적인 결합 친화도를 ELISA 검정법을 이용하여 확증할 수 있다. 미세적정 플레이트를 50 ㎕의 항체 제제(50 ㎍/ml)를 이용하여 4℃에서 하룻밤 코팅한다. 임의의 잔존 결합 부위를 PS 완충제 중 4% 탈지유(차단 완충제)를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 차단시킨다. 웰의 세척 후, 50 ㎕의 연속 희석 단량체형 FcγRIIIA-플래그(flag) 단백질을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션한다. 50 ㎕의 2.5 ㎍/ml 항-플래그-ME-바이오틴(시그마(Sigma))을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 웰을 하기 시약 각각을 이용하여 인큐베이션 사이에 세척한다. 50 ㎕의 0.1 ㎍/ml의 아비딘 접합된 HRP(피어스(PIERCE))를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 30 ㎕의 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(피어스)을 첨가하고, 이어서 30 ㎕의 0.2 M H₂SO₄로 중화시킴으로써 검출을 실시한다. 흡광도를 450 nm에서 판독한다.

다양한 인간 및 쥐과 FcγR에 대한 다양한 인간화 항-CD19 항체 제제의 상대적인 결합 친화도를 비아코어 3000 기기(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 에이비(BIAcore AB)에서 또한 확증할 수 있다. 간략하게는, 푸코실화 및 비푸코실화 형태의 IgG1-인간화 CD19 mAb를 상기 기기의 제조업자가 약술한 바와 같이 표준 아미노 커플링 화학을 이용하여 CM5 센서 칩 상의 개별 유동 세포 상에 고정화하였다. 각각의 센서 칩 상의, mAb가 없는 기준 유동 세포를 또한 준비하였다. FcγR의 스톡 용액(문헌[Oganesyan et al ., 2008])을 기기용 완충제(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% P-20 세제를 함유하는 HBS-EP 완충제)를 사용하여 연속적으로 희석시켰다. FcγR을 5 ㎕/분의 유량으로 IgG 및 기준 세포 표면 둘 모두 위에 주입하였다. 결합 데이터를 50분 동안 수집하고, 이어서 주입들 사이의 5 mM HCl의 60-se 펄스에 의해 IgG 표면으로부터 결합 FcγR을 제거하였다. 모든 결합 데이터를 수집한 후, 개개의 데이터 세트를 각각의 농도에서의 결합(평형에서의 응답)에 대하여 평균하고, 그 후 1:1 결합 등온선(농도에 대한 평형에서의 응답) 그래프에 피팅시켰다. 이것으로부터, K _D 값을 유도하였다. 이러한 계산을 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어, 버전 4.1(비아코어 에이비)을 이용하여 수행하였다.

실시예 4: 인간 CD19 형질전환(huCD19Tg) 마우스 유래의 형질 세포 상에서의 CD19의 발현

BLIMP gfp 마우스에서, 형질 세포를 녹색 형광 단백질(green florescence protein; GFP)을 발현하도록 엔지니어링하여서 이들 세포의 용이한 확인을 허용한다. BLIMPgfp+huCD19Tg 마우스를 교배에 의해 생성하고, 이들 마우스 유래의 비장 및 골수 세포를 수확하고, 유동 세포 분석법을 위하여 단일 세포 현탁물로 제조하였다. 세포를 항-CD45R/ B220(알렉사플루오르(AlexaFluor) 700), 항-쥐과 CD19(PerCPCy5.5), 및 항-인간 CD19(APC Cy7)로 염색하였다. 마우스에서, 형질 세포는 세포 표면 상에서 쥐과 CD19를 발현하며, 이외에도 형질전환 인간 CD19를 발현한다. 형질 세포 상에서의 huCD19의 수준은 비장 및 골수에서 B220+ B 세포보다 약간 더 낮으며, muCD19의 수준도 형질 세포에서 더 낮다.

실시예 5: 난백알부민(ova) 면역화 인간 CD19 형질전환(huCD19Tg) 마우스에서 항체 역가 및 형질 세포 수에 대한 16C4-aFuc의 영향

Ova-특이적 IgG 및 전체 IgG에 대한 비푸코실화 MAb 16C4(16C4-aFuc)의 영향을 조사하였다. HuCD19Tg 마우스를 100 ㎍ 난백알부민(ova) 및 CFA를 이용하여 피하로(s.c.) 면역화하였다. 면역화한 후 4주에, 배중심 반응이 진정되었을 때, 마우스에 10 mg/kg의 16C4-aFuc 또는 이소타입 대조구(R347aFuc)를 정맥내(IV) 주사하였다. 10주의 연구 종점까지 면역화하기 1주일 전 및 면역화 후 2주마다 혈액을 후안와에서 수집하여 헤파린 처리 튜브 내에 넣었다. 마우스 Ig 이소타입 결정 키트(밀리포어(Millipore))에 대한 제조업자의 프로토콜에 따라 루미넥스(Luminex) 검정법에 의해 전체 IgG를 측정하였다. Ova 특이적 IgG를 ELISA에 의해 측정하였다. 간략하게는, Ova를 40℃에서 하룻밤 넝크(NUNC) 고 결합 플레이트 상에 코팅하였다. 샘플 및 표준물(산타 크루즈(Santa Cruz))을 차단 후 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 그 후, 염소 항-마우스 전체 IgG HRP(서던 바이오테크(Southern Biotech))로 코팅하였다. 마지막으로, TMB 기질의 첨가 후 OD 값을 측정하였다. 도 2의 A의 그래프는 ㎍/mL의 항체의 평균 +/- SE를 나타낸다.

면역화 후, 모든 마우스는 2주까지 100배 증가된 Ova 특이적 IgG 항체 역가 및 증가된 전체 IgG 역가를 나타냈다. 16C4-aFuc로 처리한 후, 혈청 중 전체 IgG 및 Ova 특이적 IgG 역가는 이소타입 대조 항체로 처리한 마우스와 비교하여 유의하게 감소한다.

골수 유래의 IgG(전체 및 Ova 특이적 IgG) 생성 형질 세포에 대한 영향을 조사하였다: C57Bl/6xhCD19Tg +/- 마우스를 ova 및 CFA를 이용하여 피하로(s.c.) 면역화하였다. 면역화한 후 4주에, 마우스에 10 mg/kg의 16C4-aFuc, 비-Fcγ수용체 결합 대조구(16C4-TM), 또는 PBS를 정맥내(IV) 주사하였다. MAb를 처리한지 2주 후에, 골수(BM) 세포를 마우스로부터 수확하였다. 항체 형성 세포(antibody forming cell; AFC)를 일반 제조업자 프로토콜(맙테크(MABTECH))에 따라 ELISpot에 의해 검출하였다. 그 후, Ova 특이적 AFC는 상기 일반 프로토콜에 따라 Ova로 플레이트를 코팅함으로써 검출하였다. 도 2의 B는 16C4-aFuc를 이용한 처리가 골수에서 전체 IgG 및 Ova 특이적 IgG AFC의 수를 유의하게 감소시키며, 반면에, 비-Fcγ수용체 결합 대조구(16C4TM)는 영향을 주지 않음을 나타낸다.

실시예 6: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 혈액 및 조직 B 세포에 대한 영향

메디뮨(MedImmune)의 동물 사용 정책에 따라 SLE1+/+ 마우스를 hCD19Tg 마우스와 교배함으로써 SLE1xhCD19Tg+/- 마우스를 생성하였다. 제0주에, 10 mg/kg의 16C4-aFuc 또는 동일 용량의 대조 항체(16C4-TM) 중 어느 하나를 SLE1xhCD19Tg+/- 마우스에 IV 투약하였다. 마우스는 제2주에 동일 처리를 받고, 후속적으로, 6주에서 시작하여 2주마다 최대 10주 동안 16C4-aFuc를 마우스당 300 ㎍으로 IP 주사하였다. 상기 실험의 지속 기간 전체에 걸쳐 2주마다 혈액을 후안와 채혈에 의해 수집하여 헤파린 처리 튜브 내에 넣었다. 상기 연구를 제12주에 종료하고, 비장, 혈액 및 골수 세포를 회수하고, FACS 및 ELISpot 분석을 하였다. 혈청 샘플을 ELISA로 분석하였다. SLE1xhCD19Tg+/- 마우스에서의 16C4의 종단적 연구의 개략도가 도 3a에 예시되어 있다.

전체 순환 B 세포를 항-CD45R/B220 및 항-쥐과 CD19 MAb로 염색한 후 FACS로 검출하였다. 도 3b의 그래프는 16C4-aFuc(오렌지색 원)으로 처리하든지 비-Fcγ수용체 결합 대조구, 16C4-TM(흑색 정사각형)으로 처리하든지 간에, 연구에서 각각의 마우스에서의 B220+mCD19+ B 세포의 수를 나타낸다. 16C4-aFuc로 처리한 모든 마우스는 처음에 90% 초과의 순환 B 세포 격감을 갖는다. 하위 세트의 마우스는 IV 주사 후 6주에 일시적 B 세포 회복을 갖지만, 연구 종료까지는 IP 주사 후 모든 마우스가 다시 한번 B 세포 격감된다.

SLE1xhuCD19Tg 마우스의 비장에서 전체 및 배중심 B 세포에 대한 16C4-aFuc의 영향은 16C4-aFuc를 이용한 다수의 처리 후 제12주에 조사하였다. SLExhCD19Tg 마우스는 대조 MAb 처리 마우스와 비교하여 비장에서 90% 초과의 B 세포 감소를 갖는다. 도 3c의 그래프는 FACS 염색에 의해 검출된 전체 B 세포 또는 배중심 B 세포의 수를 도시한다. 전체 B 세포를 항-CD45R/B220(알렉사플루오르 700)으로 검출하였다. 배중심 B 세포를 PNA+(FITC) 및 IgD-(알렉사 647)로서 검출하였다.

SLE1xhuCD19Tg 마우스의 골수에서 B 세포 집단에 대한 16C4-aFuc의 영향을 또한 조사하였다. SLExhCD19Tg 마우스를 16C4-aFuc로 처리한 후 골수 B 세포의 수를 FACS 염색에 의해 결정하였다. 동일 마우스로부터의 두 대퇴골을 연구 개시 후 12주에 수집하고, 세포의 단일 세포 현탁물을 하기 항체를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다: CD43(FITC), IgM(PE-Cy7), IgD(Alexa 647), CD45R/B220(A700). 전체 B 세포(B220+)의 수는 대조구와 비교하여 16C4 처리 마우스에서 68%만큼 감소하였으며, 이는 도 3d에 나타낸 바와 같았다. 남아 있는 대다수의 B 세포는 프로-B 세포(CD43+IgM-)로 간주되었는데, 이는 형질전환 CD19를 매우 낮게 발현하였다.

실시예 7: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 비장 및 골수 형질 세포에 대한 영향

SLExhCD19Tg의 비장 및 골수 형질 세포를 16C4-aFuc로 처리한 후 ELISpot에 의해 또는 CD138(PE) 염색에 의해 검출하였다.(도 4의 A 및 도 4의 B 참조). FACS 데이터는 CD138+ B 세포의 총수로서 도시한다. 12주에, 비장에서 형질 세포의 98% 감소가 있으며, 반면에, 골수(BM)에서 형질 세포 수의 유의한 변화는 전혀 없다.(도 4의 C 및 도 4의 D 참조). 전체 IgG 및 IgM 항체 형성 세포(AFC)에 대한 ELISpot 데이터는, 비장 AFC에서 유의한 감소가 있고 BM에서는 차이가 전혀 검출되지 않는 유사한 패턴을 나타낸다.

실시예 8: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 항-dsDNA 자기 항체에 대한 영향

16C4-aFuc 처리를 한지 12주 후에 SLExhCD19Tg 마우스의 비장 및 BM에서 항-dsDNA AFC를 검출하기 위하여 ELISpot 검정법을 이용하였다. BM에서는 항-dsDNA 특이적 AFC의 수준의 차이가 전혀 없는 반면, 항-dsDNA에 특이적인 비장 AFC에서는 유의한 감소가 있었다(도 5 참조).

실시예 9: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg 마우스의 처리 - 시간이 지남에 따른 혈청 면역글로불린에 대한 영향

12주 동안 1개월당 2회 16C4-aFuc로 처리한 SLExhCD19Tg 마우스로부터 2주마다 혈청을 수집하였다. 혈청중 Ig 수준은 마우스 Ig 이소 타입 결정 키트(밀리포어)에 대한 제조업자의 프로토콜에 따라 루미넥스에 의해 검출하였다. 도 6은 기저선(제0일) 수준의 백분율로서 도시된 생성된 데이터를 나타낸다. 처리 전 수준과 비교하여 16C4-aFuc로 처리한 마우스에서 혈청 IgM, IgG1, IgG2a, 및 IgG2b의 유의한 감소가 있었다. 그러나, 이소타입 항체 처리 전후의 수준은 유사하였다. IgG3 및 IgA는 유의하게 다르지 않았다.

실시예 10: 16C4-aFuc를 이용한 SLE1xhuCD19Tg의 처리 - 혈청 중 자기 항체의 감소

SLExhCD19Tg 마우스를 16C4-aFuc 또는 음성 대조 MAb(16C4TM)로 12주 동안 처리하였다(1개월당 2회 투약). 혈청중 자기 항체의 수준을 알파 다이아그노스틱스(Alpha Diagnostics)로부터의 사전 제조 ELISA 키트를 이용하여(제조업자의 프로토콜에 따라) 검출하였다. 도 7은 항-ANA, 항-히스톤 및 항-dsDNA의 역가에 대한 데이터를 기저선(제0일)의 백분율로서 그래프로 나타낸다. 8주 및 12주에, 자기 항체 역가의 40 내지 80% 감소가 있었다.

실시예 11: 인간 조직 유래의 형질모세포 및 대부분의 형질 세포 상에서의 CD19의 발현

CD19 에 대하여 양성인 CD27 + CD38 고 세포는 형질 세포 표현형을 갖고 IgG 를 분비한다

골수 단핵 ASC(CD38hiCD27+CD19+CD20-) 및 B 세포(비-PC 게이트(non-PC gated), CD19+CD20+)를 비디(BD)의 FACSAria II 세포 분류기에서 FCM을 통하여 분류하였다. 세포를 CD38 및 CD27 발현을 기반으로 하여 두 분획물로 분리하였다. CD38hiCD27+(PC)는 CD19+CD20- 상에서 추가로 게이팅되었으며, 비-PC 세포는 CD19+CD20+ 미숙 B 세포 내로 추가로 게이팅되었다(FACS 패널, 도 8a). 이들 두 집단을 분류하고, 형태에 의해 추가로 특성화하였다(도 8b). 라이트(Wright) 염색 분류 세포의 예는 명확한 큰 핵을 갖는 두 분획물을 나타내지만, CD19+ PC 분류 분획물은 CD19+CD20+ 비-PC 분획물에는 존재하지 않는 PC의 특징적인 핵주위 세포질 특성을 나타냈다.

분류된 세포의 전체 IgG ELISpot은 CD19+ PC 게이트 세포가 IgG를 분비함을 나타내는데, 이는 웰당 10개의 세포로 검출가능하였다(도 8c). CD19+CD20+ 비-PC 분획물은 어떠한 실제 세포 스폿(spot)도 나타내지 않았다. 이들 결과로부터, CD19에 대하여 양성인 CD27+CD38고 세포가 형질 세포 표현형을 가지며 IgG를 분비함을 알 수 있다.

CD19 는 혈액 및 림프 기관 유래의 CD27 + CD38 고 항체 분비 세포( ASC ) 상에서 발현된다

혈액(PBMC) 및 림프 기관(편도선, 비장, 골수) 유래의 CD38고CD27+ 세포를 유동 세포 분석법에 의해 이들의 상대적인 CD19 및 CD20 발현에 대해 분석하였다.

CD38hiCD27+ ASC 상에서의 CD19(도 9의 좌측 컬럼) 및 CD20(도 9의 우측 컬럼) 표면 발현의 대표적인 오버레이(overlay)가 실선 그래프로서 예시되어 있다. 각각의 조직에 있어서의 생존성 단핵 세포가 음영 처리 회색 곡선 하에 비교용으로 예시되어 있다.

CD19는 분석한 혈액 및 림프 조직 유래의 대부분의 ASC 상에서 발현된다. 단지 비장 및 골수가 특유한 CD38고CD27+ 집단을 함유하는데, 이는 CD19에 대하여 음성이다. 분석한 혈액 및 대부분의 조직에서, CD38highCD27+ 세포는 CD20에 대하여 음성이다.

BM 유래의 CD19 음성 ASC 집단은 백신 항원에 대하여 대부분의 체액성 기억을 포함한다

BM은 CD19 발현을 기반으로 하여 구별할 수 있는 2가지의 특유한 PC 집단을 함유한다. 대다수의 BM PC는 CD19를 발현하는 반면, 소수 집단은 CD19 음성이다(FACS 패널, 도 10의 상부).

CD19 양성 및 음성 PC를 ELIspot에 의해, 특정 백신 항원에 대한 항체의 생성 및 전체 IgG 분비에 대하여 분석하였다(도 10의 하부). BM CD19- PC는 CD19+ PC와 비교하여 증가된 빈도로, 백신 항원에 대하여 기억-유사 특이성을 나타낸다. CD19+ 및 CD19-는 전체 IgG ELISpot에서 유사한 수의 스폿을 나타낸다(500개의 분류된 항체 분비 세포(ASC)). 그러나, CD19- 분획물 사이에서 플루존(Fluzone) 또는 답타셀(Daptacel)에 대하여 특이적인 ASC에 의해서는 ELISspot의 수가 증가한다(3000개의 분류된 ASC).

실시예 12: 형질 세포 시그너처

건강한 지원자로부터의 정제된 PC 및 분류된 세포 분획물의 전체 게놈 마이크로어레이(microarray) 분석을 이용하여, 다수의 PC 풍부화 유전자(IGHA, IGJ, IGKC, IGKV, 및 TNFRSF17)의 발현 수준들을 합하여 시그너처 스코어를 개발하여서 환자 샘플 중 PC 카운트를 개산하였다. 경피증(NCT00946699)에 있어서 16C4afuc의 제I기 용량 증가 실험, MI-CP200에 등록한 환자에서의 이러한 세포 집단의 변화를 이러한 새롭게 개발된 유전자 발현 기반 PC 시그너처를 사용하여 모니터링하였다. 16C4afuc의 단회 용량 후 다양한 시점에(전혈에 있어서 제3일, 제29일, 제85일; 피부에 있어서 제29일), PC 및 B 세포 시그너처에서의 유전자 발현 변화를 혈액 및 피부 샘플에서 평가하였다. 이들 시그너처의 변화를 각각의 환자의 기저선(제1일) 샘플과 비교하여 계산하였다.

결과는, WB에 있어서 16C4afuc가 대략 98%를 최대 격감로 하여, PC 유전자 시그너처의 강한 감소를 야기하였고, 처리 후 제85일까지 격감을 유지하였음을 나타낸다(도 A-1). 측정한 마지막 시점인 제85일까지, PC 시그너처는 기저선의 대략 65%까지 회복되었다(도 11). WB에 있어서 PC 시그너처의 기저선 값과 MEDI-551 처리 후 값 사이의 차이는 측정한 모든 시점에 통계적으로 유의하였다(p < 0.01). 16C4afuc 처리 후 피부 샘플에서의 PC 유전자 시그너처의 통계적으로 유의한 감소가 또한 관찰되었으며(p < 0.05), 이는 90%의 최대 수준 및 대략 55%의 중간값에 도달하였다(도 12). 더욱이, 매칭된 혈액 및 질환 조직 시편을 갖는 환자에 있어서, WB 및 피부에 있어서 PC 유전자 시그너처의 조화된 저해가 있었다(스피어만 순위 상관 r=0.72, p=0.002; 도 13).

실시예 13: 인간 형질 세포(PC)의 매개된 격감

인간 형질 세포(CD27 고 CD38 고)의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성적 사멸을 매개하는 16C4afuc의 능력을 평가하였다.

시험관내 PC 분화 검정법에 있어서, 고지에 입각한 동의서를 받은 후 건강한 공여자(n=3)로부터 신선한 인간 혈액을 획득하였다. 소듐 헤파린을 포함하는 CPT 튜브 내에 샘플들을 넣고, 수집한지 2시간 내에 프로세싱하였다(processed). 제품 인서트에 의해 제공된 표준 프로토콜에 따라 PBMC를 전혈로부터 단리하였다. MACS 세포 분리 시약을 이용하여 미경험 및 기억 B 세포를 음성 선발하여 기존의 PC 집단 뿐만 아니라 비-B도 제거하였다. 생성된 B 세포를 비구별(비보충) 또는 형질 세포 구별(항-IgM/항-CD40/IL-21의 보충) 조건 하에 도말하였다. 배양한지 6.5일 후, 하기 항체의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 초래 잠재력을 표준 4시간 ADCC 검정 프로토콜을 통하여 평가하였다: 16C4 afuc(CD19에 대한 비푸코실화 hIgG1), 16C4TM(이펙터 활성의 감소용으로 조절된, CD19에 대한 삼중 돌연변이 hIgG1), hIgG1afuc(비푸코실화 비특이적 hIgG1 대조구) 및 리툭산(CD20에 대한 hIgG1). 간략하게는, 소비된 배지를 교환하고, 웰을 적절한 항체 함유 배지 중에 재현탁시켰다. IL-2 사전 활성화 KC1333 NK 세포를 2:1의 E:T의 비로 첨가하였다. 인비트로겐(Invitrogen)의 고정가능 생/사 식별자 및 B 세포 마커(CD19, CD20, CD27, 및 CD38)를 이용한 염색을 통하여, 인큐베이션한지 4 내지 6시간 후에 세포 독성 효능을 평가하였다. 모든 샘플을 48시간 내에 염색하고, 고정하고, LSR II 유동 세포 분석기에 러닝시켰다(run).

일차 골수 유래된 PC의 격감 검정법에 있어서, 건강한 공여자(n=2)의 신선한 인간 골수를 론자(Lonza)로부터 입수하였다. 샘플을 수집한지 2시간 내에 50 ml 코니칼 튜브(conical tube) 중에 수집하고, 냉장 조건 하에 동일한 날에 선적하고, 프로세싱하였다. 미경험, 기억 및 PC B 세포를 스템셀(STEMCELL) 세포 분리 시약을 이용하여 음성 선발하여 비-B 세포 집단을 제거하였다. 생성된 B 세포를 도말하고, 하기를 제외하고는 상기에 기술한 바와 같이 표준 ADCC 검정 프로토콜을 통하여 테스트 및 대조 항체의 ADCC 초래 잠재력을 평가하였다: 검정 인큐베이션 시간을 6시간으로 늘이고, KC1333NK 세포를 1:1의 E:T의 비로 첨가하였다.

ADCC 데이터는, 인간 골수로부터 신선하게 단리된 PC(도 15) 뿐만 아니라 hPBMC 구별 PC(도 14)의 유의한 격감도 16C4afuc가 매개하였음을 나타낸다. 둘 모두의 검정에서, 형질 세포는 유동 세포 분석법에 의해, 정제된 B 세포 집단 내에서 CD27 고 CD38 고 림프구로서 확인되었다(도 14의 A 및 도 15의 B).

예상된 바와 같이, CD27 고 CD38 고 PC로의 강한 분화는 PC 분화 배지의 포함에 의존적이었으며(도 14의 A) 대다수의 생성된 PC는 CD19 및 CD20을 동시 발현하였다(도 15의 B). 사분면 게이트를 벌크 림프구 집단을 이용하여 세팅하였다(데이터는 예시되어 있지 않음). 3명의 공여자 중 3명에 있어서, 모든 테스트한 용량의 16C4afuc에 의해 PC가 유의하게 격감되었다(p 값 = 0.001). 1 ㎍/ml로 투약한 리툭산도 시험관내 분화 PC의 유의한 격감을 매개하였지만, 어떠한 항체 대조구로부터의 감소도 유사한 용량의 16C4afuc를 이용한 접종보다 더 평범하지는 않았다. 1 ㎍/ml의 16C4 TM 및 hIgG1afuc 대조 항체의 첨가는 영향이 최소였다.

인간 골수로부터 신선하게 단리된 CD27 고 CD38 고 PC 상에서의 CD19 발현은 둘 모두의 공여자에서 83% 초과였다. CD20 발현은 전체 PC의 4% 미만만큼 단지 희미하게 발현되었다(도 15의 B). 100%의 공여자에서, PC는 모든 테스트한 용량의 16C4afuc에 의해 유의하게 격감되었다(p 값 = 0.001). 1 ㎍/ml로 투약한 리툭산은 신선하게 단리된 골수 PC의 유의한, 그러나 강한 것은 아닌 격감을 또한 매개하였다. 1 ㎍/ml의 16C4 TM 및 hIgG1afuc 대조 항체의 첨가는 영향이 최소였다.

실시예 14: 다발성 경화증(MS) 환자 유래의 뇌척수액(CSF) 및 전혈(WB)에서의 면역 세포의 FACS 표현형 분석

RRMS 환자의 WB에 대한 CSF에서의 형질 세포 및 형질모세포의 존재를 평가하고, 그의 CD19 발현 패턴을 CD20의 것과 비교하여 FACS에 의해 조사하였다.

WB 및 CSF를 RRMS 환자로부터 수집하였다. 상업적으로 입수가능한 형광 접합된 항체의 패널을 사용하여 세포를 유동 세포 분석법적 분석용으로 염색하였다. 세포를 세척하고, 그 후 취득을 위하여 PBS/FCS 중에 재현탁시켰다. CD20에 대한 CD19의 발현을 측정하기 위하여, 세포를 크기, 싱글렛(singlet) 및 CD45(조혈 세포 계통 마커)에 따라 게이팅하였다.

결과는, RRMS 환자의 CSF 중에 CD19+CD20- 형질모세포 및 형질 세포가 풍부화됨을 나타냈다. 도 16은 3개의 대표적인 유동 세포 분석 그래프를 나타낸다. CD19는 WB 및 CSF(상부 사분면) 유래의 B 세포의 표면 상에서 검출할 수 있다. 대부분의 CD19+ 세포는 또한 CD20을 발현하는 반면, CSF 중의 작은 하위 세트의 CD19+ 세포는 CD20을 발현하지 않는다(상부 좌측 사분면). 이들 세포는 WB보다 CSF 중에 더욱 우세하다. CD19+CD20- B 세포는 항체 분비 형질모세포 및 형질 세포인 것으로 보고된다. 이들 세포의 표면 상의 다른 마커(CD138, CD27)는 이러한 지정을 지지한다(데이터는 나타내지 않음).

SEQUENCE LISTING <110> MedImmune LLC Herbst, Ronald Wang, Yue Carter, Laura Knappertz, Volker <120> TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS WITH ANTI-CD19 ANTIBODY <130> CD19-108WO1 <150> US61609704 <151> 2012-03-12 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 1 Ser Ser Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 2 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 3 Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 4 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 5 Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 6 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH sequence <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL sequence <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile His Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 9 Ser Ser Trp Met Asn 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 10 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 11 Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Leu Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 12 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 13 Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 14 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH sequence <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL sequence <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (27)

1. 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS) 질환의 치료 방법으로서, 상기 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하며, 상기 항체는 CD19 항원에 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
2. 제1항에 있어서, 다발성 경화증 질환은 재발 완화형(relapsing-remitting; RR) MS, 원발성 진행형(primary-progressive; PP) MS, 이차 진행형(secondary-progressive; SP) MS, 재발성 진행형(relapsing-progressive; RP) MS 및 진행성 재발형(progressive-relapsing; PR) MS로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 다발성 경화증 질환은 RRMS인 방법.
4. 제2항에 있어서, 다발성 경화증 질환은 PPMS, SPMS 및 PRMS로부터 선택되는 진행성 형태의 MS인 방법.
5. 제4항에 있어서, 다발성 경화증 질환은 PPMS인 방법.
6. 제4항에 있어서, 다발성 경화증 질환은 SPMS인 방법.
7. 제4항에 있어서, 다발성 경화증 질환은 PRMS인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 상기 VH는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 VH CDR1, 서열 번호 2의 아미노산에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 VH CDR3을 포함하는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 상기 VH는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 번호 2의 아미노산을 갖는 VH CDR2 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 상기 VL은 서열 번호 4의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 VL CDR1, 서열 번호 5의 아미노산에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 VL CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 VL CDR3을 포함하는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 상기 VL은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 번호 5의 아미노산을 갖는 VL CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 것인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, VH는 서열 번호 7의 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, VH는 서열 번호 7의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, VL은 서열 번호 8의 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, VL은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fc 변이체를 포함하며, 상기 Fc 변이체는 C1q, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 Fc 리간드에 대하여 변경된 친화도를 갖는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, Fc 변이체는 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도가, 비견되는 분자의 친화도보다 약 5배 이상 더 낮으며, 상기 Fc 변이체는 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도가, 상응하는 비변이형 Fc 분자의 친화도의 약 2배 이내인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 향상된 ADCC(antigen-dependent cell-mediated-cytotoxicity; 항원 의존성 세포 매개 세포 독성) 활성을 갖는 것인 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연대 B 세포, 여포성 B 세포, 복막 B 세포 및 골수 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 B 세포의 격감을 포함하는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 선구(progenitor) B 세포, 초기 프로(pro)-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프레(pre)-B 세포, 소형 프레-B 세포, 미숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원 자극된 B 세포 및 형질 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 B 세포의 격감을 포함하는 것인 방법.
21. 제9항 또는 제10항에 있어서, 격감은 B 세포의 수준을 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100%까지 감소시키는 것인 방법.
22. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 격감은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기간 동안 지속되는 것인 방법.
23. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 세포 독성제에 접합되는(conjugated) 것인 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 항-CD20, 항-CD52, 또는 항-CD22 항체와 함께 동시 투여하는 것인 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 인터페론-베타, 코팍손(Copaxone)^TM, 코르티코스테로이드, 시클로스포린, 칼시뉴린 저해제, 아자티오프린, 라파뮨(Rapamune)^TM, 셀셉트(Cellcept)^TM, 메토트렉세이트 또는 미톡산트론과 함께 동시 투여하는 것인 방법.
26. 인간에 있어서의 다발성 경화증의 치료 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 CD19 항원에 결합하는 복수의 단일 클론 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체의 80% ∼ 100%는 비푸코실화된 것인 방법.
27. 제16항에 있어서, 항체는 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.

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